WO1998013715A1

WO1998013715A1 - Microscope generant une representation tridimensionnelle d'un objet

Info

Publication number: WO1998013715A1
Application number: PCT/FR1997/001695
Authority: WO
Inventors: Vincent Lauer
Original assignee: Vincent Lauer
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 1998-04-02
Also published as: US6249349B1; EP0928433A1

Abstract

L'invention concerne un microscope qui comprend une partie optique permettant la génération de figures d'interférences entre une onde lumineuse de référence et une onde lumineuse diffractée par l'objet observé, des capteurs permettant de numériser ces figures d'interférences, des actionneurs permettant d'agir sur le système optique, et un ordinateur recevant les figures d'interférences numérisées, contrôlant les actionneurs, et doté de mémoire et de moyens de calcul lui permettant de calculer des images tridimensionnelles à partir des figures d'interférences, selon un principe analogue à l'holographie. La partie optique permet l'enregistrement sur une surface de capteurs (116) des figures d'interférences produites par un faisceau de référence Fr et un faisceau Fe traversant un échantillon (109). Les figures d'interférences peuvent différer entre elles par la phase de l'onde de référence contrôlée par l'actionneur piézoélectrique (120) ou la répartition spatiale de l'onde d'éclairage contrôlée par le positionneur (106). Ce microscope peut être utilisé en biologie ou en métrologie.

Description

Microscope générant une représentation tridimensionnelle d'un obiet

Domaine technique II s'agit d'un microscope optique générant une représentation en trois dimensions de l^'objet observe

Technique antérieure

Les microscopes courants forment par un procède optique une image bidimensionnellc correspondant a une coupe aggrandic de l'objet observe Cette image peut le cas échéant être enregistrée par une caméra \ ideo afin de pouvoir être restituée ultérieurement

Il est possible de générer une image 1D en utilisanl un de ces microscopes et en faisant varier le réglage de focalisation A chaque réglage correspond un plan de coupe differenl et une image en trois dimensions peut être reconstituée a partir de ces plans de coupe Certains microscopes munis d'un dispositif de focalisation motorisé et d'un logiciel approprie effectuent cette opération automatiquement De tels microscopes sont décrits par exemple dans l^'article « 4-D îmaging software observe living cells », par Charles Thomas et John W ite. paru dans l'exemplaire de décembre 1996 du journal « Scientific Computing World » publié par IOP publishing Ltd à Bristol. Grande-Bretagne

Il existe également des microscopes confocauv dans lesquels l'éclairage est focalise sur un point et l 'image tridimensionnelle est générée en balayant tous les points de l'obiet De tels microscopes sont décrits par exemple dans l'article « Under a Microscope Confocal Microscopv Casts New Light on the Dynamics of Life », par W Conard Holton, paru en février 1995 dans la revue « Photoiucs Spectra » publiée par Optical Publications Company a Pittsfield. Massachussets, Etats-Unis

Par ailleurs, il existe des microscopes înterférométriques utilisant deux ondes distinctes dont la superposition fournit une image Sur ces appareils, l image est toujours observée directement dans un plan qui est l'image géométrique de l'objet traversé par au moins une des deux ondes Ces dispositifs produisent des images bidimcnsionnclles semblables a celles produites par un microscope ordinaire a ceci près que les variations d'éclairement de l'image ne sont pas caractéristiques de l'absorptivité de l'échantillon mais des interférences entre les deux ondes dans un plan image de l 'objet Ces dispositifs ne permettent pas d'obtenir d'images en trois dimensions Ils sont décrits par exemple au chapitre III de l'ouvrage « Progress in Microscopy » par M Françon, paru en 1961 chez Pergamon Press. Oxford Grande-Bretagne

Le seul moyen permettant l'enregistrement rapide d'une image microscopique tridimensionnelle est la microscopie holographique Mais cette méthode ne permet pas l'enregistremenl direct de l'information sur forme numérique l'hologramme doit être enregistre sur un papier spécial puis l'image doit être reconstitué optiquement et observée par un microscope classique En effet le pas d'analyse pour un enregistrement holographique doit être inférieur a la longueur d'onde, ce qui est hors de portée des systèmes de conversion optique-numérique actuels Cette méthode est décrite par exemple dans l'article intitule « Holographie Microscopy », par M Pluta, paru en 1987 dans le volume 10 de la série « Advances in Optical and Electron Microscopy », chez Académie Press. Londres

Expose de l'invention

L'objet de l^'invention est un dispositif permettant d'obtenir une représentation en trois dimensions de l'objet et une représentation complète de l'onde diffractee par celui-ci sous divers éclairages, le tout sous forme numérique autorisant ensuite tout mode de représentation et tout type d'analyse Ce dispositif comprend une partie optique permettant la génération de figures d'interférences entre une onde lumineuse de référence et une onde lumineuse diffractee par l'objet observe, des capteurs permettant de numériser ces figures d'interférences, des actionneurs permettant d'agir sur le svstemc optique, et un ordinateur recevant les figures d'interférence numérisées contrôlant les actionneurs. et dote de mémoire et de moyens de calcul lui permettant de calculei des images tridimensionnelles a partir des figures d^'interférences Une solution permettant de reconstruire l'onde lumineuse dans l'objet observé est de la faire interférer avec une onde de référence, suivant le principe de l'holographie Après enregistrement de l_ι figure d'interférences, l'ordinateur peut effectuer par calcul une opération de reconstruction équivalente à l'opération optique utilisée en holographie Mais l'enregistrement numérique d^'un hologramme est généralement impossible du fait que les variations de luminosité se font sur des distances de 1 ordre de la longueur d'onde, bien inférieures au pas des capteurs optoélectroniques existants Selon l'invention l'onde de référence utilisée est une onde approximativement spheπquc et centrée, réellement ou virtuellement, en un point proche de la partie observée de l'objet Ceci permet d'obtenir des figures d^'interférences dans lesquelles les variations d'intensité se font sur des distances caractéristiques plus élevées, permettant un enregistrement numérique et une reconstruction par calcul équivalente à la reconstruction optique

