WO1998021972A2 - Verbindungen mit verbesserter knorpel- und/oder knocheninduzierender aktivität - Google Patents

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    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor

Definitions

  • the present invention relates to new improved compounds with cartilage and / or bone-inducing activity, consisting of one or more members of the TGF- ⁇ family, preferably MP52, or a DNA sequence coding therefor and a special carrier matrix composed of crystallographically pure tricalcium phosphate.
  • the invention further relates to the production of these compounds and use for the treatment of diseases affecting the cartilage and / or bone and for the treatment of damage to the cartilage and / or bone tissue.
  • TGF-ß proteins such as the TGF-ß1, TGF-ß2, TGF-ß3, TGF-ß4 and TGF-ß5, cf. for example: US Patent 5,284,763; EP 0376785; U.S. Patent 4,886,747; Madisen, L.
  • GDF-1 2 can also be assigned to this subfamily due to its amino acid homology (cf. WO 96/02559). It is known from ßA and ßB that they are also a homodimer Can form heterodimer ßAßB. When combined with an a subunit, the inhibins are formed, which have essentially opposite activities compared to activins, cf. : Vale, W.
  • BMP Bone Morphogenetic Protein
  • BMP-2a proteins BMP-3, BMP-3b, BMP-4 (BMP-2b), BMP5, BMP-6, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (OP-2), BMP- Count 9, BMP-10, BMP-1 1, BMP-1 2 and BMP-1 3, cf. e.g. Wozney, ÜM. et al.
  • WO 93/1 6099, WO 95/0481 9 and WO 96/01 31 6 describe the DNA and protein sequences of proteins of the TGF-ß family, namely the MP52 and MP1 21.
  • MP1 21 is the activin ßC already mentioned above.
  • MP52 sometimes also called GDF5 in publications
  • a cartilage and bone-inducing potential has already been demonstrated (WO 95/0481 9 and Hotten et al. Growth Factors 1 3 (1 996) 65-74).
  • the members of the TGF-ß superfamily which have a cartilage and / or bone-inducing potential, are characterized by high amino acid homologies in the mature portion and possess the seven conserved cysteines typical of TGF-ß superfamily members. Members of this superfamily are normally all in their active form as homo- and / or heterodimeric proteins. The cartilage and / or bone-inducing potential of these proteins is usually demonstrated on inert carrier matrices which themselves have no cartilage and / or bone-inducing effect. As early as the 1960s, intensive research work began on the possible uses of calcium phosphate ceramics for implantable bone replacement (Bhaskar et al., Oral Surg.
  • TCP and HA are largely integrated in the bone bed without connective tissue encapsulation, as was the case in the 1970s. could be impressively proven in the animal experiment by the Battelle working group mentioned.
  • bioactivity was introduced at the time for this outstanding property.
  • TCP tricalcium phosphate
  • HA hydroxylapatite
  • TCP is particularly advantageous for temporary bone replacement, in which over time the biomaterial is resorbed simultaneously with bone regeneration ( Cyst filling in the jaw area, filling of disease or surgery-related or degenerative bone defects, etc.).
  • HA is preferably indicated for long-term bone replacement, e.g. B. in connection with the coating of joint endoprostheses, in which one wants to avoid direct contact of the loaded bone bearing with the metal or other inert materials.
  • the object of the present invention is to provide new compounds which have particularly high cartilage and / or bone-inducing activities in mammals and in particular primates such as humans, but which do not have the disadvantages of the materials used hitherto or to the smallest extent possible.
  • Such connections are intended to enable the healing process of diseases affecting the cartilage and / or bones, which are particularly associated with a loss of bone substance. hen, and / or accelerate damage to the cartilage and / or bone tissue significantly.
  • a bioactive implant material for bone replacement with cartilage and / or bone-forming activity consisting of two components A and B, which as component A is a cartilage and / or bone-inducing protein or protein mixture or for such DNA encoding protein or protein mixture, and having as component B a matrix material made of calcium phosphate, which itself has osteogenic activity, and A is applied to B.
  • component A is a cartilage and / or bone-inducing protein or protein mixture or for such DNA encoding protein or protein mixture
  • component B a matrix material made of calcium phosphate, which itself has osteogenic activity
  • a material which consists of the two components A and B, where A is a protein or protein mixture, namely from one or more homo- or heterodimeric proteins of the TGF- ⁇ superfamily with cartilage and / or bone-inducing activity and B is an osteoinductive carrier matrix consisting of preferably biodegradable bone ceramic, particularly preferably of a- or? -tricalcium phosphate ceramic.
