WO1997030173A1

WO1997030173A1 - Anticorps monoclonal reconnaissant les antigenes presents a la surface des cellules endotheliales d'un vaisseau tumoral

Info

Publication number: WO1997030173A1
Application number: PCT/JP1997/000387
Authority: WO
Inventors: Tadanori Mayumi; Shinsaku Nakagawa; Yasuo Tsutsumi; Iwao Ohizumi
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1996-02-15
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 1997-08-21
Also published as: EP0881299A1; US7189824B2; US20020081305A1; US6440733B1; AU1672097A; EP0881299A4

Description

明細害腫瘍血管内皮表面の抗原を認識するモノクローナル抗体技術分野

本発明は、腫瘍血管内皮細胞表面に発現している抗原を認識するモノクローナル抗体、上記抗体を産生するハイプリドーマ、上記抗体を含む医薬、並びに、上記抗体と他の結合分子との結合体を含む医薬または診断薬に関する。背景技術

現在知られている制瘙剤の一つとしては、腫瘙細胞に対する抗体をターゲティング（targeting) キャリアとして用いた制癌 DDS剤がある。しかしながら、この種の制癌剤は、腫瘍間質圧などが物質透過の障壁となり、標的への薬物送達性が著しく低下するという欠点がある。また、腫瘳細胞表面抗原の不均一性のために、ある特定の一つの抗体を、各種の腫瘳に共通のターゲティングキャリアとして利用することは不可能であつた。

—方、腫痛血管は、物質透過機能が高まっているなど、数多くの共通した特性を有していることから、腫 ¾組織血管内皮細胞（TEC) 中においては、癌の種類に関わりなく共通の特異分子が発現している可能性がある。また、腫癢血管を樣的としたターゲッティング療法は、組織移行性という陣壁を考盧する必要がないため、制瘙 DDS剤としての利点が有効に発揮し得ることが期待され、血管内皮細胞、特には腫 «組織内に存在する血管内皮細胞（腫瘳血管内皮細胞）に特異的なモノクローナル抗体の開発が行われてきている。

現在まで、血管内皮細胞を広く認識するマーカーとしては CD 31、 CD36、 Ulex europaeus-I agglutinin (UEA—l) 、また一般に活性化され大型化した血管内皮細胞に発現されるマーカーとしては von fillebrand factor (vWF) 、 I CAM- 1 (CD54) 、 E-selectinが知られている。

一方、上記の通り、臚«血管内皮細胞には正常組織では発現していない特異的な抗原を発現していることが推察されており、現在まで様々な腫瘍血管内皮細胞を認識する抗体が報告されており、その例として以下のものが挙げられる：

E— 9抗体（Wang, J. M. et al. , Int. J. Cancer (1993) 54, 363) ；

抗 FB5 (endosialin) 抗体（Rettig, I. J. Pro. Natl. Sci. USA (1992) 89,

10832) ；

H4Z18抗体（Cotran, R. S. et al.. J. Exp. Med. (1986) 164. 661) ；

Q B END/10 抗体（Ramani, P. et al. , Histopathology (1990) 17. 23 7) ；

EN4/EN3抗体（Schlingemann, R.0. et al. , Amer. J. Pathol. (1991) 1 38. 1335) ；

BMA120抗体（Schlingemann, R.0. et al.， Amer. J. Pathol. (1991) 138, 1335) ；

EN7Z44抗体（Hageneier. H. H. et al. , Int. J. Cancer (1986) 38, 481)

PAL— E抗体（Schlingemann, R.0. et al. , Amer. J. Pathol. (1991) 138, 1335) ；

H E C— 1抗体（Gougos, A. et al. , J. Immunol. (1988) 141. 1934) ； TE C 4及び TE C 11抗体（Thorpe, P.E. et al. , Am. Assoc. Cancer Res. (abstract) (1994) 35. 379) ：

しかしながら、これらの抗体の認識する抗原は正常内皮細胞や他の細胞種でも僅かながら発現されており、またこれら抗体の抗腫瘙作用については報告されていないことから、腫痛血管内皮細胞をターゲットとした固形癌治療にさらに適した抗体の開発が望まれている。

さらに、リンパ球細胞の表面などに存在する抗原タンパク質の 1種として CD 44が知られており（J. Immunol. , 142, 2045-2051, 1989年 3月 15日）、 CD44に対するモノクローナル抗体が報告されている（特開平 5— 50830 9号公報： WO 94— 12631号公報；および WO 95-33771号公報） _c しかしながら、 C D 44に対する抗体に関して腫瘩血管内皮細胞表面の抗原を認識する抗体についてはこれまでに報告されておらず、また本願優先曰以前においては C D 44が腫痛血管内皮細胞表面に存在することも報告されていない。発明の開示

本発明の目的の一つは、腫 «血管内皮細胞表面の抗原を認識する新規なモノク口ーナル抗体を提供することである。

本発明の別の目的は、腫痛血管内皮細胞表面に特異的に存在する抗原を認識する新規なモノクローナル抗体を提供することである。

本発明の別の目的は、腫 «血管内皮細胞表面の抗原を認識する新規なモノク口ーナル抗体を産生するハイプリドーマを提供することである。

本発明の別の目的は、腫 ¾血管内皮細胞表面の抗原を認識する新規なモノク口ーナル抗体を含む医薬を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、腫瘳血管内皮細胞表面の抗原を認識するモノクローナル抗体と腫瘳に関連した病状の治療や診断のための結合分子との桔合体を含む、医薬または診断薬を提供することである。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、腫瘳血管内皮細胞表面に存在する抗原を認識するモノクローナル抗体を得、得られた抗体の艨器分布、抗原蛋白質の解析を行い、さらに上記のモノクローナル抗体が、単独あるいは他の薬剤と組み合わせた場合に、腫痛移植ラットの固形痛に対して抑制効果を示すことを確認することに成功し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、その最も広い意味においては、腫瘍血管内皮細胞表面の抗原を認識することを特徴とするモノクローナル抗体、およびそれを産生するハイブリドーマ、並びに、上記モノクローナル抗体を含む医薬、および上記モノクローナル抗体と他の結合分子との桔合体を含む医薬または診断薬を提供するものである。

