WO1997036168A1 - System for the quantitative resolved evaluation of test elements - Google Patents

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WO1997036168A1
WO1997036168A1 PCT/EP1997/001469 EP9701469W WO9736168A1 WO 1997036168 A1 WO1997036168 A1 WO 1997036168A1 EP 9701469 W EP9701469 W EP 9701469W WO 9736168 A1 WO9736168 A1 WO 9736168A1
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zone
analyte
test element
detection zone
detection
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PCT/EP1997/001469
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Peter Blasberg
Franz Bolduan
Susanne Gentsch
Hans-Peter Haar
Erich Händler
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G01N21/8483—Investigating reagent band
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex

Definitions

  • the present invention relates to a system for the quantitative, spatially resolved detection of an analyte using a test element, including
  • test element with a sample application zone which contains a labeled substance which binds specifically to the analyte and a detection zone which contains an area which serves to immobilize a complex of analyte and labeled substance
  • a plurality of sensors are arranged in a row and this linear array is moved transversely to the row of sensors by a transport device so that an area is covered,
  • the present invention is in the area of the quantitative evaluation of test elements by transmission or reflection measurement
  • the European patent application EP-A-0 646 784 describes a video system for evaluating test elements, in which test elements are placed on a support by the user. The test elements are evaluated without prior positioning and the video system used must therefore be Capture the entire pad to ensure that the detection zone is in the image field. This system ensures a very high degree of user-friendliness, since the user does not have to carry out any positioning, but this results in a greatly reduced accuracy of the analysis result, since only relatively few sensors of the video system are available for evaluating the actual test field. In order to grant the user the desired freedom when storing a test element, the apparatus described must also have a large opening area through which stray light can penetrate. The apparatus described is therefore only suitable for quantitative evaluations in which the signal to be measured is large and the accuracy requirements are low
  • DE 3247355 Devices for evaluating thin-layer chromatograms are described in documents EP-B-0 437 968 and DE 3247355.
  • the device of DE 3247355 is a scanner with which a thin-layer chromatography plate is scanned.
  • the flat elements viewed by a single sensor have a size of about 0.05 to 0.2 mm.
  • the object of the present invention was to improve the existing equipment for evaluating test elements to such an extent that clinically relevant analytes which occur in very low concentrations (pico-mol) can be quantitatively determined with high accuracy. It was a further object of the invention to find a device which is easy to use and inexpensive for this purpose
  • Test elements which can be used for the present invention are referred to in the prior art as immunological test elements.
  • Test elements suitable for the invention have one or more absorbent matrices on a carrier material, "the matrices being arranged on the carrier material in such a way that a Liquid flow through all matrices is possible.
  • a suitable test element has a sample application and a detection zone. Furthermore, it can also have a zone for separating interfering substances, for example erythrocytes.
  • the carrier material of the test element should make it possible to fix the matrices on it and make the entire arrangement manageable. Carrier materials should therefore be sufficiently rigid and chemically inert for the examination to be carried out.
  • plastic films for example made of polysterol, have proven to be suitable
  • the one or more matrices can be attached to the carrier material, for example by double-sided adhesive tape or with a hot melt adhesive.
  • the matrices are arranged on the carrier material in such a way that they form a liquid transport path and liquid, which is applied to the sample application zone, reaches the detection zone by capillary forces .
  • a so-called suction zone to the detection zone, which consists of a material that absorbs liquids well.
  • specifically bindable substance there is a labeled substance in the sample application zone that binds specifically to the analyte. If, for example, saccharides are to be detected, the corresponding lectins can be used as a specifically binding substance. In the detection of DNA or RNA, complementary DNA or RNA strands can be considered as the specifically bindable substance.
  • a particularly important class of specifically bindable substances are antibodies or antibody fragments which bind to the corresponding analytes, which are antigens. Further specifically bindable substances are known in the prior art
  • the specifically bindable substance has a label.
  • Chromophore or fluorophoric groups can be considered here due to the optical evaluation in reflection or transmission.
  • Corresponding dyes are sufficiently known in the prior art.
  • Gold marking has been found to be particularly suitable for the application according to the invention.
  • the term "marking" is also intended to include groups which are not themselves colored, but by a chemical reaction or by specific binding to a colored molecule can be detected.
  • porous, fibrous or non-fibrous materials have proven to be the most suitable matrix material Proven Suitable " Papers, nonwovens, porous plastic layers and membranes may be mentioned here.
  • Fibrous matrices which contain a high proportion of glass fibers and / or synthetic fibers, such as polyester fibers and / or cellulose, have proven particularly suitable During the liquid transport, a complex is formed from the analyte to be detected and the labeled substance, which also migrates with the liquid stream.This complex arrives with the liquid stream into the detection zone.
  • the detection zone is the zone that is illuminated and is detected by the reflected or transmitted radiation Detection zone must therefore be made that it is optically as homogeneous as possible so as not to interfere with the detection process. Any inhomogeneities can, however, be taken into account to a certain extent in the evaluation, provided that they are the same before and after the detection reaction. However, such optical inhomogeneities that only occur when the detection zone is moistened should be avoided
  • the detection zone has an area which serves to immobilize a complex of analyte and labeled substance. This area can be generated by applying a substance that binds the complex to the detection zone. It has proven to be advantageous that the substance that binds the complex transversely to the flow direction to be applied as a line or thin tape Lines of several tens of millimeters to several millimeters, preferably of 0.5 to 1 mm in width, have proven to be very suitable for the detection of analytes in concentrations of approximately 10 12 mol / l which bind the complex Substance in turn must be bound to the matrix material so that it enables the complex to be immobilized.
  • the substance binding the complex can be applied, for example, with a cannula by an inkjet process or an airbrush in the desired width. It has proven advantageous proven if the detection zone in this area consists of cells There is urozitrate or nitrocellulose ester, since very many substances, in particular proteins or nucleic acids, are strongly absorptively bound to it. It is thus possible to bind the specific binding substance sufficiently firmly to the matrix by pure absorption. Of course, it is also possible that covalently bind the complex immobilizing substance to the matrix
  • test elements that can be used in the context of the invention can be found in EP-A-0 323 605 and EP-A-0 186 799. These literature references refer in particular to matrix materials, chromogenic or fluorophoric groups , full content "Referring specifically binding substances, substances for immobilization of complexes of analyte and labeled substance and the production of these test elements
  • the amount of labeled substance in excess of the amount of analyte is advantageously selected so that quantitative binding of the analyte to the labeled substance
  • the substance that is used to immobilize the complex of analyte and labeled substance should bind to the labeled substance as little as possible in order to avoid falsification of the analysis result.
  • the immobilization zone passes, the complex is intercepted from the liquid, while unbound labeled substance moves on.
  • the amount of analyte or amount of sample that is applied to the sample application zone should be large enough to transport the unbound labeled substance out of the area of the detection zone, so that a falsification of the analysis result by labeled substance that is not bound to analyte is avoided If the amount of sample is not sufficient, an auxiliary liquid, such as water, isotonic saline or detergent solution, can be added to the sample application zone
  • the use of the type of test element mentioned in the context of the present invention has the advantage that the amount of analyte and thus also the amount of complex of analyte and labeled substance is concentrated in a relatively small and well-defined range Analyte concentration reaches a high signal level, which has a more favorable signal-to-noise ratio than would be the case if the label to be detected were distributed over a larger area, as is the case, for example, with thin-layer chromatograms. Furthermore, the use of a specifically bindable Substance for labeling the analyte and also the specific immobilization of the complex formed the advantage that the analyte is separated from other substances
  • a test element according to the invention is advantageously located in a housing in which it is held.
  • the housing has an opening for feeding the sample liquid onto the sample application zone and an opening through which the detection zone is optically accessible.
  • the housing generally consists of a base and a base Upper part, between which the test element is clamped By struts and the like, it is ensured that the test element is in a well-defined position within the housing.
  • the housing serves to mechanically stabilize the test element, to enable easier positioning and the test element to be made accessible through openings at the necessary points.
  • materials are used for the housing that have sufficient rigidity " In particular, plastics such as polyethylene or polystyrene are possible here.
  • An apparatus is used to evaluate a test element which has reacted with test liquid, which enables a spatially resolved evaluation.
  • This apparatus contains a holder for the test element or a housing, in which a test element is located, for positioning the detection zone.
  • An insert can be used as a holder, for example, in which the test element is pushed onto stop edges, through which it is positioned within a plane.
  • the test element is preferably also pressed onto the base from the top in order to position it vertically
  • a system according to the invention also has an illumination device for illuminating the detection zone of the test element.
  • the lighting device can have a broadband spectrum.
  • an illumination device with a narrow-band spectrum is preferred.
  • light-emitting diodes have proven to be advantageous.
  • halogen lamps in combination with spectral filters are also suitable
  • the lighting device is installed so that the detection zone is illuminated as homogeneously as possible.
  • this can be achieved with a circular arrangement of light-emitting diodes in a plane parallel to the plane of the detection zone, the radiation cone of the light-emitting diodes being directed at the plane of the detection zone. It is not necessary to focus the light-emitting diode on the detection zone.
  • the frequency band of the lighting device such that it falls within the absorption range of the marking of the marked substance.
  • green light-emitting diodes have been well preserved as light sources.
  • blue light-emitting diodes are particularly suitable. It is known in the prior art to control the light sources in such a way that their radiation intensity is as constant as possible during the recording of the measured values, for example by pulsing the light sources with a suitable current. The measurement is carried out during a plateau phase of the light pulse
  • the detection zone is illuminated by the lighting device and detected by it reflected or transmitted by a sensor array.
  • a sensor array is either a two-dimensional array, for example a CCD array, or a linear array that is moved across the row of sensors with a transport device, so that an area is covered.
  • Two-dimensional sensor arrays are already relatively inexpensive due to their use in video cameras available Arrays suitable for the use according to the invention should be at least approximately Have 250,000 individual sensors. With a size of the detection zone in the range of 1 cm x 1 cm, a resolution of approximately 0.1 mm in each spatial direction is achieved. Increasing the resolution has an advantageous effect on the evaluation accuracy
  • a linear sensor array is used, either a classic transport device can be used with which the sensor array is displaced transversely to the row of sensors, but it is also possible to optically image individual strips of the detection zone on the line array using an optical arrangement.
  • An apparatus according to DE 3247355 is suitable for this, for example.
  • a device according to P 19520606.1 can also be used particularly advantageously.However, two-dimensional sensor arrays offer the advantage that no moving parts are required in the apparatus. However, one-dimensional arrays are much cheaper and easier to control if several thousand pixels per row are to be resolved
  • An essential aspect of the present invention is that the spatially resolved evaluation of the detection zone and in particular the area around the immobilization zone is carried out with a sufficient number of sensors. In addition to a sufficient number of individual sensors, this requires a suitable optical imaging of the detection zone on the sensor array. The optical imaging should take place in such a way that the image of the detection zone fills the area of the sensor array or the area covered by a linear array as completely as possible.
  • An arrangement according to the invention has the advantage over a quantitative evaluation of thin-layer chromatograms that the area in which the detectable signal occurs is predetermined by the immobilization zone. It is therefore possible to adjust the size of the detection zone, the size of the sensor array and the optical imaging means to one another that the sensor array is used optimally.