  • A is associated with B without being covalently bound and can e.g. are slowly released by B during the bone formation process to the extent that B is subject to chemical degradation in the bone bed. A is thus subjected to a so-called "controlled release".
  • A can also mean a DNA coding for the proteins or protein mixtures mentioned.
  • the DNA can optionally be protected against degeneration by methods known to the person skilled in the art. After release into the surrounding tissue, such a DNA can be taken up and expressed by the cells present there or by cells migrating into the carrier matrix, so that in turn the expressed proteins or protein mixtures act as an active substance.
  • the DNA is therefore preferably associated with sequences which bring about or promote expression.
  • the promotion of expression is particularly through targeted recombination into the cell genome possible at a location that leads to the production of protein under the control of cellular sequences.
  • protein of the TGF-ß superfamily with cartilage and / or bone-inducing activity means a protein which contains the characteristic preserved 7 cysteines in the mature portion. These include members of the TGF-ß, Aktivin, BMP and GDF families and in particular MP52 as well as fragments thereof with basically the same activity.
  • the corresponding nucleotide and protein sequences can be found in the above-mentioned references, the disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • Homodimers of the proteins mentioned are preferably included, but also heterodimers from different family members. Proteins are preferably included which have the same receptor mechanism and / or the same signal transmission as the members of the BMP and / or GDF family, in particular of MP52.
  • the combination of different proteins of the TGF-ß superfamily with cartilage and / or bone inducing activity is also included.
  • the cartilage and / or bone-inducing potential can be determined in known experiments such as in vivo by inducing cartilage and / or bone after implantation of the protein with a suitable carrier matrix in the rat muscles; see. eg Sampath, TK et al., J. Biol. Chem. 267 (1 992) 20352-20362 and / or in vitro by induction of alkaline phosphatase activity on ROB-C26 cells; see. Yamaguchi, A. et al., J. Cell Biol. 1 1 3 (1 991) 681 -687 and / or W-20-1 7 cells; see.
  • the protein can also be used as a precursor protein or protein with different processing in the propeptide portion and / or with additional or modified derten N- and / or C-terminal amino acid sequences which essentially do not influence the biological activity are present.
  • fusion proteins are also possible, where, in addition to the portion or fragments (s) coding for the mature protein, functional signal and / or propeptide portions of other proteins, in particular the TGF-ß superfamily, in particular also the activin, BMP and GDF proteins are included.
  • the corresponding nucleotide and protein sequences can be found in the above-mentioned references, the disclosure of which is hereby incorporated by reference. It is important that the correct reading frame for the mature protein is preserved. For example, the replacement of propeptide portions by corresponding portions of other proteins in Mol. Endocrinol. 5 (1,991), 149-1 55 and Proc. Natl. Acad. Be. USA 90 (1 993), 2905-2909.
  • the protein in the compound of the invention, or the protein encoded thereby may contain or be substituted or inserted amino acids, also provided the activity is not significantly affected, and from different species, e.g. Human, mouse, rat, beef or pig be isolated.
  • the protein can be modified by methods known in the prior art, for example glycosylations, phosphating, sulfating and esterification with fats, also on the condition that there is no significant change in activity.
  • A is a protein from the GDF or BMP family or a fragment thereof.
  • component A is characterized by a protein which (a) comprises the mature portion and, if appropriate, further functional portions of the sequence shown in SEQ ID NO. 1 contains the protein sequence shown, (b) contains parts of the mature portion of (a) which have essentially the same activity, in particular mature proteins with an altered N-terminus,
  • (c) contains parts corresponding to (a) or (b) which, because of the origin of the protein from other vertebrates of SEQ ID NO. 1 differ but have essentially the same activity,
  • this embodiment comprises the mature protein MP52 or functional parts or fragments thereof, the active form preferably being a dimer.
  • Functional partial areas or sections or fragments which contain at least the area of the seven conserved cysteines are particularly preferred.
  • a “biocompatible” and “bioactive” carrier matrix means, in the osteological sense, a calcium phosphate ceramic, which on the one hand can be integrated into the bones without harmful tissue reactions such as connective tissue encapsulation, inflammation and tissue degeneration and on the other hand a direct growth of bones on or in the Stimulates surface structure of the implant.
  • tissue reactions such as connective tissue encapsulation, inflammation and tissue degeneration
  • the actual "bioactivity" of a carrier matrix is only present when histologically and clinically demonstrable stimulation of bone growth takes place.
  • inventive highly porous bioactive carrier matrix such as Cerasorb ®
  • ciumphosphat Trical-based in particular .beta. and ⁇ -TCP
  • this implant material is in the form of an injectable suspension. This makes it possible, for example, to apply the material in a minimally invasive manner.