本発明の第 1の側面によれば、腫瘙血管内皮細胞表面の分子量 4 0 k Dまたは 8 0 k Dの抗原を認識することを特徼とするモノクローナル抗体が提供される。また本発明によれば、それぞれ固定化した腫瘙血管内皮細胞と正常血管内皮細胞とに対する結合の度合いを E L I S A法で測定した場合に、正常血管内皮細胞に対する結合よりも腫瘙血管内皮細胞に対する結合の方が同等もしくはそれ以上であることを特徴とする上記のモノクローナル抗体が提供される。さらにまた本発明によれば、ラッ卜の腫瘙、肝 ¾および胥«の組織槺本に対する反応性を免疫組織化学染色法で測定した場合、肝 «および腎«に対する反応性よりも腫 «組織に対する反応性の方が同等もしくはそれ以上であることを特徴とする上記のモノクローナル抗体が提供される。

さらにまた、本発明によれば、抗体を担癌ラッ卜へ投与した場合、血液中の存在 iよりも腫 ¾組織中の存在量の方が同等もしくはそれ以上であり、血液中の存在量よりも肝臓、肺、脾職、小腸および筋肉の各組維中の存在量の方が同等もしくはそれ以下であることを特徵とする上記のモノクローナル抗体が提供される。さらにまた本発明によれば、ラット KMT—1 7固形癌から得た腫瘳血管内皮細胞から調製した細胞膜小胞を動物に免疫し、上記動物から抗体産生細胞を単離し、これをミエローマ細胞と触合することによりハイプリドーマを作製し、次いで得られたハイプリドーマをスクリーニングすることにより得られる単一クローンのハイプリドーマにより産生されることを特徼とする上記のモノクローナル抗体が提供される。

さらにまた、本発明によれば、上記の免疫操作において、腫 ¾血管内皮細胞から網製した細胞膜小胞を勐物に免疫する前に、正常血管内皮細胞から調製した細胞旗小胞に対する抗血清を、前記の動物に受動免疫することをさらに含むことを特徽とする上記のモノクローナル抗体が提供される。

さらにまた本発明によれば、受託番号 F E RM B P— 5 7 8 6または 5尺 M B P— 5 7 8 7を有するハイプリドーマが産生することを特徵とする上記のモノクローナル抗体が提供される。

さらにまた本発明によれば、抗踵瘳活性を有することを特徴とする上記のモノクローナル抗体が提供される。

本発明の第 2の側面によれば、上記したような本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマが提供される。

特に好ましくは、本発明により、受託番号 F E RM B P— 5 7 8 6または F E RM B P— 5 7 8 7を有するハイプリドーマが提供される。

本発明の第 3の側面によれば、上記したようなモノクローナル抗体を含む医薬が提供される。好ましくは、本発明により、腫 ¾治療用であることを特徴とする上記の医薬が提供される。

本発明の第 4の側面によれば、（a) 上記したようなモノクローナル抗体：および（b) 抗瘙化学療法剤、ラジオァイソトーブ、蛋白性毒素、致死性蛋白あるいはこれを発現する遺伝子を挿入した発現ベクター、酵素、ストレブトァビジンから成る群から選択される結合分子：の結合体を含む医薬または診断薬が提供される。

好ましくは、腫瘙の治療用または診断用であることを特徴とする上記の医薬または診断薬が提供される。図面の簡単な説明

図 1は、 TES 23— 3— 10 (レーン 1) または TES 1— 10— 1 (レーン 2) が認識する抗原蛋白を示すウェスタンプロッティングの写真である。図 2は、瘙細胞を移植したラットに各試験物質（コントロール、抗体と NCS の結合体、抗体、 NCS、および抗体と NCSとの併用）を投与した場合の、腫痕体積の増加率の変化を示すグラフである。

図 3は、瘙細胞を移植したラットに各試験物質（コントロールおよび抗体）を投与した場合の、腫痛体積の增加率の変化を示すグラフである。

図 4は、腫瘙血管内皮細胞に対する PAPS、 PAPS結合コントロール抗体 MOPC— 31 C、 PAPS結合抗体 TES 23— 3— 10および PAPS結合抗体 TES 17— 8— 4の增殖抑制効果を示すグラフである。

図 5は、正常血管内皮細胞に対する P AP S、 P AP S桔合コントロール抗体 MOPC— 31 C、 PAPS結合抗体 TES 23— 3— 10および PAPS結合抗体 TES 17— 8— 4の增殖抑制効果を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

本発明による腫瘙血管内皮細胞表面の抗原を認識することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法について、以下に説明する。

本発明の抗体を得るための免疫原としては、腫¾血管内皮細胞を用いることができる。かかる細胞の単雜のための源および単雜方法は、特には限定されず、一般にはそれを多量に含有することが予測される試料から単離される。

腫¾血管内皮細胞の単離方法の一例としては、 Utoguchi 他著. Jpn. J. Cance r Res. (1995) 86, 193-201 に記載の方法が挙げられ、これは以下の実施例でも使用した方法である。

なお、上記の方法は腫瘳血管内皮細胞の単贐方法の一例を示すものであり、本発明のモノクローナル抗体を得るためには、各種の変更を加えた方法を用いても良いことは明らかである。

次いで、例えば上記のような方法により得た腫 ¾血管内皮細胞を、動物に投与して免疫感作するわけであるが、腫 ¾血管内皮細胞の細胞表面に存在する抗原に特異的な抗体を得る目的で、上記細胞の膜画分を単雛して、それを免疫感作に用いることが好ましい。

免疫原として、細胞蹊画分以外に生細胞（1 0 <"から 1 0 ⁷倕）を腹腔内投与

(アジュバンドを用いない）して免疫感作する方法も有効である。この場合、最終感作方法は 1 0 ^β個の生細胞を静脈内投与する。

膜画分の単雜は、当業者に知られる通常の方法を用いて行うことができる。例えば、培養細胞を 1 0 O mMのパラホルムアルデヒド、 2 mMのジチオスレイトール、 I mMの C a C 1 ₂および 0 . 5 mMの M g C 1 ₂を含む D M E Mで一晚 3 7 で処理し、その培地を 1 0 gで逮心し、さらにその上清を 3 0 , 0 0 0 gで 3 0分間 4 °Cで遠心した上淸を細胞膜小胞として用いることができる（Scott, B. E. Science (1976) 194, 743-745) 。

