WO1997004080A1

WO1997004080A1 - Nouvelle proteine et anticorps monoclonal specifique a cette derniere

Info

Publication number: WO1997004080A1
Application number: PCT/JP1996/001956
Authority: WO
Inventors: Motoharu Seiki; Hiroshi Sato; Akira Shinagawa
Original assignee: Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date: 1995-07-14
Filing date: 1996-07-12
Publication date: 1997-02-06
Also published as: EP0870826A1; EP0870826A4; US6780412B2; US6191255B1; US20010016333A1

Description

明細書新規な蛋白質及び該蛋白質に特異的なモノクローナル抗体産業上の利用分野

本発明は癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診断治療に関わる研究に有用な診断手段として、あるいはその他の医学的生理学的用途に有用な、新規なタンパク質及びそれをコ一ドする遺伝子に関するものである。特に本発明は、潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種である MT— MMP— 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である新規な膜結合型タンパク質及びそれをコードする遺伝子に関する。さらに詳しくは、本発明はヒト癌細胞表層で特異的に発現している新規マ卜リックスメタ口プロテア一ゼ〔本発明で明らかにされた新規マトリックスメ夕口プロテアーゼを MT— MM P— 3 (Memb r an e-Typ e Ma t r i x me t a l l op r o t e i n a s e-3) と命名する〕、それをコードする塩基配列を含有する DNA、該 DNAで形質転換せしめた宿主細胞、該宿主細胞を用いる該マトリックスメタロプロテァーゼの製造方法、該マトリックスメタロプロテアーゼタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、さらにはそれらタンパク質及び抗体の用途に関するものである。

背景技術

原発巣組織内に存在する癌細胞が浸潤、転移するためには、その周囲に存在する細胞外マトリックスが、癌細胞の移動の障害になる。したがつて、癌細胞が組織を浸潤し転移するには、原発巣からの遊離、周辺の細胞外マトリックスの破壊が必要となる。癌細胞の転移は、その後基底膜の破壊、血管への侵入、侵出、二次臓器への生着、増殖等の段階を経て成立する。癌細胞の転移の障壁となっている細胞外マトリックスは、

I V型コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチン、フイブロネクチン、ラミニン、へパラン硫酸等の複雑な成分から構成されているが、この細胞外マトリックスの分解には、基質特異性を異にするマトリックスメタ口プロテア一ゼ（以下 MMPと略記する）と総称される一群の酵素が関与している。

これまでに MMPとして間質型コラゲナーゼ（MMP— 1 ) 、 72 k Da ゼラチナーゼ（ I V型コラゲナーゼあるいはゼラチナーゼ Aともいう： MMP— 2) 、 92 kD a ゼラチナ一ゼ（ I V型コラゲナ一ゼあるいはゼラチナーゼ Bともいう： MMP— 9) 、ストロムライシン一 1 (MMP - 3) 、マトリライシン（MMP— 7) 、好中球コラゲナ一ゼ（MMP— 8) 、ストロムライシン一 2 (MMP - 10) 、ストロムライシン— 3 (MMP— 1 1 ) 等が報告されている（C r i t. Rev. Or a l. B i o l. Me d. ， 4 : 1 97〜 250， 1 993) 。これらの MMPはフアミリーを形成し、遺伝子の一次構造は既に報告されている。これらの MMPの c DNAデータから推定されるアミノ酸配列には相同性が認められており、基本的に分泌産生時に除かれる N末端のシグナルべプチドに続き、プロべプチドドメイン、 Z n + 結合触媒ドメイン、 5〜50アミノ酸よりなるプロリンに富んだヒンジドメイン、 C 一末端のへモぺキシン凝血酵素様ドメインから構成されている。 MMP 一 7においてはへモぺキシン凝血酵素様ドメィンはない。 MMP— 2と MMP— 9では、この他にゼラチン結合ドメインを含んでいる。

これらの MMPのうち、基底膜の主要構造体である I V型コラーゲンを主たる基質とする I V型コラゲナーゼ（MMP— 2と MMP— 9 ) は、高転移性の癌細胞における高い発現が数多く報告され、癌細胞の基底膜浸潤への関与が提唱されてきた（Ce l l. , 64 ： 327〜336， 1 991) 。 MM Pの活性発現調節は、少なくとも転写レベル、酵素活性を示さなレ、潜在型酵素から活性型酵素への活性化の段階、 MM Pの特異的阻害剤であるティシュインヒビターォブメタ口プロテア一ゼ (T I MP) による活性調節などといった段階で行われていると考えられている（Tr end s Gen e t. , 6 : 1 21〜1 25， 1 99 0) 。全ての MM Ρは不活性な潜在型として分泌されるが、 I n V i t r oの実験では、 MMP— 1、 MMP— 9の活性化は、プラスミン、トリブシン、カテブシン G等のセリンプロテアーゼによって生じることが示されており、さらに、 MMP— 9の活性化が活性型 MMP— 3の作用によっても引き起こされることが報告されている（J. B i o l. C hem. , 267 : 3581〜 3584， 1 992) 。しかしながら、 MMP— 2が上述のプロテアーゼの切断部位を持たないため、 MMP— 2の活性化は、これらによっては起こらないと考えられている (Cu r r. 〇 p i n. Ce l l B i o l. , 5 : 891〜 897， 1 993) 。一方、これらの MMPは、必ずしも癌細胞だけから産生されている訳ではなく、周辺の線維芽細胞や炎症細胞からもそれぞれ異なる MM Pが産生されていることも報告されている（B r e a s t Can c e r Re s. Tr e a t. , 24 : 209— 21 8, 1993. Cu r r. 0 p i n. Ce l l B i o l. , 5 : 89 1〜 897， 1 993) 。中でも MM P— 2は、組織構築の改変を伴うような様々な部位の線維芽細胞で発現しているが、正常組織と癌組織の MMP— 2を比較するとその活性化が癌組織で特異的に生じていることが肺癌の例等で報告されている（C l i n. Exp. Me t a s t a s i s, 1 1 ： 1 83〜 1 8 9， 1 993 ) 。 MMP— 9では、活性型が検出される頻度は低い。また、癌細胞の浸潤の先端（i nvadopod i a) で活性型 MMP— 2が局在することが I n v i t r oの実験系で示され、癌細胞浸潤における重要性が示唆されている（Can c e r Re s. ， 53 : 3 1 59〜 3 164, 1 993. B r e a s t Can c e r Re s. Tr e a t. , 53 : 3 159〜 3 164， 1994) 。

この様な背景から、 MMP— 2の活性化機構が注目されてきたが、前述の様に MM P— 1、 MMP— 9の活性化がトリプシンなどのセリンプ口テアーゼで誘導されるのに対し、 MMP— 2の活性化機構は不明であり、特に活性化因子は同定されていなかった。 MMP— 2の産生細胞である HT 1 080細胞をコンカナバリン Aや 12— 0 — t e t r ad e c anoy l pho rbo l 13— a c e t a t e (TPA) で処理すると活性型 MMP— 2が培養上清に出現することが知られており、これらの細胞では、 MMP— 2の活性化因子が誘導されていると考えられる（J. Na t l. Can c e r I n s t. 85 : 1758〜 176 4， 1993. C l i n. Exp. Me t a s t a s i s. , 1 1 : 1 83〜1 89. 1 993 ) 。この MM P— 2の活性化が細胞膜画分により誘導されること、キレート剤ゃ T I MPによって活性化が抑制されることから、活性化因子は膜結合型の MM Pの 1種であることが想定された B i o l. C h e m. , 268 : 14033〜 14039， 1 993 ) ο

本発明者らは、先に遺伝子工学的手法により新規な MM Ρ遺伝子のクローニングを行い、 C末端に典型的なトランスメンブレン ' ドメインを持ち、 MMP— 2を活性化する新しい MMPをコ一ドする遺伝子をクロ一二ングした（N a t u r e， 370 : 61〜65， l 994 ) 。実際、この遺伝子を培養細胞で発現させると、その遺伝子産物は分泌されることなく細胞膜上に局在したことから、本発明者らはこういつた MMPを MT-MMP (memb r an e-t yp e MMP) と命名した。これまで述べてきたように MMPとりわけ MMP— 2は、その活性型が癌細胞特異的に見出されることから、抗癌、癌などに対する抗転移薬の標的として益々認識されつつある。し力、しな力《ら、 MMP— 2は正常組織においても潜在型として比較的恒常的に存在することから、活性発現調節は活性化酵素への活性化の過程にあり、その鍵を握る活性化因子の探索、同定は癌の診断、悪性度の判定マーカー及び癌などに対する抗転移薬剤の標的として極めて重要であるとすることができる。

また、アルツハイマー病の発症に関与する ^アミロイドタンパク質の切断における MMP— 2の関与が指摘されている。 /3アミロイドタンパク質はァミロイドタンパク質前駆体の一部であり、 /3アミロイドタンパク質領域は、その 1Z4がアミロイドタンパク質前駆体の膜貫通領域に含まれ、残りは細胞外に出ている。最近、アミロイドタンパク質前駆体の複数の代謝が明らかにされたが、その一つは、ひセクレターゼと呼ばれるプロテアーゼにより 5アミロイドタンパク質領域内を切断され、細胞外放出されるものである。最近、 MMP— 2に αセクレターゼ様の/ 3 アミロイドタンパク質分解活性が見出され、 ΜΜΡ— 2がセクレターゼあるいは細胞外でのアミロイドタンパク質分解酵素として機能している可能性が指摘されている（Na t u r e, 3 62 : 8 3 9, 1 9 9 3 ) 。 /5アミロイドタンパク質は、アルツハイマー病患者の脳で観察される老人斑の主成分であり、 /3アミロイドタンパク質の自己凝集と沈着により老人斑のコァを形成する。アルッハイマ一病の患者の脳では 3ァミロイドタンパク質分解酵素の機能低下が生じている可能性もあることから MMP— 2が注目されているが、やはりその鍵を握るのは MM P— 2の活性化の過程である。先に本発明者らが同定した MT— MMP (新たに、ここで「MT— MMP— 1」と名付けられた）は MMP— 2の活性化因子であると考えられるが、 MT— MMP— 1のような未知の MM Pが存在することは、細胞外マトリックスには多様な構成成分が存在することからも充分に予想され、 MT— MMP— 1以外の MMP— 2の活性化因子の存在も否定できない。発明の開示

本発明は、潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT— MMP— 1以外であって潜在型 MMP - 2活性化能を有する潜在型 MMP— 2活性化因子である新規なタンパク質及びそれをコ一ドする遺伝子、該潜在型 MMP— 2活性化因子である新規なタンパク質の製造方法及び該夕ンパク質及び該遺伝子の用途等を提供することを目的とする。

本発明者らは、潜在型 MMP— 2の活性化が癌細胞膜画分により誘導されること、キレート剤や T I MPによって活性化が抑制されることから活性化因子は膜結合型の MM Pの 1種であると想定されていることに着目し、先に潜在型 MMP— 2活性化能を有する新規な MMPをコ一ドする遺伝子を単離したが、これ以外にも MMP— 2の活性化因子として作用する MM Pや生化学的に既知の MM Pと異なる MM Pが存在するのではないかと考え、遺伝子工学的手法を用い種々研究した結果、新たな潜在型 MMP— 2活性化能を有する MMPをコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成させるに至った。

現在まで、潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPとして MT— MMP— 1が知られていたが、それ以外の潜在型 MMP— 2活性化因子については同定されていなかった。本発明者により新規な潜在型 MM P 一 2活性化因子たる MMPの遺伝子がクローニングされ、遺伝子塩基配列およびアミノ酸配列の全てが明らかにされるに至った。本発明者らは、この新規な MMPを当初 MT— MMP— 2と命名した（平成 7年（1 9 9 5年） 7月 1 4日に日本国に出願された特願平 7— 2 0 0 3 1 9号並びに特願平 7— 2 0 0 3 2 0号）力く、ゴ一ドンリサーチコンファレンスオンマトリックスメタ口プロテアーゼズ（アンド一バ一ェヌェイチ 1 9 9 5年 7月 1 6— 2 1日） [Gordon Research Conferen ce on Matrix Metal loproteinases (Andover, NH July 16 - 21, 1995)〕において、このものは新たに「MT— MMP— 3」と呼ぶべきものとされ、そこに於いて「MT— MMP_ 3」と呼称するとの合意がなされた (ザジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（The Journal of Biological Chemistry), Vol. 270， pp.23013-23020 (1995)) 。したがって、本 MT— MMP— 3は、特願平 7 - 2 0 0 3 1 9号並びに特願平 7 - 2 0 0 3 2 0号に記載の MT— MMP— 2と同一のものを指しているのである。

すなわち、本発明は新規なタンパク質、 MT— MMP— 3.及びその類縁体に関わるものである。さらに本発明は新規な MT— MMP— 3の全体又は一部をコードする DN A配列、このような DN A配列を有するベクタ一及びこのようなベクターで形質転換又はトランスフヱクションされた宿主細胞にも関する。さらに組換え MT— MM P— 3の製造法及びその用途も包含している。また MT— MMP_ 3に特異的に結合する抗体にも関する。別の観点からは上記の産物を用いた測定試薬、その試薬を用いた測定方法にも関する。特には、生体内及び生体外での MT— M MP— 3を測定する手法も提供される。

本発明は、潜在型 MM P— 2の活性化能を有する MM Pの一種であるが MT— MMP— 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の M T—MMPと実質的に同等な活性を有するタンパク質またはその塩、そのタンパク質の特徵的な部分べプチドまたはその塩、それらをコードする遺伝子、例えば DNA、 RNAなど、その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作することが可能なように含有しているべクタ一あるいはプラスミド、こうしたベクターなどで形質転換された宿主細胞、その宿主細胞を、培養して該タンパク質またはその塩を製造する方法、こうして得られた該タンパク質またはその塩やそのタンパク質の特徴的な部分べプチドまたはその塩を用いて得られた抗体、特にはモノクローナル抗体、その抗体を産生するハイプリドーマ細胞、該単離された遺伝子、例えば DNA、 RNAなどをプローブとして用いたり、あるいは該抗体を用いた測定診断手段に関する。

特には本発明は、潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種であるが MT— MMP— 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT— MMP_ 3と実質的に同等な活性を有するタンパク質またはその塩、そのタンパク質の特徴的な部分ペプチドまたはその塩、それらをコードする遺伝子、例えば D N A、 RNAなど、その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作することが可能なように含有しているべクタ一あるいはプラスミド、こうしたベクターなどで形質転換された宿主細胞、その宿主細胞を、培養して該タンパク質またはその塩を製造する方法、こうして得られた該タンパク質またはその塩やそのタンパク質の特徴的な部分べプチドまたはその塩を用いて得られた抗体、特にはモノクローナル抗体、その抗体を産生するハイプリドーマ細胞、該単離された遺伝子、例えば DNA、 RNAなどをプローブとして用いたり、あるいは該抗体を用いた測定診断手段に関する。

好ましくは、本発明では、配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同等のァミノ酸配列を有することを特徴とする MT— MMP— 3またはその塩が挙げられる。

本発明は、 ( 1 ) 潜在型 MM P— 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ M T-MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT— MMPと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質またはその塩、

(2) 該タンパク質が MT— MMP— 3またはその塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは実質的に同等の一次構造コンフオメーションを持つものであることを特徴とする上記第（1 ) 項記載のタンパク質、

(3) C末端領域に、配列表の配列番号： 2の A 1 a⁵⁶¹ 〜Ph e⁵⁸⁴ で表されるァミノ酸配列又はそれと実質的に同等のァミノ酸配列を有することを特徴とする上記第（1 ) 又は（2) 項記載のタンパク質、

(4) 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同等のァミノ酸配列を有する MT— MMP— 3またはその塩であることを特徴とする上記第（1)〜（3) 項のいずれか一記載のタンパク質、

( 5 ) 外因性 D N A配列を原核生物において発現して得たものである力、、あるいは真核生物で発現させて得たものであることを特徴とする上記第 ( 1 )〜（4) 項のいずれか一記載のタンパク質、

(6) 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする上記第（1)〜（5) 項のいずれか一記載のタンパク質、

(7) 上記第（1 )〜（6) 項のいずれか一記載のタンパク質の部分べプチドまたはその塩、

(8) 上記第（1)〜（7) 項のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドをコ一ドする塩基配列を有することを特徴とする核酸、

(9) 上記第（2)〜（4) 項のいずれか一記載の MT— MMP— 3をコードする塩基配列を有する DNA遺伝子であることを特徴とする上記第（ 8 ) 項記載の核酸、 (1 0) 配列表の配列番号： 1で表される塩基配列のうちオープンリーディングフレーム部分又はそれと実質的に同等な活性を有する塩基配列を有することを特徴とする上記第（8) 又は（9) 項記載の核酸、

(1 1) 上記第（8) 〜（1 0) 項のいずれか一記載の核酸を含有することを特徴とするベクター、

(1 2) 上記第（8) 〜（1 0) 項のいずれか一記載の核酸又は上記第 (1 1) 項記載のベクターを保有することを特徴とする形質転換体、

(1 3) 上記第（1 2) 項記載の形質転換体を増殖可能な栄養培地中で培養し、組換えタンパク質として MT— MMP— 3またはその塩を包含する上記第（1) 〜（6) 項のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドを生成せしめることを特徴とする MT— MMP— 3またはその塩を包含する上記第（1) 〜（6) 項のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドの製造方法、

(1 4) 潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ MT-MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT 一 MM Pと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩に対する抗体、

(1 5) MT— MMP— 3またはその塩と、実質的に同等な活性を有する力、、あるいは実質的に同等の一次構造コンフオメ一シヨンを持つものであるタンパク質に対する抗体であることを特徴とする上記第（1 4) 項記載の抗体、

(1 6) 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同等のァミノ酸配列を有する MT— MMP— 3又はその塩である夕ンパク質に対する抗体であることを特徴とする上記第（1 4) 又は（ 1 5) 項記載の抗体、

(1 7) 外因性 DN A配列を原核生物において発現して得たものである力、、あるいは真核生物で発現させて得たものであるタンパク質に対する抗体であることを特徴とする上記第（1 4) 〜（ 1 6) 項のいずれか一記載の抗体、

(1 8) 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする上記第（1 4) 〜（1 7) 項のいずれか一記載の抗体、

(1 9) タンパク質の部分ペプチド又はその塩に対する抗体であることを特徴とする上記第（1 4) 〜（1 8) 項のいずれか一記載の抗体、

(2 0) 抗血清であることを特徵とする上記第（1 4) ~ (1 9) 項のいずれか一記載の抗体、

(2 1 ) モノクローナル抗体であることを特徴とする上記第（1 4) 〜 (1 9) 項のいずれか一記載の抗体、

(2 2) MT-MMP- 3又はその塩に対するモノクロ一ナル抗体であることを特徴とする上記第（1 4) 〜（1 9) 及び（2 1 ) 項のいずれか一記載の抗体、

(2 3) 潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT-MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT 一 MM Pと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩を扰原として用い、それに対する抗体を得ることを特徴とする潜在型 MM P— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT— MMP— 1以外の潜在型 MMP— 2 活性化因子である天然の MT— MMPと実質的に同等な活性を有する夕ンパク質又はその部分べプチドに対する抗体の製造方法、

(2 4) 潜在型 MMP - 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT-MMP- 1以外の潜在型 MMP_ 2活性化因子である天然の MT 一 MMPと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩で免疫した動物から得られた、潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ M T-MMP- 1以外の潜在型 MM P - 2活性化因子である天然の MT— MM Pと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又はその部分べプチドに対する抗体を産生する細胞を、継代培養可能な細胞と融合せしめ、継代培養可能でかつ MT— MM P— 3を包含するタンパク質に対する抗体を産生するハイプリッド細胞を選別することを特徴とする上記第（2 1 ) 又は（2 2) 項記載の抗体の産生方法、