  • the suspension of this matrix in liquids suitable for medical use, such as water, serum, plasma and blood, does not cause giant cell or connective tissue infiltration into the implant.
  • the essential object of the invention is therefore an implant material consisting of two components A and B, in which the osteopoetic effect of component A is synergistically enhanced by an osteoinductive effect of component B.
  • the connection is based on the advantageous combination of mechanisms of action of two components, ie cartilage and / or bone-inducing protein or protein mixture and osteoinductive carrier matrix.
  • Such an implant material according to the invention avoids counterproductive effects compared to the osteopoetic effect of proteins A, which some biocompatible but not bioactive implant materials show. Because of their slow biodegradability, carrier materials like HA are often not suitable for the use of protein-stimulated osteosynthesis.
  • Rapidly biodegradable carrier Ramics such as phosphate glasses and metastable phases or phase mixtures of CaP, but also chemically converted matrices, which are obtained from corals, for example, have a counterproductive effect on protein-stimulated osteosynthesis simply by activating macrophages and / or osteoclasts. It was also shown that the coating of the matrix surface of suitable carrier materials with physiologically inert protein fillers such as collagen had an absorption and thus bioactivity-inhibiting effect.
  • mixtures of carrier materials based on microporous phase-pure TCP, preferably / 5-TCP with homogenates of red bone marrow or blood, despite the considerable covering of the matrix surface with proteins, have been shown to promote osteosynthesis.
  • the implantation materials according to the invention thus represent an optimization of these findings.
  • the minimal matrix coverage with the protein or DNA component A ensures the preservation of the bioactive, that is to say independent, osteoinductive properties of the carrier matrix B and is inevitably released by the interconnecting microporous structure thereof thus biologically effective, as it corresponds to the chemical degradation of the matrix at the implantation site.
  • the osteopetic protein A according to the invention would quickly lose the biological effect at the implantation site through metabolism, removal by body fluids or possibly phagocytosis.
  • the phase purity of the carrier matrix with a defined microporous structure ensures a predictable absorption and thus a "controlled release" of the protein component A or a DNA coding therefor.
  • Such an interaction between matrix B and protein A undoubtedly represents a synergistic enhancement of the two components A and B.
  • Another object of the present invention is a method for producing the implant materials according to the invention, in which the protein A or the DNA is applied as a solution in a physiologically harmless, water-miscible solvent or in corresponding solvent mixtures into the microporous structure of the biocompatible matrix B is that a homogeneous distribution of component A in and / or on the microporous structure of the matrix is achieved.
  • the proteins are produced in bacteria, the proteins, e.g. in the case of MP52, in the form of inclusion bodies, they are renatured according to methods known per se in order to obtain the protein, for example MP52, in an active form.
  • MP52-like proteins expressed in E. coli can be folded back into an active protein cf. : Kriegistein, K. et al., J. Neuroscience Res. 42 (1 995) 724-732.
  • Precise methods are also described in Japanese patent application Hei-7 ('95) -93664 and in DE 1 952541 6.3. Further own investigations as well as investigations by Ruppert, R. et al. (Eur. J. Biochem. 237, 295-302 (1 996)) have shown that e.g. BMP-2 can also be expressed in E. coli and folded into a dimer.
  • the DNA is prepared by methods known to the person skilled in the art, such as, for. B. in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-Intersience, Wiley & Sons, 1 987-1 996) or in Molecular Cloning (Sambrook et al., Second edition, Cold Spring Harbor Labora- tory Press 1 989).
  • the following method according to DE 38 10 803 C2 can be used to produce the carrier matrix B: Homogeneous stoichiometric mixtures of CaCO 3 and CaHPO 4 are produced according to the state diagram (phase diagram) of the system CaO and P 2 0 5 (Trömel, Stahl und Eisen 63 ( 1,943) 21; Welch, J. Chem. Soc. (1 961) 4442) in compacted bodies in various steps, subject to sintering temperatures of up to 1,350 ° C., water and CO 2 being removed from the sintering system.
  • the intermediate stages of the sintering synthesis are fed to comminution, micronization, recompacting in the case of molded article manufacture or pelletization in the case of granulate manufacture.
  • the sintering processes are carried out with respect to time and temperature so that coexisting neighboring phases of the TCP according to the phase diagram, ie in particular the tetra-calcium phosphate on the one hand and the di-calcium phosphate on the other hand, are avoided.
  • metastable phases of the thermodynamically stable /? - Ca 3 (PO 4 ) 2 or? -TCP can either be avoided in a targeted manner by directing the sintering processes or made coexistent in a targeted manner or even predominantly represented alone.