また、腫痛血管内皮細胞に特異的な抗体を得る目的のために、腫痛血管内皮細胞からの膜画分による免疫感作に先立って、正常血管内皮細胞を単離し、これから IS製した膜画分をマウスなどに免疫して得た抗血清（正常血管内皮細胞表面の抗原に対する多様な抗体を含む）を、動物にあらかじめ感作しておくことが好ましい。このように正常血管内皮細胞に対する抗血澝を免疫する動物にあらかじめ投与することは、「マスク」するとも称され、目的とする抗体（本発明では、腫癌血管内皮細胞表面に特異的に発現している抗原に対する抗体）を効率よく取得するための有効な手段の一つである。本発明のモノクローナル抗体を得るために用いるべき動物の種類は特には限定されないが、高い抗体産生能を有する勖物が好ましく、また細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択することが好ましい。一般的にはマウス、ラット、ゥサギ、ハムスターなどが挙げられ、マウスなどが好ましく、特には B A L B Z cマウスなどが好ましい。

上記のように、好ましくは正常血管内皮細胞に対する抗血清を免疫する動物にあらかじめ注入した（受動免疫）後に、腫瘳血管内皮細胞の膜画分を免疫感作する。この免疫感作の時期、回数、投与量、方法などは用いる免疫する動物の種類、状態などに応じて、適宜選択することができ、これらは当業者の知識の範囲内のものである。

投与回数は、一般的には 1〜 1 5回、好ましくは 3〜5回であり、 2回目以降の追加免疫の時期も当業者により適宜：！択することができる。

また、総投与量は、一般的には、抗原を投与する場合には蛋白量として 1 0〜 2 0 0 0 / gであり、好ましくは、 5 0〜了 0 0 gであり、これらは上記のように 1回で投与しても、複数に分けて投与してもよい。

また、必要に応じて、調製した腫瘙血管内皮細胞の膜画分を適当な免疫アジュバンド、例えばフロイントの完全アジュバンドまたは不完全アジュバンドとエマルジョン化してから投与してもよい。

免疫原の注入方法も特に限定はされず、例えば皮下、腹腔内、脾 «内、皮内、筋肉内、リンパ節内または静脈内への注射などが可能である。

上記のような免疫感作の後、免疫した動物よりハイプリドーマ作製のための抗体産生細胞を単雜する。なお、本発明のモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞は B細胞であり、 B細胞は体内を循環しているが、脾«などに蓄積されることも知られている。従って、免疫した動物の脾¾を摘出して、そこから抗体産生細胞を調製するのが好ましいが、必ずしも脾) «でなくてもよく B細胞が多く存在する部分を使用することもできる。

次いで、このようにして得た抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合し、不死化する。

細胞融合技術としては、当業者に公知の技術を用いることができる。細胞融合は、一般的には、抗体産生細胞とヒポキサンチンーグァニンホスホリボシルトランスフヱラーゼ（HGPRT) 欠 ¾無限増殖性細胞株であるミエローマ細胞とを、融合促進剤を含有する培地中で保温することにより行われる。

ミエローマ細胞の種類は特には限定されず、公知のものを使用することができ、例えばマウスのものとしては P3X63 Ag8U. 1、 S p 2Z0— Ag 14、ラットのものとしては YB2Z0、 Y3ZAgl. 2. 3. などが挙げられる。ミエローマ細胞の選択の際には抗体産生細胞との適合性を考慮するのが好ましい。

融合促進剤としては、ポリエチレングリコールなどの化学物質、センダイウイルスなどの細胞触合媒介ウィルスを用いることができ、さらに黢合効率を高めるための補助剤を添加してもよい。

上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを適当な比率、一般的には抗体産生細胞：ミエローマ細胞が 1 ： 1から 20： 1、好ましくは 2： 1から 10： 1の比率で、細胞培養培地中で混合した後に、触合促進剤を添加することにより細胞融合を行う。次いで、適当な培地の添加、および上清の除去を操り返すことによりハイプリドーマを形成する。

次いで、ヒポキサンチンアミノプリテンチミジン（HAT)培養液中で培養し、 »合細胞のみを選択する。 HAT培地での細胞の培養は、ハイプリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な期間行えばよく、通常は数日から数週間の期間行えばよい。

なお、抗体産生細胞の不死化は、細胞 ¾合（ハイプリドーマの作製）によるものに限定されるわけではなく、その他の公知の技術を用いることができる。

例えば、抗体産生細胞としてのヒ卜の Bリンパ球を用いる場合には、エブスタイン ·バールウィルス（EBV) を用いて形質転換することにより不死化を行つてもよい。

次いで、上記により得られたハイプリドーマについて、腫痛血管内皮細胞表面の抗原を認識する抗体を産生する単一のクローンを得るためにスクリーニングを行う。単一のクローンを得るためのクローニング法は当業者に知られる方法を用いればよく、例えば、限界希釈法、钦寒天法などを用いることができる。また、目的とする抗体を産生するハイプリドーマを得るためのスクリーニング法も当業者に知られる方法を用いればよく、例えば、 E L I S A法、プラーク法、凝集反応法、 R I A法、免疫組織化学染色法などの抗体を検出するための各種方法により行うことができる。

スクリーニングは、作業効率の向上などの観点から 1次スクリーニングと 2次スクリーニングなどのように段階的に行ってもよい。例えば、以下の実施例で行つているように、 1次スクリーニングを E L I S A法、 2次スクリーニングを免疫組織化学染色法で行うことなどが可能である。

上記のようにして得られた所望の抗体を産生する細胞株は、通常の培地において継代培養が可能であり、また液体窒素中などで長期保存が可能である。

本発明による腫«血管内皮表面の抗原を認識するモノクローナル抗体を、上記のようにして得たハイプリドーマから得るための方法の例としては、以下の 2つの方法が挙げられる。

第 1の方法によれば、上記のハイプリドーマを一定の時間、適当な培地中で培養し、その培養上澝から、例えばァフィ二ティーカラムクロマトグラフィーなどを用いてそのハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体を単雜精製することができる。

あるいは第 2の方法によれば、上記のハイプリドーマをそれと適合性のある (即ち、同質遺伝子または半同質 «伝子を有する）哺乳動物、例えばマウスなどの腹腔内に注射し、一定時間後に、その動物の血清または腹水からそのハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体を単離精製することができる。