(2 5) 潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ MT-MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT 一 MMPと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩を試薬として用いるか、あるいは上記第（1 4) ~ (22) 項のいずれか一記載の抗体を試薬として用いることを特徴とする MT— MMP— 3の検出 ·測定方法、 (2 6) 上記第（2 5) 項の MT— MMP— 3の検出 ·測定方法に用いる標識化された MT— MMP— 3に対する抗体、

(2 7) 上記第（2 5) 項の MT— MMP— 3の検出 '測定方法に用いる潜在型 MM P— 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ MT— MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT— MM Pと実質的に同等な活性を有するタンパク質又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩であることを特徴とする標識化されたタンパク質あるいは部分べプチド又はその塩、

(2 8) MT— MMP— 3発現細胞あるいは組織の検出 ·測定方法に用、る潜在型 MM P一 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ M T -MMP- 1以外の潜在型 MM P— 2活性化因子である天然の MT— M MPと実質的に同等な活性を有するタンパク質又はその部分べプチドをコードすることを特徴とする標識化された核酸、及び

(2 9) ハイブリダィゼーション ·プローブであることを特徴とする上記第（2 8) 項記載の核酸を提供する。

特に本発明は、

(3 0) 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のァミノ酸配列を有することを特徴とする MT— MMP— 3またはその塩、

(3 1 ) 上記第（3 0) 項記載の MT— MMP— 3の部分べプチドまたはその塩、

(3 2) 上記第（3 0) 項記載の MT— MMP_ 3をコードする塩基配列を有する DN A遺伝子、

(3 3) 配列表の配列番号： 1で表される塩基配列を有する上記第（3 2) 項記載の DN A遺伝子、

(3 4) 上記第（3 2) 項記載の遺伝子を含有するべクタ一、

(3 5) 上記第（3 2) 項記載の遺伝子又は上記第（34) 項記載のベクタ一を保有する形質転換体、

(3 6) 上記第（3 5) 項記載の形質転換体を増殖可能な栄養培地中で培養し、組換えタンパク質として MT— MMP— 3またはその塩を生成せしめることを特徴とする MT— MMP— 3またはその塩の製造方法、 ( 3 7 ) 上記第（3 0) 項記載の MT— MMP— 3又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩を抗原として用い、それに対する抗体を得ることを特徴とする MT— MMP— 3に対する抗体の製造方法、

(3 8) 上記第（3 1) 項記載の MT— MMP— 3に対する抗体、

(3 9) 抗血清であることを特徴とする上記第（3 8) 項記載の MT— MM P— 3に対する抗体、

(4 0) モノクローナル抗体であることを特徴とする上記第（3 8) 項記載の MT— MMP— 3に対する抗体、

(4 1) 上記第（3 0) 項記載の MT— MMP— 3又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩で免疫した動物から得られた MT— MM P 一 3に対する抗体を産生する細胞を、継代培養可能な細胞と融合せしめ、継代培養可能でかつ MT— MM P— 3に対する抗体を産生するハイプリッド細胞を選別することを特徴とする上記第（4 0) 項記載の MT— M MP- 3に対するモノクロ一ナル抗体の産生方法、

(4 2) 上記第（3 0) 項記載の MT— MMP— 3又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩を試薬として用いるか、あるいは上記第 (3 8) 項記載の MT— MMP— 3に対する抗体を試薬として用いることを特徴とする MT— MMP— 3の検出 ·測定方法、

(4 3) 上記第（4 2) 項記載の MT— MMP— 3の検出 '測定方法に用いる標識化された MT— MMP— 3又はその塩あるいはその部分ぺプチド又はその塩、及び

(4 4) 上記第（4 2) 項記載の MT— MMP— 3の検出 '測定方法に用いる標識化された MT— MMP— 3に対する抗体を提供する。図面の簡単な説明

図 1 A〜Eは、本発明の MT— MMP— 3のアミノ酸配列と既知の M M Pファミリ— （MM P— 1、 MMP - 2、 MMP— 3、 MMP— 7、 MMP— 8、 MMP- 1 0、 MMP— 1 1及び MT— MMP— 1 ) のァミノ酸配列との相同性を比較し、ドメイン構造を示した図である。アミノ酸の表記は一般的な一文字表記に従い、プレ型の N末端をァミノ酸 1 位として番号を付した。

図 2は、ノ一ザンブロット分析の結果の電気泳動写真を示す。

A：ノーザンブロット分析による各種ヒト組織中での MT— MMP— 3mRNAの発現を調べた結果を示したものである。

B ：ノーザンブロット分析による各種ヒト培養癌細胞中での MT— M MP— 3 mRNAの発現を調べた結果を示したものである。

図 3は、 MT— MMP— 3 cDNAを COS— 1細胞中で発現させ、 MT-MMP- 3タンパク質を免疫沈殿法によりセルライゼ一卜及びコンディション培地中より検出した結果の電気泳動写真を示したものである。 MT— MMP— 3タンパク質（6 4 kD a)、 T I MP— 1タンパク質（2 8 kDa) の位置をそれぞれ▲、 △で示した。

図 4は、 MT— MMP— 3の C末端の疎水性アミノ酸の連続配列がトランスメンブレンドメインとして機能していることを、 T I MP— 1/ 疎水性ァミノ酸の連続配列の融合タンパク質を作製して検討した結果の電気泳動写真を示す。

A ：遺伝子工学的に作製した融合タンパク質を COS— 1細胞中で発現させ、セルライゼ一トとコンディシヨン培地中より検出した結果を電気泳動写真で示したものである。

図 5は、 MT— MMP— 3の C末端の疎水性ァミノ酸の連続配列がトランスメンブレンドメインとして機能していることを、 T I MP— 1 Z 疎水性ァミノ酸の連続配列の融合タンパク質を作製して検討した結果を生物の形態を示す写真として示す。

B ： C 0 S— 1細胞中で発現させた T I MP— 1 Z疎水性ァミノ酸の連続配列の融合タンパク質を免疫蛍光染色により検出した結果を生物の形態を示す写真で示したものである。

図 6は、 MT— MMP— 3の発現による潜在型 MMP— 2の活性化の様子をザィモグラフィ一の結果の電気泳動写真で示す。

A： MT-MMP- 3 c D N A及び潜在型 MM P— 2 c DNAをコトランスフヱクシヨンした COS— 1細胞中での潜在型 MM P— 2の活性化を示した電気泳動写真である。

B： MT— MMP— 3 c DNAをトランスフエクシヨンした HT 1 0 8 0細胞中での潜在型 MMP— 2の活性化及びこの潜在型 MMP— 2 の活性化に及ぼす T I MP— 1、 T I MP— 2の影響を示した電気泳動写真である。発明を実施するための最良の形態

潜在型 MM P— 2の活性化能を有する MM Pの一種であるが M T— M MP— 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT— MM P (例えば、 MT— MMP— 3) と実質的に同等な活性を有するタンパク質またはその塩、そのタンパク質の特徴的な部分べプチドまたはその塩、それらをコードする遺伝子、例えば DNA、 RNAなど、その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作することが可能なように含有しているベクターあるいはプラスミド、こうしたベクタ一などで形質転換された宿主細胞、その宿主細胞を、培養して該タンパク質またはその塩を製造する方法、こうして得られた該タンパク質またはその塩やそのタンパク質の特徴的な部分べプチドまたはその塩を用いて得られた抗体、特にはモノクロ一ナル抗体、その抗体を産生するハイプリドーマ細胞、該単離された遺伝子、例えば DNA、 RNAなどをプローブとして用いたり、あるいは該抗体を用いた測定診断手段が提供される。

より具体的には、本発明は配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする MT— MM P— 3またはその塩を提供する。本発明の MT— MMP— 3としては、潜在型 MM P— 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ MT— MM P— 1以外であって潜在型 MM P— 2活性化能を有することを特徴とし潜在型 MM P一活性化因子でかつ新規なアミノ酸配列を有するものであればよい。より好ましくは本発明の MT— MMP— 3としては、配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するものがすべて挙げられる。さらに本発明の MT— MMP— 3としては、プレ部分として配列中のァミノ酸番号 1位の Me tから 2 1位の P h eまでのァミノ酸配列の一部または全部を有していてもよく、プロ部分としてアミノ酸番号 2 2位の P h eから 1 1 9位の A r gまでのァミノ酸配列の一部または全部を有していてもよい。こうした配列を有するものはすべて包含されてよい。

本発明の MT— MMP— 3は、配列表の配列番号： 1で表される塩基配列の 1 1 3から 1 1 5位の AT Gから 1 9 2 2から 1 9 2 4位の GT Gより構成される塩基配列にコードされるもの（ 1 9 2 5から 1 9 27 位の終止コドン TGAは、 TAAまたは TAGでも有りうる）であることができるし、また、該塩基配列と相同性を有するが、 MT— MMP— 1以外の配列を持ち且つ潜在型 MM P— 2の活性化能を有するといったそれと同効の塩基配列を含有する DN A配列でコードされるものであることができる。該 MT— MMP— 3の塩基配列は、修飾（例えば、付加、除去、置換など）されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。

配列表の配列番号： 1で表される塩基配列またはそれと同効の塩基配列を含有する本発明の DNAは、例えば以下に示す方法によって取得した。なお、遺伝子組換え技術は、例えば T. Maniatis et al. , "Molecular Cloning", 2nd Ed.， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Ha rbor, N. T. (1989)；日本生化学会編、「続生化学実験講座 1、遺伝子研究法 I I」、東京化学同人（ 1 9 8 6 ) ；日本生化学会編、「新生化学実験講座 2、核酸 I I I (組換え DN A技術）」、東京化学同人（1 9 9 2 ) ； R. Wu ed. , "Methods in Enzymology， Vol. 68, Academic Press, New York (1980) ； R. Wu et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 100 & 101, Academic Press, New York (1983) ； R. Wu et al. e d. , "Methods in Enzymology", Vol. 153， 154 & 155, Academic Press, New York (1987) などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。

種々のヒト組織（胎盤、口腔癌、肺癌等）あるいは培養細胞（ヒト線維肉腫細胞 HT 1 0 8 0、ヒト単球性白血病細胞 U 9 3 7等) から mR N Aを単離する。特に好適にヒトロ腔癌細胞より mRN Aを単離できる。 mRN Aの単離は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、 T. Maniatis et al., "Mole cular Cloning", 2nd Ed. , Chapter 7, Cold Spring Harbor Laborator y， Cold Spring Harbor, N. T. (1989); L. Grossman et al. ed. , "Me thods in Enzymology", Vol. 12, Part A & B, Academic Press, New Y ork (1968)； S. L. Berger et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vo 1. 152, p.33 k p.215， Academic Press, New York (1987) (Biochemist ry, 18， 5294-5299, 1979 などに記載の方法、例えばグァニジン一塩化セシゥム法、チオシァン酸グァニジン法、フヱノール法などの方法で行うことが出来る。必要に応じ、得られた全 RNAはオリゴ（dT) —セルロースカラムなどを使用して精製してポリ（A) · mRNAを得ることが出来る。この mRNA及び逆転写酵素を用いて c DN Aを作製する。 m R N A及び逆転写酵素を用いての c D N A合成は当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、 H. Land et al. , "Nucleic Acids Res.", Vol. 9， 2251 (1981); U. Gubler et al. , "Gene", Vol. 25, 263-269 (1983); S. L. Berger et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 152, p.307, Academic Press, New York (1987) などに記載の方法が挙げられる。

こうして作製された c DNAを基に c DNAライブラリーを構築できる。またファージベクターを使用する以外で、大腸菌などの宿主細胞の形質転換をするには、例えばカルシウム法、ルビジウム Zカルシウム法など当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができる（D. Hanahan, J. Mol. Biol., Vol. 166, p.557 (1983) など）。さらに市販の種々ヒト組織由来 c D N Aライブラリ一（例えば、 CLONTECHなどより入手可能）を直接使用することもできる。作製された cDNAを铸型に PCR増幅反応を行う。典型的な場合、既知の MMPファミリーのアミノ酸配列から選択した、高度に保存されているアミノ酸配列を基に、デジヱネレイテツド 'プライマ一を作製する。プライマーの作製は、当該分野で知られた方法で行うことができ、例えば DNA自動合成装置を用い、フォスフォジエステル法、フォスフォトリエステル法、フォスフォアミグイト法などにより合成できる。このプライマーと上記作製した c DNAとを用い、 PCRを行う。 PCR反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる力く、例えば R. Saiki, et al. , Science, Vol. 230, pp. 1350 (1985); R. Saiki, et al. , Science, Vol. 239， pp. 487 (1985)； P CRテクノロジ一（PCR Technology) ，ストックトンプレス（Stockton Press) などに記載された方法に従って行うことができ o

得られた P C R産物をクロ一ニングし、得られた P C R産物の塩基配列を決定し、新規な MM P遺伝子配列を有する DN A断片を取得する。塩基配列の決定は、ダイデォキシ法、例えば M l 3ダイデォキシ法など、 Maxam-Gilbert 法などを用いて行うことができる力市販のシークェンシングキット、例えば Taqダイプライマーサイクルシークェンシングキットなどを用いたり、自動塩基配列決定装置、例えば蛍光 DN Aシーケンサー装置などを用いて行うことが出来る。特にはこの DNA断片をプローブに種々のヒト組織（胎盤、口腔癌、肺癌等）あるいは培養細胞

(ヒト線維肉腫細胞 HT 1 08 0、ヒト単球性白血病細胞 U 9 3 7等）から構築された c DN Aライブラリーをスクリーニングし、塩基配列の決定から目的とする DNAを単離することができる。好ましくは胎盤 c DNAライブラリ一をスクリ一ニングし、塩基配列の決定をして目的とする DNAを単離する。なお、プローブなどを放射性同位体などによつて標識するには、市販の標識キット、例えばランダムプライムド DNA ラベリングキット（Boehringer Mannhaim)などを使用して行うことが出朱る。

以下にさらに詳細に記述する。

本発明者らは、既知の MMPファミリ一の触媒ドメィン中から選択した高度に保存されているァミノ酸配列 GE AD I LV及び GDAHFD DDEを基に、次の配列を有する 5' プライマ一、

5 P- 4 配列番号： 3

S G N V V N G C WG A Y A TMR T S A T

(配列中、 8 =(：又は0、 N = A又は C又は G又は T、 V = A又は C又は G、 W=A又は T、 Υ二 C又は Τ、 Μ=Α又は C、 R = A又は Gのそれぞれのミックスド ·ベースを示す）

及び次の配列を有する 3' プライマ一、

3 P - 2 配列番号： 4

^TCRTSNTCRT

(配列中、 Y = C又は T、 R = A又は G、 S = C又は G、 N = A又は C 又は G又は T、 Η二 Α又は C又は Τのそれぞれのミックスドベースを示す）を設計、合成した。なお、上記の配列のうち、 S、 N、 V、 W、 Y、 Μ、 R及び Ηはそこに複数の塩基を導入すること、そしてその結果マルチプルなヌクレオチド配列を生ずることを示している。

ブライマ一は MM Pファミリ一に特徴的な領域のァミノ酸配列に基づいてデザインし、合成し、使用することが出来る。

これらのプライマーとヒトロ腔癌細胞から調製した c DNAライブラリ一を用い、 PCR反応を行った。プライマーのデザインから予想されるサイズ（9 0から 1 2 0 b. p. ) を持つところの得られた P CR産物をサブクローニングし、塩基配列を決定した結果、 MMP— 1、 MM P— 9と同一な配列を持つ P C R産物以外に、既知の MM Pと相同性を有する力く、配列が新規な 9 3 b. p. の DNA断片を得た。

同様にこれらプライマーと各種のヒト細胞由来の c DNAライブラリ一を用いて、 MMP— 1、 MMP— 9と同一な配列を持つ P CR産物以外に、既知の MMPと相同性を有するが、配列が新規な P CR産物を検索することもできる。

この 9 3 b. p. DNA断片をプローブとして、ヒト胎盤 cDNAライブラリーのスクリーニングを行い、 2. 1 k bの DNA断片が得られた。この断片の塩基配列の決定から配列表の配列番号： 1で表される塩基配列が得られた。

配列表の配列番号： 1で表される塩基配列と同一の配列は、 GENE

BANK/EMBL DNA D a t a B a s e中には存在せず、この塩基配列を有する D N Aは全く新規なものであることが認められた。配列表の配列番号： 1で表される塩基配列を有する上記のクローンの塩基配列は、 3，非翻訳配列と共に推定 6 04個のアミノ酸残基をコードするオープンリ一ディングフレームを有していた。開始コドンのすぐ下流から推定されるシグナル配列が続き、 C末端のアミノ酸番号 5 6 1 から 5 8 4に 2 4個の疎水性アミノ酸の連続した膜結合型タンパク質に特徴的な疎水性領域の存在が認められた。こうして得られた新規 MMP を「MT— MMP— 3」と命名した（本発明者等は当初 MT— MMP— 2と呼称した（平成 7年 7月 1 4日日本国出願の特願平 7 - 2 0 0 3 1 9号並びに特願平 7— 2 0 0 3 2 0号）力く、ゴ一ドンリサーチコンファレンスオンマトリックスメタ口プロテア一ゼズ（アンドーバーェヌェイチ 1 9 9 5年 7月 1 6— 2 1 日） [Gordon Research Conf erence on Matrix Metal loproteinases (Andover, NH July 16 - 21, 199 5)〕の会合での合意に基づいて新たに MT— MMP— 3と呼ぶことになつた）。

MT— MMP— 3遺伝子産物の確認を、 MT— MMP— 3遺伝子をトランスフエクシヨンした COS— 1細胞などの適した動物細胞などを用いて行った。この外来遺伝子を哺乳動物などの動物細胞に導入する方法としては当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができ、例えばリン酸カルシゥム法（例えば、 F. L. Graham et al.， "Virology", Vol. 52, pp.456 (1973)など) 、 DEAE—デキストラン法（例えば、 D. Warden et al., "J. Gen. Virol.", Vol. 3, pp.371 (1968) など）、エレクトロポレーシヨン法（例えば、 E. Neuma nn et al., "EMB0 J", Vol. 1， pp.841 (1982)など）、マイクロインジヱクション法、リボソーム法、ウイルス感染法、ファージ粒子法などが挙げられる。こうして MT— MMP— 3遺伝子をトランスフヱクションされた動物細胞の産生する遺伝子産物を抗 MT— MM P— 3モノクロ一ナル抗体を用いた免疫沈降実験で解析した結果、細胞溶解物から 6 4 k D aのタンパク質が免疫沈降されたのに対し、培養上清からは相当するタンパク質は検出されなかった。すなわち、 MT— MMP— 3遺伝子産物は分泌されることなく、細胞表層上で発現していることが示唆された。図 1 A〜Eに示すように既知の MMPファミリ一のァミノ酸配列との相同性を調査した結果、 MT— MMP— 3は既知の MMPファミリ一と高い相同性を示した。 MMPフアミリーで保存されている前駆体と成熟体のプロセッシング部位近傍の配列、および活性部位の配列は M T— M MP— 3中で最も良好に保存されていた。また、 MMPの 1次構造上の特徴であるプロペプチドドメイン、 Zn 結合触媒ドメイン、プロリンに富んだヒンジドメイン、 C一末端のへモぺキシン凝血酵素様ドメインは良好に保存されていた。