  • this is achieved by means of a weak reduction optics for imaging the detection zone on the sensor array.
  • an image converter which consists of a large number of optical fibers, all of which have a cross section at one end that corresponds in size and shape to the detection zone, the other end in size and shape corresponds to the sensor array.
  • image converters are available, for example, from Schott or Galileo Electro-Optics Corporation
  • the illumination devices are preferably arranged around the edge of the imaging system.
  • LEDs can be grouped in a circle around the lens.
  • Such an arrangement of the light emitting diodes improves the homogeneity optical illumination A number of 4 to 30 light-emitting diodes has proven to be well suited
  • the system according to the invention has a converter which digitizes these signals.
  • Such converters are sufficiently known in the prior art and are generally referred to as analog-digital converters.
  • the digitized sensor signals are generally obtained from an evaluation device a micro computer, evaluated
  • test elements according to the invention there is a distribution of the detection signal which is essentially determined by the shape of the immobilization zone.
  • the concentration of the marking substance is high in the area facing the application zone, while it decreases in the direction of the suction matrix. It has been found that For the exact quantitative evaluation of this type of test element, an integral measurement is not sufficient. On the other hand, it has been shown that with the spatially resolved evaluation according to the invention, a very precise quantitative evaluation is possible.
  • each individual sensor signal is converted into a quantity of substance and based on it the total amount of substance determined in the individual measurement. With knowledge of the amount of sample applied to the test element, the concentration of analyte can be determined.
  • the advantage of the spatially resolved measurement is that the non-linear relationship between concentration and remission or absorption can be better taken into account.
  • the accuracy of the evaluation depends crucially on how strong the concentration within the surface area, which is detected by a single sensor of the sensor array, is constant.
  • the shape of the immobilization zone, the distribution curve of the marking substance is largely predetermined. It is therefore possible to adapt a spline function on the basis of the measured values, so that interpolation between the individual measured values is possible when calculating the amount of immobilized marking substance.
  • This increases the evaluation accuracy in particular when the signals from two adjacent sensors are relatively far apart , since this indicates that the concentration or amount of marking substance fluctuates relatively strongly within the area that is detected by a single sensor
  • the signals averaged over the columns in turn represent a line which reproduces the signal curve perpendicular to the detection lines.
  • light materials such as papers or nonwovens
  • the signal curve along the analytical test element which is determined by a reflectance measurement, therefore has minima at the locations of the detection zones.
  • a spatially resolved evaluation of test elements also offers the advantage that a correction of the background is possible.
  • the background which is caused by a coloration of the detection zone that is not caused by the substance to be detected, can only be in Form of a constant are taken into account.
  • the spatially resolved method of the present invention it is possible to appropriately limit the area that is being evaluated based on the signal distribution, so that background effects outside the selected area have no influence on the measurement result.
  • the measured signal curve is analyzed and signals from Sensors that lie below or above a determined threshold value are not taken into account in later calculations.
  • the slope of the signal curve can also be used as a criterion for limiting the evaluation range, or a maximum distance from the minima of the remission curve is specified in order to cover the evaluation range limit Due to the already mentioned signal curve, which can be approximated by a function curve, it is also possible with this function curve by extrapolation to also detect areas in which the sensor signals are due to the threshold value correction were not taken into account
  • the evaluation device turns the sensor signals that are evaluated or from values that are determined by a functional curve into a quantity of substance This is usually done by comparing the sensor signals with signals that have been determined for known concentrations of analyte.
  • the creation of calibration curves which allow an assignment of reflectance or transmission values to the respective amount of substance or concentration is well known in the prior art.
  • Figure 3 cross section through a housing with test element
  • FIG. 1 shows an analysis element in which a sample application zone (1), an erytrocyte separation zone (2), a detection zone (3) and a suction zone (4) are applied to a carrier material (5).
  • a sample application matrix (6) is arranged in the sample application zone (1), which partially overlaps an erytrocyte separation matrix (7).
  • the erytrocyte separation matrix (7) in turn overlaps the detection matrix (8) (detection zone) on which an immobilized substance is in the form a line (9) is applied.
  • a suction matrix (10) slightly overlaps the detection matrix (8). All of the reagents that are required to form a complex with the analyte to be detected are accommodated in the sample application matrix (6).
  • the test element presented here as an example serves to determine the concentration of troponin T from whole blood.
  • Troponin T is an important indicator for the determination of cardiac muscle necrosis.
  • the sample application zone consists of two superposed nonwovens, the first being impregnated with a gold-labeled antibody against Troponin T and the second nonwoven containing a biotinylated antibody against Troponin T.
  • a line (9) of streptavidin is applied within the detection zone
  • Figure 2 shows a plan view of a housing (12) with a test element.
  • the housing has two openings, the sample application opening (13) and the detection opening (14) Both openings taper in the direction of the test element.
  • the housing also has a holding part (15) to improve handling
  • Figure 3 shows a cross section through a housing with test element
  • the test element lies on the lower housing part (17), while the upper housing part (16) with the housing support (18) rests on the stops (19) of the lower housing part (17), so that a defined Ab ⁇ the lower and upper housing parts can be guaranteed.
  • the test element is secured against slipping by one stop (19) and another stop (20), so that a defined position of the sample application zone and the detection zone relative to the openings in the housing is ensured can be
  • FIG. 3 also shows the application of a sample liquid (23) with the aid of a pipette (22) to the sample application zone.
  • the sample releases biotinylated antibodies and gold-labeled antibodies from the matrices (11 and 26), which bind with the analyte of the sample liquid
  • biotinylated antibodies and gold-labeled antibodies from the matrices (11 and 26), which bind with the analyte of the sample liquid
  • Different complexes between analyte and the two named antibodies, which are in equilibrium with one another, are particularly important for the detection of complexes that have both biotinylated antibodies and gold-labeled antibodies.
  • the sample liquid with the complexes migrates through the erytrocyte separation matrix (7 ) and arrives in the detection zone (8). Due to the streptavidin strip (9) applied to the detection zone, biotinylated antibodies are immobilized. Only complexes which contain both biotin and gold markings contribute to the detectable signal.
  • FIG. 4 shows a holder into which a housing with a test element is inserted.
  • the holder has a flat base plate (30) on which two stop edges (31, 32) are mounted.
  • FIG. 5 shows a cross section through the system according to the invention.
  • the detection zone (8) and in particular the immobilization line (9) are imaged onto the sensor array (41) by an optical system (40), which is shown schematically as a lens.
  • the illumination of the detection zone takes place via light-emitting diodes (42) which are arranged around the sensor array (41).
  • the microprocessor (CPU) controls the sensor array.
  • Analog signals of the sensor array are converted into digital signals with an A / D converter (A / D), which are fed to the microprocessor (CPU)
  • the sensor signals are also evaluated in the microprocessor in order to determine the concentration of analyte.
  • the analysis result is shown on a display (D)
  • FIG. 6 shows a signal curve of a test element with a control line.
  • the figure shows the signal of one line of a two-dimensional sensor array with 165 lines and 192 columns.
  • the respective column of the sensor array is indicated on the X axis of the display.
  • the Y axis shows the gray value of the respective sensors in arbitrary units.
  • the detection line at clinically relevant concentrations of troponin T has a relatively small signal swing compared to the control line. This illustrates the need for a spatially resolved measurement for this area of application.
  • edge effects are noticeable, which occur due to shadows caused by the housing. This shows that it is of crucial importance to use a spatially resolved evaluation method with this type of test element which can correct or eliminate these effects.

Abstract

The invention concerns a system for the quantitative resolved evaluation of test elements, the system comprising a test element mounting which positions the test element, a test element with a sample-charging zone and a detection zone, a lighting arrangement, a sensor array, a converter, an evaluator unit for evaluating the digital signals, and a display for displaying the evaluation results.

Description

System zur quantitativen ortsaufgelösten Auswertung von TestelementenSystem for the quantitative, spatially resolved evaluation of test elements
Die vorliegende Erfindung betrifft ein System zum quantitativen ortsaufgelösten Nachweis eines Analyten mit Hilfe eines Testelements, beinhaltendThe present invention relates to a system for the quantitative, spatially resolved detection of an analyte using a test element, including
a) eine Halterung fiir das Testeiement, durch die das Testelement positioniert wird,a) a holder for the test element, through which the test element is positioned,
b) ein Testelement mit einer Probenaufgabezone, die eine markierte Substanz enthält, welche spezifisch an den Analyten bindet sowie eine Detektionszone, die einen Bereich enthält, der zur Immobilisierung eines Komplexes aus Analyt und markierter Substanz dient,b) a test element with a sample application zone which contains a labeled substance which binds specifically to the analyte and a detection zone which contains an area which serves to immobilize a complex of analyte and labeled substance,
c) eine Beleuchtungseinrichtung zur Beleuchtung der Detektionszone des Testelements,c) an illumination device for illuminating the detection zone of the test element,
d) einen Sensorarray, bei dem entweder eine Vielzahl von Sensoren in einer Fläche ange¬ ordnet sind,d) a sensor array in which either a multiplicity of sensors are arranged in one area,
oderor
eine Vielzahl von Sensoren in einer Reihe angeordnet und dieses lineare Array durch eine Transportvorrichtung quer zur Reihe der Sensoren bewegt wird, so daß eine Fläche überstrichen wird,a plurality of sensors are arranged in a row and this linear array is moved transversely to the row of sensors by a transport device so that an area is covered,
e) einen Konverter zur Umwandlung der analogen Sensorsignale in digitale Signale,e) a converter for converting the analog sensor signals into digital signals,
f) eine Auswerteeinheit zur Auswertung der digitalen Signale um die Analytkonzentration zu bestimmen,f) an evaluation unit for evaluating the digital signals in order to determine the analyte concentration,