また、モノクローナル抗体は、抗原を免疫して得られる抗体産生細胞を钿胞» 合させて生ずるハイプリドーマから得られるものだけでなく、抗体遺伝子をクロ一二ングし、適当なベクターに組み込んで、これを公知の細胞株、例えば、 C O S、 C H O等に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させたモノクローナル抗体を用いることができる（例えば、 Vandanaie, A-M.ら、 Eur. J. Biochem. , 192. 767-775. 1990 を参照）。

上記のようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、以下の実施例に記載されるような特性を有するものである。具体的には、本発明により以下のようなモノクローナル抗体が提供されることになる。

本発明のモノクローナル抗体の特¾の一つは、それぞれ固定化した) 1癢血管内皮細胞と正常血管内皮細胞とに対する結合の度合いを E L I S A法で測定した場合に、正常血管内皮細胞に対する結合よりも腫 ¾血管内皮細胞に対する結合の方が同等もしくはそれ以上、例えば正常血管内皮細胞に対する結合に対する、腫瘳血管内皮細胞に対する結合の比率が 1以上、例えば 1. 9、あるいは 20. 0以上、例えば 22. 7、あるいは 200以上であるということである。

また、本発明のモノクローナル抗体の別の特徼は、ラッ卜の腫痠、肝魔および賢臓の組織檁本に対する反応性を免疫組織化学染色法で測定した場合、肝臓および胃績に対する反応性よりも腫痛組織に対する反応性の方が同等もしくはそれ以上であるということである。

さらに、本発明のモノクローナル抗体のさらに別の特徴は、放射棟織モノクローナル抗体を用いて、担 Sラッ卜に静脈内投与した場合に、各織器の放射活性をガンマ一カウンタ一で測定したときの職器分布が、血液中の存在量よりも腫瘳組織中の存在量の方が同等もしくはそれ以上、特にはその比率が 4. 0以上であり、肝腹、肺、脾繊、小腸および筋肉の各組織中の存在量の方が血液中の存在量よりも同等もしくはそれ以下、特にはその比率が 0. 5以下であるということである。

CD 44 (リンパ球帰還性レセブター）は、本発明の 80 kDの抗原を認識するモノクローナル抗体の一例として以下の実施例に記載される TE S 23-3- 10および TES 27— 4一 4により認識される。また、 OTS— 8 (骨芽細胞系）は、本発明の 40 kDの抗原を認饑するモノクローナル抗体の一例として以下の実施例に記載される TES 1— 10— 1、 TES7— 1一 7、 TES17— 8— 4、 TES 21— 14一 6および TES 26-7— 3により認識される。なお、 TE S 23— 3— 10および TES 27— 4-4により認識される 80 kD抗原は腫痛血管内皮細胞由来のもので、正常組織や癌細胞から採取されたものではない。また、 TES 23— 3— 10は腫疡血管内皮細胞に結合後、細胞内に取り込まれることが確認されているが、既存の抗 CD 44抗体が細胞内に取り込まれるという報告はない。さらに、腫瘳組織の免疫組織染色において、 TES 2 3— 3— 1 0は腫瘓血管を強く染色することが確認されているが、既存の抗 C D 4 4抗体の場合の染色性は弱い。

本発明による腫瘓血管内皮表面の抗原を認識するモノクローナル抗体は、これをラジオァイソトーブなどで標識したものを体内に投与することによって原発痛のみならず転移巣の局在を診断するのに有用である。

また、本発明のモノクローナル抗体は、以下の実施例 4でも示されるようにそれ自体を単独で腫瘳に投与した場合にも腫瘳抑制効果を示すことから、医薬、特には腫瘍治療用医薬としても有用である。

さらに、 C D 4 4を認識する以下の実施例に記載される抗体 T E S 2 3— 3— 1 0および T E S 2 7— 4一 4は、 C D 4 4を発現していない癌細胞の固形增殖に対して、腫瘍血管内皮細胞を標的とした結果、抗腫効果を示す。

本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒ卜に対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したものがより好ましい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体を使用することができ、このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝子組換技法を用いて製造することができる。さらに、再構成（reshaped) したヒト抗体を本発明に用いることができる。これは、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遗伝子組换手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ることができる（例えば、国際特許出願公開番号 WO 9 2 - 1 9 7 5 9を参照）。

なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（F R) 領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato ら、 Cancer Res. (1993) 53, 1-6) 。

さらに、本発明のモノクローナル抗体を他の結合分子と結合させた結合体は、腫痛組織へのターゲティング療法に応用することが可能である。このように、特には腫瘙の診断または治療のために用いることができる具体的な結合分子の例としては、以下のものが挙げられる： (1)化学療法剤に代表される低分子化合物あるいは血管内皮細胞に対して増殖抑制を有する化合物、例えば、ネオカルチノスタチン、アドリアマイシン、マイトマイシン c、エトポシド、ビンブラスチン、フマジリン誘導体など：

(2) 抗体の存在を検出するための標識物、例えば¹²⁵ I、 ¹³¹ I、 ^9DY、 ¹⁸⁶ R e、 ^e7C u、 ²¹²B i、 ² A tおよび^{99 ra}Tcなどのラジオァイソトープ；

(3)蛋白性毒素、例えば、リシン、ジフテリア毒素、プソィドモナス外毒素 A、ァメリカャマゴボウ種子由来抗ウィルス蛋白 K：

(4)致死性蛋白あるいはこれを発現する遺伝子を挿入した発現ベクター、より具体的には、 TNF—な、 INF— 7、 Fasリガンドなど：

(5) 化学療法剤などの前駆体を活性体へ変換させる酵素、例えば、ラクタマ一ゼ棟識抗体 +セファロスポリン結合ァドリァマイシン、アル力リホスファタ一ゼ標識抗体 + 1リン酸塩結合ェトポシドなど；

(6) ストレブトァビジン（組樣へ定着後にビォチン標識薬物を投与）などの特定の物質に特異的な親和性を有する分子：具体的には、ストレブトァビジン標識抗体 +ビォチン欏識抗瘙化学療法剤など：