Le calcul direct de l'onde lumineuse dans l'objet selon une méthode simulant la reconstruction holographique mène à des défauts qui sont les défauts généraux de l'holographie, à savoir la présen e d'une image parasite symétrique de l'image réelle par rapport au point d^'origine de l'onde de référence et des écarts du second ordre par rapport à la valeur exacte de 1 onde Selon une version avantageuse de l'invention, la valeur complexe (amplitude et phase) de l'onde diffusée par l'objet et arrivant sur la surface de réception est calculée Ceci permet ensuite de calculer l'onde lumineuse dans l'objet par application directe du principe de retour inverse de la lumière, sans les approximations liées a l'holographie. Selon une version avantageuse de l'invention, celle valeur est calculée a partir de plusieurs figures d'interférences différant entre elles par la différence de phase entre l'onde de référence et l'onde éclairant l'objet Selon une version avantageuse de l'invention, elle est calculée à partir de trois figures d'interférence successives obtenues en faisant varier à chaque fois de 120 degrés la différence de phase entre l'onde éclairant l'objet et l'onde de référence L'onde lumineuse issue de l'ob_jct seul est alors obtenue par une formule simple, linéaire, à partir des trois enregistrements d'intensité

La figure d'interférences produite peut être directement enregistrée par des capteurs situes à proximité de l'objet, ou on peut interposer des éléments optiques déformant l'onde entre l'objet et la surface de réception Une version avantageuse de l'invention est de former une image intermédiaire aggrandie de l'objet a l'aide d'un objectif de microscope Cette méthode permet de filtrer spatialement l'image intermédiaire par interposition d'un diaphragme dont l'ouverture déteπnine la taille de la partie observée de l'objet En diminuant la taille d'image observée, on diminue la taille en pixels des capteurs nécessaires Un système de lentilles situé derrière le diaphragme et convenablement dimensionnc permet alors de former sur un capteur la figure d'interférences L onde de référence peut être superposée a l^'onde issue de l'objet en utilisant un miroir semi-transparent interpose sur le trajet de la lumière venant de l 'objet

A partir de la représentation complexe de l'onde lumineuse issue de l'objet et arrivant sur la surface de réception, il est possible de reconstituer point par point une représentation en trois dimensions de l'onde lumineuse dans l'obiet en la calculant par application du principe de retour inverse de la lumière Le calcul point par point sur une zone suffisamment importante de l'objet demanderait un temps de calcul beaucoup trop élevé Selon une version avantageuse de 1 invention, et afin d'effectuer cette opération en un temps de calcul raisonnable, la représentation fréquenticlle de 1 onde lumineuse est générée puis une transformée de Fouπer tridimensionnelle rapide inverse est effectuée pour retrouver une représentation tridimensionnelle classique Le système de calcul permettanl cette opération peut être constitue d'un simple processeur mais il est également possible, pour accélérer le traitement, d'incorporer des moyens dédies comme des "processeurs de FFT", spécialisés dans la transformée de Fouπer rapide, ou des Asics dédiés

Selon une version particulièrement avantageuse de l'invention, le système optique est tel que lorsqu^'une onde plane vient de l'objet, l'image formée sur le capteur en l abscence d'onde de référence est ponctuelle Ceci permet d'obtenir directement une représentation frequentielle de l'onde provenant de l'objet, chaque point du capteur correspondant à une seule fréquence, c'est-à-dire un seul vecteur d'onde, de l'onde lumineuse provenant de l'objet

La représentation en trois dimensions obtenue se présente comme une grandeur complexe fonction des trois coordonnées spatiales, correspondant à la vibration lumineuse en tout point de l'ob_jet Le résultat dépend fortement du mode d'éclairage II est possible d'utiliser un faisceau parallèle, cohérent spatialement. La représentation obtenue est alors très précise dans un plan orthogonal a la direction du faisceau d'éclairage mais présente des défauts dans la direction parallèle à ce faisceau Selon un mode avantageux de réalisation, on utilise un éclairage ou la cohérence spatiale a été rompue, c'est-à-dire ou l'objet est éclairé en tout point suivant toutes les directions Cet éclairage est réalisé à l'aide d'un condenseur formant dans le plan de l'objet l'image d'un élément diffusant éclaire par le faisceau laser. Mais la représentation obtenue est alors granuleuse du fait de la cohérence temporelle de l'onde d'éclairage. Ce phénomène appelé « Speckle » pose un problème déjà connu en microscopie holographique. Selon une version avantageuse de l'invention, on améliore la représentation de l'ob_jet en utilisant l'onde diffractee par l'objet sous plusieurs éclairages différents En particulier, on peut utiliser plusieurs représentations obtenues en déplaçant légèrement l'élément diffusant entre chaque image. On peut alors moyenner sur l 'ensemble des représentations obtenues l'intensité de Tonde en chaque point. Ceci permet d'obtenir une représentation spatiale satisfaisante de l'objet

A partir de cette représentation, il est possible de générer tout type d'image en deux dimensions: coupes, projections, ...