  • a homogeneous introduction and distribution of component A in the pore structure of the carrier matrix B presupposes some process principles that enable such a distribution without the components themselves being changed by the processes.
  • a DNA-containing saline solution for example 0.1M NaCl or 0.25M NaAc
  • alcoholic solution such as absolute ethanol
  • the effectiveness of the implant materials according to the invention can be tested in common test systems such as e.g. the already mentioned animal model of the rat, the dog and the rabbit or also with primates.
  • compositions containing an implant material optionally together with pharmaceutically and physiologically compatible auxiliaries, diluents and / or fillers, as well as the use of the compounds according to the invention in a pharmaceutically active concentration optionally together with pharmaceutically and physiologically compatible Auxiliaries, diluents and / or fillers for the local treatment of cartilage and / or bone diseases and / or damage to the cartilage and / or bone tissue caused by injury, surgery, degeneration or overload, in vertebrates, especially mammals and humans .
  • Diseases associated with bone loss such as those caused by age, metabolic diseases or inflammatory processes, can be specifically treated with the compounds according to the invention.
  • Damage to the cartilage or bone tissue is conceivable after injuries, for example also sports injuries, accidents, overloading of the musculoskeletal system, or can occur due to surgery, for example through drill holes in the bone after removal of screws for artificial fastening devices or after resection of tumor tissue.
  • the targeted local treatment of bone fractures is particularly preferred.
  • Limb extension is also possible.
  • Applications in the tooth or jaw area are also of particular interest, such as the treatment of periodontosis, sinus lift or cyst filling in the jaw area. Applications can also be found in cosmetic surgery, especially in plastic surgery on the face.
  • the connections according to the invention also enable the fixation of two movable bone parts, e.g. the connection of two dorsal vertebrae via a newly formed bone bridge, e.g. can be beneficial for intervertebral disc problems.
  • the treatment methods mentioned are also included in the veterinary field.
  • the dose depending on the type of protein component and depending on the type of application, the clinical picture and the patient's condition, is in the range from 10 ⁇ g to 100 mg.
  • the amount of the carrier matrix depends on the size of the bone or cartilage defect to be treated.
  • the mechanical fastening is e.g. Steel rods and screws necessary.
  • an advantage of the implant materials according to the invention is the possibility of significantly improving and accelerating healing processes which require cartilage and / or bone-inducing reactions. This advantageously results in a significant reduction in the amount of time suffered by patients, shorter working hours and a reduction in hospitalization costs.
  • Another economic aspect is the effective treatment of the common disease periodontosis, which is associated with premature tooth loss. Economically, the tooth preservation possible through periodontal treatment contrasts with the expensive premature dentures.
  • SEQ ID NO. 1 shows the complete amino acid sequence of the precursor protein of the human TGF- ⁇ protein MP52.
  • the beginning of the mature protein is preferably in the range of amino acids 361-400, particularly preferably amino acid 381 or 382.
  • the mature protein portion contains the seven conserved cysteines at positions 400, 429, 433, 465, 466, 498 and 500.
  • 1 and 2 show the osteoinductive effect of the carrier matrix according to the invention in comparison to a biocompatible but not bioactive matrix.
  • MOLECULE TYPE Protein
  • 1 and 2 show the osteoinductive effect of the carrier matrix according to the invention in comparison to a biocompatible but not bioactive matrix.
  • FIG. 1 shows the bone formation in the pores of a bio-inert matrix, for example Al 2 O 3 (1 in Fig. 1) in an otherwise identical implantation situation:
  • cylindrical implants (1) (outside - 0: 6 mm) with an open, continuous macroposity (pore diameter approx. 0.5 to 0.7 mm 0) were implanted in the compact bone (shin bone of a dog).
  • the compact bearing bone (2) with a clearly visible directional "lamella structure” forms new bone around the implant, which tries to bridge the gap between the drill hole in the bone and the outer edge of the implant (3).
  • new bones also form in the pores of the implant (4a in FIG. 1 and 4b in FIG. 2).
  • the basic difference between the two implant materials is that the bone in the osteoinductive implant material (4b in FIG. 2) forms immediately and spontaneously on the inner surfaces of the pores and uses the carrier matrix as a nucleation site and fills the entire implant area from there.