g) ein Display zur Darstellung der Auswertungsergebnisse. Die vorliegende Erfindung liegt ιmJ3ereich der quantitativen Auswertung von Testelemen¬ ten durch Transmissions- oder Reflektionsmessungg) a display to show the evaluation results. The present invention is in the area of the quantitative evaluation of test elements by transmission or reflection measurement
Im Stand der Technik sind bereits seit einiger Zeit Systeme zur quantitativen Auswertung von Testelementen bekannt, bei denen die Detektionszone eines Testelements beleuchtet und von der Detektionszone reflektiertes oder durch die Detektionszone transmittiertes Licht integral vermessen und aus der Strahlungsintensität die Konzentration eines Analyten berechnet wird Bei dieser Meßmethode wird die Strahlung von einem einzelnen Sensor erfaßt, so daß der Informationsgehalt der Detektionszone nicht raumlich aufgelost sondern integral ermittelt wirdSystems for the quantitative evaluation of test elements have been known in the prior art for some time, in which the detection zone of a test element is illuminated and light is reflected integrally from the detection zone or transmitted through the detection zone and the concentration of an analyte is calculated from the radiation intensity in this measurement method the radiation is detected by a single sensor, so that the information content of the detection zone is not spatially resolved but is determined integrally
In der europaischen Patentanmeldung EP-A-0 646 784 wird ein Videosystem zur Auswer¬ tung von Testelementen beschrieben, bei dem Testelemente vom Benutzer auf eine Unter¬ lage abgelegt werden Die Auswertung der Testelemente erfolgt ohne eine vorhergehende Positionierung und das verwendete Videosystem muß daher die gesamte Unterlage erfassen, um sicherzustellen, daß die Detektionszone im Bildfeld ist. Dieses System gewahrt eine sehr weitgehende Benutzerfreundlichkeit, da der Anwender keine Positionierung vornehmen muß, was jedoch in einer stark verminderten Genauigkeit des Analyseergebnisses resultiert, da nur relativ wenige Sensoren des Videosystems zur Auswertung des eigentlichen Test¬ feldes zur Verfugung stehen. Um dem Benutzer die erwünschte Freiheit bei der Ablage eines Testelements zu gewähren, muß die beschriebene Apparatur auch einen großen OfT- nungsbereich aufweisen, durch den Störlicht eindringen kann Die beschriebene Apparatur ist daher lediglich für quantitative Auswertungen geeignet, bei denen das zu messende Signal groß ist und die Genauigkeitsanforderungen gering sindThe European patent application EP-A-0 646 784 describes a video system for evaluating test elements, in which test elements are placed on a support by the user. The test elements are evaluated without prior positioning and the video system used must therefore be Capture the entire pad to ensure that the detection zone is in the image field. This system ensures a very high degree of user-friendliness, since the user does not have to carry out any positioning, but this results in a greatly reduced accuracy of the analysis result, since only relatively few sensors of the video system are available for evaluating the actual test field. In order to grant the user the desired freedom when storing a test element, the apparatus described must also have a large opening area through which stray light can penetrate. The apparatus described is therefore only suitable for quantitative evaluations in which the signal to be measured is large and the accuracy requirements are low
In den Dokumenten EP-B-0 437 968 und DE 3247355 werden Vorrichtungen zur Auswer¬ tung von Dunnschichtchromatogrammen beschrieben Bei dem Gerat der DE 3247355 handelt es sich um einen Scanner, mit dem eine Dünnschichtchromatographieplatte abge¬ rastert wird Die von einem einzelnen Sensor betrachteten Flachenelemente weisen eine Große von etwa 0,05 bis 0,2 mm auf. In dieser Patentanmeldung wird auch bereits auf die Möglichkeit einer Auswertung von Dunnschichtchromatogrammen mit einem Videosystem hingewiesen Dieses wird jedoch verworfen, da eine exakte quantitative Auswertung auf Schwierigkeiten stoßt, weil eine homogene, vollflächige Ausleuchtung der DC-Platte sehr schwierig und mit monochromatischem Licht praktisch überhaupt nicht möglich sei Die "spatere europaische Patentschrift EP-B-0 437 968 schlägt dennoch ein Videodensitometer vor, mit dem eine quantitative Auswertung einer Dünnschichtchromatographie durchgeführt wird Die Verbesserung, aufgrund derer die Auswertung möglich wird, beruht auf einer sehr schnellen Bilderfassung, die zur Reduktion von Schwankungen des Systems fuhrt Die im Bereich der Dunnschichtchromatographie verwendeten Anordnungen besitzen im besten Falle eine Sensitivitat im Bereich von nano-Mol Dies resultiert daraus, daß die bei der Dunnschichtchromatographie gebildeten Banden in ihrer Breite stark vom jeweils ver¬ wendeten Analyten und insbesondere von Beschichtungsmaterial der Dunnschichtplatte ab¬ hangen Selbst bei Verwendung gleicher Materialien verursachen chargenspezifische Schwankungen eine Variation der Bandenbreite und Bandenlage. Weiterhin können Störun¬ gen des Nachweises durch Substanzen mit sehr ähnlichen Chromatographieeigenschaften auftreten. Ein weiterer Nachteil bei einer quantitativen Bestimmung von Substanzen mittels Dunnschichtchromatographie ist darin zu sehen, daß die Breite der Banden relativ groß ist, was zu einer Reduktion der Auswertegenauigkeit fuhrt, da bei abnehmender Konzentration der Anteil des optischen Rauschens zunimmtDevices for evaluating thin-layer chromatograms are described in documents EP-B-0 437 968 and DE 3247355. The device of DE 3247355 is a scanner with which a thin-layer chromatography plate is scanned. The flat elements viewed by a single sensor have a size of about 0.05 to 0.2 mm. This patent application already refers to the possibility of evaluating thin-layer chromatograms with a video system.However, this is discarded because an exact quantitative evaluation encounters difficulties because homogeneous, full-surface illumination of the DC plate is very difficult and practically not at all with monochromatic light possible was the "spatere European Patent EP-B-0437968 nevertheless proposes a Videodensitometer ago, with the quantitative evaluation is performed to thin layer chromatography the improvement due to which the evaluation is possible based on a very fast image capture that for the reduction of System fluctuations In the best case, the arrangements used in the area of thin-layer chromatography have a sensitivity in the range of nano-moles. This results from the fact that the width of the bands formed in thin-layer chromatography depends heavily on the analyte used in each case and in particular on the coating material of the thin-layer plate itself if the same materials are used, batch-specific fluctuations cause a variation in the width and position. Furthermore, disturbances in the detection by substances with very similar chromatography properties can occur. Another disadvantage of a quantitative determination of substances by means of thin layer chromatography is that the width of the bands is relatively large, which leads to a reduction in the evaluation accuracy, since the proportion of optical noise increases as the concentration decreases
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, die bestehenden Vornchtungen zur Auswer¬ tung von Testelementen soweit zu verbessern, daß auch klinisch relevante Analyten, die in sehr geringen Konzentrationen (piko-Mol) auftreten, mit hoher Genauigkeit quantitativ be¬ stimmt werden können. Es war weiterhin Aufgabe der Erfindung, ein einfach zu bedienen¬ des und kostengünstiges Gerat für diesen Zweck zu findenThe object of the present invention was to improve the existing equipment for evaluating test elements to such an extent that clinically relevant analytes which occur in very low concentrations (pico-mol) can be quantitatively determined with high accuracy. It was a further object of the invention to find a device which is easy to use and inexpensive for this purpose
Bei einer Bestimmung sehr niedrig konzentrierter Analyten, wie beispielsweise Proteinen, Pharmaka, Drogen oder Metaboliten in Körperflüssigkeiten, stellt sich das Problem, daß aufgrund der niedrigen Konzentrationen sehr empfindliche Nachweisreaktionen erforderlich sind Insbesondere muß bei solchen Analysen, bei denen häufig sehr ahnliche Verbindungen in höherer Konzentration als der Analyt vorliegen, eine eindeutige Unterscheidung bzw ausschließliche Detektion des gewünschten Analyten möglich sein. Wahrend in klinischen Laboratorien die Durchfuhrung solcher Tests für viele Analyten zum Stand der Technik gehört, ist eine quantitative Auswertung solch geringer Analytkonzentrationen mit Testele¬ ment bisher routinemäßig nicht möglich gewesen Mit dem erfindungsgemaßen System hat es sich jedoch als möglich erwiesen, Analytkonzentrationen im Bereich von 10"12 mol/l quantitativ nachzuweisenWhen determining very low concentration analytes, such as proteins, pharmaceuticals, drugs or metabolites in body fluids, the problem arises that very sensitive detection reactions are required due to the low concentrations. In particular, in such analyzes, in which very similar compounds are often present in higher concentrations when the analyte is present, a clear differentiation or exclusive detection of the desired analyte is possible. While the implementation of such tests for many analytes is part of the prior art in clinical laboratories, a quantitative evaluation of such low analyte concentrations with test element has hitherto routinely not been possible. However, with the system according to the invention it has proven possible to determine analyte concentrations in the range of 10 " Quantitative evidence of 12 mol / l
Testelemente, die für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden können, werden im Stand der Technik als immunologische Testelemente bezeichnet Für die Erfindung geeig¬ nete Testelemente besitzen ein oder mehrere saugfähige Matrizes auf einem Tragermaterial, "wobei die Matrizes so auf dem Tragermaterial angeordnet sind, daß ein Flussigkeitsfluß durch alle Matrizes möglich ist Ein geeignetes Testelement besitzt eine Probenaufgabe- und eine Nachweiszone Weiterhin kann es auch eine Zone zur Abtrennung von störenden Substanzen, beispielsweise Erythrozyten aufweisen Das Tragermaterial des Testelementes soll es ermöglichen, die Matrizes auf ihm zu befestigen und die gesamte Anordnung hand¬ habbar zu machen Tragermaterialien sollten daher ausreichend steif und für die durchzu¬ führende Untersuchung chemisch inert sein Insbesondere haben sich Kunststoffolien, bei¬ spielsweise aus Polysterol, als geeignet erwiesenTest elements which can be used for the present invention are referred to in the prior art as immunological test elements. Test elements suitable for the invention have one or more absorbent matrices on a carrier material, "the matrices being arranged on the carrier material in such a way that a Liquid flow through all matrices is possible. A suitable test element has a sample application and a detection zone. Furthermore, it can also have a zone for separating interfering substances, for example erythrocytes. The carrier material of the test element should make it possible to fix the matrices on it and make the entire arrangement manageable. Carrier materials should therefore be sufficiently rigid and chemically inert for the examination to be carried out. In particular, plastic films, for example made of polysterol, have proven to be suitable
Auf dem Trägermaterial können die ein oder mehreren Matrizes beispielsweise durch ein doppelseitiges Klebeband oder mit einem Schmelzkleber befestigt werden Die Matrizes sind auf dem Trägermaterial so angeordnet, daß sie eine Flussigkeitstransportstrecke bilden und Flüssigkeit, die auf der Probenaufgabezone aufgegeben wird, durch Kapillarkräfte in die Nachweiszone gelangt. Um den Flüssigkeitstransport zu unterstutzen hat es sich als vorteil¬ haft erwiesen, an die Nachweiszone eine sogenannte Saugzone anzuschließen, die aus einem gut Flüssigkeit aufnehmenden Material besteht.The one or more matrices can be attached to the carrier material, for example by double-sided adhesive tape or with a hot melt adhesive.The matrices are arranged on the carrier material in such a way that they form a liquid transport path and liquid, which is applied to the sample application zone, reaches the detection zone by capillary forces . In order to support the liquid transport, it has proven to be advantageous to connect a so-called suction zone to the detection zone, which consists of a material that absorbs liquids well.