さらに MT— MMP— 3では、 MT— MMP— 1 (先に本発明者らが単離同定した MT— MMPはその区別をなすため「MT— MMP— 1」と命名し直した）と同じく C末端領域に疎水性アミノ酸の連続した配列が存在することから、膜結合型の MMPであることが示唆された。このような疎水性ァミノ酸の連続した配列は、他の MMPファミリ一には存在しない。実際、遺伝子工学的にこの疎水性アミノ酸の連続配列を分泌タンパク質と融合させた融合タンパク質を作成し培養細胞で発現させたところ、融合タンパク質の分泌は抑えられ細胞膜上で発現したことから、この疎水性ァミノ酸の連続配列がトランスメンブレン ' ドメインとして機能していることが示された。

したがって、 MT— MMP— 3遺伝子は、新規な MM Pタンパク質をコードしていることは明白であり、 MT— MMP— 3遺伝子を用いて作製した組換え体プラスミドは全て新規な組換え体であり、そのプラスミドで形質転換あるいはトランスフクトされ得られた形質転換体ある、はトランスフヱクタントも新規なものである。

MT— MMP— 3遺伝子を組込むプラスミドとしては遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、 C HO細胞等の真核細胞宿主、 S f 2 1等の昆虫細胞宿主）中で該 DN Aが発現できるプラスミドであればどのようなプラスミドでもよい。こうした配列内には、例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適なコドンが導入されていることができるし、制限酵素部位が設けられていることもできるし、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御配列、促進配列など、目的とする遺伝子を結合するのに役立つリンカ一、ァダプターなど、さらには抗生物質耐性などを制御したり、代謝を制御したりし、選別などに有用な配列等を含んでいることができる。

好ましくは、適当なプロモータ一、例えば大腸菌を宿主とするプラスミドでは、トリプトファン（ t r p) プロモータ一、ラクト一ス（ 1 a c ) プロモータ一、トリプトフアン ' ラクトース（t a c) プロモータ一、リポプロテイン（ 1 p p) プロモータ一、スファージ PLプロモ一ター等を、動物細胞を宿主とするプラスミドでは、 SV 4 0レートプロモーター、 MMTV LTRプロモータ一、 RSV LTRプロモータ ―、 CMVプロモータ一、 SRaプロモーター等を、酵母を宿主とするプラスミドでは、 GAL 1、 G AL 1 0プロモータ一等を使用し得る。大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、例えば pBR 3 2 2、 pU C 1 8、 pUC 1 9、 pUC 1 1 8, pUC 1 1 9、 p S P 6 4、 p S P 6 5、 p TZ— 1 8 R ー 1 8 U、 p T Z— 1 9 R/— 1 9 U、 p G EM— 3、 pGEM - 4、 pGEM— 3 Z、 pGEM— 4 Z、 pGEM - 5 Z f (―) 、 p B l u e s c r i p t K S™ (Stratagene) などが挙げられる。大腸菌での発現に適したプラスミドベクタ一としては、 pAS、 p KK 2 23 (Pharmacia), pMC 1 4 03 , pMC 9 3 Κ PKC 3 0なども挙げられる。動物細胞を宿主とするプラスミドとしては、 S V 4 0ベクター、ポリォ一マ · ウィルスベクター、ヮクシニア · ウィルスベクタ一、レトロウイルスベクタ一などが挙げられ、例えば p cD、 p cD - SRひ、 CDM8、 p CEV4、 pME 1 8 S、 p B C 1 2 B I、 p SG 5 (Stratagene) などが挙げられる。酵母を宿主とするプラスミドとしては、 Y i p型ベクター、 YEp型べクタ一、 YRp 型ベクター、 YC p型ベクターなどが挙げられ、例えば pGPD— 2などが挙げられる。宿主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例えば大腸菌 K 1 2株に由来するものが挙げられ、例えば NM 5 3 3 XL 1 一 B l u e、 C 6 0 0、 DH 1、 HB 1 0 K JM1 0 9などが挙げられる。宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリカミドリザル線維芽細胞由来の COS 7細胞、 COS— 1細胞、 CV— 1細胞、マウス線維芽細胞由来の C〇P細胞、 MOP細胞、 WOP細胞、チャイニーズ ·ハムス夕一細胞由来の CHO細胞、 CHO DHFR 細胞、ヒト He L a 細胞、マウス細胞由来 C 1 2 7細胞、マウス細胞由来 N I H 3 T 3細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては、カイコ核多角体病ウィルス (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) をベクターとし、カイコ幼虫あるいはカイコ培養細胞、例えば BM— N細胞などを用いることが挙げられる。

本発明の遺伝子工学的手法においては、当該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆転写酵素、 DNA断片をクローン化するのに適した構造に修飾したりあるいは変換するための酵素である D N A修飾 '分解酵素、 DNAポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルトランスフエラーゼ、 DN Aリガーゼなどを用いることが出来る。制限酵素としては、例えば、 R. J. Roberts, Nucleic Acids Res, Vol. 13， rl65 (1985); S. Linn et al. ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor し ab.， C old Spring Harbor, New York, 1982 などに記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、例えばマウスモロネィ白血病ウィルス（mouse Mo loney leukemia virus； MMLV) 由釆の逆転写酵素 ^reverse transcript ase)、ニヮ卜リ骨髓芽球症ウイノレス (avian myeloblastosis virus; AM V)由来の逆転写酵素などが挙げられ、特には RNase H 欠損体などは好ましく用いることが出来る。 DN Aポリメラ一ゼとしては、例えば大腸菌 DNAポリメラ一ゼ、その誘導体であるクレノウ · フラグメント、大腸菌ファージ T 4 DNAポリメラ一ゼ、大腸菌ファージ T 7 DNAポリメラーゼ、耐熱菌 DN Aポリメラ一ゼなどが挙げられる。末端ヌクレォチジルトランスフェラ一ゼとしては、例えば R. Wu et al. ed. , "Met hods in Enzymology", Vol. 100, p. 96, Academic Press, New York (1983) に記載の 3' —OH末端にデォキシヌクレオチド（d NMP) を付加する T d T a s eなどが挙げられる。 DNA修飾 ·分解酵素としては、ェキソヌクレア一ゼ、エンドヌクレアーゼなどが挙げられ、例えばへビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、大腸菌 D N Aェキソヌクレアーゼ I、大腸菌 DN Aェキソヌクレア一ゼ I I I、大腸菌 DN Aェキソヌクレア一ゼ V I I、スェキソヌクレア一ゼ、 DN a s e I、ヌクレア一ゼ S I、ミクロコッカス（Mi crococcus) ヌクレアーゼなどが挙げられる。 DN Aリガーゼとしては、例えば大腸菌 D N Aリガーゼ、 T 4 D N Aリガーゼなどが挙げられる。

DN A遺伝子をクローニングして DN Aライブラリ一を構築するのに適したベクタ一としては、プラスミド、スファージ、コスミド、 P 1ファージ、 F因子、 YACなどが挙げられ、好ましくはスファージ由来のベクタ一が挙げられ、例えば C h a r 0 n 4 A. C h a r o n 2 1 A、ス g t l O、 λ g t 1 K ス DA SH I I、 λ F I X I λ ΕΜ B L 3、 λ Z AP I Γ^Μ (Stratagene) などが挙げられる。

さらに、本発明に係わる MT— MMP— 3の遺伝子塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いることにより、 MT— MMP— 3のアミノ酸配列中に適宜、 1個ないし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入した相当するタンパク質を製造することができる。こうした変異 ·変換 ·修飾法としては、日本生化学会編、「続生化学実験講座 1、遺伝子研究法 I I」、 p 1 0 5 (広瀬進）、東京化学同人（ 1 9 8 6 ) ；日本生化学会編、「新生化学実験講座 2、核酸 I I I (組換え DNA技術）」、 p 2 3 3 (広瀬進）、東京化学同人（ 1 9 9 2 ) ； . Wu, L. Grossman, ed. , "Methods in E nzymology ， Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, New York (1987) ； R. Wu, L. Grossman, ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 1 00， p. 457 & p. 468, Academic Press, New York (1983) ； J. A. Wells et al.， "Gene", Vol. 34， p. 315 (1985) ； T. Grundstroem et al.， "Nucleic Acids Res", Vol. 13， p. 3305 (1985) ； J. Taylor et al. , "Nucleic Acids Resノ，， Vol. 13， p. 8765 (1985) ； R. Wu ed. , "Meth ods in Enzymology， Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York (1987) ； A. R. Oliphant et al., "Gene", Vol. 44, p. 177 (1986) などに記載の方法が挙げられる。例えば合成ォリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、 Kunkel 法、 dNTP[aS]法（Eckstein) 法、亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。さらに得られた本発明のタンパク質は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ぺプチグーゼ、例えばペプシン、キモトリブシン、パパイン、ブロメライン、エンドべプチダーゼ、ェキソぺプチダーゼなどの酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体などにすることができる。また遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然の MT— MMP— 3と実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換 ·加工してもよい。遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してァフィ二ティクロマトグラフィ一などで精製することも可能である。タンパク質の構造の修飾 ·改変などは、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座 1、タンパク質 V I I、タンパク質工学」、東京化学同人（ 1 9 9 3 ) を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。また下記するようにその生物学的活性のうちには、免疫的に活性、例えば抗原性を有するということも含まれてよい。

かくして本発明は、 1個以上のァミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、 1個以上のァミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。本発明は、 M T— MM P— 3に特有なアミノ酸残基が 1個以上（例えば、 1〜 8 0個、好ましくは 1〜 6 0個、さらに好ましくは 1〜4 0個、さらに好ましくは 1〜 2 0個、特には 1〜 1 0個など）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の 1個以上（例えば、 1〜 8 0個、好ましくは 1〜 6 0個、さらに好ましくは 1〜 4 0個、さらに好ましくは 1〜 2 0個、特には 1〜 1 0個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、 1個以上（例えば、 1〜8 0個、好ましくは 1 〜6 0個、さらに好ましくは 1〜4 0個、さらに好ましくは 1〜2 0個、特には 1〜1 0個など）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。 MM Pの共通の特徴であるドメィン構造や C末端のトランスメンブレンドメイン構造が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含される。また本発明の M T— MM P— 3は天然の M T - MM P - 3と実質的に同等の一次構造コンフオメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然の M T - MM P - 3と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。こうした本発明の M T— MM P— 3は、下記で説明するように分離 ·'精製処理されることができる。

こうして得られた本発明の潜在型 MM P— 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ MT— MM P— 1以外の潜在型 MM P— 2活性化因子である天然の MT— MMP (特には、 MT— MMP— 3) と実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質またはその塩、あるいはその部分べプチドは、それを用いて酵素阻害剤の開発や探索などの研究、医薬品の開発研究、 MT— MMP— 3が関与すると考えられる生物的な現象や反応の研究を行うことができるし、さらにはそれに対する抗体を作成するのに用いることができるし、特定の分析ある、は測定対象物を調査研究するのに使用することもできる。

一方では、こうして本発明は上記したポリべプチドをコ一ドする DN A配列、そして天然の特性の全部ある L、は一部を有する MT— MM P _ 3のポリべプチド、さらにその類縁体あるいは誘導体をコードする DN A配列も包含する。

本発明の DN A配列は、これまで知られていなかった哺乳動物のタンパク質のアミノ酸配列に関する情報を提供しているから、こうした情報を利用することも本発明に包含される。こうした利用としては、例えば MT— MMP— 3及び関連タンパク質をコードする哺乳動物、特に好ましくはヒ卜の、ゲノム DN A及び c DNAの単離及び検知のためのプロ一ブの設計などが挙げられる。

本発明の DN A配列は、例えば MT— MMP— 3及び関連タンパク質をコードする哺乳動物、特に好ましくはヒトの、ゲノム DNA及び cD

NAの単離及び検知のためのプローブとして有用である。遺伝子の単離にあたっては、 PCR法、さらには逆転写酵素（RT) を用いた PCR 法（RT— PCR) を利用することが出来る。 MT— MMP— 3 c D N A及びその関連 DNAは、クローニングされ、配列決定された MT— MMP— 3 c DNA配列から推定されるアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、 DN Aプライマーをデザインして化学合成し、得られた DN Aプライマ一を用いて、 PCR法、 RT— PCR、その他の方法を用いて MT— MMP— 3関連遺伝子の単離、検出などに利用することが出来る。

MT-MMP- 3が MT— MMP— 1の構造的特徴を良好に保存していたことから、 MT— MMP— 3も潜在型 MMP— 2の活性化因子として作用する可能性が想定される。そこで、 COS— 1細胞などの哺乳動物細胞に潜在型 MMP— 2の発現プラスミド及び MT— MM P— 3の発現プラスミドをコトランスフヱクシヨンし、回収された培養上清を用いてザィモグラフィ一を行った。その結果、本来、分子量 6 8 kDaに検出される潜在型 MMP— 2以外に、 6 2 kD aの活性型 MMP— 2及び 6 4 k D aの活性中間体が検出され、 MT— MMP— 3の発現に依存した潜在型 MM P— 2の活性化が観察された。

MT-MMP- 3 mRNAのヒト組織中での発現を各種の組織由来

P o l y (A) RNAに対するノーザンプロット分析により検討した。その結果、ヒト肺、脳、胎盤で高い発現が認められたが、心臓、腎臓、肝臓、脖臓、筋肉組織では検出されなかった。本発明者らの研究では、 MT-MMP- 1 mRNAの発現は肺、腎臓、胎盤で顕著に高いのに対し、脳では最も低かった。これらのことは、 MT— MMP— 3は、 M T-MMP- 1とは構造的にも潜在型 MMP— 2の活性化能という機能的にも非常に類似しているが、実際の組織中での遺伝子発現は異なる制御を受けていることを示している。本発明の c DNAをプローブとして用いれば、例えばノーザン ·ブロティング、サザン ·ブロティング、 i n s i t uハイブリダィゼーシヨンなどによりヒト組織中での MT— MMP- 3 mRNAの発現や MT— MMP— 3遺伝子自体などを検出 •測定でき、ひいては癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診断治療、またアルツハイマー病の診断等の研究に応用できる。

以上述べた、本発明者らの研究成果により MT— MMP— 3の遺伝子及び組換え DNA分子を宿主に移入し、 MT— MMP— 3を発現させ、目的とする MT— MMPを得る方法が提供される。こうして本発明によれば、 MT— MMP— 3の遺伝子を実質的に発現する組換え体あるいはトランスフニクタント及びその製造法、さらにはその用途も提供される。別の面では、本発明は潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT— MMP - 1以外の潜在型 MMP - 2活性化因子である天然の MT— MM Pと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質またはその塩、より好ましくは MT— MMP— 3またはその塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは実質的に同等の一次構造コンフオメーションを持つ該タンパク質の少なくとも一部あるいは全部を有するポリべプチドを、大腸菌などの原核生物あるいは哺乳動物細胞などの真核生物で発現させることを可能にする D N Aや R N Aなどの核酸に関するとすることができる。またこうした核酸、特には DNA は、（a) 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコ一ドできる配列あるいはそれと相補的な配列、（b) 該（a) の DNA配列またはその断片とハイブリダィズすることのできる配列、及び（c) 該（a) 又は（b) の配列にハイブリダィズすることのできる縮重コードを持つた配列であることができる。こうした核酸で形質転換され、本発明の該ポリべプチドを発現できる大腸菌などの原核生物あるいは哺乳動物細胞などの真核生物も本発明の特徵をなす。

さらに、本発明では、本発明に係わる MT— MMP— 3と特異的に結合するモノクローナル抗体などの抗体が提供される。本発明に係わるモノクロ一ナル抗体などの抗体により、癌の診断はもとより癌の浸潤、転移に係わる研究に有用な研究手段、さらにはアルツハイマー病の発症機作や診断方法に係わる研究に有用な研究手段が提供される。本発明に係わるモノクローナル抗体などの抗体は、本発明により得られるヒト MT 一 MM P— 3を免疫原として公知の方法で動物を免疫したり、当該分野で知られたあるいは汎用されている方法、例えばミルシュタインらの方法（Na t u r e, 2 5 6 : 4 9 5〜4 9 7， 1 9 7 5 ) により製造することができる。この方法において、免疫原としては天然型 MT— MM P— 3、リコンビナントヒト MT— MMP— 3及び連続した少なくとも 8個のァミノ酸からなる MT— MMP— 3の一部のァミノ酸配列を有する合成べプチド等の何れでも使用することができる。さらに該モノク口 —ナル抗体は、常用される方法によって適宜標識することができる。標識としては、酵素、補欠分子類、色素物質、蛍光物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、放射性物質等を使用することができる。以下抗体の作製につき詳しく説明する。

本発明で使用されるモノクローナル抗体は、ミエロ一マ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られたモノクロ一ナル抗体であってよいことはいうまでもない。本発明で使用されるモノクローナル抗体は、例えば次のような工程で作製できる。

1. 免疫原性抗原の調製

2. 免疫原性抗原による動物の免疫

3. ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製

4. 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合

5. ハイプリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化

6. モノクローナル抗体の製造

1. 免疫原性抗原の調製抗原としては、例えば天然由来の M T— MM P— 3、本発明の方法に従い調製したリコンビナント M T— MM P— 3を用いることができる。 M T— MM P— 3は、さらに免疫原性コンジユゲートなどにしてもよい力 \ そのまま適当なアジュバン卜と混合して動物を免疫するのに使用できる。こうした抗原は、各種原料、例えば培養細胞、培養組織など、形質転換体細胞などの抗原産生材料から従来公知の方法、例えば硫酸ァンモニゥム沈殿法などの塩析、セフアデックスなどによるゲルろ過法、例えばジェチルァミノエチル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル基、ォクチル基、フユニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィ一法、色素ゲルクロマトグラフィ一法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、ァフィ二ティ · クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィ一法などにより精製して得ることができる。好ましくは、ポリァクリルァミド電気泳動、モノクローナル抗体などの抗原を特異的に認識する抗体などを固定化したァフィ二ティー · クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。例えば、ゼラチンーァガロース · ァフィニティ一 ' クロマトグラフィー、へパリン一ァガロース · クロマトグラフィ一などが挙げられる。さらに M T— MM P— 3は、それを断片化したもの、あるいはクロ一ニングされ、配列決定された c D N A配列から推定されるアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、ポリべプチドをデザィンして化学合成し、得られた合成ポリべプチド断片であってもよく、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体夕ンパク質類と結合させてハプテン一タンパク質の如き免疫原性コンジユゲートとし、これを用いて特定の配列のみを認識できるモノクローナル抗体をデザィンするのに用いることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシスティン残基などを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにしておくことができる。担体タンパク質類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず活性化されることができる。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入することが挙げられる。

活性化結合基としては、（ 1 ) 活性化エステルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロフヱニルエステル基、ペン夕フルオロフヱニルエステル基、 1 一べンゾトリアゾールエステル基、 N—スクシンィミドエステル基など、（ 2 ) 活性化ジチォ基、例えば 2—ピリジルジチォ基などが挙げられる。担体タンパク質類としては、キーホール ' リンぺット 'へモシァニン（K L H ) . 牛血清アルブミン（B S A) 、卵白アルブミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリぺプタイド、細菌菌体成分、例えば B C Gなどが挙げられる。