  • the bone in the non-bioactive material (FIG. 1) grows very slowly through the pore centers and also avoids any direct contact with the implant material in the long term.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein bioaktives Implantatmaterial mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität, bestehend aus zwei Komponenten A und B, wobei A ein knochen- und/oder knorpelinduzierendes Protein oder Proteingemisch und bevorzugt ein oder mehrere Proteine aus der TGF-β Superfamilie, vorzugsweise MP52, oder eine hierfür kodierende DNA-Sequenz ist und B eine Trägermatrix aus Calciumphosphat-Keramik mit interkonnektierender Mikroporosität, welche allein bereits knocheninduzierende Eingeschaften besitzt, ist. Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung dieser Verbindungen und Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen, die den Knorpel und/oder Knochen betreffen sowie zur Behandlung von Schädigungen des Knorpel- und/oder Knochengewebes.

Description

Verbindungen mit verbesserter knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue verbesserte Verbindungen mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität, bestehend aus einem oder mehreren Mitgliedern der TGF-ß Familie, vorzugsweise MP52, oder einer hierfür kodierenden DNA-Sequenz und einer speziellen Trägermatrix aus kristallographisch phasenreinem Tricalciumphosphat. Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung dieser Verbindungen und Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen die den Knorpel und/oder Knochen betreffen sowie zur Behandlung von Schädigungen des Knorpel- und/oder Knochengewebes.
Viele Wachstumsfaktoren aus der TGF-ß-Superfamilie sind für einen weiten Bereich medizinischer Behandlungsmethoden und Anwendungen, die insbesondere Wundheilung und Gewebewiederherstellung betreffen, relevant. Für einen Überblick über Mitglieder der TGF-ß-Superfamilie vgl. z.B. : Roberts, A.B. & Sporn, M.B. Handbook of Experimental Pharmacology 95 ( 1 990) 41 9-472; Kingsley , D.M., Genes & Development 8 ( 1 994) 1 33-146 und die darin zitierte Literatur. Zu den Mitgliedern zählen die TGF-ß Proteine, wie das TGF-ß1 , TGF- ß2, TGF-ß3, TGF-ß4 und TGF-ß5, vgl. z.B. : U.S. Patent 5,284,763; EP 0376785; U.S. Patent 4,886,747; Madisen, L. et al., DNA 7 ( 1 988) 1 -8; Derynck, R. et al., EMBO J. 7 (1 988) 3737-3743; Jakowlew, S.B. et al., Mol. Endo. 2 (1 988) 1 186-1 1 95; Kondaiah, P. et al., J. Biol. Chem. 265 ( 1 990) 1 089-1 093. Eine weitere Unterfamilie bilden die Aktivine/Inhibine mit den bislang bekannten Aktivinketten ßA, ßB, ßC und ßD, vgl. z.B. : Mason, A.J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 35 ( 1 986) 957-964; Hotten, G. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 ( 1 995) 608-61 3; Oda, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21 0 ( 1 995) 581 -588. Auch GDF-1 2 kann aufgrund seiner Aminosäurehomologie dieser Unterfamilie zugeordnet werden (vgl. WO 96/02559) . Von ßA und ßB ist bekannt, daß sie neben dem Homodimer auch ein Heterodimer ßAßB bilden können. Bei Kombination mit einer a Untereinheit entstehen die Inhibine, die im wesentlichen entgegengesetzte Aktivitäten in Vergleich zu Aktivinen aufweisen, vgl. : Vale, W. et al., Handbook of Experimen- tal Pharmacology 95 ( 1 990) 21 1 -248; Vale, W. et al., The Physiology of Repro- 5 duction, Raven Press, New York (1 994) 1861 -1 878. Eine weitere Unterfamilie bilden die Mitglieder der BMP (Bone Morphogenetic Protein)- Familie wozu die Proteine BMP-2 (BMP-2a), BMP-3, BMP-3b, BMP-4 (BMP-2b), BMP5, BMP-6, BMP-7 (OP-1 ), BMP-8 (OP-2), BMP-9, BMP-10, BMP-1 1 , BMP-1 2 und BMP-1 3 zählen, vgl. z.B. : Wozney, Ü.M. et al. Science 242 ( 1 988) 1 528-1 534; Celeste, ιo A.