Description sommaire des dessins:

La figure 1 représente le mode de réalisation préféré de l^'invention. La figure 2 indique un exemple de dimensionnement relatif à ce mode de réalisation. La figure 3 indique une configuration particulière utilisée lors de la procédure de réglage pour ce mode de réalisation. La figure 4 concerne une variante de ce mode de réalisation en différant par le mode d^'éclairage de l'échantillon. La figure 5 représente un support mécanique permettant de maintenir l^'ensemble du dispositif à la verticale.

Meilleure manière de réaliser l'invention:

Un laser (100) émet un rayon qui traverse un filtre ( 101) puis est séparé en faisceaux d'éclairage Fe et de référence Fr par une lame semi-réfléchissante ( 102). Le faisceau d'éclairage traverse ensuite une lentille ( 103) puis est réfléchi par un miroir ( 104) et va frapper un élément diffusant ( 105) lui-même fixé sur un positionneur motorisé deux axes (106) pouvant le déplacer dans un plan orthogonal à l'axe optique de l'objectif ( 1 10). Le faisceau diffusé par

( 105) traverse ensuite on condenseur ( 107) qui forme dans le plan de l'objet ( 109) une image de (105)_.

Ce condenseur est lui-même fixé à un positionneur manuel un axe (108) pouvant le déplacer dans le sens de son axe optique. La distance focale de la lentille ( 103) doit être choisie de façon à ce que la zone de (105) éclairée par le faisceau soit suffisamment grande pour que son image par le condenseur couvre au moins toute la zone à observer.

L'onde issue de l'objet (109) traverse l'objectif de microscope ( 1 10) Cet objectif est un objectif plan (qui donne une image plane d'un plan), à grande ouverture (par exemple 1.25), à immersion, et foπnant une image aggrandie de l'objet à une distance finie. Cet objectif de microscope est fixé à un dispositif de focalisation (111).

Dans le plan ou l'objectif forme noπnalement l'image de l'objet à observer, on interpose un diaphragme (112) permettant un filtrage spatial de l'image. En arrière de ce plan on positionne un achromat (113) dont le plan focal objet doit être confondu avec le plan focal image de l'objectif (1 10) Un second achromat (115) dont le plan focal image est dans le plan d'un capteur CCD (116) forme dans le plan de ce CCD l'image du plan focal image de l'objectif (1 10). Le CCD ( 1 16) est intégré à une caméra (117) sortant un signal vidéo analogique. Le faisceau de référence traverse d'abord un filtre (1 18) puis est réfléchi par un miroir (1 19) monte sui l'extrémité mobile d'un translateur piézoélectrique (120) Il traverse ensuite une lentille ( 121) qui focalise le faisceau en un point Le faisceau divergent issu de ce point est réfléchi partiellement par le miroir semi-réfléchissant (114), ce qui le superpose au faisceau issu de l'objet cl permet d'enregistrer leurs interférences sur le CCD (1 16) Le point de focalisation du faisceau issu de la lentille (121) doit avoir son image virtuelle après réflexion sur le miroir semi-transparent (1 14) au centre de l^'image du diaphragme (112) par 1 achromat (113) Le translateur piézoélectrique (J20) permet de moduler la phase du faisceau de référence Le plan de I objet doit être horizontal pour que l'huile optique nécessaire pour utiliser l'objectif et le condenseur a immersion ne coule pas

optique de 1 ensemble est donc vertical

La caméra (117) est montée sur un positionneur trois axes en translation Le laser (100) est monte sur un positionneur angulaire permettant un réglage de sa direction Le translateur piézoélectrique (120) est monte sur un positionneur permettant de régler la direction d'un axe orthogonal au plan miroir (119) et de déplacer l'ensemble (119)(120) en translation suivant cet axe Le miroir (104) est moule sur un positionneur permettant de régler la direction d'un axe orthogonal au plan du miroir Le réglage de ces positionneurs est en principe effectue une fois pour toutes et dans une version en grande série du système ils peuvent être supprimes au profit d'une fabrication plus soignée Néanmoins, dans cette version destinée a de petites séries. la solution la plus simple est d'utiliser des positionneurs classiques Ces positionneurs sont des systèmes connus, courants dans les montages optiques, que l'on pourra trouver par exemple au catalogue « Melles Griot » ou « Physik Instrumente » L'ensemble est fixé sur une plaque support (500). du cote de la plaque oppose au point de vue de la Fig 5 Cette plaque est fixée à deux plaques triangulaires (501 ) et (502) elles-mêmes fixées a une base carrée (503) Les plaques (500)(501)(502)(503) sont en alliage d'aluminium rigide AU4G par exemple d'épaisseur 20 mm La fixation des plaques peut se faire par des vis et des trous taraudes, et doit être faite en un nombre de points suffisant pour assurer une rigidité parfaite de l'ensemble Ceci permet de maintenir le système à la verticale en assurant une rigidité suffisante L'ensemble est pose sur un support anti vibratoire constitue par exemple d'une plaque en granit posée sur des chambres à air de camion qui amortissent les vibrations Le montage des divers éléments sur la plaque (500), et en particulier des miroirs et miroirs semi-transparents, doit être effectue de manière a assurer une rigidité maximale de l'ensemble Toutes les précautions usuelles doivent être pπses de manière a limiter les vibrations