2 . 免疫原性抗原による動物の免疫

動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学講座 1 4、免疫生物学、丸善株式会社、昭和 6 0年、日本生化学会編、続生化学実験講座 5、免疫生化学研究法、東京化学同人、 1 9 8 6年、日本生化学会編、新生化学実験講座 1 2、分子免疫学 Ι Π、抗原，抗体 ·補体、東京化学同人、 1 9 9 2年などに記載の方法に準じて行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ（R i b i ) アジュバン卜、百日咳ワクチン、 B C G、リピッド A、リボソーム、水酸化アルミニゥム、シリカなどが挙げられる。免疫は、例えば B A L B Z cなどのマウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の投与量は、例えばマウスに対して約 1〜4 0 0 Z/ g Z動物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後 1〜4 週間おきに、好ましくは 1〜2週間ごとに腹腔内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を 2〜1 0回程度反復して行う。免疫用のマウスとしては B AL B/c系マウスの他、 B AL BZc系マウスと他系マウスとの F 1 マウスなどを用いることもできる。

必要に応じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫の程度を確認できる。一方では、本発明に従えばリコンビナント MT— MM P— 3を用い、 MT— MMP— 3に対するポリクロ一ナル抗体及びその製造にも関する。こうした場合、使用される動物としては、哺乳動物や鳥類などが利用できる力 \ 例えばゥシ、ゥマ、ャギ、ヒッジ、ブタ、ゥサギ、マウス、ラット、モルモット、サル、ィヌ、ネコ、ニヮトリなどが挙げられる。抗体は抗血清であってもよく、より精製されたものであつてもよく、例えばその単離精製は下記モノクローナル抗体と同様にして行うことができる。

3. ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製

細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）としては免疫グロブリンを産生しな、細胞株から選ぶことができ、例えば P 3— N S— 1 - A g 4 - 1 (N S - 1 , Eur. J. Immunology, 6, 511〜519， 1976)、 S P 2/0 -A l 4 (S P 2, Nature, 276, 269〜270， 1978 ) 、マウスミエローマ MOP C— 2 1セルライン由来の P 3 -X 6 3 - A g 8 ― U 1 ( P 3 U 1 , Current topics in Microbiol, and Immunol. , 81, 1〜7， 1978 ) 、 P 3 -X 6 3 -A g 8 (X 6 3 , Nature, 256, 495〜 497, 1975 ) 、 P 3 - X 6 3 - A g 8— 6 5 3 (6 5 3， J. Immunol.， 123, 1548〜1550, 1979) などを用いることができる。 8—ァザグァニン耐性のマウスミエ口一マ細胞株はダルべッコ M E M培地（ D M E M培地）、 RPM I — 1 6 4 0培地などの細胞培地に、例えばべニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清（F C S) などを加え、さらに 8ーァザグァニン（例えば 5〜4 5 ii g/m 1 ) を加えた培地で継代されるが、細胞融合の 2〜5日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結保存株を約 3 7°Cで完全に解凍したのち RPM I - 1 64 0培地などの正常培地で 3回以上洗浄後、正常培地で培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよい。

4. 抗体産生細胞とミエロ一マ細胞との細胞融合

上記 2. の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは最終免疫後、 2〜5日後にその脾臓が摘出され、それから脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記 3. の工程に従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（MEM培地）、 DM EM培地、 RPMI— 1 64 0培地などの細胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当該分野で知られたものを用いることができ、この様なものとしては不活性化したセンダイウィルス（HVJ : Hema g g l u t

1 n a t i n g v i r u s o f J a p a n) なども挙げられる。好ましくは、例えば 3 0〜 6 0 %のポリエチレングリコールを 0. 5〜

2 m 1加えることができ、分子量が 1 , 00 0〜8， 0 0 0のポリェチレングリコールを用いることができ、さらに分子量が 1 , 0 0 0〜4,

0 0 0のポリエチレングリコールがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチレングリコールの濃度は、例えば 3 0〜 6 0 %となるようにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチルスルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもできる。融合に使用する脾細胞 (リンパ球）：ミエローマ細胞株の割合は、例えば 1 ： 1 ~2 0 ： 1とすることが挙げられる力 <、より好ましくは 4 ： 1〜7 ： 1とすること力くできる。

融合反応を 1 ~ 1 0分間行い、次に R PM I— 1 640培地などの細胞培地を加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培地に移す。

5. ハイプリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化

選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む、 F C S含有 MEM培地、 R PM I— 1640培地などの培地、所謂 HAT培地が挙げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレー卜に分注した容量と等容量を翌日加え、その後 1〜3日ごとに H A T培地で半量ずつ交換するというようにすることができるカ^ 適宜これに変更を加えて行うこともできる。また融合後 8〜1 6日目には、アミノプテリンを除いた、所謂 HT培地で 1〜4日ごとに培地交換をすることができる。フィーダ一として、例えばマウス胸腺細胞を使用することもでき、それが好ましい場合がある。

ハイプリドーマの増殖のさかんな培養ゥエルの培養上清を、例えば放射免疫分析（R I A) 、酵素免疫分析（EL I SA) 、蛍光免疫分析 (F I A) などの測定系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（FACS) などで、 MT— MMP— 3あるいはその断片べプチドを抗原として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的抗体を測定するなどして、スクリ一ニングしたりする。

目的抗体を産生しているハイブリドーマをクロ一ニングする。クロ一ニングは、寒天培地中でコロニーをピック 'アップする力、、あるいは限界希釈法によりなされうる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。クローニングは複数回行うことが好ましい。 6 . モノクロ一ナル抗体の製造

得られたハイプリドーマ株は、 F C S含有 M E M培地、 R P M I— 1 6 4 0培地などの適当な増殖用培地中で培養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイプリドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させる力、、例えばヌード ·マウスなどに各ハイプリドーマを移植し、増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を回収して得ることが出来る。動物はハイプリドーマの移植に先立ち、プリスタン（2 , 6， 1 0， 1 4 —テトラメチルペン夕デカン）などの鉱物油を腹腔内投与しておくことができ、その処理後、ハイプリドーマを増殖させ、腹水を採取することもできる。腹水液はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸ァンモニゥム沈殿法などの塩析、セフアデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、ァフィ二ティ · クロマトグラフィ一法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製してモノクロ一ナル抗体として用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫安分画した後、 D E A E—セファロ一スの如き、陰イオン交換ゲル及びプロティン Aカラムの如きァフィ二ティ一カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位など）を固定化したァフィ二ティ一 · クロマトグラフィー、プロティン Aを固定化したァフィ二ティ一 · クロマトグラフィ一などが挙げられる。またこうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイプリド一マ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。

さらにこれら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られる F a b、 F a b ' , F ( a b ' ) , といった抗体フラグメントにして使用してもよい。

標識物を付与する抗体としては、 I g G画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部 F a b ' を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、下記するように酵素（ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいは /S— D—ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがある。

本発明での検知 ·測定は、ィムノ染色、例えば組織ある、は細胞染色、ィムノアツセィ、例えば競合型ィムノアツセィまたは非競合型ィムノアッセィで行うことができ、ラジオィムノアツセィ、 E L I S Aなどを用いることができ、 B— F分離を行つてもあるいは行わなし、でその測定を行うことができる。好ましくは放射免疫測定法や酵素免疫測定法であり、さらにサンドィツチ型アツセィが挙げられる。例えばサンドィツチ型ァッセィでは、 M T— MM P— 3に対する抗体の一方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためィンキュベーシヨン処理し、ここで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわち M T— MM P— 3の量と比例する。このァッセィでは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アツセィ、フォワード（forward)サンドイッチ型アツセィぁるいは逆サンドイッチ型アツセィなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用される。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはィンキュベーション処理時間などのその他の測定条件は、検体中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変えることができる。当業者は通常の実験法を用いながら各測定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を行うことが出来る。

抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々知られており、本発明においても勿 nffij れらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例えば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ一アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレンーブタジェン共重合体、ポリアクリルァミド、架橋ポリアクリルアミド、スチレン一メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、ァクロレイン一エチレングリコールジメタクリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン、ァガロース、架橋ァガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースァセテ一トなどの天然または変成セル口 —ス、架橋デキストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたもの、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。

さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイターゥヱル、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質（物体）の表面などが挙げられる。

これら担体へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明で得られる MT— MM P— 3に対し特異的に結合するモノクロ一ナル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。

標識としては、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、ァシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ぺプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。

代表的な放射性物質の標識用同位体元素としては、〔^{3 2} P〕、 [ ^{, L}' ⁵ I〕、〔 I〕、〔 ⁿ H〕、〔 ' " C〕、 C^{:i r}' S ] などが挙げられる。

代表的な酵素標識としては、西洋ヮサビペルォキシダ一ゼなどのペルォキシダーゼ、大腸菌 3— D—ガラクトシダーゼなどのガラクトシダ一ゼ、マレエ一ト ·デヒドロゲナーゼ、グルコース一 6—フォスフェート ·デヒドロゲナ一ゼ、グルコースォキシダーゼ、ダルコアミラーゼ、ァセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ゥシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファタ一ゼなどのアルカリ · フォスファタ一ゼなどが挙げられる。

アル力リホスファターゼを用いた場合、 4ーメチルゥンベリフヱリルフォスフエ一卜などのゥンべリフエ口ン誘導体、二トロフエニルホスフヱートなどのリン酸化フヱノール誘導体、 N A D Pを利用した酵素的サイクリング系、ルシフヱリン誘導体、ジォキセタン誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用したりすることもできる。

力夕ラーゼを用いた場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、 'その酸素を電極などで検知することもできる。電極としてはガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電極、高分子膜電極などであることもできる。

酵素標識は、ピオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレブトァビジン）に置き換えることも可能である。

標識は、複数の異なった種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。

本発明においては、信号の形成に 4ーヒドロキシフヱニル酢酸、 1， 2—フエ二レンジァミン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ヮサビ · ペルォキシダーゼ、ゥンベリフヱリルガラクトシド、ニトロフヱ二ルガラクトシドなどと β—ϋ -ガラクトシダ一ゼ、グルコース一 6—リン酸 ♦デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フヱノール誘導体、フユ口セン誘導体などを酵素などの働きで形成しうるものが使用できる。蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合物としては、フルォレセィンイソチオシァネート、例えばローダミン Bイソチオシァネート、テトラメチルローダミンィソチオシァネートなどのローダミン誘導体、ダンシルク口リド、ダンシルフルォリド、フルォレス力ミン、フィコビリプ口ティン、ァクリジニゥム塩、ノレミフエリン、ノレシフェラーゼ、ェクオリンなどのルミノール、イミダゾール、シユウ酸エステル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。

標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、ァミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中がら適宜選択して適用できる。また上記免疫原性複合体作製に使用されることのできる縮合剤、 . 担体との結合に使用されることのできる縮合剤などを用いることができる o

縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒド、へキサメチレンジイソシァネート、へキサメチレンジイソチオシァネート、 N， N' ーポリメチレンビスョ一ドアセトアミド、 N， Ν' 一エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネ一卜、ビスジァゾベンジジン、 1 一ェチル一 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル）カルボジィミド、スクシンィミジル 3— ( 2 —ピリジルジチォ）プロピオネート ( S P D P ) 、 Ν—スクシンィミジル 4一（Ν—マレイミドメチル）シクロへキサン一 1 —カルボキシレート（S M C C ) 、 N—スルホスクシンィミジル 4一（N—マレイミドメチル）シクロへキサン一 1—力ルボキシレート、 N—スクシンィミジル（4ーョ一ドアセチル）アミノベンゾエート、 N—スクシンィミジル 4— ( 1 —マレイミドフエ二ル）ブチレート、 N— （£一マレイミドカプロィルォキシ）コハク酸ィミド（E M C S ) ，イミノチオラン、 S—ァセチルメル力プトコハク酸無水物、メチル— 3— ( 4 ' —ジチォピリジル）プロピオンイミデート、メチルー 4 一メルカプトブチリルイミデート、メチルー 3—メルカプトプロピオンィミデ一ト、 N—スクシンィミジルー S—ァセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。

本発明の測定法によれば、測定すべき物質を酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させることができるし、同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感作されたブラスチックなどのビ一ズを加えることにより測定を行うことができる。

本発明の定量法においては、免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボ —ル、マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用することができる。

測定にあたっては至適 p H、例えば p H約 4〜 9に保つように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばァセテート緩衝剤、クェン酸塩緩衝剤、フォスフヱ一ト緩衝剤、卜リス緩 . 衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トスー塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗体抗原反応は約 0て〜 6 0 °Cの間の温度で行うことが好ましい。

酵素などで標識されたモノクローナル抗体などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、さらには測定すべき物質のィンキュベーシヨン処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗体抗原反応の平銜が達成されるよりもずつと早い時点で固相と液相とを分離して限定されたィンキュベーション処理の後に反応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス ·ディテクター、ホト ·ディテクタ一などを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。

抗体抗原反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗体抗原反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加えることもできる。キレート化剤としては、エチレンジァミン四酢酸塩（E D T A ) がより好ましい。当該分野で普通に採用されていたりあるいは当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのプロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができる。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定されず用いることが出来る。

本発明の測定方法で測定される試料としては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料などが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、例えば血液、血清、血漿、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモジュネート、生検試料、組織、細胞などが挙げられる。

なお、本発明の DN Aも上記抗体と同様に処理することが出来、それ自体公知の方法又はそれと実質的に同様な方法で標識されたり、測定に用いることができることは理解されるべきである。

本発明の前述した種々の態様を利用することにより、癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診断治療に関わる研究に有用な診断手段として、あるいはその他の医学的生理学的用途に適用される種々の技術手段を提供することができる。以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明する力本発明はこれら実施例に限定されず、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。なお、明細書及び図面において、塩基及びァミノ酸等を略号で表示する場合、 I U P A C— I UB Commission on Biochemical Nomenclatureによる力、、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、アミノ酸に光学異性体が存在する場合は、特に断らないかぎり L一体を示す。

後述の実施例 1 (e) で得られた大腸菌 NM 533 XL 1 _B 1 u e (XL 1 -B 1 u e/MMP-X 2) は、平成 7年 7月 5日（原寄託日）から茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305 ) の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（NI BH) に寄託されており (微ェ研菌寄第 P— 15033号）、平成 8年 7月 1日に原寄託よりブダぺスト条約に基づく寄託への移管請求がなされ、受託番号 FERM B P— 5573として N I BHに保管されている。後述の実施例 3 ( f ) 〜（h) で得られたマウス由来単クローン性抗ヒト膜結合型マトリックスメタ口プロテア一ゼ— 3 (MT-MMP- 3)抗体産生ハイブリドーマ（1 17— 4 E 1) は、平成 7年 7月 5日（原寄託日）から N I BH に寄託されており（微ェ研菌寄第 P— 15031号）、平成 8年 7月 1 日に原寄託よりブダぺスト条約に基づく寄託への移管請求がなされ、寄託番号 F ERM B P— 5 5 72として N I BHに保管されている。実施例

以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されること無く様々な態様が含まれることは理解されるべきであ

-t>o

実施例 1 新規なメタ口プロテア一ゼ（MT— MMP— 3) cDNAの単離

新規な MMP c DN Aの単離は基本的に以下の方法にしたがって行つた。

1 ) MM Pファミリ一で保存されている配列からデジヱネレイテツドプライマーを合成し、ヒト組織由来 cDNAのスクリーニングを行い、 P CR産物を得る。 2) 得られた部分的クローンをプローブとして、 cD N Aライブラリ一より c DNA全長をスクリ一二ングする。

(a) c DNAライブラリ一の構築

c DN Aライブラリ一作製に用いる RN Aソースとしては、種々ヒト組織（胎盤、口腔癌、肺癌等）あるいは培養細胞（ヒト線維肉腫細胞 H T 1 0 8 0、ヒト単球性白血病細胞 U 9 3 7等）から抽出した全 RN A を使用することができる。本実施例では、口腔癌組織由来 RNAを出発材料として行った結果を示した。組織からの全 RN Aの抽出は、グァニジン一塩化セシウム法（B i o c h em i s t r y, 1 8 : 5 29 4〜 5 2 9 9, 1 9 7 9 ) にしたがって行い、得られた全 RN Aよりポリ (A) mRNAをオリゴ（dT) —セルロースカラムを使用して精製した。

c DN Aの合成はガブラー &ホフマンの方法（G e n e, 2 5 : 2 6 3〜26 9， 1 9 8 3 ) にしたがって行った。精製したポリ（A) m RNAをテンプレート、ランダムへキサマーあるいはオリゴ dTをブライマ一とし、 S u p e r s c r i p t逆転写酵素（ S t r a t a g e n e) を用いて 1 s t s t r a n d c DNAを合成した。これを RN a s e Hで処理し、続いて大腸菌 DNAポリメラーゼ Iを用いて、 2 n d s t r a n d c D N Aを合成し 2本鎖 c D N Aを作製した。 cD N Aの第 1鎖の合成は、 5〃 1のポリ A mRNA画分サンプル、 2〃 1のランダム 'へキサマー（8 0 M 及び反応用緩衝液 4. 5 1の混合物を 7 0°Cで 1 0分間インキュベーション処理した後、氷で冷却し、これに 5 X反応用緩衝液 4 し 0. 1 Mのジチオスレイト一ル（DD T) 2 1 OmM d NTP s 1〃 1及び RN a s eインヒビター 1〃 1を加え、良く混合し、 0. 5〃 1 (約 1 0 0ユニット）の Super Script reverse transcriptase (GIBCO BRL)を加え、 37°Cで 1時間ィンキュベ一シヨン処理した後、 70°Cで 1 0分間処理した。 c.DNAの第 2鎖の合成は、同様にして処理して実行できる。

c DN Aライブラリ一の構築は、例えば； I g t 1 1を使用して行うことができる。合成した 2本鎖 c DNAを T DNAポリメラ一ゼで平滑化した後、 E c oR Iメチラーゼにより cDNA中に存在する E c oR Iサイトをメチル化する。さらに E c oR I リンカ一 d (p GGAAT TCC) を T, DNAリガーゼで連結し、 E c oR I消化することにより両末端に E c oR Iサイトを有する c DNAを構築した。この c DN Aをス g t 1 1の E c o R Iサイトへクローニングした。次にこの c D NAをィンビトロパッケージングキットによりパッケージングし、 c D NAライブラリ一を構築する。 c DNAライブラリーとしては市販の種々ヒト組織由来 c DN Aライブラリー（CLONTECH) を直接使用することもできる。 (b) 新規な MMP c DNA断片の増幅

得られた c DNAをテンペレ一卜とし、 MMPファミリ一で保存されているアミノ酸配列を基に合成したデジュネレイテツドプライマ一及び T a q DNAポリメラーゼを用いてポリメラーゼ 'チェイン . リアクシヨン法（PCR) を行った。新規な MM P c DNA断片の PC R増幅は、例えば R. Saiki, et aし Science, Vol. 230, pp. 1350 (1985); R. Saiki, et al.， Science, Vol. 239， pp. 487 (1985)； PCRテクノロジー（PCR Technology) ，ストックトンプレス（Stockton Press) などに記載された方法に従つて行われた。

1 UL 】の上記工程の反応生成物を铸型として用い、 5 1の 1 0 X P CR緩衝液、 1〃 1の2 5]111\1 dNTP s、 1 / ]の增幅用プライマ —及び 1ュニッ卜の Taq polymerase の混合物を無菌蒸留水で 5 0 1 とした。この反応用混合物を 9 3 °Cで 1分間、 5 5 °Cで 1分間そして 7 2 °Cで 1分間を 1サイクルとして、 30サイクルの P CR増幅にかけた _c デジヱネレイテツドプライマ一は、以下のように設計、合成した。既知の MMPファミリーの触媒ドメイン中から高度に保存されているアミノ酸配列として、 GEAD I M I (MM P— 1の G 1 y ¹ 〜 I I e ^{1 fi} ' MMP一 2の G 1 y ―' 〜 I 1 e ¹⁷¹ 、 MMP一 3の G 1 y ^{15 s} 〜 I 1 e ¹⁰ ' 、 MM P— 7の G 1 yし; '¹ 〜 I 1 e ' ⁶ 、 MM P— 8の G l _y ¹ 〜 I 1 _e ¹ " 、 MM P - 9の A r g ^{1 G 2} 〜 I 1 e ' ^r' ⁸ 、 MMP- 1 0の G 1 y ¹ ; ¹ 〜 I 1 e ¹ ' 、 MMP- 1 1の G 1 y ¹⁵¹ 〜 I 1 e ^{i r}'^T 及び MMP— 1 2の G 1 y i ' 〜 Va Γ'^{; ι} にそれぞれ相当する。アミノ酸番号は図 1 Α〜Ε記載の番号にしたがった）及び