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 ( 1 990) 9843-9847; Ozkaynak, E. et al., J. Biol. Chem. 267 ( 1 992) 25220-25227; Takao et al. Biochem. Biophys. Res. Com. 21 9 ( 1 996) 656-662; WO 93/00432; WO 94/26893; WO 94/26892, WO 95/1 6035. Eine weiter Untergruppe ist die GDF (Growth Differentiation Factor)-Familie, zu denen GDF-1 , GDF-3, GDF-9, GDF-10, GDF-1 1 sowie die für
15 die Knorpel- und/oder Knocheninduktion insbesondere interessanten GDF-5, GDF-6 und GDF-7 zählen; vgl.: McPherron, A.C. & Lee, S.-J., J. Biol. Chem. 268 ( 1 993) 3444-3449; Storm, E.E. et al., Nature 368 ( 1 994) 639-643; Lee, S.- J.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 ( 1 991 ) 4250-4254; Cunningham et al. Growth Factors 1 2 ( 1 995), 99-1 09; Hotten, G. et al., Growth Factors 1 3 ( 1 996) 65-74;
20 Chang, S.C. et al., J. Biol. Chem. 269 ( 1 994) 28227-28234. Zwischen den Untergruppen der GDF und BMP Familie gibt es aufgrund von Aminosäurehomologien teilweise Überlappungen. Für die TGF-ß Superfamilienmitglieder dpp und 60A aus Drosophila konnte auch ein knorpel- und knocheninduzierendes Potential nachgewiesen werden, vgl. : Sampath, T. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA
25 90 ( 1 993) 6004-6008. Interessant sind auch die Proteine dorsalin und das Bone Formation-Inducing Protein, vgl.: Basler, K. et al., Cell 73 ( 1 993) 687-702; WO 94/01 557. Beschrieben sind auch Heterodimere von verschiedenen Mitgliedern, vgl. z.B. : Aono, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 21 0 ( 1 995) 670- 677; WO 93/09229; EP 0 626 451 . Bekannt ist, daß viele Mitglieder insbeson-
30 dere aus den Unterfamilien der TGF-ß-, BMP- und GDF-Familien ein knorpel- und/oder knocheninduzierendes Potential aufweisen, wobei aber auch Mitglieder der Aktivinfamilie, zumindest in Kombination mit weiteren TGF-ß-Superfamilien- mitgliedern, Einfluß auf die Knochenbildung nehmen können; vgl. beispielsweise Hock, J.M. et al., Endocrinol. 1 26 (1 990) 421 -426; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 ( 1 990) 2220-2224; Wozney et al., Mol. Reprod. Dev. 32 ( 1 992) 1 60-1 67; Sampath et al., J. Biol. Chem. 267 ( 1 992) 20352-20362; s Ogawa, Y. et al., J. Biol. Chem. 267 ( 1 992) 1 4233-14237; WO 88/00205; US- PS 5,01 3,649; WO 89/1 0409: WO 90/1 1 366; WO 91 /05802; WO 92/1 5323; WO 91 /1 8098; WO 93/00432; WO 93/09229; WO 94/01 557; WO 94/26893; WO 94/26892; WO 94/1 5949; WO 95/01 801 ; WO 95/01 802 und EP 0 626 451 . Da die einzelnen Proteine teilweise an unterschiedlichen Stellen im Verlauf o der Knorpel- und Knocheninduktion wirken, ist davon auszugehen, daß die Kombination verschiedener dieser Proteine vorteilhaft für die Effizienz der Knorpel- und Knocheninduktion ist. Derartige Proteingemische sind innerhalb dieser Erfindung mitumfaßt.
s In WO 93/1 6099, WO 95/0481 9 und WO 96/01 31 6 werden die DNA- und Proteinsequenzen von Proteinen der TGF-ß-Familie, nämlich dem MP52 und MP1 21 , beschrieben. Bei MP1 21 handelt es sich um das bereits oben genannte Aktivin ßC. Insbesondere von Interesse ist MP52 (in Publikationen teilweise auch GDF5 genannt), für das u.a. bereits ein knorpel- und knocheninduzierendes 0 Potential nachgewiesen werden konnte (WO 95/0481 9 und Hotten et al. Growth Factors 1 3 ( 1 996) 65-74) .