Les précisions suivantes concernent un exemple particulier de dimensionnement pratique du disposifif Le condenseur est un condenseur fond clair à immersion d'ouverture 1,2 dont le diaphragme d'ouverture a en position ouverte un diamètre de 28 mm La zone de l'élément diffusant qui est éclairée par le faisceau laser a un diamètre D6 d'environ 1 cm. La distance D5 entre cet élément diffusant et le condenseur est de 100 mm L'objectif de microscope est un objectif plan lOO d'ouverture 1,25, a distance finie, formant l'image à 160 mm du col de l'objectif, de distance focale environ 1,8 mm La distance D4 entre le col de l'objectif et le diaphragme est de 160 mm La distance D3 entre le diaphragme (1 12) et l'achromat (1 13) est de 20 mm L'achromat ( 1 13) une distance focale de 200 m et un diamètre de 30 mm et sa face la plus bombée est orientée vers le miroir scmi -transparent (114) L'achromat (115) a les mêmes caractéristiques et sa face la plus bombée est également orientée vers le miroir (1 14) La distance D2 entre les deux achromats est de 85 mm, permettant d'insérer un miroir semi-transparent (1 14) de dimensions suffisantes La distance entre l'achromat ( 1 15) et le CCD ( 1 16) est de 200 mm La lentille (121 ) a un diamètre de 4mnι et une distance focale de 6mm La distance D7 entre cette lentille et l'axe optique est d^'environ 70 mm La distance D8 entre l'achromat ( 1 12) et le centre du miroir semi-transparent (1 14). situe sur l^'axe optique, est d'environ 45 mm Le laser est un laser hé u -neon de longueur d'onde 633 nui a polarisation aléatoire de puissance environ 0,5 mW, de diamètre de faisceau 0,47 mm Le capteur CCD est un capteur a pixels carres . la surface du pixel étant d'environ 8,5 x 8,5 micromètres La caméra sort un signal video CCIR et une horloge pixel Le positionneur piézoélectrique (122) est une pile' piézoélectrique en forme de cylindre dont le corp^ est fixe et l'extrémité se déplace de 15 micromètres pour une tension appliquée de 100 Volts Le système de calcul est par exemple un ordinateur type PC. doté de cartes d'acquisition et de commande appropriées et éventuellement de moyens de calcul .supplémentaires La carte d'acquisition du signal vidéo, fonctionnant en temps réel, échantillonne le signal sur 8 bits et acquiert des images de 512x512 pixels échantillonnés suivant l'horloge pixel, donc correspondant exactement aux pixels du CCD Le positionneur piézoélectrique est piloté directement par une carte de conversion digitale/analogique sortant un signal compris par exemple entre zéro et I ^' _m^ , avec par exemple

V_mΛX = 10 volts Un filtre RC de constante de temps environ 0, 1 ms est interpose entre la sortie de la carte de conversion et les bornes de l'actionneur piézoélectrique Le positionneur ( 106) est motorise par des moteurs pas à pas également pilotés depuis l'ordinateur L'ordinateur le déplacera suivant les deux axes par pas de 0.2 mm par exemple Pour régler précisément la position de la caméra (1 17), on suppπme le faisceau de référence et on remplace l'éclairage normal par un faisceau cohérent parallèle à l^'axe optique Ceci est fait comme indiqué figure 3, en suppπmant (103) (105)(106)(107)(108), en introduisant un miroir (300) renvoyant le faisceau vers l'objectif, et en utilisant comme filtre (118) un élément totalement opaque Le miron (300) est monté sur un positionneur angulaire qui doit être réglé de manière à viser l'entrée de l'objectif (1 10) et à maximiser l'intensité de l'image reçue sur (1 16) La position de ( 116) est alors réglée dans la direction de l'axe optique de manière à ce que l'image reçue sur le capteur (1 16) soit un point, puis dans le plan orthogonal à l'axe optique de manière à ce que ce point soit au centre de la zone d'intérêt de 512x512 pixels qui sera utilisée pour les calculs. Pour ce type d^'opérations, l'image reçue sur le capteur (116) peut être affichée en temps réel sur l'écran de l^'ordinateur Le faisceau de référence doit alors être rétabli et le faisceau issu de l'objet doit être supprime en interposant un cache derrière l'objectif ( 1 10) La direction du laser (100) doit être réglée de façon a viscr le centre du miroir (120) La position de l'ensemble (1 19)(120) doit ensuite être réglée de façon a ce que le faisceau issu de (120) traverse effectivement la lentille (121) Ces réglages peuvent être contrôles simplement à l'aide d'un morceau de papier diffusant la lumière La position de I ensemble (1 1 )(120) doit être affinée de manière a obtenir un éclairage le plus intense et le plus homogène possible sur le capteur (116)

Le faisceau de référence doit alors être a nouveau suppπme et le faisceau issu de l'objet doit être rétabli, l'objet utilise étant alors une simple lame transparente La position de ( 104) doit être ieglec de façon a viser l'élément diffusant (105), puis affinée pour que l'image reçue sur le capteur (1 16) soit correctement centrée Le positionneur (108) doit être régie de façon a ce que l'image reçue sur le capteur, qui représente les fréquences issues de l'objet, soit un disque clair granuleux aussi large que possible Lors d^'un changement d'objet observé, il peut être nécessaire de modifier le réglage de (108) mais celui de ( 104) est normalement fixe une fois pour toutes