In der Probenaufgabzone befindet sich eine markierte Substanz, welche spezifisch an den Analyten bindet. Sollen beispielsweise Saccharide nachgewiesen werden, so können die ent¬ sprechenden Lektine als spezifisch bindende Substanz eingesetzt werden. Beim Nachweis von DNA oder RNA kommen als spezifisch bindefähige Substanz komplementäre DNA- oder RNA-Strange in Frage. Eine besonders wichtige Klasse spezifisch bindefähiger Sub¬ stanzen sind Antikörper oder Antikörperfragmente, die an die entsprechenden Analyten, die Antigene darstellen, binden Weitere spezifisch bindefähige Substanzen sind im Stand der Technik bekanntThere is a labeled substance in the sample application zone that binds specifically to the analyte. If, for example, saccharides are to be detected, the corresponding lectins can be used as a specifically binding substance. In the detection of DNA or RNA, complementary DNA or RNA strands can be considered as the specifically bindable substance. A particularly important class of specifically bindable substances are antibodies or antibody fragments which bind to the corresponding analytes, which are antigens. Further specifically bindable substances are known in the prior art
Erfindungsgemaß besitzt die spezifisch bindefähige Substanz eine Markierung Aufgrund der optischen Auswertung in Reflektion oder Transmission kommen hier chromophore oder fluorophore Gruppen in Betracht. Entsprechende Farbstoffe sind im Stand der Technik hin¬ länglich bekannt Als besonders geeignet für die erfindungsgemaße Anwendung hat sich eine Goldmarkierung herausgestellt Von dem Begriff "Markierung" sollen auch solche Gruppen umfaßt sein, die selbst nicht farbig sind, jedoch durch eine chemische Reaktion oder durch die spezifische Bindung an ein gefärbtes Molekül detektierbar sind.According to the invention, the specifically bindable substance has a label. Chromophore or fluorophoric groups can be considered here due to the optical evaluation in reflection or transmission. Corresponding dyes are sufficiently known in the prior art. Gold marking has been found to be particularly suitable for the application according to the invention. The term "marking" is also intended to include groups which are not themselves colored, but by a chemical reaction or by specific binding to a colored molecule can be detected.
Es ist wichtig, daß sich die in der Probenaufgabezone befindliche markierte Substanz bei der Probenaufgabe möglichst schnell und vollständig von dem Matrixmaterial ablost und mit dem Flüssigkeitsfluß abtransportiert wird Als Matrixmaterial haben sich für diese Anwen¬ dung vor allem poröse, faserige oder nicht-faserige Materialien als geeignet erwiesen Es "seien hier Papiere, Vliese, poröse Kunststoffschichten und Membranen genannt Als be¬ sonders gut geeignet haben sich faserige Matrizes,die einen hohen Anteil an Glasfasern und/oder Synthetikfasern, wie beispielsweise Polyesterfasern und/oder Zellwolle enthalten, herausgestellt Wahrend des Flussigkeitstransportes bildet sich aus dem nachzuweisenden Analyten und der markierten Substanz ein Komplex, der ebenfalls mit dem Flussigkeitsstrom wandert Dieser Komplex gelangt mit dem Flussigkeitsstrom in die Detektionszone Die Detektionszone ist die Zone, die beleuchtet und von der reflektierte oder transmittierte Strahlung detektiert wird An die Detektionszone ist daher die Forderung zu stellen, daß sie optisch möglichst homogen ist, um den Detektionsprozeß nicht zu stören. Etwaige Inhomogenitäten können jedoch bis zu einem gewissen Grade bei der Auswertung berücksichtigt werden, sofern sie vor und nach der Nachweisreaktion gleich sind Vermieden werden sollten jedoch solche optischen Inhomogenitäten, die erst bei Befeuchtung der Detektionszone auftretenIt is important that the marked substance located in the sample application zone detaches from the matrix material as quickly and completely as possible during the sample application and is transported away with the liquid flow. For this application, porous, fibrous or non-fibrous materials have proven to be the most suitable matrix material Proven Suitable " Papers, nonwovens, porous plastic layers and membranes may be mentioned here. Fibrous matrices which contain a high proportion of glass fibers and / or synthetic fibers, such as polyester fibers and / or cellulose, have proven particularly suitable During the liquid transport, a complex is formed from the analyte to be detected and the labeled substance, which also migrates with the liquid stream.This complex arrives with the liquid stream into the detection zone.The detection zone is the zone that is illuminated and is detected by the reflected or transmitted radiation Detection zone must therefore be made that it is optically as homogeneous as possible so as not to interfere with the detection process. Any inhomogeneities can, however, be taken into account to a certain extent in the evaluation, provided that they are the same before and after the detection reaction. However, such optical inhomogeneities that only occur when the detection zone is moistened should be avoided
Als Material für die Detektionszone sind ebenfalls Materialien geeignet, die bereits für die Probenaufgabezone genannt wurden. Die Detektionszone besitzt einen Bereich, der zur Immobilisierung eines Komplexes aus Analyt und markierter Substanz dient Dieser Bereich kann erzeugt werden, in dem eine den Komplex bindende Substanz auf der Detektionszone aufgebracht wird Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, die den Komplex bindende Substanz quer zur Flußrichtung als Strich oder dünnes Band aufzubringen Striche von mehreren lOtel Millimetern bis mehreren Millimetern, vorzugsweise von 0,5 bis 1 mm Breite haben sich für den Nachweis von Analyten in Konzentrationen von etwa 10"12 mol/l als sehr gut geeignet erwiesen Die den Komplex bindende Substanz muß ihrerseits an das Matrix¬ material gebunden sein, so daß sie eine Immobilisierung des Komplexes ermöglicht Die den Komplex bindende Substanz kann beispielsweise mit einer Kanüle durch ein InkJet- Verfah¬ ren oder einen Airbrush in der gewünschten Breite aufgebracht werden Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die Detektionszone in diesem Bereich aus Zellulosenitrat oder Nitro¬ zelluloseester besteht, da hieran sehr viele Substanzen, insbesondere Proteine oder Nuklein¬ säuren, stark absorptiv gebunden werden Es ist so möglich, die spezifisch bindende Sub¬ stanz durch reine Absorption genügend fest an die Matrix zu binden Es ist naturlich auch möglich, die den Komplex immobilisierende Substanz kovalent an die Matrix zu bindenAlso suitable as material for the detection zone are materials that have already been mentioned for the sample application zone. The detection zone has an area which serves to immobilize a complex of analyte and labeled substance. This area can be generated by applying a substance that binds the complex to the detection zone. It has proven to be advantageous that the substance that binds the complex transversely to the flow direction to be applied as a line or thin tape Lines of several tens of millimeters to several millimeters, preferably of 0.5 to 1 mm in width, have proven to be very suitable for the detection of analytes in concentrations of approximately 10 12 mol / l which bind the complex Substance in turn must be bound to the matrix material so that it enables the complex to be immobilized. The substance binding the complex can be applied, for example, with a cannula by an inkjet process or an airbrush in the desired width. It has proven advantageous proven if the detection zone in this area consists of cells There is ulosenitrate or nitrocellulose ester, since very many substances, in particular proteins or nucleic acids, are strongly absorptively bound to it. It is thus possible to bind the specific binding substance sufficiently firmly to the matrix by pure absorption. Of course, it is also possible that covalently bind the complex immobilizing substance to the matrix
Informationen über den Aufbau von Testelementen, die im Rahmen der Erfindung verwen¬ det werden können, finden sich in EP-A-0 323 605 und EP-A-0 186 799 Auf diese Litera¬ turstellen wird insbesondere betreffend Matrixmaterialien, chromogener oder fluorophorer Gruppen, spezifisch bindender Substanzen, Substanzen zur Immobilisierung von Komplexen aus Analyt und markierter Substanz sowie der Herstellung dieser Testelemente vollinhaltlich "Bezug genommenInformation on the structure of test elements that can be used in the context of the invention can be found in EP-A-0 323 605 and EP-A-0 186 799. These literature references refer in particular to matrix materials, chromogenic or fluorophoric groups , full content "Referring specifically binding substances, substances for immobilization of complexes of analyte and labeled substance and the production of these test elements
Vorteilhaft wird die Menge an markierter Substanz im Überschuß zur Analytmenge ge¬ wählt, so daß von einer quantitativen Bindung des Analyten an die markierte Substanz aus- gegangen werden kann Die Substanz, die zur Immobilisierung des Komplexes aus Analyt und markierter Substanz dient, sollte an die markierte Substanz so wenig wie möglich bin¬ den, um eine Verfälschung des Analyseergebnisses zu vermeiden Wahrend die Proben- flussigkeit, in der sich der Komplex aus Analyt und markierter Substanz befindet, die Immobilisierungszone passiert, wird der Komplex aus der Flüssigkeit abgefangen, wahrend ungebundene markierte Substanz weiterwandert. Die Analytmenge bzw Probenmenge, die auf der Probenaufgabezone aufgegeben wird, sollte groß genug sein, die ungebundene markierte Substanz aus dem Bereich der Detektionszone herauszutransportieren, damit eine Verfälschung des Analyseergebnisses durch markierte Substanz, die nicht an Analyt gebun¬ den ist, vermieden wird Falls die Probenmenge nicht ausreichend ist, so kann eine Hilfs- flussigkeit, wie beispielsweise Wasser, isotonische Kochsalzlosung oder Detergenzlosung auf die Probenaufgabezone gegeben werdenThe amount of labeled substance in excess of the amount of analyte is advantageously selected so that quantitative binding of the analyte to the labeled substance The substance that is used to immobilize the complex of analyte and labeled substance should bind to the labeled substance as little as possible in order to avoid falsification of the analysis result. During the sample liquid, in which the complex is composed Analyte and labeled substance is located, the immobilization zone passes, the complex is intercepted from the liquid, while unbound labeled substance moves on. The amount of analyte or amount of sample that is applied to the sample application zone should be large enough to transport the unbound labeled substance out of the area of the detection zone, so that a falsification of the analysis result by labeled substance that is not bound to analyte is avoided If the amount of sample is not sufficient, an auxiliary liquid, such as water, isotonic saline or detergent solution, can be added to the sample application zone
Eine Verwendung des genannten Testelementtyps im Rahmen der vorliegenden Erfindung bringt den Vorteil mit sich, daß die Menge an Analyt und damit auch die Menge an Komplex aus Analyt und markierter Substanz in einem relativ kleinen und gut definierten Bereich konzentriert wird In diesem Bereich wird auch bei geringer Analytkonzentration ein hoher Signalpegel erreicht, der ein gunstigeres Signal-Rausch- Verhältnis aufweist, als dies der Fall wäre, wenn die nachzuweisende Markierung über einen größeren Bereich ver¬ teilt wäre, wie dies beispielsweise bei Dunnschichtchromatogrammen der Fall ist Weiterhin besitzt die Verwendung einer spezifisch bindefahigen Substanz zur Markierung des Analy¬ ten und auch die spezifische Immobilisierung des gebildeten Komplexes den Vorteil, daß eine Trennung des Analyten von anderen Substanzen erfolgtThe use of the type of test element mentioned in the context of the present invention has the advantage that the amount of analyte and thus also the amount of complex of analyte and labeled substance is concentrated in a relatively small and well-defined range Analyte concentration reaches a high signal level, which has a more favorable signal-to-noise ratio than would be the case if the label to be detected were distributed over a larger area, as is the case, for example, with thin-layer chromatograms. Furthermore, the use of a specifically bindable Substance for labeling the analyte and also the specific immobilization of the complex formed the advantage that the analyte is separated from other substances