Die Mitglieder der TGF-ß Superfamilie, die ein knorpel- und/oder knocheninduzierendes Potential besitzen, zeichnen sich im reifen Anteil durch hohe Aminosäure- 5 homologien aus und besitzen die für TGF-ß Superfamilienmitglieder typischen sieben konservierten Cysteine. Mitglieder dieser Superfamilie liegen in ihrer aktiven Form normalerweise alle als homo- und/oder heterodimere Proteine vor. Das knorpel- und/oder knocheninduzierende Potential dieser Proteine wird meistens auf inerten Trägermatrices, die selber keinerlei knorpel- und/oder 0 knocheninduzierende Wirkung aufweisen, nachgewiesen. Bereits in den 60er Jahren begannen intensive Forschungsarbeiten über die Einsatzmöglichkeiten von Calciumphosphat-Keramiken für den implantierbaren Knochenersatz (Bhaskar et al., Oral Surg. 32 ( 1 971 ) 47), denen die chemische Analogie dieser Verbindungsgruppe zu dem mineralischen Anteil des Knochens zu Grunde lag. Eine der ersten systematischen Untersuchungen über die Zusammenhänge zwischen den chemisch-werkstofflichen Parametern und den biologischen Eigenschaften wurde Anfang der 70er Jahre am Batteile Institut durchgeführt (Heide, Köster et al., Z. Orthop. 1 1 8 ( 1 979) 398 und Biotechn. Umschau 2 ( 1 978) 226) . Hierbei wurden Calciumphosphate mit wechselnden CaO/P2O5- Verhältnissen durch Sinterverfahren als granuläre und stückige keramische Implantatmaterialien hergestellt und im Tierversuch getestet. Die herausragenden Ergebnisse dieser Studien lassen sich wie folgt zusammenfassen:
(a) Calciumphosphatkeramiken innerhalb bestimmter Zusammensetzungen zeichnen sich durch eine hervorragende Gewebeverträglichkeit gegenüber Knochen aus.
(b) Das Optimum der Gewebeverträglichkeit konzentriert sich auf Keramiken mit einem CaO/P2O5-Verhältnis wie 3/1 , also auf das Trical- ciumphosphat TCP, Ca3(PO4)2 (bzw. in keramischer Formelschreibweise
3CaO-P2O5) und den Hydroxylapatit (HA) selbst, also [Ca5(PO4)3OH], der sich ebenfalls synthetisch darstellen lässt. Dieses Ergebnis ist folgerichtig, da bekanntlich auch die Zusammensetzung des mineralischen Knochenanteiles mit seiner wichtigsten mineralischen Komponente, dem Hydroxyl- apatit diesem Verhältnis in etwa entspricht. Obwohl TCP und HA eine ähnlich chemische Zusammensetzung besitzen, unterscheiden sie sich in ihrem Löslichkeitsverhalten und anderen physikalischen Eigenschaften, wie der Dichte und der Festigkeit erheblich voneinander. Hiervon hängen naturgemäß auch die möglichen Einsatzgebiete ab.
(c) Die beiden optimal biokompatiblen Modifikationen des Tricalcium- phosphats TCP (d.h. die metastabile Hochtemperaturmodifikation α-TCP und besonders die stabile Tieftemperaturmodifikation ?-TCP) und der Hydroxylapatit HA sind mehr oder weniger biodegradabel, d.h. sie werden im biologischen Lager mehr oder weniger schnell abgebaut bzw. resorbiert. Eine ausgeprägte Biodegradabilität weisen nach Ramselaar et al., J. Materials Sei. 2 ( 1 991 ) 63, a- und /?-TCP auf. HA unterliegt im biologischen Milieu einer sehr viel geringeren Resorption. Der Abbau des TCP im Knochenlager erfolgt nach Untersuchungen mit radioaktiv dotierten Implantatmaterialien von Schuster, Heide et. al., (unveröffentl. Ber. des Batteile Institutes Frankfurt) auf mehr chemischem Wege, d.h. Lösung und Verstoffwechselung der Lösungsprodukte erfolgt ohne Beteiligung knochenabbauender Zellen, während die sehr viel langsamere Resorption des Hydroxylapatites mehr auf der spezifischen Leistung knochenabbauender Zellen (Osteoklasten) beruht.
(d) Die biokompatiblen Calciumphosphatkeramiken auf der Basis von
TCP und HA werden im Knochenlager weitgehend ohne bindegewebige Abkapselung integriert, wie in den 70er Jahren u.a. von der genannten Battelle-Arbeitsgruppe im Tierexperiment eindrucksvoll belegt werden konnte. Für diese herausragende Eigenschaft hat man damals den Aus- druck "Bioaktivität" eingeführt.