Au cours des opérations précédentes, les valeurs de densité optique des filtres (101) et (1 18) doivent être constamment modifiées pour avoir le faisceau le plus facilement observable lorsqu'il esi observe a l'oeil nu ou pour avoir un éclairage optimal de (1 16) lorsque 1 image reçue sur ( 1 16) est observée sur écran L'ajustement automatique de gain sur la caméra peut avantageusement être utilise

Lors du fonctionnement normal du microscope, les valeurs de densité optique des filtres (1 1 ) et (1 18) doivent être choisies de façon à ce que le faisceau de référence et le faisceau provenant de l'objet aient des intensités proches en arrivant sur le capteur CCD, et que la figure d'interférences produite soit la plus intense possible sans toutefois que la valeur maximale du pixel autonsee par la caméra et la carte de numérisation vidéo soit dépassée

La tension de commande de l 'actionneur piezoélectnque doit être calibrée Pour cela, on détermine la différence de tension AV correspondant a un décalage de 360 degrés de l'onde de référence Ceci est fait en utilisant une simple lame transparente comme échantillon, l'onde de référence et l'onde issue de l'objet étant présentes Si on note p la précision avec laquelle on souhaite obtenir le résultat, par exemple =0 01 Volts, l'ordinateur effectue alors, pour un indice / variant de

V 0 a ^{• mwi}- , une série de cycles du type suivant

P application d'une tension nulle à l'actionneur temps d'attente (10 ms) acquisition de la figure d'interférence application d'une tension V_l = / p à l'actionneur temps d'attente (10 ms) acquisition de la figure d'interférence application d'une tension V_miX à l'actionneur calcul de la corrélation entre les deux figures d'interférences stockage du résultat dans un tableau Corφ] Le tableau Corrf/ 1 contient alors la corrélation entre les figures d'interférences obtenues pour les tensions V_t = / p et celle obtenue pour une tension nulle L^'ordinateur effectue alors un filtrage passe- bas adapie sur le contenu de ce tableau pour en éliminer le bruit Puis il détermine la valeur moyenne M de Corr[/] , puis détermine les valeurs de / vérifiant Corφ] ≤ M et Corφ -f l] M II calcule la différence d entre deux valeurs de / successives vérifiant cette condition La tension AV est alors

AV = p d

Lors du fonctionnement normal du microscope, l'éclairage est modifie en déplaçant l'élément diffusant (105) à l'aide du positionneur (106) A chaque position du positionneur, coirespond un éclairage différent Pour chaque éclairage, l'ordinateur calcule la valeur complexe (c'est-a-dire le nombre complexe représentant la phase et l 'intensité ) de l'onde lumineuse en tout point de l'objet L image finale de l'objet est obtenue en moyennant les intensités ainsi obtenues pour un nombre suffisant d' éclairages distincts L'intensité de l^'onde en un point est le carre du module de la valeur complexe correspondante Pour obtenir la valeur complexe de l 'onde lumineuse en tout point de l'objel, I ordinateur calcule d'abord la valeur complexe de l'onde lumineuse issue de l'objet en tout point du capteur CCD Cette valeur est obtenue a partir de l'enregistrement de trois figures d interférences reçues sur le capteur, la phase de l'onde de référence étant décalée de 120 degrés entre chacune de ces figures On note I\P, θ) l'intensité en un point P du capteur de la figure d'interférences produite par l'onde issue de l'objet et l'onde de référence pour un décalage de phase θ radians de l'onde de référence On note I _ref {f) l'intensité de l'onde de référence seule en ce point du capteur La valeur complexe de l'onde lumineuse issue de l'objet et reçue sur un pixel P du capteur CCD est donnée par

Chaque pixel P du capteur correspond à une fréquence pure de l'onde dans l'objet Si on note (/,./) les coordonnées (distance en pixels) d'un point du capteur par rapport au point central de la zone d'intérêt, la fréquence pure à laquelle correspond le point de coordonnées (', /) , exprimée dans un repère dont le troisième axe est orthogonal au plan du capteur vaut alors, a un facteur constant près

(l, J, k) avec k = -KJK - I - / ^" - C , ou K est une constante C est une constante nulle, mais on peut lui affecter une valeur non nulle de manière à translater la représentation fréquentielle, ce qui se traduit sur l'image par une modulation de phase n'affectant pas le résultat final L'ordinateur utilise cette formule pour générer une représentation fréquenUelle tridimensionnelle de l'onde lumineuse, pui; apphque une transformée de Founer inverse pour établir la représentation complexe de l'onde lumineuse dans l'objet observé Ceci se traduit de la manière suivante

- La valeur de l'intensité de l'onde de référence seule en chaque point est stockée dans un tableau de nombres réels Iref i,j], les coordonnées (i,j) étant prises par rapport au coin du capteur - La capture des trois images décalées en phase donne un tableau I d^'entiers 8 bits, de dimensions 3x512x512 dans lequel I[a,ij] représente la valeur au pixel de coordonnées (i,j) de la figure d'interférences correspondant à un décalage de phase de a fois 120 degrés, les coordonnées (i,j) etanl maintenant prises par rapport au coin du capteur

- L ordinateur génère le tableau S[i j] de nombres complexes, pour i et J variant de 0 a 51 1 en affectant aux cléments du tableau les valeurs suivantes

- partie réelle de S[i,j] ^[ — (2l[(). ι,j] - l[l . 1. 1] - l[2. i. |])

6- /lrefïι. \]