これら分子と抗体との結合については、以下の方法が考えられる。抗瘙化学療法剤、蛋白質や遺伝子べクタ一では、 SMCC (Batra, J. K. et al. , Pro. Nat 1. Acad. Sci. USA (1992) 89, 5867) 、 S P D P (Carlsson, J. et al. , Bioc hem. J. (1978) 173. 723) 、 SMPT (Thrope, P.E. et al. , Cancer Res. (1 987) 47, 5924-5931)、 2 I T (Thrope, P.E. et al. , Cancer Res. (1987) 47. 5924-5931) などの架橋剤を用いたり、蛋白の場合には遺伝子工学的に tt合蛋白 Kとして作製する (Bosslet, K. et al. , Br, J. Cancer (1992) 65, 234) ことも可能である。ラジオァイソトーブでは、 Iodogen法（^12SI、 ¹³¹ I ：実施例 2 参照）、 RP 1などのキレーター（^e9eTc ： Buis . R. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 5413) などで抗体との結合が可能である。

本発明の腫瘓血管内皮特異抗体は、診断と治療への応用が可能である。診断では、ラジォアイソトープひ²⁵ I、 ¹³¹ I、 ^eoY、 ^18eR e、 ¹⁸⁸R e、 ^e7C u、 ²¹ ²B i、 ^21lAtなど）で標識した抗体を癌患者に静脈内投与することにより、原発癌のみならず転移瘙の局在を非侵襲的かつ速やかに知ることができる。また治療への応用に関しては、薬剤などの分子を結合させた抗体を痛患者に静脈内投与することで腫痛組織へのターゲティング療法が可能である。投与ルートとしては、好ましくは非経口的に、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身あるいは局部的に投与することができる。投与ルー卜は、抗原が血管内面に局在するため静脈内投与が最も適切である。

さらに、本発明の抗体または上記抗体と他の分子との結合体は、少なくとも一種の医薬上許容し得る担体または希釈剤とともに医薬組成物ゃキットの形態をとることができる。

本発明の医薬、特には腫瘪治療用医薬のヒトに対する投与量は患者の病態、年齡あるいは投与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが必要である。例えば、約 1〜100 OmgZ患者の範囲で 4回以下の分割用 Sを還択することができる。また、 1〜1 OmgZkgZ週の用量で投与することができる。しかしながら、本発明の医薬、特に睡痛治療用医薬の投与量はこれらに限定されるものではない。

本発明の医薬、特には腫痛治療用医薬は、常法にしたがって製剤化することができる (Remington s Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publish ing Company, Easton, 米国を参照）。例えば、注射用製剤は、精製された抗体を溶剤、たとえば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液などに溶解し、それに、吸着防止剤、たとえば、 Tireen 80、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（HSA) などを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えば、マンニトール、ブドゥ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。実施例

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によつて限定されるものではない。

実施例 1 ：

腫痛血管内皮モノクローナル抗体 T ES 1-10- 1, TES 7- 1-7, TE S 17-8-4. TES 21-14-6, TES 23-3-10. TES 26- 7-3, TES 27_4— 4を産生するハイプリドーマの網製

Zhu, D. and Pauli. B. U. , J. Histochem. Cytochem. (1991) 39, 1137-1142 の方法にて、正常血管内皮細胞で発現している抗原を抗血淸投与でマスクさせることで腫 ¾血管内皮に特異的な抗原に対するモノクローナル抗体を調製した。

Madri. J. A. and Williams. S. K. , J. Cell Biol. (1983) 97, 153-165の方法にて、ラット脂肪組織より正常血管内皮細胞を単離培養した。その後、 10 OmMのパラホルムアルデヒド、 2mMのジチオスレィトール、 ImMの C aC 1₂および 0. 5mMの Mg C 1₂を含むダルべッコ改変イーグル培地（DMEM) で一晩 37 °Cで処理し、細胞旗小胞（vesicle) を绸製した（Scott, R. E. Scie nce (1976) 194, 743-745) 。 116 gの細胞旗小胞を完全フロイントアジュバンドとェマルジヨン化させた後、 BALB cマウス（日本 SLC製）の皮下に注射した。その 1、 2、 4および 6週間後に再び、 86// gの細胞膜小胞を不完全フロイントアジュバンドとェマルジヨン化させた後、皮下に注射した。最終注射の 3曰後にマウスの血液を採取して正常血管内皮細胞に対する抗血淸を得た。次に、 Utoguchi, N. et al. , Jpn. J. Cancer Res. (1995) 86, 193-201の方法にて、 WKAHZHkmラット（日本 SLC製）の皮下で形成されたラット K MT-17固形痛から腫¾血管内皮細胞を単雜培養した。具体的には以下の通りである。

先ず、 WKAHZHkmラッ卜で 3—メチルコラントレンにより誘導された移植可能な繊維肉腫である KMT— 17腫瘙細胞（3 X I 0^s細胞）を WKAH/ Hkmラットに移植し、腫瘓が 10〜14 gの大きさに達した後に採取した。採取した踵痛を抗生物質を含むバランス塩溶液中に入れ、組織の周辺および壊死部分を除去した後、残りの腫痛組織をはさみやかみそりで細切した。細切した組織を 0. 75%コラゲナーゼで消化し、得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュ (300 ^m) に通過させ、逮心によって 10%FC S含有 MEM中で 2回洗浄した。沈殿を 10%FC S含有 MEM中に再懸濁し、アングルローターで 20. 000 gで 15分遠心することにより調製した 45%Percollこう配（Percoll 9ml , 10 xMEMlm 1. 10 % F C Sを含む ME M 10 m 1 ) の上部に、得られた 2m 1の細胞！ β»液（1. OxlO⁸細胞）をのせ、こう配チューブをスイングローターで 1, 500 gで 10分遠心し、 Percoll こう配の上部から 2 m 1ずつ連統的に分画した。この段階で 11個の画分を得た。

11個の画分の細胞を MEMで 2回洗浄し、 Percoll溶液を除去し、次いで細胞を 10%F C Sと 25 gZm 1の内皮細胞增殖添加物とを含む DMEM中に再懸濁し、培養皿上にプレートした。 24時間の培養後に、細胞を PBSで洗浄し、非接着細胞を除去した。