GDAHFDDDE (ΜΜΡ - 1の G 1 y ^{1 !}'² ~G 1 u ²⁰¹ 、

MMP— 2の G 1 y ²。^:：〜G 1 u²¹¹ 、 MMP— 3の A s n^{l fl2} 〜 G】 u ^{2U I} 、 MMP— 7の G 1 y i 'に〜G 1 u 、 MMP— 8の G 1 y ¹ 〜G 1 u²。。、 MMP— 9の G 1 n ' ^!M1 〜G 1 u-^(U! 、 MMP - 1 0の Ty r 〜G 1 u ^{2 n} " 、 MMP— 1 1の G 1 u ^,8" 〜 G 1 u ^{, n?} 、 MMP- 1 2の G l y¹"² 〜G l u^{2n i} にそれぞれ相当する。アミノ酸番号は図 1 A〜Eに記載の番号にしたがった）を選択した (プライマ一部分に相当するアミノ酸配列のァミノ酸表記は一般的な 1 文字表記にしたがった）。このアミノ酸配列を基に、デジヱネレイト · オリゴヌクレオチド ·プライマーである、次の配列を有する 5' プライマ一（5' プライマ一 5 P— 4 )

〔配列番号： 3〕

5' 一（C又は G) G (A又は C又は G又は T) (A又は C又は G) (A又は C又は G) (A又は C又は G又は T) GC (A又は T) GA (C又は T) AT (A又は C) (A又は G) T (C又は G) AT- 3' 及び次の配列を有する 3，プライマ一（3' プライマー 3 P— 2) 〔配列番号： 4

5' - (C又は T) TC (A又は G) T (C又は G) (A又は C又は G 又は T) TC (A又は G) TC (A又は G) AA (A又は G) TG (A 又は G) (A又は G) (A又は C又は T) (A又は G) TC (C又は T) CC

を DN Aシンセサイザ Mo d e l 3 9 2 (Ap p l i e d B i o s y s t ems) を使用し、 /5—シァノエチルフォスフォアミダイ卜法により合成した。

上記配列中、括弧内に示された塩基はその複数の塩基を導入すること、そしてその結果マルチプルなヌクレオチド配列を生ずることを示している。括弧内複数の塩基は合成時に混合塩基を用いて導入した。

この時、プライマー 5 P— 4には 5' 側に B amH Iサイト、プライマ一 3 P— 2には 3' 側に E c oR Iサイトを導入した。得られたブライマ一 5 P— 4およびプライマ一 3 P— 2は 1 0 mM リン酸ナトリゥム緩衝液 P H 6. 8で平衡化した二ックカラム（Pha rma c i a) を用い精製し、 260 nmの吸光度を測定して 20〃Mに調製したものを用いた。

得られた P C R産物を 1 0 %ァガロースゲル電気泳動で分離し、設定したプライマーから予想されるサイズ（90〜1 20 bp) の PCR産物、 7種類を抽出、精製した。精製した各 PCR産物を B amH I及び E c 0 R Iで処理し、適当なブラスミド、例えば p B 1 u e s c r i p t ^TM や pUC 1 8などの B amH E c oR Iサイ卜にサブクローニングした。例えば、 1 0 1の P C R産物を 1 0 %ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離して確認し、約 1 20— 1 30 b pの P CR産物を、プラスミド pB l u e s c r i p t ^{I 1}ベクタ一にサブクローニングした。

1〃 1の P C R産物、 1 1の 1 0 Xライゲ一ション緩衝液、 2〃 1の再懸濁化べク夕一液及び 1〃 1の T 4 D N Aリガーゼからなる反応用混合物を 1 2 °Cでー晚インキュベーション処理した。得られたベクターを適当なコンぺテント細胞（例えば、大腸菌 H B 1 0 1や XL l—B l u e のコンペテント細胞が使用できる）に TA Cloning Kit (Invitrogen) のプロトコールに従い導入し、サブクロ一ニングした。そのほか pUC l 1 9， p CR'^Mなどのベクタ一を用いることもできる。クローン化した P CR産物の塩基配列を蛍光 DNAシーケンサ Mo d e 1 373 A (A pp l i e d B i o s y s t ems) Taqダイプラィマーサイクノレシークェンシングキット (App l i e d B i o s y s t ems) を使用し決定した。

決定したこれら 7種の P C R産物の塩基配列を既知 MM Pの塩基配列と比較した結果、 2つは既に報告されている MMP— 2の塩基配列（J. B i o l. Ch em. , 2 6 1 : 6 6 0 0〜 6 6 0 5， 1 9 8 6 ) の一部と、 1つは MMP— 9の塩基配列（J. B i o l. Ch em. ， 2 6 4 : 1 7 2 1 3〜 1 7 2 2 1， 1 9 8 9 ) の一部と一致した。残りの 4 種の PCR産物の内、 2つは MMPとは無関係な塩基配列であつたが、後の 2つは 9 3 b pで同一の配列を有しており、 MM P遺伝子と相同性を示し推定されるアミノ酸配列も保存されていた。この PCR産物を便宜的に MMP— X 2フラグメントと命名した。

(c) c DNAライブラリ一からの新規 MT— MMP— 3遺伝子のスクリ一二ングと塩基配列の決定

前項（b) で得られた MMP— X 2フラグメント（cDNA断片） 2 5 n gを、例えばランダムプライムド DNAラベリングキット（Bo e h r i n g e r Ma n n h a i m) を使用して〔α— " P〕 d CTP (Amersham) を用いて標識し、 2~5. 0 CPMZ〃 gの比活性を持つプローブを得た。これを種々のヒト組織または細胞由来 cDNAライブラリ一をスクリ一ニングするためのプローブとして用いた。

(a) 項で記載したス g t 1 1中に構築したヒト口腔癌組織 cDNA ライブラリーを宿主菌大腸菌 Y 1 0 9 0に 4 X 1 (Γ プラーク形成単位 / 1 5 cm² プレートの濃度で感染させ、プラークを形成させた。まず、大腸菌 Y 1 0 9 0株を 0. 0 2 %マルト一スを含む L培地で 1晚培養後、集菌し、 1 OmM M g S 0 , に懸濁した。この細胞懸濁液とファージ液を混合し 3 7°C 1 5分間保温し、ファージを宿主菌に吸着させた。これに軟寒天を加え、予め作製しておいた 1 5 cm² の Lプレート上に広げた。プレートを 4 2°Cで 1晚保温し、プラークを形成させた後、ナイロンフィルター（例えば、ハイボンド（Hy b 0 n d) — N、 Ame r s h am) あるいはニトロセルロースフィルタ一（例えば HATF、 M i 1 1 i p o r e) をプレート上に置き、約 3 0秒間放置した。膜を穏やかに剝がしアルカリ変性液（0. 5M NaOH及び 1. 5M N a C 1 ) に 1分間浸した後、中和液（1. 5M Na C l含有0. 5M T r i s -HC 1緩衝液、 pH 8) に 1 5分間浸した。このフィルターを 2 X S SPE C0. 3 6 M N a C 20 mM NaH ' PO 及び 2mM EDTA) で洗浄した後、風乾した。上述のプラークのフィルターへの転写を繰り返し、少なくとも 2枚のフィルターを調製する。但し、 2枚目以降のフィルターとプレー卜の接触時間は 2分間程度に延長した。

このフィルターを 8 0°Cで 2時間べ一キングし、 DNAを固定した。

1つのプレー卜から調製した少なくとも 2枚のフィルタ一をそれぞれ 4 2°C、 1時間洗浄液（1M Na C l、 1 mM £0丁八及び0. 1 % S o d i um d o d e c y l s u l f a t e (S D S) 含有 5 0 mM T r i s -HC 1緩衝液、 p H 8. 0) で洗浄後、ハイブリダイゼーシヨンバッグ中にフィルターを入れ、プレハイブリダィゼーシヨン溶液 [50% f o rmam i d e, 5 xD e n h a r d t' s溶液 ( 0. 2 %ゥシ血清アルブミン、 0. 2 % p o l y v i n y l p y r o l i d o n e) 、 5 xS S PE、 0. 1 % SDS、 1 0 0 / g/m 1 熱変性サケ精子 D NA] に浸し、 4 2 °Cで 6〜 8時間プレハイブリダィゼ一シヨンを行った。次に 1 0 0°C、 5分間加熱変性させた（c) 項で記載した³² P標識プローブをプレハイプリダイゼーション溶液に添加し、 4 2 で 1晚ハイブリダイゼーションを行つた。ハイブリダイゼーシヨン完了後、フィルタ一を室温で多量の 0. 1 %SDS含有 2 XS S C溶液で洗浄した。次にフィルターを 0. 1 %SDS含有の 0. 2 XS S C溶液中に 5 5°C、 3 0分間置いた。この操作を 2回繰り返したこのフィルタ一を風乾した後、 X線フィルム（Ko d a k XR) と重ね一 8 0 で 1 2時間ォ一トラジォグラフィ一を行った。 X線フィルムを現像し、 1枚のプレートからできた 2枚のフィルムを重ね、重なるシグナルをマークする。マークしたシグナルに相当するプラークを SM溶液 ( l O O mM N a C l及び 1 0 mM 1^280.₁ 含有5 01111\1 T r i s— HC 1緩衝液、 p H 7. 5 ) に懸濁した。このファージ懸濁液を適度に希釈して、好ましくは 1 0〜1 0 0プラーク形成単位 Z 1 0 cm² プレー卜の濃度に希釈して大腸菌を培養してある 1 0 cn ^ プレートにプレーティングし、上記と同様のスクリーニングを行い、組換え体ファージを得た。

(d) 新規 MT— MMP— 3遺伝子を持つ組換え体; I g t 1 1 DNA の調製

クローン化したファージをそれぞれ前（c) 項の記載と同様にプレーティングし 4 2 °C、 3時間保温し、続いて 3 7 °C、 1晚保温した後 S M 溶液に数滴のクロ口ホルムを加え室温で 3 0分間放置した。 SM溶液と共に上層の軟寒天を搔き取り、遠心分離した。遠心後の上清に終濃度 1 0 %になるようにポリエチレングリコール一 6 0 0 0 (P EG— 6 0 0 0) を加え攪拌した後、 4 °Cで 1時間放置した。これを遠心分離し上清を捨て、ファージ粒子を回収した。このファージ粒子を SM溶液に懸濁し、グリセロールグラジェント超遠心分離法（Mo l e c u l a r c l o n i n g, a l a b o r a t o r y ma n u a l , E d. T. M a n i a s t i s , C o l d S p r i n g H a r v o u r L a b o r a t o r y, 2 n d E d. 7 8, 1 9 8 9 ) により精製した。得られたファージを TM溶液に懸濁し、 DN a s e Iおよび RN a s e Aで処理後、 2 0 mM EDTA、 5 0 g/m 1 P r o t e i n a s e K及び 0. 5 % SD S混合液を加え 6 5 °C、 1時間保温した。これをフヱノール抽出、ジェチルエーテル抽出後、エタノール沈殿により DNAを沈殿させた。得られた DN Aを 70%エタノールで洗浄後乾燥し、 TE溶液（ 1 OmM £0丁含有1 01111^ Tr i s—HC l 緩衝液、 PH8) に溶解した。

(e) 挿入断片の塩基配列決定

前項（d) で調製した λ g t 1 1 DNAを E c oR Iで分解し、揷入断片を分離精製後、ベクター pB 1 u e s c r i p t™ (S t r a t a g e n e) の E c oR I部位にサブクローニングする。この組換え体 pB l u e s c r i p tで大腸菌 NM 533 XL 1 -B 1 u eを形質転換した。形質転換細胞を F' 選択後、ヘルパーファージ VCSM13 (S t r a t a g e n e) を感染させ終夜培養する。培養液を遠心分離し菌体を除き、これに PEGZNaC 1を加えファージを沈殿させる。沈殿を TE溶液に懸濁後、 1本鎖 DN Aをフヱノール抽出、エタノール沈殿により回収した。この 1本鎖 DNAの塩基配列を蛍光 DNAシーケンサ Mo d e l 373A (App l i e d B i o s y s t ems) 、 T a qダイプライマーサイクルシークェンシングキット（A p p 1 i e d B i o sy s t ems) を使用し決定した。決定した塩基配列の全長は 2 1 07 b pであり、その配列は配列表の配列番号： 1に記載した。 GENBANK/EMBL DNA Da t a Ba s eを使用し、配列表の配列番号： 1に記載した塩基配列を検索したが、同一の配列は存在しなかった。この約 2. 1 k bの DNA配列中には、推定 604アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームの存在が認められ、その推定されるァミノ酸配列を配列表の配列番号： 2に記載した。この推定されるタンパク質を、「MT— MMP— 3」と名付けた。得られた D N A断片をプラスミド P EX， pMEMn e o、 pKGなどのベクタ一に組込み、大腸菌、 CHO細胞などで発現させることができる。

上記 MT— MMP— 3をコードする塩基配列を挿入したベクター（p SG 5™ (S t r a t a g e n e) ) を保有する大腸菌 NM 5 3 3 X L 1 -B 1 u e (XL 1 -B 1 u e /MM P— X 2 ) は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM B P— 5 5 7 3として寄託保存されている（平成 7年 7月 5日（原寄託日）に寄託された微ェ研菌寄第 P— 1 5 0 3 3号（原寄託）よりブダぺスト条約に基づく寄託への移管請求が平成 8年 7月 1日にされた）。 ( O MT— MMP— 3のアミノ酸配列解析

配列表配列番号： 1に記載の MT— MMP— 3の塩基配列から推定される配列表配列番号： 2に記載したァミノ酸配列を既知の MM P sのァミノ酸配列と比較したァライメントを図 1 A~Eに示した。配列表配列番号： 2に示したアミノ酸配列は、 MMPファミリーと高い相同性を示し、 MMPファミリ一に特徴的なドメィン構造、すなわち、分泌産生時に除去されるシグナルぺプチド、プロべプチドドメィン、触媒ドメィン、ヒンジドメイン、へモぺキシン凝血酵素様ドメインが良好に保存されていた。特に、 MMPファミリーで非常に高度に保存されているプロ体と活性型の切断部位近傍の配列 PRCGVPDは MT - MMP— 3でも完全に保存されており、また活性ドメインの配列も高い保存性を示した。 Z n ² 'の結合部位を含む活性ドメインのアミノ酸配列を MT— MM P— 3と他の既知の MMPと比較したところ、 MT— MMP— 1に対する相同性は 6 6 %と最も高く、また他の MMPに対する相同性も MMP— 1 2に対して 5 1 %、 MMP- 2及び MM P— 9に対して 5 0 %、 MMP - 1に対して 4 9 %、 MM P— 3に対して 4 8 %、 MM P— 8に対して 4 7%、 MMP- 1 1に対して 4 6 %、 MMP- 7に対して 4 4 %の相同性を示した。

さらに MT— MMP— 3のァミノ酸配列上で他の MM Pと比較して特徵的な点は、 3ケ所の挿入配列が存在する点である。すなわち、プロべプチドドメィンと触媒ドメィンの間に存在する G S SKFH I RRKR の配列からなる 1 1アミノ酸残基の挿入配列一 1 ( I S— 1 ；配列表の配列番号： 2の G 1 y '^π 〜A r g' ) 、触媒ドメィン中の P YS E LENGの配列からなる 8アミノ酸残基の挿入配列一 2 (I S— 2 ；配列表の配列番号： 2の P r 0¹⁷¹ ~G 1 y '⁷ⁱ' ) 及びトランスメンブレンドメイン様の 24個の疎水性ァミノ酸の連続配列 A I A I V I P C I LALCLLVLVYTVFQFを含む 75ァミノ酸残基の揷入配列一 3 ( I S— 3 ；配列表の配列番号： 2の A s p「'³。〜V a 1 ^fi( ) が存在する。このような 3ケ所の挿入配列は、 MMPフアミリー中では MT -MMP- 1においてのみ存在し、他の MM Pには認められなかった。 MT-MMP- 3における 3ケ所の挿入配列について位置及び構成するアミノ酸残基の数は、 MT— MMP— 1におけるそれとほとんど同じであつたが、アミノ酸の組成は、 MT— MMP— 1のそれとは明らかに異なっており、 I S— 3の MT— MMP— 1との相同性は 37 %であった。なお、全配列の相同性は 43 %であった。最初の挿入配列 I S— 1は例外的に MMP— 1 1にも存在している力く、 I S— 1中で保存されている配列 R X K Rは、ズブチリシン様プロテア一ゼの切断部位の配列であり、了ミノ酸配列 RXKRはズブチリシン様プロテア一ゼによる多くの真核生物分泌タンパク質の切断部位であることが知られている（J. B i o 1. Ch em. , 266 : 1 2 1 27〜 1 2 1 30， 1 99 1) 。 I S 一 3中の疎水性ァミノ酸の連続配列はトランスメンブレンドメインと考えられ、 MT— MMP— 1の際立って特徴的な点であり（J. B i o l. C h em. : 270， 80 1〜805， 1 995 ) 、 MT— MM P— 3 の I S— 3中に存在する疎水性ァミノ酸の連続配列もトランスメンブレンドメインと考えられた（実施例 5参照）。本発明により単離された M T— MMP_3 cDNAによってコ一ドされるタンパク質のァミノ酸配列は、他の MMPファミリーと相同性が高く、先に本発明者らが見出した MT— MMP— 1とも類似している力詳細な点では明らかに異なり、また分子量も異なっていた。本発明のタンパク質は約 69 k Daの分子量を有している。

これらの配列上の特徴は、 MT— MMP— 1及び MT— MMP— 3は、 MMPファミリ一中のサブファミリ一を構成していることを示唆している。実施例 2 MT— MMP— 3 mRNAの発現

(a) ヒト組織中での発現

ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、脖臓各組織由来の p o 1 y (A) RNAをブロットしてあるメンブレン Huma n Mu l t i p l e T i s s u e No r t he rn B l o t s (C l o n t e c h) を用い、：¹-'P標識した実施例 1 (e) 項に記載した 2. 1 k bの c DN Aをプローブとしてノーザンブロッティングを行った。プローブの標識は実施例 1 (c) 項の記載と同様に行った。 3 XSSC (0. 45 M N a C 1 , 0. 045 M t r i s od i um c i t r a t e 2 H₂ 0, pH 7. 0) で湿らせた Mu l t i p l e T i s s u e No r t he rn B 1 o t sのフィルターをプレハイブリダイゼ一シヨン溶液（0. 75 M NaC l、 2. 5 mM EDTA、 0. 5 xDe nh a r d t' s溶液、.50% f o rmami d e及び 1 % SDS含有20mM Tr i s— HC 1緩衝液、 pH7. 5) 1 0 m 1中で穏やかに攪拌しながら 42°Cで 2〜3時間プレハイプリダイズした。次にハイブリダイゼ一ション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液に 1 0 % s o d i um d e x t r a ru 2 0〃 g/m 1変性サケ精子 DN Aを加えた溶液） 1 0m lに熱変性したプローブを加えプレハイブリダイゼーション溶液と交換し、 4 3 °Cでー晚ハイブリダイゼーシヨンを行った。ハイブリダィゼーシヨン完了後、 0. 1 % SDS 含有 2 X S S C溶液で洗净した。