-partie imaginaire de S[i,j] — - (l[l , ι, il - l[2, ι, il)

2 3Irellι, j ï

- L^'ordinateur génère le tableau H de nombres complexes représentant les fréquences, de dimensions 512x512x512. en l'initialisant a zéro et en parcourant ensuite l^'ensemble des indices i et j variant de 0 a 51 1 en effectuant l'opération

H^, j^K² - (i - 256)² - (j - 256)² - c] = S[i,j]

- L^'ordinateur effectue la transformée de Founer tridimensionnelle inverse du tableau H pour obtenir la répartition tridimensionnelle de l'onde dans l'objet observe, obtenant un tableau G de dimensions 512x512x512 Si le calcul de transformée tridimensionnelle inverse est fait de la manière la plus standard, une constante dans l'espace des fréquences donne dans la représentation spatiale un dirac centré sur le point de coordonnées (0,0,0) qui doit être ramené au point de coordonnées (256.256.256) pour centrer l'image correctement La représentation tridimensionnelle de l^'onde dans l'objet observe s'obtient alors en générant le tableau F par F[ι, j. k] = G[(ι + 256)%512, 0 + 256)%512, (k + 256)%512]

, ou le signe % signifie « modulo » Dans cette représentation trisimensionnelle. le point d'origine virtuel de l'onde de référence se trouve au centre, c'est-à-dire au point de coordonnées (256.256,256)

La transformée tndimensionnelle inverse étant une opérauon longue, l'ordinateur peut se contenter, dans certains cas, par exemple l^'opération de focalisation, de générer une image bidimensionnelle Une coupe dans le plan de l'objet peut être générée en effectuant la transfoπnée de Founer bidimensionnelle inverse du tableau S[i,j] qui donne un tableau Gl . suivie du calcul du tableau F 1 par Fl[ι, j] = Gl[(ι + 256)%512. (j + 256)%512] Le tableau F 1 constitue la représentation bidnnensionnelle de l'onde dans le plan de l'objet passant par le point d^'origine virtuel de l'onde de référence el orthogonal à l'axe optique (coupe) Une coupe dans un plan orthogonal au précèdent peut être générée en calculant d'abord le tableau S2[ij] de dimensions 512\512 en 1 mitialisant a 0 puis en parcourant tous les indices (i,j) en effectuant

S2 .,/κ² -(ι - 256)² - (j - 256)² - C + = S[ι,j]

_

( ce qui signifie en utilisant les notations du language informatique T ajouter la valeur complexe de

S[i, j] a la valeur complexe de S2 i, - K ² - (i - 256)^" - (j - 256) C initialement présente

dans le tableau )

La transformée de Founer bidnnensionnelle inverse du tableau S2 donne alors un tableau G2 dont on tire comme précédemment un tableau F2 par F2[ι, j] = G2[(ι + 256)%512, (j + 256)%5 12] Lt tableau F2 constitue la représentation bidnnensionnelle de 1 onde dans le plan de 1 objet passant pai le point d'origine virtuel de l^'onde de référence, et parallèle a 1 axe des i et a l^'axe optique

Pour déterminer K el C il est nécessaire d'effectuer une opération préalable de calibration A cet effet un micromètre objectif (règle graduée, avec une graduation tous les 10 micromètres, montée sur une lame de microscope) est utilisé Une image bidnnensionnelle de ce micromètre est réalisée par transformée de Founer bidnnensionnelle inverse du tableau S[i,j] Le diaphragme (1 12) est règle de façon à ce que son image soil clairement visible au centre de l'image bidnnensionnelle ainsi calculée S'il est trop ouvert, il sort de la zone observée et il se produit des phénomènes de repliement de spectre nuisant à la qualité de l'image. Le microscope est focalisé de manière a avoir l'image la plus nette possible L'image bidnnensionnelle est moyennée en intensité sur plusieurs éclairages pour limiter l 'aspect granuleux Si la distance entre deux graduations séparées par D_ncl nuciometres est sur l'image ainsi obtenue de D pixels, si l'indice moyen dans l'échantillon est ri (en général ^'/ =1 5) et

si la longueur d'onde du laser est A ( λ =0.633 micromètres) alors on a K = ~- . ou bien n entendu D_reel et λ sont dans la même unité La valeur de ( utilisée sera alors C K-5 W Le cycle de fonctionnement normal du microscope, utilisé également lors de la procédure de calibration ci-dessus, est le suivant mise de l'actionneur piézoélectnque sous tension nulle temps d'attente (10 ms) r mise de l'actionneur piézoélectnque sous tension temps d'attente (10 ms) acquisition de la première figure d'interférences

V _Ά mise de l^'actionneur piézoélectnque sous tension ^tm

temps d'attente (10 ms) acquisition de la deuxième figure d'interférences ^y _m,κ ΔΓ mise de l'actionneur piézoélectrique sous tension — '- — l