各画分の細胞懸濁物を H B S Sで 2回洗浄してから、ホゥ酸緩衝液に再懸濁し、超音波処理した。

次いで、各々の画分のアンギオテンシン変換酵素（ACE)活性、蛋白質含量および細胞数を分析した。

比較的高い AC E活性を示す画分からの細胞を組織培養皿で培養するが、この中には異種の細胞が多く含まれている。そこで、内皮細胞は他の細胞より接着速度が早いことに接みて、培養 24時間後に、非接着細胞を洗浄除去することにより、接着細胞のみを選択的に培養した。これにより形態的に均一である細胞が得られ、 Factor V I I I染色に陽性であることからラットの KMT— 17固形癌由来の内皮細胞であることが確認された。

その後、正常内皮細胞の場合と同様にして細胞膜小胞を網製した。 100 1 の正常内皮钿胞抗血清を B A LBZcマウス（日本 SLC製）の静脈内へ注射 5 分後に、 174 gの腫癢血管内皮細胞膜小胞を完全フロイントアジュバンドとェマルジヨン化させて皮下に注射した。その 4、 5および 8週間後に再び、 97 gの腫瘍血管内皮細胞膜小胞を不完全フロイントアジュバンドとェマルジョン化させた後、皮下に注射した。最終注射の 4週間後にマウスの抗体産生価をさらに上昇させるために P B Sに懸 ¾させた腫癢血管内皮細胞膜小胞 358 gを腹腔内に注射した。その 3日後、マウスより脾艨を摘出し、 Harlow, E. and Lane. D.の方法 (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1988) 20 3) に従い摘出した脾細胞とミエローマ細胞 P 3X63 Ag8U. 1とを細胞融合に付した。

腫瘙血管内皮細胞あるいは正常血管内皮細胞をコートしたブレートを使用する E L I S A (Posner, . R. et al.. J. Immunol. Methods (1982) 48, 23)によりハイプリドーマ培養上清中の抗体のスクリーニングを行った。単離した腫瘙血管内皮細胞あるいは正常血管内皮細胞を 96穴プレート（Falcon製）に 1穴当たり 2x 10⁴個分注し、一晩培養した。集密（confluent) 状態になった細胞を P B Sで 2回洗净してから 0. 1%のグルタルアルデヒドを含有する PBSで 10 分間 4。Cで固定化した。その後、 150mMのNa C し

。 1₂、 0.05%の Twe e n 20、 0. 02 %の N a N₃および 1 %の B S Aを含む 5 OmMの T r i s— HC I (pH8. 1 ) 溶液でブロッキングした後、ハイプリドーマ培養上消を加え、室温で 1時間インキュベートした。次いで、室温にて 1 時間アルカリホスファターゼ檫識抗マウス I gGャギ抗体（Zymed製）を反応させ、 5回洗浄して、室湿にて 1時間、 p—二トロフヱニルホスフヱ一ト基質溶液 (Sigma製）を反応させた。

2 N硫酸で反応を停止させ、マイクロプレート ' リーダー（Bio-Rad製）で 4 05-620 nm (405 n mで測定； 620 n mは reference波長）における吸光度を測定した。正常血管内皮細胞に比べ腫瘓血管内皮細胞へ強く結合するクローンを攝性とした。賜性のハイプリドーマを二度クローン化し、これらハイブリドーマ培養上澝を用いてラット KMT— 17腫瘳およびラット肝魔と賢 Kの組織糠本に対する反応性を免疫組織化学染色法で绸ベた。

結果を下記の表 1に記載する。表 1に示されるように、 7つのクローンが腫癢血管内皮細胞あるいは KMT— 17腫 ¾組織に特異的に反応するモノクローナル抗体であった。

比率 (OD405-620 nm) 内皮細胞の免疫化学組辙染色クローン番号腫瘙内皮/正常内皮腫瘍組織肝臓胃繊

TES1-10-1 20. 5 + + + + + + +

TES7-1-7 π υ ND ND

TF¾i 7-8-4 22. 7 + , + 4- 4-

TES21-14-6 23. 9 + + +

TES23-3-10 1. 9 + + + +

TES26-7-3 47. 5 + + + + ND

TES27-4-4 1. 0 + + + ND

ND：未検討

遷択されたハイブリドーマクローンをブリスタン処理した B AL BZcマウスの腹腔内に注射して、腹水を取得した。その後、プロテイン Aァフィ二ティーク口マトグラフィー（Millipore製）を用いた抗体精製装 S (Con Sep LC100, Mil lipore製）によりマウス腹水より精製した。

正常血管内皮細胞と腫瘙血管内皮細胞に対するこれらモノクローナル抗体の反応性をフローサイトメトリーで調べた結果、 EL I S Aでの反応性と相関性が認められた。

これらハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のサブクラスを、サブクラス特異的抗マウスゥサギ抗体（Zymed製）を用いた EL I SAにて決定した。得られた 7種類の抗体は、全て I gGt のサブクラスを有していた。

これら抗体を産生するハイプリドーマは曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3 号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、 1996年 1月 31曰に、受託番号 FERM P - 15411 (TE S 1 - 10 - 1) 、 FERM P— 15412 (TES 7-1-7) 、 FERM P - 15413 (TES17 - 8 - 4) 、 F ERM P - 15414 (TE S 21 - 14一 6) 、 FERM P- 15415 (TES23— 3— 10)、 FERM P- 15416 (TES 26-7-3) および F ERM P— 1 541 7 (TE S 27— 4一 4) の下、国内寄託されている。なお、 FERM P— 1 54 13 (TE S 1 7— 8— 4) および FERM P— 15415 (TE S 23— 3— 1 0) については、 1997年 1月 1 6日付にて、それぞれ受託番号 FERM B P— 5786および F ERM B P— 5 787の下、国際寄託に移管されている。実施例 2 ：

腫瘓血管内皮モノクローナル抗体の特性

腫痛血管内皮抗体の腫癢組織集積性を in vivoで検討するために、 ¹²⁵ I檩識抗体を作製し、 KMT— 1 7担瘙ラッ卜での臓器分布を評価した。

¹²⁵ I標識抗体は以下の操作により作製した。コントロール抗体あるいは抗体 TE S 23— 3— 1 0 (10 g) を Iodogen (2. 5 g (Pierce製）処理したバイアル中で Na^12S I (0. 5mC i ) (Amersham製）と室温で 5分間反応させた後、 PD— 10カラム（Pharmacia製）で分画して¹²⁵ I標識蛋白画分を回収した。得られた¹²⁵ I標識抗体の比放射能は l g = 6. 0〜8. 6 β 0 iであった。