次にプロットを 0. 1 % 303含有1 ズ 33。溶液中に5 5°( 、 3 0分間置いた。このブロットをバイオイメージアナライザー B AS 1 0 0 0 (富士写真フィルム株式会社）でトレースし各組織における mRN Aの発現強度を評価した。このとき、同じプロットを" P標識した G 1 y c e r a l d e h y d e— 3— p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e (GAPDH) 遺伝子（CLONTECH) を用いてプロ一ビングし、 mRN Aの内部標準とした。

その結果を図 2 Aに示した。 MT— MMP— 3mRNAのサィズは、何れの組織でも 1 2 k bであり、調べた組織中、肺、脳、胎盤で高い発現を認めたが、心臓、腎臓、肝臓、滕臓、骨格筋では検出されなかった。一方、同様に Hum a n Mu l t i p l e T i s s u e No r t h e r n B l o t s (C l o n t e c h) を用い、：'²P標識した MT -MMP- 1 c DNAをプローブとしてノ一ザンブロッティングを行つたところ、 4. 5 k bに検出された MT— MMP— 1 mRNAは、肺、腎臓、胎盤で顕著に発現していたのに対し脳では最も低 L、発現であつた。因みに、 MT— MMP— 1 と MT— MMP— 3のクロスハイブリダィゼーションは生じなかった。 (b) 培養癌細胞中での発現

種々ヒト培養癌細胞中での MT— MMP— 3 mRN Aの発現を検討した。ヒト癌細胞として、喉頭癌由来細胞 H e p 2、膀胱癌由来細胞 T 2 4、肺癌由来細胞 PC— 3、胃癌由来細胞 KKLS、 NKPS及び MK N— 28、骨肉腫由来細胞 SK— E S— 1及び U— 2 0 S、扁平細胞癌由来細胞 0 S C— 1 9及び悪性黒色腫細胞 A 3 7 5、線維芽細胞として胎児肺由来線維芽細胞 HE Lを使用した。

各細胞から抽出した RNA、 1検体につき 1 0〃 gを 5 0 % f 0 rm am i d e、 1 7. 5%f o rma l i n含有2%M〇PS、 pH 7. 5に溶解し、 6 5°Cで 1 0分間反応させた。これを 1 %ァガロースで 2 %M〇P S中で電気泳動を行った。泳動後のゲルを、ナイロンメンブレン（例えば、 Hy b o n d— N， Am e r s h a m) に転写した。転写後のメンブレンを波長 2 5 4 nmの紫外線を 1 20 0マイクロジュール照射し、固定した。このプロットを前項（a) と同じく標識した c DNAと 1 6時間ハイブリダィゼーシヨンを行い、バイオイメージアナライザ一 B AS 1 0 0 0 (富士写真フィルム株式会社）でトレースし、シグナルの検出、強度を評価した。

MT— MMP— 3mRNAは、 T 2 4細胞及び H e p 2細胞で他の細胞より高い発現が検出されたが、これらの細胞における MT— MMP— 1 mRNAの発現レベルは低レベルであった。一方、 MT— MMP— 1 mRNAの顕著な発現を認めた OS C— 1 9細胞及び H E L細胞では逆に MT— MMP_ 3 mRNAの発現は他の細胞に比べ低レベルであった (図 2 B) 。

MT-MMP- 1及び MT— MMP— 3は、そのァミノ酸配列の比較から極めて類似したドメィン構造を有し、またプロ MM P— 2の活性化という同じ作用を有しているにも拘らず（実施例 6参照）、その発現は、組織あるいは細胞レベルでは全く異なるパターンを示した。このことは、 MT-MMP- 1と MT— MMP— 3が類似した構造及び作用を有するにも拘らず、異なる発現制御を受けていることを示している。実施例 3 モノクロ一ナル抗体の調製

(a) 抗原ポリべプチドの調製

配列表の配列番号： 2に記載した MT— MMP— 3のアミノ酸配列中より他の MMPファミリーとの相同性が低い、 MT— MMP— 3に特徴的な配列として、次の 4個の配列を選択し、合成した。

〔配列番号： 5〕

QTRGS SKFH I RRKR

(配列表配列番号： 2の G 1 n ¹ "'' 〜A r g ' ¹ " の配列；「ポリぺプチ KA」と略記する）

〔配列番号： 6 ]

EEVPYSELENGKRD

(配列表配列番号： 2の G 1 u ' ⁰ " 〜 A s p ¹ の配列；「ポリぺプチ KB」と略記する）

〔配列番号： Ί )

PTS PRMSVVRSAETMQSA

(配列表配列番号： 2の P r 0⁵⁵〜 A 1 a ⁷ の配列；「ポリペプチド C」と略記する）

〔配列番号： 8〕

TLGNPNHDGNDLFL

(配列表配列番号： 2の T h r ²² '·' ~ L e u ² ·' の配列；「ポリべプチ KD」と略記する） .

これらのポリべプチドをぺプチド合成機（ぺプチドシンセサイザー 9 6 0 0 M i 1 1 i G e n/B i o s e r c h) を使用して、 Fmo c — b o p法で合成した。ポリベプチドの N末端にはシスティンを導入した。合成したぺプチドは〃 B 0 n d a s p h e r e， C 1 8カラム（W a t e r s ) を用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製した。

(b) 各ポリペプチドと BS Aの複合体の調製

システィン残基を介してゥシ血清アルブミン（BSA) と結合させ抗原コンジュゲートとした。 2 0mgBSAを 2m lの 0. 1 Mリン酸緩衝液（PH 7. 5 ) に溶解したものと 1 8. 1 3mg N - ( 6 - m a 1 e i m i d o c a p r o y l oxy) s u c c i n i m i d eを 2 0 0 \ のジメチルホルムアミドに溶解したものと混合し、 3 0°C、 3 0 分間反応させた。ついで、上記の混合液を 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH 7. 0) で平衡化した PD— 1 0 (Ph a rma c i a) でゲルろ過した。マレイミドが結合した B S Aを分取し、 1. 5m l以下に濃縮した。マレイミドが結合した BS Aに対し 5 0倍モル量の前記（a) で合成した各ポリぺプチドを 1 m 1の 0. 1 Mリン酸緩衝液（ p H 7.. 0 ) に溶解したものとそれぞれ混合し、 4°C、 20時間インキュベートし、 BS A—ポリぺプチド複合体を調製した。

( c ) 抗体産生細胞の調製

前記（b) で調製した 4種類のポリペプチド A、 B、 C及び Dと BS Aとの複合体それぞれ 2 0 0 u gを完全フロインドアジュバントと共に 8週令 B a 1 bZc雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫した。 1 8日後に 0. 1 Mリン酸緩衝液（ p H 7. 5) に溶解した各複合体 2 0 0 ^ g をそれぞれの初回免疫したマウスに腹腔内投与し、追加免疫した。さらに 3 2日後に追加免疫時と同様に各複合体 1 0 を静脈内投与し、最終免疫とした。その 3日後に脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を調製した。 (d) 細胞融合

( 1 ) 以下の材料および方法を用いた。

RPM I— 1 64 0培地： RPM I - 1 64 0 (F l ow L a b. ) に重炭酸ナトリウム（24 mM) 、ピルビン酸ナトリウム（1 mM) 、ペニシリン Gカリウム（ 5 0 UZm 1 ) 、硫酸ァミカシン（ 1 0 0 / g /m 1 ) を加え、ドライアイスで pHを 7. 2にし、 0. 2 m東洋メンブレンフィルターで除菌ろ過した。

NS- 1培地：上記 RPMI - 1 64 0培地に除菌ろ過した F C S (M. A. B i o p r o d u c t s) を l S ^ CvZv) の濃度になるように加えた。

P E G 4 0 0 0溶液： R P M I— 1 6 4 0培地にポリエチレングリコール 4 0 00 (PEG 4 00 0, Me r k & Co. ) を 50% (w/w) になるように加え、無血清溶液を調製した。

8ーァザグァニン耐性ミエローマ細胞 S P 2 (S P 2/0 - A 1 4) との融合は、 S e l e c t e d Me t h o d i n C e l l u l a r I mmu n o l o gy p p 3 5 1〜37 2 ( e d. B. B. M i s h e l l a n d S. N. S h i i g i ) , W. H. F r e ema n a n d C omp a ny ( 1 9 8 0 ) に記載の 0 iらの方法を若干改変して行った。

(2) 以下では、ポリペプチド A— BSA複合体で免疫したマウス由来の有核脾細胞とミエローマ細胞 SP 2との融合に関して詳述する。

前記（c) で調製した有核脾細胞（生細胞率 1 0 0%) それぞれとミエローマ細胞（生細胞率 1 0 0 %) とを 5 ： 1の比率で以下の手順で融合した。ポリペプチド A脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそれぞれ RP M I 1 6 4 0培地で洗浄した。次に同じ培地に懸濁し、融合させるために有核脾細胞 1. 1 X 1 0 " 個とミエ口一マ細胞 2. 1 X 1 0 個を混合した。次に遠心分離により細胞を沈殿させ、上清を完全に吸引除去した。沈殿した細胞に 3 7°Cに加温した PEG 4 0 0 0溶液〔5 0 % (w /v) ポリエチレングリコール 4 0 0 0含有 RPM 1 1 6 4 0培地〕 7. 1 m lを 1分間で滴下し、 1分間攪拌し、細胞を再懸濁、分散させた。次に 3 7 °Cに加温した R PM I 1 6 4 0培地 1 4. 2 m 1を 2分間で滴下した後、同培地 4 9. 7m 1を 2〜3分間で常に攪拌しながら滴下し、細胞を分散させた。これを遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。次にこの沈殿した細胞に 3 7°Cに加温した NS— 1培地〔除菌ろ過した ] 5 % ( w/ V ) 仔牛胎児血清（J RH B i o s c i e n c e s) 含有 RPM I 1 6 4 0培地〕 7 1 m 1を速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピぺッティングで分散した。さらに同培地 1 4 2m lを加えて希釈し、ポリスチレン製 9 6穴マイクロウヱルにゥヱル当り 6. 0 X 1 0 個 Z 0. 1 m lの細胞を加えた。細胞を加えた上記マイクロウヱルを 7 %炭酸ガス Z 9 3 %空気中で温度 3 7 °C、湿度 1 0 0 %で培養した。

ポリぺプチド B— B S A複合体で免疫したマウス由来脾細胞の場合では、脾細胞 6. 2 X 1 0 " 個とミエローマ細胞 1. 2 4 X 1 0 個を混合し、上記で使用した PEG 4 0 0 0溶液、 RPM I 1 6 4 0培地、 N S— 1培地をそれぞれ 4. 1 m 3 6. 9m 1、 1 2 3m l用いた。ポリペプチド C一 B S A複合体で免疫したマウス由来の脾細胞の場合、脾細胞 3. 6 X 1 0 " 個とミエローマ細胞 7. 5 X 1 0⁷ 個を混合し、 PEG 4 0 0 0溶液、 R P M I 1 6 4 0培地、 N S— 1培地をそれぞれ 2. 5mし 2 2. 5m l、 7 5 m 1使用した。ポリペプチド D— B S A複合体で免疫したマウス由来の脾細胞の場合、脾細胞 6. 0 X 1 0 " 個とミエローマ細胞 1. 2 X 1 0 " 個を混合し、 P EG 4 0 0 0溶液、 RPM I 1 6 4 0培地、 N S— 1培地をそれぞれ 4. 0 m 1、 3 6. 0 m 1、 1 2 0 m 1使用した。

(e) 選択培地によるハイプリドーマの選択的増殖

(〗）使用する培地は以下の通りである。

H A T培地：前記（ d ) ( 1 ) で述べた N S一 1培地に更にヒポキサンチン（ 1 0 0〃Μ) 、アミノプテリン（0. 4〃Μ) およびチミジン (1 6 uM) を加えた。

HT培地：アミノブテリンを除去した以外は上記 HAT培地と同一組成のものである。

(2) 前記（d) の培養開始後翌日（1日目）、細胞にパスツールピぺットで H A T培地 2滴（約 0 · 1 m l ) を加えた。 2、 3、 5、 8日目に培地の半分（約 i m l ) を新しい HAT培地で置き換え、 1 1日目に培地の半分を新しい HT培地で置き換えた。 1 4日目にハイプリド一マの生育が肉眼にて認められた全ゥエルについて固相一抗体結合テスト法（EL I SA) により陽性ゥエルを調べた。

すなわち、ポリスチレン性 9 6穴プレートを抗原としたポリべプチド A、 B、 Cおよび Dそれぞれでコートし、次に洗浄用 PBS (0. 0 5 %Tw e e n 2 0含有）を用いて洗浄して未吸着のぺプチドを除いた。さらに各ゥエルの未コート部分を 1 %B S Aでブロックした。この各ゥエルにハイプリドーマの生育が確認されたゥェルの上清 0. 1 m 1を添加し、室温で約 1時間静置した。 2次抗体として西洋わさびペルォキシダ一ゼ（HRP) 標識ャギ抗マウス免疫グロブリン（C a p p e 1 L a b. ) を加え、さらに室温で約 1時間静置した。次に基質である過酸化水素と 0 - フヱニレンジアミンを加え、発色の程度をマイクロプレート用吸光度測定機（MRP— A 4、東ソ一）を用いて 4 9 2 nmの吸光度で測定した。 ( f ) ハイブリドーマのクローニング

上記（e) で得られた各抗原ペプチドに対する陽性ゥエル中のハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクローン化した。すなわち、 NS 一 1培地 1 m 1当りフィーダ一として 1 0⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し、 9 6穴マイクロウェルにハイブリドーマをゥエル当り 5個、 1個、 0. 5個になるように希釈し、それぞれ 3 6 穴、 3 6穴、 2 4穴に加えた。 5日目、 1 2日目に全ゥエルに約 0. 1 m 1の NS— 1培地を追加した。クローニング開始後約 2週間で、肉眼的に十分なハイプリドーマの生育を認め、コロニー形成陰性ゥエルが 5 0 %以上である群について（e) に記載した EL I S Aを行った。調べた全ゥエルが陽性でない場合、抗体陽性ゥエル中のコロニー数が 1個のゥエルを 4〜6個選択し、再クロ一ニングを行った。最終的に表 1〜表 4にまとめて示したように各ポリペプチド A、ポリペプチド B、ポリべプチド Cまたはポリペプチド Dに対するモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマがそれぞれ 7個、 1 6個、 1 1個、 4個得られた。

(g) ハイプリドーマの培養とモノクローナル抗体の精製

得られた各ハイプリドーマ細胞を NS— 1培地で培養し、その上清から濃度 1 0〜 1 0 0〃 g/m 1のモノクロ一ナル抗体を得ることができた。また、得られたハイブリドーマ 1 0⁷ 個を予め 1週間前にプリスタンを腹腔内投与したマウス（BALB/c系、半、 6週齢）に同じく腹腔内投与し、 1〜2週間後、腹水中からも 4~7mgZm lのモノクローナル抗体を含む腹水を得ることができた。得られた腹水を 4 0 %飽和硫酸アンモニゥムで塩析後、 I gGクラスの抗体をプロテイン Aァフィゲル（B i o— R a d) に吸着させ、 0. 1 Mクェン酸緩衝液（ p H 5 ) で溶出することにより精製した。

(h) モノクローナル抗体のクラス、サブクラスの決定

前述した E L I S Aに従い、各ポリペプチド A、ポリペプチド B、ポリぺプチド Cまたはポリぺプチド Dをコートしたマイクロタイトレーシヨンプレートに、（f) で得られたモノクローンの上清を加えた。次に PBSで洗浄後、アイソタイプ特異的ゥサギ抗マウス I gG抗体（Zy m e d Lab. ) を加えた。 PBSにより洗浄後、西洋わさびペルォキシダ一ゼ標識ャギ抗ゥサギ I gG (H + L) を加え、基質として過酸化水素および 2， 2' —アジノ一ジ（3—ェチルベンゾチアゾリン酸）を用いてクラス、サブクラスを決定した。最終的に表 1〜表 4に示したように MT— MMP— 3に対するモノクロ一ナル抗体産生ハイブリド一マを得た。

表 1

表 2

表 4

なお、クローン番号 117-4E1は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP— 5 5 7 2として寄託保存されている（平成 7年 7月 5日（原寄託日）に寄託された微ェ研菌寄第 P— 1 5 0 3 1号 (原寄託）よりブダぺスト条約に基づく寄託への移管請求が平成 8年 7 月 1日にされた）。

( i ) 抗 MT— MM P— 3モノクローナル抗体の特異性

ヒト新生児線維芽細胞（NB 1 RGB) の培養上清中からそれぞれ精製した潜在型 MM P— 1 (C l i n. C h i m. Ac t a, 2 1 9 : 1 〜1 4, 1 9 9 3 ) 、潜在型 MM P— 2 (C l i n. C h i m. Ac t a, 2 2 1 : 9 1〜 1 0 3， 1 9 9 3 ) 及び潜在型 MM P- 3 (C 1 i n. Ch i m. A c t a, 2 1 1 : 5 9〜 7 2， 1 9 9 2) 、ヒト直腸癌細胞（C aR— 1) の培養上清から精製した潜在型 MMP— 7 (C a n c e r Re s. , 5 0 : 77 5 8〜 7 7 6 4， 1 9 9 0) 、ヒト好中球より精製した潜在型 MMP— 8 (B i o l . Ch em. Ho p p e 一 S e y l e r, 3 7 1 : S u p p l eme n t 2 9 5〜3 0 4， 1 9 9 0) 並びにヒト線維芽細胞腫株（HT 1 0 8 0 ) の培養上清から精製した潜在型 MMP— 9 (J. B i o l. C h em. , 2 67 : 2 1 7 1 2〜2 1 7 1 9， 1 9 9 2 ) をそれぞれ抗原として使用し、前述の（e) に記載した固相—抗体結合テスト法（EL I S A) によりヒト MT— M MP— 3ぺプチドと陽性反応を示す抗 MT— MMP— 3モノクローナル抗体（モノクロ一ン番号 1 1 7— 4 Eし 1 5 7— 6 F 5及び 1 5 8— 8 E 6) の交差反応性を調べた。

すなわち、ポリスチレン製 9 6穴プレートを使用し、各ゥヱルに精製した各 MMP— 1、 MMP— 2、 MMP— 3、 MMP— 7、 MMP— 8 及び MMP— 9をそれぞれ 50 n g/we 1 1で加えコ一トした。洗浄用 PBSで洗浄し未吸着の抗原を除去した後、各ゥエルの未コート部分を 3 %スキムミルク含有 P B Sでブロックした。この各ゥエルに各抗 M T一 MMPモノクローナル抗体それぞれを 1 g/we 1 1で加え、室温で約 1時間静置した。プレートを洗浄後、 2次抗体としてペルォキシダ一ゼ標識ャギ抗マウス免疫グロプリンを加えさらに室温で約 1時間反応させた。次に基質である過酸化水素と 0 —フヱニレンジアミンを加え、発色の程度をマイクロプレート用吸光度測定機（MRP— A4、東ソ一）を用いて 4 9 2 nmの吸光度で測定した。

その結果、抗 MT— MMP— 3モノクローナル抗体は何れも、供試した MT— MMP— 3以外の精製 MM P sと反応性を示さなかった。

本実施例 3の方法を、合成べプチド抗原の代わりにリコピナント MT 一 MM P— 3、例えば下記実施例 4あるいは 5の方法で得られたリコビナント MT— MMP— 3を抗原として用いることにより繰り返し、同様にして抗 MT— MMP— 3モノクローナル抗体を作製する。実施例 4 遺伝子産物の発現と同定

動物細胞を宿主として MT— MMP— 3を発現させるため、 cDNA を発現ベクターと連結した。本実施例では、発現用べクタ一には SV 4 0のプロモーター、ェンハンサ一、ポリ Aシグナル、 sma l l T an t i g e n遺伝子の介在配列を含む p S G 5 (S t r a t a gen e) を用いた。実施例 1 (e) で構築した MT— MMP— 3遺伝子をクローン化した組換え pB l u e s c r i p t™ (S t r a t a gen e) から E c oR I切断により 2. 1 kbの挿入断片を切り出し、真核細胞用発現ベクター p S G 5の E c 0 R Iサイトにクローニングし、発現用プラスミド p S GMT 2を作製した。ライゲーシヨン反応は、ライゲーシヨンキッ卜に添付のプロトコールに従って行った。 5%ゥシ胎児血清及び 2mM g 1 u t am i n eを含むダルべッコ改変ィ一グル培地 (Du l b e c co s mod i f i ed Eag l e' s m e d i urn ; DMEM) 中で培養したアフリカミドリザル腎由来細胞 COS 一 1に p S GMT 2及び p S GT 1 (T I M P— 1 c D N Aを p S G 5 にクローン化してあるもの）をリン酸カルシウム法によりコトランスフェクシヨンした（V i r o l ogy, 52 : 456， 1 973) 。対照として、 pSG5単独で COS— 1をトランスフヱクシヨンした。

すなわち、蒸留水に 2 a gの組換え p S G 5あるいは p S G 5単独に、 60 / 1の 0. 25M C a C 1₂ を加え、次に 2 X B B S溶液（ 2.