2 3 temps d attente ( 10 ms) acquisition de la troisième figure d interférences mise de 1 actionneur piézoélectrique sous tension V_m^ déplacement du positionneur (106) calcul de la l^'onde lumineuse correspondante dans l'objet calcul de 1 intensité lumineuse dans l'obiet Ce cycle est répète N_mιΛ, fois Apres N_nιm répétitions du cycle, l'ordinateur peut moyenner en chaque point les valeurs d'intensité obtenues pour les N_mm éclairages différents, puis générer la représentation tridimensionnelle de l^'objet el afficher une image bidnnensionnelle dérivée de cette représentation II peut alors recommencer l'ensemble de l'opération Plus N est important, mieux la granulaπté de l'image est atténuée Le cycle ci-dessus est le plus simple, mais il peut être optimise pour tenir compte des recouvrements entre temps d'exposition des capteurs et temps de transfert de l'image Le calcul de Fonde lumineuse peut se faire sur l'objet entier ou sur une partie de l'objet, par exemple une coupe, en fonction du temps et de la capacité de calcul disponible Dans le cas le plus simple. l'ordinateur génère et affiche une simple coupe de l'objet Le déplacement du positionneur (106) se fait comme indiqué plus haut, par pas de 0,2 mm suivant les deux directions L'ordre dans lequel sont effectues ces déplacements est indifférent pourvu que les N_mm éclairages utilises pour calculer la représentaϋon tridimensionnelle de l'objet soient obtenus à partir de positions toutes distinctes de l'actionneur (106), pour ne pas avoir plusieurs fois le même éclairage Le passage a chaque cycle par les valeurs 0 et V_mΛ de la tension permet de limiter l'effet de l'hystérésis de l'actionneur piézoélectrique en ayant toujours le même cycle

Avant d'obtenir une image, l'opérateur doit régler le dispositif de focalisation du microscope

Si ce réglage est fait à la main, il doit être fait pas à pas, l'opérateur lâchant le dispositif de focalisation pendant la prise d'image, de manière à ne pas induire de vibrations pendant la prise d'image Pour faciliter cette opération il peut être intéressant de motonser le dispositif de focalisation Le calcul d'une transformée de Founer à trois dimensions étant difficile à effectuer en temps réel, on peut également se contenter, pendant l'opération de focalisation, d'une image bidnnensionnelle obtenue en effectuant directemcnt la transformée de Founer du tableau S[ι,j] On peut également se contenter d'effectuer la transformée de Founer bidnnensionnelle de la partie centrale, par exemple une zone de 256x256 points du tableau S[i,j], ce qui génère une image moins sensible a la précision de la focalisation II est pai contre utile d'effectuer, même pendant cette opération de focalisation, un moyennage en intensité sui quelques images de la représentation bidnnensionnelle ainsi obtenue

Les méthodes de calcul indiquées ci-dessus ne sont pas limitatives L^'ordinateur peut générer des représentations tridimensionnelles représentant des portions d'objet plus ou inoins étendues (coupes, projections, ensemble de coupes sur une épaisseur limitée ) Il peut filtrer ces represenialioiis limitant l'aspect granuleux de l'image au prix d^'une moins bonne définition Le traitement effeclue esl fonction des besoins (rapidité de la prise d image et définition calcul en temps recl ou diffère) et de i.i capacité de calcul de l'ordinateur

Une variante de ce mode de réalisation consiste a utiliser un faisceau d^'éclairage unidirectionnel Ceci supprime la nécessite d^'effectuer un niovcnnagc en intensité sur plusieuis images car chaque point de l'objet est alors éclaire avec la même intensité Le movennage en intensité n elanl pas nécessaire, la représentation tridimensionnelle conserve également une information de phase utilisable Par contre, les images obtenues ne sont précises dans les trois dimensions que pour certains types particuliers d'objets, par exemple des particules subinicromclπques incluses dans du verre En gênerai l'image est très précise dans le plan orthogonal a la direction du faisceau et présente des défauts dans la direction du faisceau Ce mode d'éclairage peu! cependant être utilise dans les cas ou on se contente d'une image bidnnensionnelle. ou pour faciliter l'opération de focalisation du microscope ou encore pour certains lypes particuliers d'objets (localisation de défauts ponctuels dans un verre p<n exemple) Cet éclairage peut cire réalise comme indique sur la figure 4 analogue a la figure 3 a ceci près que le faisceau de référence n'est plus bloque et qu une lentille supplémentaire (400) doit être insérée entre le miroir (300) et l'échantillon ( 109) Cette lentille doit être positionnée de sorte que soi foyer coïncide avec l'échantillon et sa distance focale doit être telle que la tache de diffraction formée a la traversée de l'échantillon ait à peu près le diamètre de la zone observée On peut réaliser une vaπantc de cet éclairage en orientant différemment le faisceau, dont la direction peut ne pas être incluse dans le cône d^'ouverture de l'objectif de microscope Dans ce dernier cas l'image bidnnensionnelle obtenue présente en général des défauts, mais pour certains types d'échantillons (défauts ponctuels dans un verre) le rapport signal sur bruit esl améliore et l'image tridimensionnelle est de bonne qualité Cette méthode est alors équivalente à de Fultramicroscopie. mais en version tndimensionnelle