統いて、 WKAHZHkmラット（6通令、雌、日本 SLC製）皮下に 1 x 1 0^β個の KMT— 17を移植後 9曰目（腫 «重量約 l〜2 g) にコントロール抗体、抗体 TE S 23— 3— 10の各¹²⁵1檩識抗体（4. 9〜6. O if C i /ラット）と非檫識抗体（99 gノラット）の混合物を静脈内投与した。

投与 8曰目に血液、敏器（肝織、背 «、脾繊、小腸、肺、筋肉）、腫痛組織を摘出し放射活性をガンマ一カウンター（Aloka製）で測定した。

結果を下記の表 2に記載する。表 2から分かるように、投与 8曰目で抗体 TE S 23— 3— 10は腫瘳組織に特異的に集積していた。一方、コントロール抗体は特異的な膽器分布は認められず、低レベルのため検出不可能であった。表 2 ：

膽器組織/血液分布比

腫瘳 4. 11

肝織 0. 35

腎濂 1. 24

肺 0. 24

脾》 0. 30

小腸 0

筋肉 0. 28 実施例 3 ：

腫痛血管内皮モノクローナル抗体が認識する抗原蛋白質の解析

SDS— PAGEおよびウェスタンプロッティングを以下の操作に従って行つた。

75 cm²フラスコ 3枚分の腫¾血管内皮細胞を洗浄後、細胞溶解锾衝液（1 mMの EDTA、 ImMの PMSF、 10 tz gZm 1のアブロチニン、 10 g /m 1のロイぺブチン、 1%の Nonidet P-40、および 15 OmMの Na C 1を含む 50mMの T r i s-HC 1、 pH7. 5)を加え室温で 5分間インキュベーシヨンした。スクレーパーで細胞および細胞溶解液を回収し、 0。Cで 30分間ィンキュベーシヨンした。この細胞溶解液を 15, 000 r pmにて 10分間遠心分雜し、次いで、この上清の蛋白置を定量した。

SDSサンプル溶液（2. 3%の SDS、 125mMの T r i s (pH6. 8) 、 20%のグリセロール、 0. 05%の BPB) と 1 ： 1の比率で混合し、 3分間煮沸した。 1〜10 8：の蛋白撤を4〜20%305—？八0£に付した後、ウェスタンブロッテイングを行った。

すなわち、ニトロセルロースメンブラン（Millipore製）へブロットした後にスキムミルクでブロッキングを行い、 TBST溶液（25mMの T r i s、 15 OmMの Na C l、 3mMの KC 1、 0. 05%の Tween 20) に溶解した各抗体 (10 X g/m 1 ) で室温 2時間処理した。 TB ST溶液で 3回洗浄後、ペルォキシダーゼ標識抗マウス I gGャギ抗体（Zymed製）で室温 1時間処理して同様に TBST溶液で 3回洗浄した。

その後、 E C Lウェスタンブロッテイング検出システム（Anershain) で X線フィルムへ露光させてバンドを検出した。

その結果、抗体 TES 1— 10— 1、 TES7— 1— 7、 TES 17— 8— 4、 TES21— 14一 6、 TE S 26— 7— 3では分子量 40 kDのバンドを、また抗体 T E S23— 3— 10、 TES27— 4一 4では分子量 80 k Dのバンドを特異的に染色した。

10 gの抗原蛋白を TES23— 3— 10で検出した結果（レーン 1) と 1 ^8の抗原蛋白を丁£31—10— 1で検出した桔果（レーン 2) を図 1中に示す。右側の数字は分子量の大きさ（kD) を表す。実施例 4：

腫痕移植ラットにおける腫痛血管内皮モノクローナル抗体の効果

先に、化学療法剤ネオカルチノスタチン（NCS) と本願発明の腫癌血管内皮モノクローナル抗体（TES23— 3— 10) との結合体（innunocon jugate) を作成した。 Zara, J. J. et al.. Anal. Biochem. (1991) 194, 156の方法にて、 PDPHを架橘剤として用い、抗体 F c部位の糖鎖と NCSを結合させた。

5 X 10^s個/ラッ卜の割合となるようにラット肉腫株 KMT— 17を 5週令の WKAH Hkmラット（日本 SLC製）の皮内に移植した。驢痛径が 6〜8m m角に成長したのを確認後（4日後）、コントロールとしての PBS (図 2中では白丸で表示）、〇5桔合抗体丁£323— 3— 10 (N C S量として 5 g Zラット、抗体量として 32 gZラット；図 2中では黒丸で表示）、抗体 TE S23-3-10 (抗体量として 32 gノラット；図 2中では白四角で表示）、 NCS (5 gZラット；図 2中では黒四角で表示）、あるいは抗体 TES 23 -3-10 (抗体量として 32 jug/ラット）と NCS ラット）との単独併用投与（図 2中では白三角で表示）の各試験物質について、 1曰 »きに 3 回（即ち、肉腫株細胞の移植後、 4日目と 6日目と 8曰目）静脈内投与した。

実験は、各投与群につき 5匹のラッを用いて同様に行った。肉腫株細胞移植後 4曰目からの睡《体積の増加率を測定し、各投与群について腫痛抑制効果を調ベた。得られた結果を、図 2に示す。

図 2から分かるように、 N C S結合抗体 T E S 23— 3— 10を投与した群については、移植ラッ卜の固形癌增殖に対して有意な抑制効果が認められた。

また、抗体依存性細胞陣害活性に基づいた抗腫 ¾効果を検討するため、抗体単独による投与も行った。すなわち l x l 0^β個/ラッ卜の割合となるようにラット肉腫株 ΚΜΤ— 17を 7週令の WKAH/Hkmラット（日本 SLC製）の皮下に移植した。腫癀径が 6〜 8 mm角に成長したのを確認後（4曰後）、抗体 TE S 23— 3— 10あるいはコントロール抗体を lmgZラッ卜で毎日 5回静脈内投与した。

実験は、各投与群につき 7匹のラヅトを用いて同様に行った。肉腫株細胞移植後 4曰目からの腫瘙体積の増加率を測定し、各投与群について增殖抑制効果を調ベた結果を、図 3に示す。