Vorteilhaft befindet sich ein erfindungsgemaßes Testelement in einem Gehäuse, in dem es gehaltert wird Das Gehäuse besitzt eine Öffnung zur Aufgabe der Probenflussigkeit auf die Probenaufgabezone und eine Öffnung, durch die die Detektionszone optisch zuganglich ist Das Gehäuse besteht in der Regel aus einem Unter- und einem Oberteil, zwischen denen der Testelement eingeklemmt wird Durch Streben und dergleichen wird dafür gesorgt, daß sich das Testelement innerhalb des Gehäuses in einer wohl definierten Postion befindet Das Gehäuse dient dazu, das Testelement mechanisch zu stabilisieren, eine leichtere Positionie¬ rung zu ermöglichen und das Testelement an den notwendigen Stellen durch Öffnungen zugänglich zu machen. Um die Erhöhung der mechanischen Stabilität zu gewahrleisten, werden für das Gehäuse Materialien eingesetzt, die eine ausreichende Steifigkeit aufweisen "Insbesondere kommen hier Kunststoffe, wie Polyethylen oder Polystyrol in Frage Ein weiterer wichtiger Vorteil des Gehäuses ist es, die Infektionsgefahr für den Anwender herabzusetzen Zur Auswertung eines Testelementes, das mit Probeflussigkeit reagiert hat, wird eine Appa¬ ratur verwendet, die eine ortsaufgeloste Auswertung ermöglicht. Diese Apparatur beinhaltet eine Halterung für das Testelement oder ein Gehäuse, in dem sich ein Testelement befindet, zur Positionierung der Detektionszone Als Halterung kann beispielsweise ein Einschub dienen, bei dem das Testelement an Anschlagkanten geschoben wird, durch die es innerhalb einer Ebene positioniert wird. Bevorzugt wird das Testelement auch von der Oberseite her auf die Unterlage gedrückt, um es in der Senkrechten zu positionierenA test element according to the invention is advantageously located in a housing in which it is held.The housing has an opening for feeding the sample liquid onto the sample application zone and an opening through which the detection zone is optically accessible.The housing generally consists of a base and a base Upper part, between which the test element is clamped By struts and the like, it is ensured that the test element is in a well-defined position within the housing. The housing serves to mechanically stabilize the test element, to enable easier positioning and the test element to be made accessible through openings at the necessary points. In order to ensure the increase in mechanical stability, materials are used for the housing that have sufficient rigidity " In particular, plastics such as polyethylene or polystyrene are possible here. Another important advantage of the housing is that the risk of infection for the user is reduced An apparatus is used to evaluate a test element which has reacted with test liquid, which enables a spatially resolved evaluation. This apparatus contains a holder for the test element or a housing, in which a test element is located, for positioning the detection zone. An insert can be used as a holder, for example, in which the test element is pushed onto stop edges, through which it is positioned within a plane. The test element is preferably also pressed onto the base from the top in order to position it vertically
Ein erfindungsgemaßes System weist weiterhin eine Beleuchtungseinrichtung zur Beleuch¬ tung der Detektionszone des Testelementes auf. Die Beleuchtungseinrichtung kann ein breitbandiges Spektrum besitzen. Bevorzugt ist jedoch eine Beleuchtungseinrichtung mit einem schmalbandigen Spektrum. Insbesondere haben sich Leuchtdioden als vorteilhaft er¬ wiesen Es sind beispielsweise auch Halogenlampen in Kombination mit Spektralfiltern ge¬ eignetA system according to the invention also has an illumination device for illuminating the detection zone of the test element. The lighting device can have a broadband spectrum. However, an illumination device with a narrow-band spectrum is preferred. In particular, light-emitting diodes have proven to be advantageous. For example, halogen lamps in combination with spectral filters are also suitable
Die Beleuchtungseinrichtung wird so installiert, daß eine möglichst homogene Ausleuchtung der Detektionszone erreicht wird. Insbesondere kann dies mit einer kreisförmigen Anord¬ nung von Leuchtdioden in einer Ebene parallel zur Ebene der Detektionszone erreicht wer¬ den, wobei der Strahlungskegel der Leuchtdioden auf die Ebene der Detektionszone ge¬ richtet ist. Eine Fokussierung der Leuchtdiode auf die Detektionszone ist dabei nicht not¬ wendig.The lighting device is installed so that the detection zone is illuminated as homogeneously as possible. In particular, this can be achieved with a circular arrangement of light-emitting diodes in a plane parallel to the plane of the detection zone, the radiation cone of the light-emitting diodes being directed at the plane of the detection zone. It is not necessary to focus the light-emitting diode on the detection zone.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, das Frequenzband der Beleuchtungseinrichtung so zu wählen, daß es in den Absorptionsbereich der Markierung der markierten Substanz fällt Bei mit Goldpartikeln markierten Substanzen, die eine rote Farbe aufweisen, haben sich grüne Leuchtdioden als Lichtquellen gut bewahrt. Besonders geeignet sind jedoch blaue Leucht¬ dioden. Es ist im Stand der Technik bekannt, die Lichtquellen so anzusteuern, daß ihre Strahlungsintensität wahrend der Meßwertaufnahme möglichst konstant ist, z B. durch pulsformiges Ansteuern der Lichtquellen mit einem geeigneten Strom Dabei wird die Messung während einer Plateauphase des Lichtimpulses durchgeführtIt has proven to be advantageous to choose the frequency band of the lighting device such that it falls within the absorption range of the marking of the marked substance. With light-colored substances marked with gold particles, green light-emitting diodes have been well preserved as light sources. However, blue light-emitting diodes are particularly suitable. It is known in the prior art to control the light sources in such a way that their radiation intensity is as constant as possible during the recording of the measured values, for example by pulsing the light sources with a suitable current. The measurement is carried out during a plateau phase of the light pulse
Die Detektionszone wird mit der Beleuchtungseinrichtung beleuchtet und von ihr reflektier¬ tes oder durch sie transmittiertes Licht mit einem Sensorarray detektiert. Ein solches Sensorarray ist erfindungsgemaß entweder ein zweidimensionales Array, beispielsweise ein CCD-Array oder ein lineares Array, das mit einer Transportvorrichtung quer zur Reihe der Sensoren bewegt wird, so daß dabei eine Fläche überstrichen wird Zweidimensionale Sensorarrays sind aufgrund ihrer Verwendung in Videokameras bereits relativ kostengünstig erhältlich Für die erfindungsgemaße Verwendung geeignete Arrays sollten mindestens etwa 250 000 Einzelsensoren aufweisen. Bei einer Große der Detektionszone im Bereich von 1 cm x 1 cm erreicht man eine Auflosung von ungefähr 0, 1 mm in jeder Raumrichtung Eine Erhöhung der Auflosung wirkt sich vorteilhaft auf die Auswertegenauigkeit ausThe detection zone is illuminated by the lighting device and detected by it reflected or transmitted by a sensor array. According to the invention, such a sensor array is either a two-dimensional array, for example a CCD array, or a linear array that is moved across the row of sensors with a transport device, so that an area is covered. Two-dimensional sensor arrays are already relatively inexpensive due to their use in video cameras available Arrays suitable for the use according to the invention should be at least approximately Have 250,000 individual sensors. With a size of the detection zone in the range of 1 cm x 1 cm, a resolution of approximately 0.1 mm in each spatial direction is achieved. Increasing the resolution has an advantageous effect on the evaluation accuracy
Bei Verwendung eines linearen Sensorarray kann entweder eine klassische Transportvor¬ richtung verwendet werden, mit der das Sensorarray quer zur Reihe der Sensoren ver¬ schoben wird, es ist jedoch auch möglich, über eine optische Anordnung einzelne Streifen der Detektionszone optisch auf das Zeilenarray abzubilden. Hierfür ist beispielsweise eine Apparatur gemäß DE 3247355 geeignet. Besonders vorteilhaft kann auch eine Vorrichtung gemäß P 19520606.1 eingesetzt werden Zweidimensionale Sensorarrays bieten jedoch den Vorteil, daß in der Apparatur keine beweglichen Teile erforderlich sind Dafür sind jedoch eindimensionale Arrays wesentlich preisgünstiger und auch leichter anzusteuern, wenn mehrere tausend Bildpunkte pro Reihe aufgelost werden sollenIf a linear sensor array is used, either a classic transport device can be used with which the sensor array is displaced transversely to the row of sensors, but it is also possible to optically image individual strips of the detection zone on the line array using an optical arrangement. An apparatus according to DE 3247355 is suitable for this, for example. A device according to P 19520606.1 can also be used particularly advantageously.However, two-dimensional sensor arrays offer the advantage that no moving parts are required in the apparatus. However, one-dimensional arrays are much cheaper and easier to control if several thousand pixels per row are to be resolved
Ein wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, daß die ortsaufgeloste Auswer¬ tung der Detektionszone und insbesondere des Bereiches um die Immobilisierungszone mit einer ausreichenden Zahl von Sensoren erfolgt. Dafür ist, neben einer ausreichenden Zahl der Einzelsensoren, eine geeignete optische Abbildung der Detektionszone auf das Sensor¬ array notwendig. Die optische Abbildung sollte so erfolgen, daß das Bild der Detektions¬ zone die Fläche des Sensorarrays bzw. die von einem linearen Array uberstrichene Fläche, möglichst vollständig ausfüllt. Eine erfindungsgemaße Anordnung besitzt gegenüber einer quantitativen Auswertung von Dunnschichtchromatogrammen den Vorteil, daß der Bereich, in dem das detektierbare Signal auftritt, durch die Immobilisierungszone vorgegeben ist Es ist daher möglich, die Große der Detektionszone, die Größe des Sensorarrays und die optischen Abbildungsmittel so aufeinander einzustellen, daß das Sensorarray optimal ausgenutzt wird. In der Regel wird dies durch eine schwache Verkleinerungsoptik zur Abbildung der Detektionszone auf das Sensorarray erreicht Neben einer konventionellen Ausgestaltung der Optik mit Linsen, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, einen Bildwandler zu verwenden, der aus einer Vielzahl von Lichtleiterfasern besteht, die in ihrer Gesamtheit an dem einen Ende einen Querschnitt aufweisen, der in Größe und Form der Detektions¬ zone entspricht, wobei das andere Ende in Größe und Form dem Sensorarray entspricht Solche Bildwandler sind beispielsweise bei der Firma Schott oder Firma Galileo Electro- Optics Corporation erhältlichAn essential aspect of the present invention is that the spatially resolved evaluation of the detection zone and in particular the area around the immobilization zone is carried out with a sufficient number of sensors. In addition to a sufficient number of individual sensors, this requires a suitable optical imaging of the detection zone on the sensor array. The optical imaging should take place in such a way that the image of the detection zone fills the area of the sensor array or the area covered by a linear array as completely as possible. An arrangement according to the invention has the advantage over a quantitative evaluation of thin-layer chromatograms that the area in which the detectable signal occurs is predetermined by the immobilization zone. It is therefore possible to adjust the size of the detection zone, the size of the sensor array and the optical imaging means to one another that the sensor array is used optimally. As a rule, this is achieved by means of a weak reduction optics for imaging the detection zone on the sensor array.In addition to a conventional design of the optics with lenses, it has proven to be advantageous to use an image converter which consists of a large number of optical fibers, all of which have a cross section at one end that corresponds in size and shape to the detection zone, the other end in size and shape corresponds to the sensor array. Such image converters are available, for example, from Schott or Galileo Electro-Optics Corporation