8 mM Na₂ HP〇.，及び 28 OmM NaC l含有50mM BE S緩衝液、 pH7. 9) 62. 5〃 1をチューブの底に加えた。これを混合後、室温で 30分程度放置し、沈殿形成を十分行った。沈殿をピぺッティングにより分散し、 COS— 1細胞に滴下した後、 C0₂ インキュべ一ター中で約 24時間インキュベートした。次に培地を除き、細胞を P B Sで洗浄後、 30 C i /m 1の^{3 s} S—メチォニンを含む新鮮なメチォニン不含 DMEMを加えた。培養を 5時間継続し、細胞タンパク質を³⁵ Sで標識した。

遠心分離により細胞とコンディシヨン培地を分離し、細胞を溶解緩衝液（0. 15M N a C K 0. 1 % Sod i um de oxy ch o l a t e、 0. 1 % SDS、 1 mM Tr i t on X— 1 00、 1 % NP— 40、 1 mM EDTA、 1 mM pheny lme t a ne s u l f ony l f l uo r i de (PMSF) 含有 1 0 mM T r i s— HC 1緩衝液、 pH 7. 5 ) 中で 4 °C、 1時間インキュベー卜した。細胞溶解液を遠心分離し、上清を回収した。上清及びコンディション培地を実施例 3で得られた抗 MT—MM P— 3ポリぺプチド抗体 c l one N 0 s. 1 17— 4 E 1あるいは 1 17— 1 3 B 6、また対照として抗 T I MP— 1抗体 c 10 n e No. 50 _ 1 H 7と 4 °C、 1 6時間反応させた。 c 1 o n e No s. 1 17— 4 E lあるいは 1 1 7 - 1 3 B 6抗体は、抗 MT— MMP— 3モノクローナル抗体の中でも非特異的反応性の低いものとして選択した。これらの抗原一抗体複合体にプロティン Aを力ップリングさせたセファロース一 4 B (P h a r ma c i a) を加え、 4 °Cで 2時間攪拌しながらインキュベートし、免疫沈降を行った。次に、遠心分離により免疫沈降させたモノクローナル抗体を力ップリングしたセファロースー 4 Bを沈殿させ、細胞溶解液で 3回洗浄し、最後に 0. 05 M T r i s— HC 1緩衝液、 pH 6. 8 で洗浄した。この洗浄したセファロース一 4 Bに SDSポリアクリルァミド電気泳動用サンプル緩衝液（1 0% g l y c e r o l、 2% S DS、 2 % /3-me r c ap t o e t hano 0. 1 % b r o mo p h e n o 1 b l u e含有 50 mM T r i s— H C 1緩衝液、 pH6. 5) を加え、 1 00 で 3分間加熱した後、 12 % S D Sポリアクリルアミド電気泳動を行った。バイオイメージアナライザー B A S 1 0 00 (富士写真フィルム株式会社）を用いて泳動後のゲルのシグナルの検出を行い、その結果を図 3に示した。

使用した抗 MT— MMP— 3ポリぺプチド抗体 c l o n e No s. 1 1 7— 4 E 1及び 1 1 7— 1 3 B 6はいずれも、 MT— MMP— 3遺伝子をトランスフヱクションした細胞のセルライゼ一ト中の分子量 64 kD aのタンパク質を免疫沈降した。対照とした MT— MMP— 3遺伝子を含まないベクター p SG 5単独をトランスフヱクトした細胞では、何れの抗体でも分子量 6 4 kDaタンパク質は免疫沈降されなかった。免疫沈降で検出されたタンパク質の分子量 64 kDaは、配列表配列番号： 2に記載したアミノ酸配列から算出される分子量とほぼ一致した。また、分子量 3 0、 3 3及び 5 2 kD aに相当する 3本のバンドが M T-MMP- 3遺伝子をトランスフヱクションした細胞のセルライゼ一ト中から検出されたが、対照ではこれらのバンドは検出されなかった。一方、セルライゼートから免疫沈降されたこれらタンパク質は、コンデイシヨン培地中からは検出されなかった。これに対し、丁 11^?ー 1は分泌タンパク質であるが、実際、発現した T I MP— 1は、その殆どがコンディション培地中に検出され、確かに細胞外に分泌されていることが確認された。

以上の結果は、 MT— MMP— 3は、そのアミノ酸配列からシグナルぺプチドの存在が示唆されるにも拘らず、容易に分泌されないことを示している。この知見は、 MT— MMP— 1が細胞表層上で発現し培地中では検出できなかった先の本発明者らの知見（Na t u r e, 3 7 0 ; 6 1〜6 5， 1 9 9 4 ) と非常によく類似している。

MT— MMP— 3 cDNAは、 mRN Aから逆転写酵素により合成された完全長の c D N Aであるので、この c D N Aを適当な発現べクタ一に移すことで、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等を宿主として MT— MMP- 3を大量生産できる。 P SGMT 2を COS— 1に導入した本実施例では、 MT— MMP— 3の産生は短期的（ t r a n g i e n t e x p r e s s i o n) であるが、適当な選択マーカー（n e o遺伝子、 d e h y d r o f o l a t e r e d u c t a s e遺伝子等) を有する発現ベクターを使用し、 C H 0細胞等に導入することにより長期間生産可能な細胞株を得ることもできる。実施例 5 MT— MMP— 3の C末端疎水性ァミノ酸連続配列の機能 (a) MT— MMP— 3の C末端疎水性アミノ酸連続配列と T I MP— 1 とのキメラタンパク質（T I MP/MT- 3) 及び MT— MMP— 1 の C末端疎水性ァミノ酸連続配列と T I MP- 1とのキメラタンパク質 (T I MP/MT- 1 ) の調製

MT— MMP sの C末端疎水性ァミノ酸連続配列と T I M P— 1とのキメラタンパク質の調製は、 C a 0らの MT— MMP— 1のトランスメンブレンドメインと T I MP— 1とのキメラタンパク質の調製法（J. B i o l . Ch e m. ， 1 3 ; 8 0 1〜8 0 5， 1 9 9 5) に準じて行つた。

MT— MMP— 3の C末端疎水性ァミノ酸連続配列を含むァミノ酸配列（A 1 a ⁵⁵⁶ 〜Va 1⁶⁰⁴ ) をコードする cDNA断片、あるいは M T-MMP- 1の C末端疎水性ァミノ酸連続配列を含むァミノ酸配列 (G 1 y ⁵³ⁱ 〜V a 1⁵⁸² ) をコ一ドする c D N A断片を P C Rにより増幅し、断片を回収した。 PCR増幅は、実施例 1 (b) と同様にして行った。

得られた DNA断片それぞれを T I MP— 1 c DNAの 3' 末端側に連結し、 p SG 5にサブクローニングすることにより T I MP— 1 /M T- 3キメラタンパク質発現プラスミド p S GT 1 Μ2及び T I MP— 1 /ΜΎ- 1キメラタンパク質発現プラスミド p S GT 1 M 1を作製した。ライゲ一シヨン反応は、ライゲ一シヨンキットに添付のプロトコ一ルに従って行った。

これらのプラスミドの COS— 1へのトランスフエクションは実施例

4に記載と同様に行った。 5 %ゥシ胎児血清及び 2 mM 1 u t am i n eを含む DMEM中で培養した COS— 1に p S GT l M 2、 p S GT 1 M lあるいは p SGT 1それぞれをリン酸カルシウム法によりトランスフヱクシヨンした。対照として、 p S G 5単独で COS— 1をトランスフエクシヨンした。すなわち、 2 / gのプラスミド DNAに、 6 0〃 1の0. 2 5 M C a C を加え、次に 2 X B B S溶液（2. 8 mM N a ₂ ΗΡΟ 及び 2 8 O mM N a C 1含有 5 0 mM BES 緩衝液、 pH 7. 9) 6 2. 5〃 1をチューブの底に加えた。これを混合後、室温で 3 0分程度放置し、沈殿形成を十分行った。沈殿をピぺッティングにより分散し、 COS— 1細胞に滴下した後、 C0₂ インキュベ—ター中で約 ₂ 4時間インキュベートした。次に培地を除き、細胞を P B Sで洗浄後、 ³⁵ S—メチォニンを含む新鮮なメチォニン不含 DM E Mを加えた。培養を 5時間継続し、細胞タンパク質を ³⁵ Sで標識した。遠心分離により細胞とコンディシヨン培地を分離し、細胞は溶解緩衝液（0. 1 5 M N a C l、 0. 1 %S o d i urn d e o x y c h o l a t e. 0. 1 % SD S、 1 mM T r i t o n X— 1 0 0、 1 % NP— 4 0、 1 mM EDTA、 1 mM PMS F含有 l O mM T r i s— HC 1緩衝液、 pH 7. 5 ) 中で 4 ° (、 1時間インキュべ一トした。細胞溶解液を遠心分離し、上清を回収した。上清及びコンデイション培地を実施例 3で得られた抗 T I MP— 1抗体 c l o n e N o. 50— 1 H 7と 4 °Cで 1 6時間反応させた。得られた抗原一抗体複合体にプロティン Aを力ップリングさせたセフアロースー 4 B (P h a rma c i a) を加え、 4 °Cで 2時間攪拌しながらインキュベートし、免疫沈降を行った。次に、遠心分離により免疫沈降させたモノクロ一ナル抗体を力ップリングしたセファロースー 4 Bを沈殿させ、細胞溶解液で 3回洗浄し、最後に 0. 05 M T r i s— HC 1緩衝液、 pH 6. 8で洗浄した。この洗浄したセファロース— 4 Bに SDSポリアクリルァミド電気泳動用サンプル緩衝液（1 0% g l y c e r o l、 2 % SDS、 2 % 3-me r c ap t o e t hano 0. 1 % b r omopheno l 131リ 6含有50 1^ Tr i s—HC l緩衝液、 pH6. 5) を加え、 100°Cで 3分間加熱した後、 12% S DSポリアクリルアミド電気泳動を行った。バイオイメージアナライザ一 BAS 1 000 (富士写真フィルム株式会社）を用いて泳動後のゲルのシグナルの検出を行った。

T IMP— 1、 T I MP- 1 /MT- 1 , T IMP— 1ZMT— 3はセルライゼート中で、それぞれ 28、 32、 32 kD aのタンパク質として検出された。検出されたキメラタンパク質 T IMP- 1/MT- 1 及び T I MP- 1 ZMT— 3の分子量は、融合遺伝子から推定される分子量と合致した。丁11^?ー1は、セルライゼート中でも検出されたが、その大半はコンディション培地中に検出された。一方、 TIMP— 1Z MT— 1は、セルライゼ一ト中からのみ検出され、コンディション培地中からは検出されなかった（J. B i 01. C h em. ， 1 3 ； 80 1 〜805， 1 995 ) 。これに対し、 T I MP— 1 /MT— 3は T I M P— 1 ZMT— 1と同様セルライゼ一卜からのみ検出され、全く同じ局在を示した（図 4) 。

これらの結果は、 MT— MMP— 3の C末端領域の疎水性ァミノ酸連続配列が MT— MMP— 1の C末端領域の疎水性ァミノ酸連続配列と同様に融合タンパク質の細胞外への分泌を抑制していることを示している

(b) 細胞表層でのキメラタンパク質の発現

MT— MMP— 3の C末端領域の疎水性ァミノ酸連続配列が実際にトランスメンブレンドメィンとして機能しているかどうかを、 T I MP— 1 /MT— 3発現細胞の間接蛍光免疫染色により検討した。

COS— 1に pSGTlあるいは pSGT 1 M 2を実施例 4に記載の方法と同様にリン酸カルシウム法により卜ランスフヱクションした。但し、本実施例では、アイソトープラベルした培地は使用せず、細胞はスラィドチャンバー上で培養した。培養 24時間後、細胞を 5 / gZm 1 の抗 T I MP— 1抗体 c 10 n e No. 50 - 1 H 7 3%BSA含有 PBS中で 37 °Cで 40分間反応させた。次に細胞を 3% BSA含有 PBSで 3回洗浄し、風乾後、 95% アセトンで 5分間固定した。続いて細胞を 3% 83 含有？88に浸し、 1 500倍に希釈した f l uo r e s c en t i s o t h i o cy an a t e (F I TC) 標識ゴート抗（マウス I gG) I gG (Cap e 1 ) と 37 °Cで 30分間反応させた後、ふたたび 3 % B S A含有 P B Sで過剰な抗体を洗浄した。最後に g 1 y c e r i nを重層し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、 p SGT 1 M2を発現している細胞（キメラタンパク質 T IMP— 1ZMT— 3を発現している細胞）では、細胞表面に蛍光が観察され、キメラタンパク質の T I MP— 1部分が細胞表層上で発現していることが確認された。一方 p SGT 1を発現している細胞（キメラでない T I MP— 1を発現している細胞）では蛍光は観察されず、細胞表層での T I MP— 1の発現は認められなかった（図 5) 。

この結果は、 MT— MMP— 3の C末端の疎水性ァミノ酸連続配列がトランスメンブレンドメインとして機能していることを示している。実施例 6 MT— MM P— 3の発現による潜在型 MM P— 2の活性化実施例 4で作製した MT— MMP— 3 c DN Aをクローン化したブラスミド p SG 5M2あるいは MT— MMP— 1 cDNAをクローン化したプラスミド p SG 5M1あるいはベクタ一 p SG 5それぞれと、潜在型 MMP— 2をクローン化したプラスミド p SGGAを、実施例 4に記載したリン酸カルシウム法により COS— 1にコトランスフヱクションした。ただし、： S—メチォニン含有新鮮培地の代わりに、通常の新鮮培地を使用した。また、ヒト線維芽細胞腫株 HT— 1 0 8 0に、 p S G T 1あるいは p SGT2あるいは p SG 5それぞれと、 p SGM2を、同様にコトランスフエクションした。 HT— 1 0 80は、潜在型 MMP 一 2及び潜在型 MMP— 9を構成的に分泌しており（図 6中の 6 8 KD a及び 97. 4 kD aのバンドにそれぞれ相当）、また、 MT— MMP 一 3 c DNAをトランスフェクションした細胞では、 MT— MMP— 3 が発現していることを免疫沈降実験により確認した（実施例 4参照）。得られたトランスフヱクタントを無血清 DMEM中で 24時間培養し、回収した培養上清をサイモグラフィーにかけた。培養上清を S D Sポリァクリルァミド電気泳動用サンプル緩衝液（非還元； 1 0% g 1 y c e r o l、 2 % SDS、 0. 1 % b r omo p h e n o l b 1 u e含有 50 mM T r i s— H C 1緩衝液、 p H 6. 5) と混和後 37 °Cで 2 0分間インキュベートした後、 0. 1 % g e l a t i n含有 1 0 %ポリアクリルァミドゲルを用い、電流 2 0 m A、 4 °Cで電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルを 2. 5 % T r i t 0 nX- 1 0 0溶液中で 1時間ゆっくり振盪しながら洗浄し、次にゼラチナーゼ用緩衝液（1 0 mM C aC " 、 0. 1 5M N a C 0. 02% N aN:< 含有 5 0 mM T r i s— H C 1、 pH 7. 6 ) 中で 3 7 °Cで 2 4時間ゆつくり振盪させながらインキュベードした。緩衝液を廃棄し、ゲルを 0. 1 % c o oma s s i e b r i 1 1 i a n t b l u e R 2 5 0 ( 5 0 %メタノ一ルー 1 0 %酢酸に溶解）で 1時間染色後、脱色液 (5%メタノール一 7. 5 %酢酸）に浸し脱色した。得られたザィモグラフィ一の結果を図 6に示した。

MT-MMP- 3 cDNAをトランスフヱクシヨンした COS— 1では、 MT— MMP— 1 cDNAをトランスフエクシヨンした COS— 1 と同様に、新たにそれぞれ活性中間体 MM P— 2と活性型 MM P— 2に相当する 6 4 kDaと 6 2 kDaのバンド力く出現し、潜在型 MM P— 2 の活性化が確認された。一方、ベクター p SG 5をトランスフヱクションした細胞では、潜在型 MMP— 2の 6 8 kD aのバンドのみが検出され、活性化に伴う分子量変化は観察されなかった（図 6 A) 。 .