Une autre variante de ce mode de réalisation consiste a n^'utiliser qu'une seule figure d'interférences pour générer une représentation tridimensionnelle Cette variante est l' équivalent numérique de la reconstruction holographique optique Selon cette variante, l'actionneur piézoélectrique (120) n'est pas utilisé On note l(P) l'intensité de la figure d'interférences produite en un point P du capteur par l'onde issue de l'objet et l'onde de référence La fonction S(P) est I(P) - I (P) maintenant donnée par S(P) = , - - On noie ifi, j] la valeur au pixel (ι,j) de la figure

d'interférences produite, les coordonnées étant prises par rapport a un coin du capteur Les formules donnant Sfi l deviennent _r _. partie réelle de S ι, l

partie imaginaire de Sli J 0

Le point de focalisation du faisceau issu de la lentille ( 121 ) doit avoir son image virtuelle après réflexion sur le miroir semi-transparent ( 1 14) sur le coté de l^'image de 1 ouverture du diaphragme ( 1 12) par 1 achromat (1 1 ). et non au cenlrc comme précédemment Le cvclc de fonctionnement du microscope est modifie au sens ou une seule image par cycle esl utilisée au lieu de trois et ou il n x ri donc plus d action sur le svstemc de contrôle de phase L^'image est affectée par des approximations du second ordre par rapport au rapport de l 'onde diffraclce par l'objet a 1 onde de référence En fonctionnement normal du microscope, les filtres (1 1 ) et ( 1 18) doivent donc être choisis de manière à ce que l'onde de référence ait une intensité nettement supérieure à l^'onde issue de l^'objet en arrivant sur le capteur CCD. et non des intensités proches comme précédemment Ce choix doit êtic affine de manière a avoir dans la représentation tridimensionnelle le meilleur compromis entre le bnnt et les distortions du second ordre Pour le reste, le fonctionnement et le mode de calcul sont les mêmes que précédemment

La représentation tridimensionnelle générée comprend la partie observée de l'objet délimitée par le diaphragme, et sa symétrique par rapport au point de focalisation virtuel du faisceau issu de la lentille (121) L^'ouverture du diaphragme doit être suffisamment réduite pour être visible sur la représentation obtenue, ainsi que sa symétrique La zone de l'objet que l^'on peut observer est donc plus réduite que dans le mode de réalisation préféré Cette représentation tridimensionnelle est également affectée par des approximations du second ordre par rapport au rapport de l^'onde diffractee par l'objet à l'onde de référence, et l'onde diffractee par l'objet doit être nettement inférieure à l'onde de référence pour obtenir un résultat probant II s'ensuit que le résultat obtenu esl nettement plus bruite que dans le mode de réalisation préféré Par contre, le système est moins sensible aux vibrations et permet d'obtenir les images plus rapidement

D'autres modes de réalisation sont bien entendu possibles et la description ci-dessus n'est pas limitative

Possibilités d'application industrielle Cc microscope peut êlre utilisé au lieu de microscopes a transmission usuels dans le domaine de la biologie ou de la micromesure L'enregistrement de l'image tridimensionnelle est plus rapide qu'avec d'autres méthodes, ce qui facilite l'observation d'échantillons mobiles

Claims

REVENDI CATIONS

1- Microscope caractérisé par le fait qu^'il numérise des figures d'interférences formées sur une surface de réception par la superposition d'une onde lumineuse de référence et d^'une onde lumineuse diffractee par l'objet, et qu'il utilise ces enregistrements pour calculer une représentation tridimensionnelle de l'objet observé.

2. Microscope selon la revendication 1. caractérisé par le fait que l'onde de référence esl approximativement sphérique et centrée, réellement ou virtuellement, en un point proche de la zone observée de l'objet ou inclus dans celle-ci. 3 -Microscope suivant une des revendications 1 ou 2. caractérisé par le fait que la première étape du calcul consiste à calculer la valeur complexe de l'onde diffractee par l'objet et arrivant sur la surface de réception, et que cette valeur est obtenue à partir de plusieurs figures d'interférences différant par la différence de phase entre l'onde de référence et l'onde éclairant l'objet. 4-Microscope selon la revendication 3. caractérisé par le fait que la valeur complexe de l^'onde diffractee par l^'objet et arrivant sur la surface de réception est obtenue à partir de trois figures d'interférences, la différence de phase entre l'onde de référence et l'onde éclairant l'objet étant décalée de 120 degrés entre chaque figure. 5-Microscope selon une des revendications 1 à 4. caractérisé par le fait qu^'une image intermédiaire est formée optiquement, puis filtrée spatialement par un diaphragme, et en ce que des lentilles sont utilisées pour former à partir de cette image intermédiaire une figure de diffraction sur la surface de réception.

6-Microscope selon une des revendications 1 à 5. caractérisé par le fait qu'il utilise la représentation complexe de l'onde diffractee sur la surface de réception pour calculer la valeur complexe de l'onde lumineuse en chaque point de l'objet observé.

7-Microscope selon une des revendications I à 6, caractérisé en ce que la transformation de Fourier rapide est utilisée pour obtenir rapidement la valeur complexe de l'onde lumineuse en chaque point de l'objet observé.

8-Microscope selon une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu'en l'abscencc d'onde de référence, une onde plane provenant de l'objet produit sur la surface de capteurs une image ponctuelle 9-Microscope selon une des revendications 1 à 8. caractérisé en ce que l'onde éclairant l'objet est obtenue par utilisation d'un condenseur formant sur l'objet l'image d'un élément diffusant éclairé par le faisceau laser

10-Microscope suivant une des revendications 1 à 9. caractérisé en ce que plusieurs représentations complexes d'ondes diffractées sur la surface de réception sont utilisées pour un objet donné, ces représentations différant entre elles par des modifications de l'onde éclairant l'objet.

11-Microscope selon les revendications 9 et 10, caractérisé en ce que les modifications de l'onde éclairant l'objet sont obtenues en déplaçant l'élément diffusant.

12-Microscope selon une de revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que la représentation tridimensionnelle de l'objet observé est obtenue par moyennage en intensité des représentations tridimensionnelles complexes obtenues pour chaque modification de l'onde éclairant l'objet.