' Wird mit dem erfindungsgemäßen System eine reflektometrische Auswertung durchgeführt, sind die Beleuchtungseinrichtungen bevorzugt um den Rand des abbildenden Systems herum angeordnet. Beispielsweise können Leuchtdioden kreisförmig um das Objektiv herum gruppiert werden. Eine derartige Anordnung der Leuchtdioden verbessert die Homogenitat der optischen Ausleuchtung Als gut geeignet hat sich eine Zahl von 4 bis 30 Leuchtdioden erwiesenIf a reflectometric evaluation is carried out with the system according to the invention, the illumination devices are preferably arranged around the edge of the imaging system. For example, LEDs can be grouped in a circle around the lens. Such an arrangement of the light emitting diodes improves the homogeneity optical illumination A number of 4 to 30 light-emitting diodes has proven to be well suited
Zur Umwandlung der analogen Sensorsignale besitzt das erfindungsgemaße System einen Konverter, der diese Signale digitalisiert Solche Konverter sind im Stand der Technik hin¬ länglich bekannt und werden in der Regel als Analog-Digitalwandler bezeichnet Die digi¬ talisierten Sensorsignale werden von einer Auswertevorrichtung, in der Regel einem Mikro¬ computer, ausgewertetTo convert the analog sensor signals, the system according to the invention has a converter which digitizes these signals. Such converters are sufficiently known in the prior art and are generally referred to as analog-digital converters. The digitized sensor signals are generally obtained from an evaluation device a micro computer, evaluated
Bei den erfindungsgemaßen Testelementen liegt eine Verteilung des Detektionssignales vor, die im wesentlichen durch die Form der Immobilisierungszone bestimmt wird Im der Auf¬ tragszone zugewandten Bereich ist die Konzentration an Markierungssubstanz groß, wahrend sie in Richtung auf die Saugmatrix hin abnimmt Es hat sich herausgestellt, daß zur exakten quantitativen Auswertung dieser Art von Testelementen eine integrale Ver¬ messung nicht ausreicht Hingegen hat es sich gezeigt, daß mit der erfindungsgemaßen orts- aufgelosten Auswertung eine sehr genaue quantitative Auswertung möglich ist Bei der erfindungsgemaßen Auswertung wird jedes einzelne Sensorsignal in eine Substanzmenge umgerechnet und aufgrund der Einzelmessung die gesamte Substanzmenge ermittelt Mit Kenntnis der auf das Testelement aufgegebenen Probenmenge kann die Konzentration an Analyt bestimmt werden. Der Vorteil der ortsaufgelösten Messung liegt darin, daß der nicht-lineare Zusammenhang zwischen Konzentration und Remission bzw Absorption besser berücksichtigt werden kann. Die Genauigkeit der Auswertung hangt bei diesem An¬ satz entscheidend davon ab, wie stark die Konzentration innerhalb des Flachenbereiches, der durch einen einzelnen Sensor des Sensorarrays erfaßt wird, konstant ist Bei Auswertung der beschriebenen Testelemente kann man bei der Auswertung weiterhin davon profitieren, daß durch die Form der Immobilisierungszone die Verteilungskurve der Markierungssub¬ stanz weitestgehend vorgegeben ist. Es ist daher möglich, aufgrund der Meßwerte eine Spline-Funktion anzupassen, so daß bei Berechnung der Menge an immobilisierter Markierungssubstanz eine Interpolation zwischen den einzelnen Meßwerten möglich ist Dies steigert die Auswertegenauigkeit insbesondere dann, wenn die Signale zweier benach¬ barter Sensoren relativ weit auseinander liegen, da dies darauf hindeutet, daß die Konzen¬ tration bzw Menge an Markierungssubstanz innerhalb der Flache, die von einem einzelnen Sensor erfaßt wird, verhältnismäßig stark schwanktIn the test elements according to the invention there is a distribution of the detection signal which is essentially determined by the shape of the immobilization zone. The concentration of the marking substance is high in the area facing the application zone, while it decreases in the direction of the suction matrix. It has been found that For the exact quantitative evaluation of this type of test element, an integral measurement is not sufficient. On the other hand, it has been shown that with the spatially resolved evaluation according to the invention, a very precise quantitative evaluation is possible. In the evaluation according to the invention, each individual sensor signal is converted into a quantity of substance and based on it the total amount of substance determined in the individual measurement. With knowledge of the amount of sample applied to the test element, the concentration of analyte can be determined. The advantage of the spatially resolved measurement is that the non-linear relationship between concentration and remission or absorption can be better taken into account. In this approach, the accuracy of the evaluation depends crucially on how strong the concentration within the surface area, which is detected by a single sensor of the sensor array, is constant. When evaluating the test elements described, one can further benefit from the evaluation that: the shape of the immobilization zone, the distribution curve of the marking substance is largely predetermined. It is therefore possible to adapt a spline function on the basis of the measured values, so that interpolation between the individual measured values is possible when calculating the amount of immobilized marking substance. This increases the evaluation accuracy in particular when the signals from two adjacent sensors are relatively far apart , since this indicates that the concentration or amount of marking substance fluctuates relatively strongly within the area that is detected by a single sensor
' Wird zur Immobilisierung des Komplexes aus nachzuweisender Substanz und spezifisch bindender markierter Substanz eine Zone mit hoher Symmetrie, beispielsweise ein Strich, gewählt, so gestattet die Berücksichtigung dieser Symmetrie eine Verbesserung der Aus¬ wertegenauigkeit Wird die Immobilisierungszone als Strich ausgebildet, so sollten die parallelen Zeilen des Sensorarrays, die senkrecht zum Strich verlaufen, einen sehr ahnlichen Signalverlauf aufweisen Aufgrund dieser Information können beispielsweise Randzonen des Testelements, die einen verzerrten Signalverlauf aufweisen, erkannt und eliminiert werden Eine derartige Eliminierung ist für Zeilen vorteilhaft, bei denen der maximale Signalhub 5 % unterhalb des maximalen Signalhubes im Zentrum des Detektionssignales (in der Mitte des Detektionsstriches) liegt. Weiterhin können Inhomogenitäten des Testelementes erkannt und berücksichtigt oder eliminiert werden Sind Zeilen des Sensorarrays lokalisiert worden, die aufgrund dieser Kriterien einen geeigneten Signalverlauf aufweisen, so kann die Auswertung des Testelementes beschleunigt werden, indem die Auswertevorrichtung äquivalente Spalten dieser Zeilen mittelt und die nachfolgenden Berechnungen auf dieser Basis durchführt. 'Is to immobilize the complex of the substance to be detected and specific binding of labeled substance is a zone of high symmetry, for example a bar, chosen so should the consideration of this symmetry permits an improvement in the accuracy values Aus¬ the immobilization zone formed as a bar, the parallel lines of the sensor array that run perpendicular to the line have a very similar signal curve. Based on this information, for example, edge zones of the test element that have a distorted signal curve can be recognized and eliminated. Such an elimination is advantageous for lines in which the maximum signal swing is 5%. below the maximum signal swing in the center of the detection signal (in the middle of the detection line). Furthermore, inhomogeneities of the test element can be recognized and taken into account or eliminated. If lines of the sensor array that have a suitable signal curve based on these criteria have been localized, the evaluation of the test element can be accelerated by averaging equivalent columns of these lines and the subsequent calculations on them Base performs.
Die über die Spalten gemittelten Signale stellen ihrerseits wieder eine Zeile dar, die den Signalverlauf senkrecht zu den Detektionsstrichen wiedergibt In der Regel werden für ana¬ lytische Testelemente helle Materialien, wie Papiere oder Vliese eingesetzt und bei Durch¬ führung des Tests verfärben sich die Nachweiszonen. Der Signalverlauf entlang des analy¬ tischen Testelementes, der durch eine Remissionsmessung ermittelt wird, weist daher an den Orten der Nachweiszonen Minima auf.The signals averaged over the columns in turn represent a line which reproduces the signal curve perpendicular to the detection lines. In general, light materials, such as papers or nonwovens, are used for analytical test elements and the detection zones change color when the test is carried out. The signal curve along the analytical test element, which is determined by a reflectance measurement, therefore has minima at the locations of the detection zones.
Eine ortsaufgeloste Auswertung von Testelementen bietet weiterhin den Vorteil, daß eine Korrektur des Hintergrundes möglich ist Bei einer integralen Auswertung von Testelemen¬ ten kann der Hintergrund, der durch eine Färbung der Detektionszone hervorgerufen wird, die nicht durch die zu detektierende Substanz verursacht wird, lediglich in Form einer Konstanten berücksichtigt werden. Bei dem ortsaufgelosten Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, aufgrund der Signalverteilung den Bereich, der ausgewertet wird, geeignet zu begrenzen, so daß Hintergrundeffekte außerhalb des ausgewählten Bereiches keinen Einfluß auf das Meßergebnis haben Zur Begrenzung des Auswertebereiches wird die gemessene Signalkurve analysiert und Signale von Sensoren, die unterhalb oder oberhalb eines ermittelten Schwellenwertes liegen, bei spateren Berechnungen nicht berücksichtigt Statt eines Schwellenwertes kann als Kriterium zur Begrenzung des Auswertebereiches auch die Steigung der Signalkurve verwendet werden oder es wird ein maximaler Abstand zu den Minima der Remissionskurve vorgegeben, um den Auswertebereich zu begrenzen Aufgrund des bereits genannten Signal Verlaufes, der durch eine Funktionskurve angenähert werden kann, ist es möglich, mit dieser Funktionskurve durch Extrapolation auch noch Be¬ reiche zu erfassen, in denen die Sensorsignale aufgrund der Schwellenwertkorrektur nicht "berücksichtigt wurdenA spatially resolved evaluation of test elements also offers the advantage that a correction of the background is possible. In the case of an integral evaluation of test elements, the background, which is caused by a coloration of the detection zone that is not caused by the substance to be detected, can only be in Form of a constant are taken into account. In the spatially resolved method of the present invention, it is possible to appropriately limit the area that is being evaluated based on the signal distribution, so that background effects outside the selected area have no influence on the measurement result. To limit the evaluation area, the measured signal curve is analyzed and signals from Sensors that lie below or above a determined threshold value are not taken into account in later calculations. Instead of a threshold value, the slope of the signal curve can also be used as a criterion for limiting the evaluation range, or a maximum distance from the minima of the remission curve is specified in order to cover the evaluation range limit Due to the already mentioned signal curve, which can be approximated by a function curve, it is also possible with this function curve by extrapolation to also detect areas in which the sensor signals are due to the threshold value correction were not taken into account
Aus den Sensorsignalen, die zur Auswertung gelangen, bzw aus Werten, die durch eine Funktionskurve ermittelt werden, wird durch die Auswertevorrichtung eine Substanzmenge ermittelt Dies erfolgt in der Regel, in dem die Sensorsignale mit Signalen verglichen wer¬ den, die für bekannte Konzentrationen an Analyt ermittelt wurden. Die Erstellung von Kali- brationskurven, die eine Zuordnung von Remissions- oder Transmissionswerten zu der je¬ weiligen Substanzmenge bzw. Substanzkonzentration ermöglichen, ist im Stand der Technik hinlänglich bekannt.The evaluation device turns the sensor signals that are evaluated or from values that are determined by a functional curve into a quantity of substance This is usually done by comparing the sensor signals with signals that have been determined for known concentrations of analyte. The creation of calibration curves which allow an assignment of reflectance or transmission values to the respective amount of substance or concentration is well known in the prior art.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren naher erläutert.The present invention is explained in more detail with reference to the following figures.