COS— 1細胞では、潜在型 MM P— 2発現プラスミド（p SGGA) をコトランスフヱクシヨンし、発現プラスミド由来の潜在型 MMP— 2 の活性化を観察したが、潜在型 MMP— 2を構成的に発現する HT 1 0 8 0でも同様に、 MT— MMP— 3の発現に伴う潜在型 MMP— 2の活性化が観察された。この HT 1 0 8 0で観察された活性型 MMP— 2は、細胞を 1 0 0 g/mlのコンカナバリン Aで処理して誘導される活性型 M MP— 2分子と同じ分子量を示し、また抗 MMP— 2モノクローナル抗体と特異的に反応した。この活性化は、ベクタ一単独をトランスフヱクシヨンしたコントロールでは観察されなかった。一方、潜在型 MM P— 9は、コントロールの細胞と同様に分子量の変化は認めらず、活性化は認められなかった。

T I MP— 1と MT— MMP— 3、あるいは T I MP— 2と MT— M MP— 3をコトランスフヱクションした細胞における潜在型 MMP— 2 の活性化は、何れも抑制された。その抑制の程度は T I MP— 2をコトランスフヱクシヨンした細胞の方が、 T IMP— 1の場合よりも顕著であり、この傾向は MT— MMP_ 1、 MT— MMP— 3とも同様であつた（図 6 B)。

本発明の態様のうちには、（A) 潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ MT— MM P— 1以外の潜在型 MM P— 2活性化因子である天然の MT— MMPと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質またはその塩；（B)該タンパク質が MT— M MP— 3またはその塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは実質的に同等の一次構造コンフオメーションを持つものであることを特徴とする上記（A) 項記載のタンパク質；（C) C末端領域に、配列表の配列番号： 2の A l a ^5fil 〜Phe^5! で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同等のァミノ酸配列を有することを特徴とする上記 (A) 項又は（B) 項記載のタンパク質；（D)配列表の配列番号： 2で表されるァミノ酸配列又はそれと実質的に同等のァミノ酸配列を有する MT 一 MMP— 3またはその塩であることを特徴とする上記（A)〜（C) 項のいずれか一記載のタンパク質；（E) 外因性 DNA配列を原核生物にお、て発現して得たものであるか、あるいは真核生物で発現させて得たものであることを特徴とする上記（A)〜（D) 項のいずれか一記載のタンパク質；（F) 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のァミノ酸配列を有することを特徴とする上記 (A) 〜（E) 項のいずれか一記載のタンパク質；（G)上記（A)〜 (F) 項のいずれか一記載のタンパク質の部分べプチドまたはその塩； (H) 上記（A) 〜（F) 項のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドをコ一ドする塩基配列を有することを特徴とする核酸；（ I ) 上記（B)〜（D) 項のいずれか一記載の MT— MMP— 3をコードする塩基配列を有する DNA遺伝子であることを特徴とする上記（H) 項記載の核酸；（J) 配列表の配列番号： 1で表される塩基配列のうちォ一プンリ一ディングフレーム部分又はそれと実質的に同等な活性を有する塩基配列を有することを特徴とする上記（H) 又は（I) 項記載の核酸；（K) 上記（H)〜（J) 項のいずれか一記載の核酸を含有することを特徴とするベクター；（L) 上記（H) 〜（J) 項のいずれか一記載の核酸又は上記（K) 項記載のベクターを保有することを特徴とする形質転換体；（M) 上記（L) 項記載の形質転換体を増殖可能な栄養培地中で培養し、組換えタンパク質として MT— MMP— 3またはその塩を包含する上記（A)〜（F) 項のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドを生成せしめることを特徴とする MT— MM P— 3またはその塩を包含する上記（A)〜（F) 項のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドの製造方法にも関連する。こうしたタンパク質又はその部分ペプチド、さらには核酸は標識され測定 ·検査などに用いるものであることもできる。

本発明の態様のうちには、（a) MT— MMP— 3又はその塩を包含する請求の範囲に記載の請求項 1〜 6のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドを抗原として用い、それに対する抗体を得ることを特徴とする MT— MMP— 3を包含する請求の範囲に記載の請求項 1〜 6のいずれか一記載のタンパク質に対する抗体の製造方法；（b) MT -MMP- 3を包含する請求の範囲に記載の請求項 1〜6のいずれか一記載のタンパク質に対する抗体；（c) 抗血清であることを特徴とする上記（b) 項記載の抗体；（d) モノクローナル抗体であることを特徴とする上記（b) 項記載の抗体；（e) MT— MMP— 3又はその塩に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする上記（b) 項又は (d) 項記載の抗体；（f ) MT— MMP— 3又はその塩を包含する請求の範囲に記載の請求項 1〜 6のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドまたはその塩で免疫した動物から得られた M T— MM P— 3を包含する請求の範囲に記載の請求項 1〜 6のいずれか一記載のタンパク質に対する抗体を産生する細胞を、継代培養可能な細胞と融合せしめ、継代培養可能でかつ MT— MMP— 3を包含する請求の範囲に記載の請求項 1〜 6の、ずれか一記載のタンパク質に対する抗体を産生するハイプリッド細胞を選別することを特徴とする上記（d) 項又は（e) 項記載の抗体の産生方法；（g) 請求の範囲に記載の請求項 1〜 6のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドあるいはその塩を試薬として用いる力、、あるいは上記（b) 〜（e) のいずれか一記載の抗体を試薬として用いることを特徴とする MT— MMP— 3の検出 ·測定方法；（h) 上記（g) 項の MT— MMP— 3の検出 ·測定方法に用いる標識化された MT— MMP— 3に対する抗体：（ i ) 上記（g) 項の M T-MMP- 3の検出 ·測定方法に用いる標識化された MT— MMP— 3又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩を包含する請求の範囲に記載の請求項 1〜 6のいずれか一記載の標識化されたタンパク質あるいはその部分ペプチド又はその塩；（j ) MT— MMP— 3発現細胞あるいは発現組織の検出 ·測定方法に用いる標識化された請求の範囲に記載の請求項 8〜 1 0の、ずれか一記載の核酸；及び（ k ) ハイブリダィゼ一シヨン 'プローブであることを特徴とする上記（j) 項記載の核酸なども含まれてよい。産業上の利用可能性

潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT—

MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT— MM Pと実質的に同等な活性を有するタンパク質またはその塩を得ることができ、さらにそのタンパク質をコードする核酸が得られたことで、癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診断治療に関わる研究に有用な診断手段が得られることになつた。またその他の医学的生理学的用途に有用でもある。本発明は特にヒト癌細胞表層で特異的に発現している新規マトリックスメタロプロテアーゼ、それをコ一ドする塩基配列を含有する D N A、該 D N Aで形質転換せしめた宿主細胞、該宿主細胞を用いる該マトリックスメタ口プロテアーゼの製造方法、該マトリックスメタ口プロテア一ゼタンパク質に特異的に結合するモノクロ一ナル抗体、さらにはそれらタンパク質及び抗体の用途がそれぞれ提供され、癌の診断、悪性度の判定マーカ一及び癌などに対する抗転移薬剤の標的として、細胞表層で特異的に発現しているマトリックスメタ口プロテアーゼを研究することが可能となった。アルツハイマー病の研究にも資することが可能となった。本発明により、有効な検知診断手段が提供される。

配列表

【配列番号： 1】

配列の長さ： 2107

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA

起源

生物名：ヒト

配列

GGCTCCTTAC CCACCCGGAG ACTTTTTTTT GAAAGGAAAC TAGGGAGGGA GGGAGAGGGA 60 GAGAGGGAGA AAACGAAGGG GAGCTCGTCC ATCCATTGAA GCACAGTTCA CT ATG 115

Met

1

ATC TTA CTC ACA TTC AGC ACT GGA AGA CGG TTG GAT TTC GTG CAT CAT 163 l ie Leu Leu Thr Phe Ser Thr Gly Arg Arg Leu Asp Phe Val Hi s Hi s

5 10 15

TCG GGG GTG TTT TTC TTG CAA ACC TTG CTT TGG ATT TTA TGT GCT ACA 211 Ser Gly Val Phe Phe Leu Gin Thr Leu Leu Trp He Leu Cys Ala Thr

20 25 30

GTC TGC GGA ACG GAG CAG TAT TTC AAT GTG GAG GTT TGG TTA CAA AAG 259 Val Cys Gly Thr Glu Gin Tyr Phe Asn Val Glu Val Trp Leu Gin Lys

35 40 45

TAC GGC TAC CTT CCA CCG ACT AGC CCC AGA ATG TCA GTC GTG CGC TCT 307 Tyr Gly Tyr Leu Pro Pro Thr Ser Pro Arg Met Ser Val Val Arg Ser

50 55 60 65

GCA GAG ACC ATG CAG TCT GCC CTA GCT GCC ATG CAG CAG TTC TAT GGC 355 Ala Glu Thr Met Gin Ser Ala Leu Ala Ala Met Gin Gin Phe Tyr Gly

70 75 80

ATT AAC ATG ACA GGA AAA GTG GAC AGA AAC ACA ATT GAC TGG ATG AAG 403 l ie Asn Met Thr Gly Lys Val Asp Arg Asn Thr l i e Asp Trp Met Lys

85 90 95

AAG CCC CGA TGC GGT GTA CCT GAC CAG ACA AGA GGT AGC TCC AAA TTT 451 Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Gin Thr Arg Gly Ser Ser Lys Phe

100 105 110

CAT ATT CGT CGA AAG CGA TAT GCA TTG ACA GGA CAG AAA TGG CAG CAC 499 Hi s H e Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Leu Thr Gl y Gin Lys Trp Gin Hi s

115 120 125 os8 n on

nio SJV V naq 3\\ ¾i naq 丄 usv sqj usy Ayo dsv SAQ 8Π usv IT 9V010310D 113 LLV 100 V1313V OVV 1113VV 009 IVO 10131V OVV

928 Oeg

OJd sAq ¾iv Ai9 OJd JAi J9S OJd 3jy Ajg J¾ OJd OJJ 3jy OJd OJd

2ΖΠ 330 VVV 3D0 VOO 303 IV丄 001333 VOV 300 OOV V03133 003133丄 33

028 S18 018

sAq ojj Sjy dsv usy sAq Sjy OJJ dsy ¾tv OJJ OJJ an S-^V SIH

S丄 Οΐ VVV V33 OOV 3V0 IVV VVV OOV VD3 OVO 130 D03133 I1V 1313033V3

SOS 008 S62 062

OJd OJJ fBA J MX ojj nai OJJ SJV ^JlU ^0Λά OJd OJJ an sAq ds OJJ

ISOT VOO 333 OXD VOV 033 V13133 VOV VOV 130 VOO 133 LLV 9VV OVO丄)：）

98Z 082 SAZ

J9S J^L UIO SIH 丄 dsv dsv usv OJJ naq U13 nsq 丄

6A6 VOI 01V XVI VOV OVO IVO OOV OVI IVO IVO IVV 133 via VVO 113 vov

Q^g ggg

uiO nio }dV{ ΛΑΙ ui J aqd OJd ¾iv 19W all ¾TV 丄 OJd dsy usv

186 OVO VVO 01V OVX OVO OVI 1X1 VOO 10001V 31V 33010V 333 OVO IVV

952 OSZ 9 2

J9S SIH "10 nai A[g na ¾tv S!H to na nio SIH 1¾Λ ¾t Λ "31

888 031 XVO OVO Oil V03913130 IVO V090X3 VVO IVD 310 VOO VIO丄丄）

0^2 982 OSZ

9 ild ^η3Ί dsv usv ^10 ds SIH USV OJJ us Aig nsq jq c 丄 OJ<J

988 丄丄丄 VIL 3V9 IVV VOO IVO IVO IV 133 IVV VOO VIO V3V 001 VOO OVO

ZZ OZZ 512 012 ds J3S dsy slid SIH J¾ dsy A[9 io 9π A{0 OJd Aio OJ^ aqd J

IVO VOX OVO ill 1V333V IVO VOO VOO 1IV VOO VOO VOO 100311 OVI

¾IV SIH ¾I tiaq

68A 330 XVO V30 Oil

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595 600 604

TTTCTTTCTT TTGCAGGAGT TTGTGGTAAC TTGAGATTCA AGACAAGAGC TGTTATGCTG 2004

TTTCCTAGCT AGGAGCAGGC TTGTGGCAGC CTGATTCGGG GCTGACCTTT CAAACCAGAG 2064

GGTTGCTTGG TCCTGCACAT GAGTGGAAAT ACACTCATGG GGA 2107

【配列番号： 2】

配列の長さ： 604

配列の型：アミノ酸

配列の種類：タンパク質

起源

生物名：ヒト

配列

Met lie Leu Leu Thr Phe Ser Thr Gly Arg Arg Leu Asp Phe Val His

1 5 10 15

His Ser Gly Val Phe Phe Leu Gin Thr Leu Leu Trp lie Leu Cys Ala

20 25 30

Thr Val Cys Gly Thr Glu Gin Tyr Phe Asn Val Glu Val Trp Leu Gin

35 40 45

Lys Tyr Gly Tyr Leu Pro Pro Thr Ser Pro Arg Met Ser Val Val Arg

50 55 60

Ser Ala Glu Thr Met Gin Ser Ala Leu Ala Ala Met Gin Gin Phe Tyr

65 70 75 80

Gly lie Asn Met Thr Gly Lys Val Asp Arg Asn Thr lie Asp Trp Met

85 90 95

Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Gin Thr Arg Gly Ser Ser Lys

100 105 110

Phe His lie Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Leu Thr Gly Gin Lys Trp Gin

115 120 125

His Lys His lie Thr Tyr Ser lie Lys Asn Val Thr Pro Lys Val Gly

130 135 140 s on

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Pro Glu Ser Pro Gin Gly Ala Phe Val His Lys Glu Asn Gly Phe Thr

485 490 495

Tyr Phe Tyr Lys Glu Gly Val Leu Glu lie Gin Thr Thr Arg Tyr Ser

500 505 510

Arg Leu Glu Pro Gly His Pro Arg Ser lie leu Lys Asp Leu Ser Gly

515 520 525

Cys Asp Gly Pro Thr Asp Arg Val Lys Glu Gly His Ser Pro Pro Asp 530 535 540

Asp Val Asp lie Val lie Lys Leu Asp Asn Thr Ala Ser Thr Val Lys 545 550 555 560

Ala lie Ala lie Val lie Pro Cys lie Leu Ala Leu Cys Leu Leu Val

565 570 575 Leu Val Tyr Thr Val Phe Gin Phe Lys Arg Lys Gly Thr Pro Arg His

580 585 590 lie Leu Tyr Cys Lys Arg Ser Met Gin Glu Trp Val

595 600 604

【配列番号： 3】

配列の長さ： 20

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

SGNVVNGCWG AYATMRTSAT 20

【配列番号： 4】

配列の長さ： 27

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

YTCRTSNTCR TCRAARTGRR HRTCYCC 27

【配列番号： 5】

配列の長さ： 14

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Gin Thr Arg Gly Ser Ser Lys Phe His lie Arg Arg Lys Arg

1 5 10 14

【配列番号： 6】

配列の長さ： 14

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Glu Glu Val Pro Tyr Ser Glu Leu Glu Asn Gly Lys Arg Asp

1 5 10 14

【配列番号： Ί】

配列の長さ： 18

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Pro Thr Ser Pro Arg Met Ser Val Val Arg Ser Ala Glu Thr Met Gin 1 5 10 15

Ser Ala

18 【配列番号： 8】

配列の長さ： 14

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Thr Leu Gly Asn Pro Asn His Asp Gly Asn Asp Leu Phe Leu 1 5 10 14

Claims

請求の範囲

1. 潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ M T-MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT— MM Pと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質またはその塩。

2. 該タンパク質が MT— MMP— 3またはその塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは実質的に同等の一次構造コンフォメーションを持つものであることを特徴とする請求項 1記載の夕ンパク質。

3. C末端領域に、配列表の配列番号： 2の A l a⁵⁶¹ 〜Ph e⁵⁸⁴ で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同等のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 1又は 2記載のタンパク質。

4. 配列表の配列番号： 2で表されるァミノ酸配列又はそれと実質的に同等のァミノ酸配列を有する MT— MMP— 3またはその塩であることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか一記載のタンパク質。

5. 外因性 DN A配列を原核生物において発現して得たものであるか、あるいは真核生物で発現させて得たものであることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか一記載のタンパク質。

6. 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 1 ~ 5のいずれか -

7. 請求項 1〜 6のいずれか一記載のタンパク質の部分べプチドまたはその塩。

8. 請求項 1〜 7のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドをコ一ドする塩基配列を有することを特徴とする核酸。

9. 請求項 2〜4のいずれか一記載の MT— MMP_ 3をコ一ドする塩基配列を有する D N A遺伝子であることを特徴とする請求項 8記載の核酸。

1 0. 配列表の配列番号： 1で表される塩基配列のうちオープンリ一ディングフレーム部分又はそれと実質的に同等な活性を有する塩基配列を有することを特徴とする請求項 8又は 9記載の核酸。

1 1. 請求項 8〜 1 0のいずれか一記載の核酸を含有することを特徴とするベクタ一。

1 2. 請求項 8〜 1 0のいずれか一記載の核酸又は請求項 1 1記載のベクタ一を保有することを特徴とする形質転換体。

1 3. 請求項 1 2記載の形質転換体を増殖可能な栄養培地中で培養し、組換えタンパク質として MT— MMP— 3またはその塩を包含する請求項 1〜 6のいずれか一記載の夕ンパク質又はその部分べプチドを生成せしめることを特徴とする MT— MMP— 3またはその塩を包含する請求項 1〜6のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドの製造方法。

1 4. 潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT-MMP- 1以外の潜在型 MM P— 2活性化因子である天然の MT 一 MM Pと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩に対する抗体。

1 5. MT— MMP— 3またはその塩と、実質的に同等な活性を有する力、、あるいは実質的に同等の一次構造コンフオメ一ションを持つものであるタンパク質に対する抗体であることを特徴とする請求項 1 4記載の抗体。

1 6. 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同等のァミノ酸配列を有する MT— MMP— 3又はその塩である夕ンパク質に対する抗体であることを特徴とする請求項 1 4又は 1 5記載の抗体。

1 7. 外因性 DNA配列を原核生物において発現して得たものである力、、あるいは真核生物で発現させて得たものであるタンパク質に対する抗体であることを特徴とする請求項 1 4〜1 6のいずれか一記載の抗体。

1 8. 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする請求項 1 4〜1 7のいずれか一記載の抗体。

1 9. タンパク質の部分ペプチド又はその塩に対する抗体であることを特徴とする請求項 1 4〜 1 8のいずれか一記載の抗体。

2 0. 抗血清であることを特徴とする請求項 1 4〜1 9のいずれか一記載の抗体。

2 1. モノクロ一ナル抗体であることを特徴とする請求項 1 4〜1 9 のいずれか一記載の抗体。

2 2. MT— MMP— 3又はその塩に対するモノクローナル抗体であることを特徵とする請求項 1 4〜1 9及び 2 1のいずれか一記載の抗体。

2 3. 潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT-MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT 一 MM Pと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又はその塩あるいはその部分ペプチド又はその塩を抗原として用い、それに対する抗体を得ることを特徴とする潜在型 MM P— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT— MMP— 1以外の潜在型 MMP— 2 活性化因子である天然の M T— MM Pと実質的に同等な活性を有するタンパク質又はその部分べプチドに対する抗体の製造方法。

2 4. 潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ MT-MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT 一 MMPと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩で免疫した動物から得られた、潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ M T-MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT— MMPと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質又はその部分べプチドに対する抗体を産生する細胞を、継代培養可能な細胞と融合せしめ、継代培養可能でかつ MT— MMP— 3を包含するタンパク質に対する抗体を産生するハイプリッド細胞を選別することを特徴とする請求項 2 1又は 2 2記載の抗体の産生方法。

2 5. 潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT-MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT 一 MM Pと実質的に同等な活性を有することを特徵とするタンパク質又はその塩あるいはその部分べプチド又はその塩を試薬として用いるか、あるいは請求項 1 4〜22のいずれか一記載の抗体を試薬として用いることを特徴とする MT— MMP— 3の検出 ·測定方法。

2 6. 請求項 2 5の MT— MMP— 3の検出 ·測定方法に用いる標識化された MT— MMP— 3に対する抗体。

2 7. 請求項 2 5の MT— MMP— 3の検出 ·測定方法に用いる潜在型 MM P一 2の活性化能を有する MM Pの一種であり且つ MT— MM P 一 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT— MM Pと実質的に同等な活性を有するタンパク質又はその塩あるいはその部分ぺプチド又はその塩であることを特徴とする標識化されたタンパク質あるいは部分べプチド又はその塩。

2 8. MT— MMP— 3発現細胞あるいは組織の検出 ·測定方法に用いる潜在型 MMP— 2の活性化能を有する MMPの一種であり且つ MT -MMP- 1以外の潜在型 MMP— 2活性化因子である天然の MT— M M Pと実質的に同等な活性を有するタンパク質又はその部分べプチドをコードすることを特徴とする標識化された核酸。

2 9 . ハイブリダィゼ一シヨン 'プローブであることを特徴とする請求項 2 8記載の核酸。