図 3から分かるように、抗体 TES 23— 3— 10を投与した群については、移植ラッ卜の固形瘙增殖に対して有意な抑制効果が認められた。実施例 5 ：

腫 ¾血管内皮モノクローナル抗体の腫瘳血管内皮細胞に対する特異的增殖抑制効まず、 Barbieri, L. et al. , Biochem. J. (1982) 203, 55-59 に記載のァメリカャマゴボウ種子由来抗ウィルス蛋白質（PAPS) (Inland Laboratories 製）と本発明の腫痛血管内皮モノクローナル抗体（TES23— 3— 10および TES 17-8-4) との結合体（immunotoxin) を作製した。同様に PAPS とコントロール抗体（MOPC— 31 C) との結合体を作製した。 Thrope. P.E. et al.. Cancer Res. (1987) 47. 5924-5931 らの方法にて S MPT (P I EC E製）を抗体側の架棰剤として用い、同様に Thrope, P.E. et al. , Cancer Ees. (1987) 47. 5924-5931 らの方法にて 2 I T (P I ECE製）を PA PS側の架橋剤として用いて、抗体と P AP Sを結合させたのち、 Superdex 200 HE 10/30 カラム（Pharmacia Biotech製）によるゲル濂過法にて P A P S結合抗体を精製した。

単離した腫痛血管内皮細胞あるいは正常血管内皮細胞を 96穴ブレート（Falc on製）に 1穴当たり 2x10³個播種し、 6〜8時間培養した。細胞の接着を確認した後に、終濃度 1 /M〜0. InMとなるよう PAPS (図 4および図 5中では白菱形で表示）を、もしくは終濃度 1 OnN！〜 1 OpMとなるよう PAPS 結合コントロール抗体 MO PC— 31 C (図 4および図 5中では白丸で表示）、 ?八？3結合抗体丁£523— 3— 10 (図 4および図 5中では白三角で表示）、 PAPS結合抗体 TES 17-8-4 (図 4および図 5中では白四角で表示）を加えて 70. 5時間培養した。その後、 CellTiter 96™ AQueous Assay Reagent s (Promega製）を 1穴当たり 20 1加え、さらに 90分間培養した。

10%SDSを 1穴当たり 1加え反応を停止した後、マイクロブレートリーダー（ラボシステムズ製）で 492— 690 nm (492 nmで測定： 69 0 nmは reference波長）における吸光度を測定した。コントロール（培地のみで培養）の吸光度を 100%として增¾抑制活性を算出した。得られた結果を図 4および図 5に示す。

図 4および図 5から分かるように、 PAPS結合抗体 TES 23— 3— 10もしくは PAPS結合抗体 TES 17— 8— 4は腫瘓血管内皮細胞に対して強い增殖抑制効果を示し、一方正常血管内皮細胞に対しては全く効果を示さなかつた。また、 PAPS結合コントロール抗体 MOP C— 31 Cは 10 nMにおいても ffi 痕血管内皮細胞および正常血管内皮細胞に対して增殖抑制効果を示さなかつた。産業上の利用可能性

本発明のモノクローナル抗体は、腫《血管内皮細胞表面に存在する抗原を認識することができ、単独で、もしくは化学療法剤、ラジオアイソトープなどのような結合分子と結合させることにより、特には腫痛の東または診断のための、医薬または診断薬として有用である。

Claims

媾求の範囲

1. 腫痛血管内皮細胞表面の分子量 4 0 k Dまたは 8 0 k Dの抗原を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。

2. それぞれ固定化した腫痛血管内皮細胞と正常血管内皮細胞とに対する桔合の度合いを E L I S A法で測定した場合に、正常血管内皮細胞に対する結合よりも腫癘血管内皮細胞に対する結合の方が同等もしくはそれ以上であることを特徴とする請求項 1に記載のモノクローナル抗体。

3. ラッ卜の腫瘳、肝臓および腎魔の組織檁本に対する反応性を免疫組辙化学染色法で測定した場合、肝膽およびに対する反応性よりも膣痛組織に対する反応性の方が同等もしくはそれ以上であることを特徼とする請求項 1または 2に記載のモノクローナル抗体。

4. 抗体を担瘙ラッ卜へ投与した場合、血液中の存在量よりも臛癌組織中の存在量の方が同等もしくはそれ以上であり、血液中の存在量よりも肝繊、肺、脾繊、小腸および筋肉の各組織中の存在量の方が同等もしくはそれ以下であることを特微とする請求項 1から 3の何れか 1項に記載のモノクローナル抗体。

5. ラット KMT— 1 7固形痛から得た腫痕血管内皮細胞から網製した細胞膜小胞を動物に免疫し、上記動物から抗体産生細胞を単雕し、これをミエローマ細胞と »合することによりハイプリドーマを作製し、次いで得られたハイプリドーマをスクリーニングすることにより得られる単一クローンのハイブリドーマにより産生されることを特徽とする請求項 1から 4の何れか 1項に記載のモノクロ一ナル抗体。

6. 腫«血管内皮細胞から調製した細胞膜小胞を動物に免疫する前に、正常血管内皮細胞から網製した細胞腆小胞に対する抗血清を、前記の動物に受動免疫することをさらに含むことを特徴とする講求項 5に妃載のモノクローナル抗体。

7. 受託番号 F E RM B P— 5 7 8 6または F E RM B P— 5 7 8 7を有するハイブリドーマが産生することを特徴とする請求項 1から 6の何れか 1項に記載のモノクローナル抗体。

8. 抗腫 ¾活性を有することを特徴とする請求項 1から 7の何れか 1項に記載のモノクローナル抗体。

9. 請求項 1から 8の何れか 1項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ。

10. 受託番号 FERM BP— 5786または FERM BP— 5787を有するハイプリドーマ。

11. 講求項 1から 8の何れか 1項に記載のモノクローナル抗体を含む医薬。

12. 腫痛治療用であることを特徵とする講求項 11に記載の医薬。

13. (a)請求項 1から 8の何れか 1項に記載のモノクローナル抗体；および（b)抗«化学療法剤、ラジオァイソトーブ、蛋白性毒素、致死性蛋白あるいはこれを発現する遺伝子を挿入した発現ベクター、酵素、ストレブトァビジンから成る群から:！択される結合分子：の結合体を含む医薬または診断薬。

14. 腫癌の治療用または珍断用であることを特微とする請求項 13に記載の医薬または診断薬。