Figur 1 Aufbau eines TestelementsFigure 1 Structure of a test element
Figur 2 Aufsicht auf ein Gehäuse mit TestelementFigure 2 supervision of a housing with test element
Figur 3 Querschnitt durch ein Gehäuse mit TestelementFigure 3 cross section through a housing with test element
Figur 4 Halterung, in die ein Gehäuse eingeschoben istFigure 4 bracket into which a housing is inserted
Figur 5 Querschnitt durch ein erfindungsgemäßes SystemFigure 5 cross section through an inventive system
Figur 6 Signalkurve eines Testelements mit KontrollstrichFigure 6 signal curve of a test element with control line
Figur 1 zeigt ein Analyseelement, bei dem auf einem Trägermaterial (5) eine Probenauf¬ gabezone (1), eine Erytrozytenabtrennzone (2), eine Detektionszone (3) und eine Saugzone (4) aufgebracht sind. In der Probenaufgabezone (1) ist eine Probenaufgabematrix (6) ange¬ ordnet, die eine Erytrozytenabtrennmatrix (7) teilweise überlappt Die Erytrozytenabtrenn- matrix (7) ihrerseits überlappt etwas die Detektionsmatrix (8) (Detektionszone), auf der eine immobilisierte Substanz in Form eines Striches (9) aufgebracht ist. Eine Saugmatrix (10) überlappt etwas die Detektionsmatrix (8). In der Probenaufgabematrix (6) sind alle diejenigen Reagenzien untergebracht, die zur Bildung eines Komplexes mit dem nachzu¬ weisenden Analyt erforderlich sind. Der hier beispielhaft vorgestellte Testelement dient zur Bestimmung der Konzentration von Troponin T aus Vollblut. Troponin T ist ein wichtiger Indikator zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen. Im vorliegenden Fall besteht die Probenaufgabezone aus 2 ubereinanderliegenden Vliesen, wobei das erste mit einem gold¬ markierten Antikörper gegen Troponin T getränkt ist und das zweite Vlies einen biotinyiier- ten Antikörper gegen Troponin T enthält. Innerhalb der Detektionszone ist ein Strich (9) aus Streptavidin aufgebrachtFIG. 1 shows an analysis element in which a sample application zone (1), an erytrocyte separation zone (2), a detection zone (3) and a suction zone (4) are applied to a carrier material (5). A sample application matrix (6) is arranged in the sample application zone (1), which partially overlaps an erytrocyte separation matrix (7). The erytrocyte separation matrix (7) in turn overlaps the detection matrix (8) (detection zone) on which an immobilized substance is in the form a line (9) is applied. A suction matrix (10) slightly overlaps the detection matrix (8). All of the reagents that are required to form a complex with the analyte to be detected are accommodated in the sample application matrix (6). The test element presented here as an example serves to determine the concentration of troponin T from whole blood. Troponin T is an important indicator for the determination of cardiac muscle necrosis. In the present case, the sample application zone consists of two superposed nonwovens, the first being impregnated with a gold-labeled antibody against Troponin T and the second nonwoven containing a biotinylated antibody against Troponin T. A line (9) of streptavidin is applied within the detection zone
Figur 2 zeigt eine Aufsicht auf ein Gehäuse (12) mit einem Testelement. Das Gehäuse be¬ sitzt zwei Öffnungen, die Probenaufgabeöffnung (13) und die Detektionsöffhung (14) Beide Offnungen verjungen sich in. Richtung auf das Testelement Das Gehäuse besitzt weiterhin ein Halteteil (15) zur Verbesserung des HandlingsFigure 2 shows a plan view of a housing (12) with a test element. The housing has two openings, the sample application opening (13) and the detection opening (14) Both openings taper in the direction of the test element. The housing also has a holding part (15) to improve handling
Figur 3 zeigt einen Querschnitt durch ein Gehäuse mit Testelement Das Testelement liegt auf dem Gehauseunterteil (17), wahrend das Gehauseoberteil (16) mit den Gehausetragern (18) auf den Anschlagen (19) des Gehauseunterteils (17) ruht, so daß ein definierter Ab¬ stand von Gehauseunter- und Gehauseoberteil gewahrleistet werden kann Das Testelement wird durch den einen Anschlag (19) und einen weiteren Anschlag (20) gegen ein Verrutschen gesichert, so daß eine definierte Lage der Probenaufgabezone und der Detek¬ tionszone gegenüber den Öffnungen des Gehäuses gewahrleistet werden kannFigure 3 shows a cross section through a housing with test element The test element lies on the lower housing part (17), while the upper housing part (16) with the housing support (18) rests on the stops (19) of the lower housing part (17), so that a defined Ab ¬ the lower and upper housing parts can be guaranteed. The test element is secured against slipping by one stop (19) and another stop (20), so that a defined position of the sample application zone and the detection zone relative to the openings in the housing is ensured can be
Figur 3 zeigt weiterhin die Aufgabe einer Probeflussigkeit (23) mit Hilfe einer Pipette (22) auf die Probenaufgabezone Die Probe lost aus den Matrizes ( 1 1 und 26) biotinylierten Antikörper und goldmarkierten Antikörper, die mit dem Analyten der Probeflussigkeit binden Es bilden sich dabei verschiedene Komplexe zwischen Analyt und den zwei genann¬ ten Antikörpern aus, die miteinander im Gleichgewicht stehen Für die Detektion sind insbesondere solche Komplexe wichtig, die sowohl biotinylierten Antikörper als auch gold¬ markierten Antikörper aufweisen Die Probenflussigkeit mit den gebildeten Komplexen wandert durch die Erytrozytenabtrennmatrix (7) und gelangt in die Detektionszone (8) Hier werden aufgrund des auf der Detektionszone aufgebrachten Streptavidinstreifens (9) biotinylierte Antikörper immobilisiert Lediglich Komplexe, die sowohl Biotin als auch Goldmarkierungen enthalten, tragen zu dem detektierbaren Signal bei An die Detektions¬ zone (8) schließt sich ein Saugvlies (10) anFIG. 3 also shows the application of a sample liquid (23) with the aid of a pipette (22) to the sample application zone. The sample releases biotinylated antibodies and gold-labeled antibodies from the matrices (11 and 26), which bind with the analyte of the sample liquid Different complexes between analyte and the two named antibodies, which are in equilibrium with one another, are particularly important for the detection of complexes that have both biotinylated antibodies and gold-labeled antibodies. The sample liquid with the complexes migrates through the erytrocyte separation matrix (7 ) and arrives in the detection zone (8). Due to the streptavidin strip (9) applied to the detection zone, biotinylated antibodies are immobilized. Only complexes which contain both biotin and gold markings contribute to the detectable signal. The detection zone (8) closes a suction fleece s (10)
Figur 4 zeigt eine Halterung, in die ein Gehäuse mit Testelement eingeschoben ist Die Halterung besitzt eine ebene Basisplatte (30), auf der zwei Anschlagkanten (31, 32) montiert sind. An einer Halterung (33) befinden sich Blattfedern (34), die seitlich gegen das Gehäuse (12) druckenFIG. 4 shows a holder into which a housing with a test element is inserted. The holder has a flat base plate (30) on which two stop edges (31, 32) are mounted. On a holder (33) there are leaf springs (34) which press laterally against the housing (12)
Figur 5 zeigt einen Querschnitt durch das erfindungsgemaße System Die Detektions¬ zone (8) und insbesondere der Immobilisierungsstrich (9) werden durch ein optisches System (40), das schematisch als Linse dargestellt ist, auf das Sensorarray (41) abgebildet Die Beleuchtung der Detektionszone erfolgt über Leuchtdioden (42), die um das Sensor¬ array (41 ) herum angeordnet sind Der Mikroprozessor (CPU) steuert das Sensorarray an Analoge Signale des Sensorarrays werden mit einem A/D-Wandler (A/D) in digitale Signale umgewandelt, die dem Mikroprozessor (CPU) zugeführt werden Im Mikroprozessor er¬ folgt auch die Auswertung der Sensorsignale, um die Konzentration an Analyt zu be¬ stimmen Das Analyseergebnis wird mit Hilfe eines Displays (D) dargestellt Figur 6 zeigt eine Signalkurve eines Testelementes mit einem Kontrollstrich. Dargestellt ist in dieser Figur das Signal einer Zeile eines zweidimensionalen Sensorarrays mit 165 Zeilen und 192 Spalten. Auf der X-Achse der Darstellung ist die jeweilige Spalte des Sensorarrays angegeben. Die Y-Achse zeigt den Grauwert der jeweiligen Sensoren in willkürlichen Ein¬ heiten an. In Figur 6 ist zu erkennen, daß der Nachweisstrich bei klinisch relevanten Kon¬ zentrationen an Troponin T gegenüber dem Kontrollstrich einen verhältnismäßig kleinen Signalhub aufweist. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit einer räumlich aufgelösten Messung für dieses Anwendungsgebiet. An den Rändern des Testelements, d. h. bei Spaltenzahlen kleiner als 30 und größer als 170 machen sich Randeffekte bemerkbar, die durch einen Schattenwurf, bedingt durch das Gehäuse auftreten. Dies zeigt, daß es von ent¬ scheidender Bedeutung ist, bei dieser Art von Testelement eine ortsaufgelöste Auswerte¬ methode zu verwenden, die diese Effekte korrigieren bzw. eliminieren kann. FIG. 5 shows a cross section through the system according to the invention. The detection zone (8) and in particular the immobilization line (9) are imaged onto the sensor array (41) by an optical system (40), which is shown schematically as a lens. The illumination of the detection zone takes place via light-emitting diodes (42) which are arranged around the sensor array (41). The microprocessor (CPU) controls the sensor array. Analog signals of the sensor array are converted into digital signals with an A / D converter (A / D), which are fed to the microprocessor (CPU) The sensor signals are also evaluated in the microprocessor in order to determine the concentration of analyte. The analysis result is shown on a display (D) FIG. 6 shows a signal curve of a test element with a control line. The figure shows the signal of one line of a two-dimensional sensor array with 165 lines and 192 columns. The respective column of the sensor array is indicated on the X axis of the display. The Y axis shows the gray value of the respective sensors in arbitrary units. In FIG. 6 it can be seen that the detection line at clinically relevant concentrations of troponin T has a relatively small signal swing compared to the control line. This illustrates the need for a spatially resolved measurement for this area of application. At the edges of the test element, ie with column numbers less than 30 and greater than 170, edge effects are noticeable, which occur due to shadows caused by the housing. This shows that it is of crucial importance to use a spatially resolved evaluation method with this type of test element which can correct or eliminate these effects.
BezugszeichenlisteReference list
(D Probenaufgabezone(D sample application zone
(2) Erytrozytenabtrennzone(2) Erytrocyte separation zone
(3) Detektionszone(3) detection zone
(4) Saugzone(4) suction zone
(5) Trägermaterial(5) substrate
(6) Probenaufgabematrix(6) Sample application matrix
(7) Erytrozytenabtrennmatrix(7) Erytrocyte separation matrix
(8) Detektionsmatrix(8) Detection matrix
(9) Strichfbrmige Immobilisierungszone(9) Line-shaped immobilization zone
(10) Saugmatrix(10) Suction matrix
( H) Probenaufgabematrix getrankt mit goldmarkiertem Antikörper(H) Sample application matrix soaked in gold-labeled antibody
(12) Gehäuse(12) housing
(13) Probenaufgabeoffhung(13) Sample loading opening
(14) Detektionsoffhung(14) Detection facility
(16) Gehäuseoberteil(16) Upper part of the housing
(17) Gehauseunterteil(17) lower housing part
(18) Gehäusetrager (Abstandshalter)(18) Housing support (spacer)
(19) Anschlag(19) stop
(20) Anschlag(20) stop
(21) Steg unter Gehauseoberteil(21) Bridge under the upper part of the housing
(22) Pipette(22) pipette
(23) Probenflussigkeit(23) Sample liquid
(26) Probenaufgabematrix getrankt mit biotinmarkiertem Antikörper(26) Sample application matrix soaked in biotin-labeled antibody
(30) Basisplatte(30) base plate
(31, 32) Anschlagkanten(31, 32) stop edges
(33) Halterung(33) bracket
(34) Blattfedern(34) leaf springs
(40) Linsensystem/optisches System(40) lens system / optical system
(41) Sensorarray(41) Sensor array
(42) Leuchtdioden(42) LEDs
A/D analog/DigitalwandlerA / D analog / digital converter
CPU MikroprozessorCPU microprocessor
D Display D display

Claims

Patentansprüche claims
1 System zur quantitativen ortsaufgelosten Auswertung von Testelementen, beinhaltend1 system for the quantitative, spatially resolved evaluation of test elements, including
a) eine Halterung fiir ein Testelement, durch die das Testelement positioniert wird, b) ein Testelement mit einer Probenaufgabezone, die eine markierte Substanz ent¬ halt, welche spezifisch an den Analyten bindet sowie eine Detektionszone, die einen Bereich enthalt, der zur Immobilisierung eines Komplexes aus Analyt und markierter Substanz dient, c) eine Beleuchtungseinrichtung zur Beleuchtung der Detektionszone des Test¬ elements, d) einen Sensorarray, bei dem entweder eine Vielzahl von Sensoren in einer Flache angeordnet sind oder eine Vielzahl von Sensoren in einer Reihe angeordnet sind und dieses lineare Array durch eine Transportvorrichtung quer zur Reihe der Sensoren bewegt wird, so daß eine Fläche überstrichen wird, e) einen Konverter zur Umwandlung der Sensorsignale in digitale Signale, f) eine Auswerteeinheit zur Auswertung der digitalen Signale, um die Analytkon¬ zentration zu bestimmen, g) ein Display zur Darstellung der Auswertungsergebnissea) a holder for a test element, through which the test element is positioned, b) a test element with a sample application zone that contains a labeled substance that binds specifically to the analyte, and a detection zone that contains an area that is used to immobilize a sample A complex of analyte and labeled substance is used, c) an illumination device for illuminating the detection zone of the test element, d) a sensor array in which either a plurality of sensors are arranged in a surface or a plurality of sensors are arranged in a row, and this linear array is moved transversely to the row of sensors by a transport device so that an area is covered, e) a converter for converting the sensor signals into digital signals, f) an evaluation unit for evaluating the digital signals in order to determine the analyte concentration, g) a display to show the evaluation results
2) System gemäß Anspruch 1, bei dem die spezifisch markierte Substanz, die an den Analyten bindet, ein Antikörper gegen den Analyten ist2) System according to claim 1, wherein the specifically labeled substance that binds to the analyte is an antibody against the analyte
3 System gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Probenaufgabezone weiterhin eine markierte Substanz besitzt, die an den Analyten bindet und die in der Detektionszone immobilisiert werden kann3 System according to claim 1 or 2, wherein the sample application zone further has a labeled substance which binds to the analyte and which can be immobilized in the detection zone
4 System gemäß Anspruch 1, bei dem die Markierung der markierten Substanz, die spezifisch an den Analyten bindet, eine Goldmarkierung ist4. The system of claim 1, wherein the label of the labeled substance that specifically binds to the analyte is a gold label
5 System gemäß Anspruch 1 , bei dem in der Detektionszone des Testelements eine Substanz strichibrmig aufgebracht ist, die zur Immobilisierung des Komplexes aus Analyt und markierter Substanz dient5 System according to claim 1, in which in the detection zone of the test element a substance is applied in dashed lines, which serves to immobilize the complex of analyte and labeled substance
6 System gemäß Anspruch 5, bei dem die strichfbrmige Immobilisierungszone eine Breite von 0,5 bis 1 mm aufweist 6 System according to claim 5, wherein the line-shaped immobilization zone has a width of 0.5 to 1 mm
7 System gemäß Anspruch 1, bei dem sich das Testelement in einem Gehäuse mit zwei Öffnungen befindet, wobei die erste Öffnung die Probenaufgabezone zuganglich macht und die zweite Öffnung eine optische Untersuchung der Detektionszone er¬ möglicht7. System according to claim 1, in which the test element is located in a housing with two openings, the first opening making the sample application zone accessible and the second opening allowing an optical examination of the detection zone
8 System gemäß Anspruch 1, bei dem die Beleuchtung aus 4 bis 30 Leuchtdioden be¬ steht, die kreisförmig in einer Ebene angeordnet und so ausgerichtet sind, daß sie die Detektionszone beleuchten8 System according to claim 1, in which the lighting consists of 4 to 30 light-emitting diodes which are arranged in a circle in a plane and are aligned such that they illuminate the detection zone
9. System gemäß Anspruch 1, bei dem das Sensorarray mindestens 250 000 Sensoren aufweist.9. The system of claim 1, wherein the sensor array comprises at least 250,000 sensors.
10 System gemäß Anspruch 5, bei dem das Testelement neben der strichfbrmigen10 System according to claim 5, wherein the test element in addition to the dashed
Immobilisierungszone eine zweite strichfbrmige Immobilisierungszone aufweist, die die markierte, spezifisch an den Analyten bindungsfähige Substanz immobilisiert, ohne daß die spezifisch bindungsfahige Substanz an einen Analyten gebunden istImmobilization zone has a second line-shaped immobilization zone which immobilizes the labeled substance which is specifically bindable to the analyte without the specifically bindable substance being bound to an analyte
11. Verfahren zur quantitativen Auswertung von Testelementen,11. Method for the quantitative evaluation of test elements,
mit einem Testelement, das eine Probenaufgabezone sowie eine Detektionszone besitzt und wobei die Probenaufgabezone eine markierte Substanz enthalt, welche spezifisch an den Analyten bindet und im Bereich der Detektionszone eine Immobilisierungszone angeordnet ist, in der ein Komplex aus Analyt und markier¬ ter Substanz immobilisiert wird, wobei eine Probenflussigkeit auf die Probenaufgabezone des Testelements auf¬ gegeben und nach einer Inkubationszeit die Detektionszone des Testelements mit einer Beleuchtungseinrichtung beleuchtet wird, von der Detektionszone reflektiert es oder durch die Detektionszone transmittier- tes Licht mit einem Sensorarray detektiert wird, wobei das Sensorarray entweder eine V'elzahl von Sensoren in einer Fläche oder eine Vielzahl von Sensoren in einer R ιe besitzt, Signale des Sensorarrays in digitale Signale umgewandelt werden, die digitalisierten Sensorsignale mit einer Auswerteeinheit zur Ermittlung der Konzentration eines Analyten ausgewertet werden und die Analytkonzentration mit einem Display dargestellt wird 2 Verfahren gemäß Anspruch 1 1 , bei dem die Beleuchtuneseinrichtung gepulst ange¬ steuert wirdwith a test element which has a sample application zone and a detection zone and the sample application zone contains a labeled substance which binds specifically to the analyte and an immobilization zone is arranged in the region of the detection zone in which a complex of analyte and labeled substance is immobilized, whereby a sample liquid is applied to the sample application zone of the test element and after an incubation period the detection zone of the test element is illuminated with an illuminating device, it reflects from the detection zone or light transmitted through the detection zone is detected with a sensor array, the sensor array being either a V number of sensors in a surface or a plurality of sensors in a channel, signals of the sensor array are converted into digital signals, the digitized sensor signals are evaluated with an evaluation unit for determining the concentration of an analyte and the analyte concentration is shown on a display 2 The method according to claim 1 1, in which the lighting device is triggered in a pulsed manner
13 Verfahren gemäß Anspruch 1 1, bei dem die Sensorsignale mit einer Kalibrationskurve in Konzentrationswerte umgewandelt werden, die als Stutzwerte zur Ermittlung einer Konzentrationskurve verwendet werden13. The method according to claim 1 1, in which the sensor signals are converted with a calibration curve into concentration values which are used as truncation values for determining a concentration curve
14 Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem14. The method of claim 13, wherein
ein Testelement mit einer strichfbrmigen Immobilisierungszone verwendet wird,a test element with a line-shaped immobilization zone is used,
Zeilen des Sensorarrays, die senkrecht zur strichfbrmigen Immobilisierungszone angeordnet sind, miteinander verglichen werden,Lines of the sensor array, which are arranged perpendicular to the line-shaped immobilization zone, are compared with one another,
Zeilen, die von Kurven im Zentrum des Testelements abweichen, gestrichen werden und aus den verbleibenden Kurven eine gemittelte Kurve berechnet wird, die zur weiteren Auswertung dientLines that deviate from curves in the center of the test element are deleted and an averaged curve is calculated from the remaining curves, which is used for further evaluation
15 Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem der Signalverlauf einzelner Zeilen des Sensorarrays analysiert und Bereiche, die unterhalb 5 % des Signalhubes im Zentrum des Detektionssignales liegen, eliminiert werden15. The method according to claim 11, in which the signal curve of individual lines of the sensor array is analyzed and areas which are below 5% of the signal swing in the center of the detection signal are eliminated
16. Verfahren gemäß Anspruch 1 1, bei dem ein Testelement verwendet wird, das außer einer strichfbrmigen Immobilisierungszone in der Detektionszone eine weitere strich¬ fbrmige Immobilisierungszone innerhalb der Detektionszone aufweist, die detektierbar markierte Substanz immobilisiert, die nicht an Analyt gebunden ist und der Signalver¬ lauf im Bereich dieser zweiten Immobilisierungszone als Korrekturwert für die Aus¬ wertung der ersten Immobilisierungszone verwendet wird 16. The method according to claim 1 1, in which a test element is used which, in addition to a line-shaped immobilization zone in the detection zone, has a further line-shaped immobilization zone within the detection zone, which immobilizes the detectably labeled substance which is not bound to analyte and the signal ver run in the area of this second immobilization zone is used as a correction value for evaluating the first immobilization zone
PCT/EP1997/001469 1996-03-22 1997-03-22 System for the quantitative resolved evaluation of test elements WO1997036168A1 (en)

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DE19611347.4 1996-03-22

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