Im Zuge der weiteren Entwicklung der vielversprechenden Calciumphosphatkeramiken erwies sich eine detaillierte Kenntnis der komplexen kristallchemischen Zusammenhänge des Systems CaO-P2O5 ( + H2O) als unumgängliche Vorausset- zung für eine systematische Optimierung. Leider ist in der Vergangenheit und wird noch immer von zahlreichen Anwendern gegen diese Voraussetzung verstoßen, insbesondere dann, wenn für typische temporäre Anwendungen wie z.B. die Sanierung von Parodontaltaschen Materialien auf der Basis des nur schwer biodegradablen HA eingesetzt werden. Wichtige Arbeiten in diesem Zusammen- hang wurden von De Groot et al., Biomaterials 1 ( 1 980) 47, und Bauer und Hohenberger, Berichte der DKG 66 ( 1 989) 23, veröffentlicht. Zahlreiche, heute noch marktübliche Implantatmaterialien, welche aus Undefinierten Gemengen von TCP und HA sowie anderen Calciumphosphat-Phasen wie Dioder Tetracalciumphosphaten und Calciumphosphatgläsern bestehen, haben negative biomedizinische Eigenschaften im Sinne einer Provokation von Bindege- websinfiltrationen sowie Aktivierung von Makrophagen, mitunter begleitet von entzündlichen Reaktionen. Die bindegewebige Einkapselung solcher fehlerhaft zusammengesetzter Materialien ist dann Ausdruck der Abstoßung des Implantats (Bauer und Hohenberger, Berichte der DKG 66 ( 1 989) 23). Die stöchiometrische Zusammensetzung allein ist kein Kriterium für die Existenz von unphysiologi- sehen Fremdphasen. Aus diesen Erkenntnissen leitet sich die Forderung nach kristallographischer Phasenreinheit der jeweils verwendeten Implantatmaterialien ab.
Die beiden Haupttypen des Calciumphosphats, das Tricalciumphosphat (TCP) und der Hydroxylapatit (HA) haben entsprechend ihrer unterschiedlichen Resorption unterschiedliche Einsatzgebiete: TCP ist insbesondere vorteilhaft für den temporären Knochenersatz, bei dem im Laufe der Zeit eine Resorption des Biomateriales simultan mit der Knochenregeneration erfolgt (Zystenfüllung im Kieferbereich, Auffüllen krankheits- bzw. operationsbedingter oder degenerativer Knochendefekte usw.). HA dagegen ist vorzugsweise bei langdauerndem Knochenersatz angezeigt, wie z. B. in Verbindung mit der Beschichtung von Gelenk- endoprothesen, bei denen man einen direkten Kontakt des belasteten Knochenlagers mit dem Metall oder anderen inerten Materialien vermeiden will.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen bereitzustellen, die besonders hohe knorpel- und/oder knocheninduzierende Aktivitäten in Säugetieren und insbesondere Primaten wie dem Menschen aufweisen, aber nicht oder in möglichst geringem Umfang die Nachteile der bisher verwendeten Materialien aufweisen. Solche Verbindungen sollen ermögli- chen, den Heilungsprozess von Erkrankungen, die den Knorpel und/oder Knochen betreffen und die insbesondere mit einem Verlust an Knochensubstanz einherge- hen, und/oder von Schädigungen des Knorpel- und/oder Knochengewebes wesentlich zu beschleunigen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein bioaktives Implantatmate- rial für den Knochenersatz mit Knorpel- und/oder Knochen-bildender Aktivität bestehend aus zwei Komponenten A und B, welches als Komponente A ein knorpel- und/oder knocheninduzierendes Protein oder Proteingemisch oder für ein solches Protein oder Proteingemisch kodierende DNA, und als Komponente B ein Matrixmaterial aus Calciumphosphat aufweist, welches selbst osteogene Aktivi- tat besitzt, und A auf B aufgebracht ist. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben. Insbesondere wird ein Material bereitgestellt, das aus den zwei Komponenten A und B besteht, wobei A ein Protein oder Proteingemisch, und zwar aus einem oder mehreren homo- oder heterodimeren Proteinen der TGF-ß-Superfamilie mit knorpel- und/oder knochen- induzierender Aktivität bedeutet, und B eine osteoinduktive Trägermatrix bestehend aus vorzugsweise biodegradabler Knochenkeramik, besonders bevorzugt aus a- oder ?-Tricalciumphosphat-Keramik, bedeutet. A ist dabei an B assoziiert, ohne kovalent gebunden zu sein und kann z.B. während des Knochenbildungsprozesses langsam von B in dem Maße freigesetzt werden, wie B dem chemi- sehen Abbau im Knochenlager unterliegt. Damit wird A einem sogenannten "controlled release" unterworfen.
Alternativ kann A auch eine für die genannten Proteine oder Proteingemische kodierende DNA bedeuten. Die DNA kann gegebenenfalls vor Degeneration nach dem Fachmann bekannten Methoden geschützt werden. Eine derartige DNA kann nach Freisetzung in das umliegende Gewebe von den dort vorhandenen Zellen oder aber von in die Trägermatrix einwandernden Zellen aufgenommen und exprimiert werden, so daß als wirksamer Stoff wiederum die exprimierten Proteine oder Proteingemische agieren.
Vorzugsweise ist die DNA deshalb mit Sequenzen assoziiert, die eine Expression bewirken oder fördern. Die Förderung der Expression ist insbesondere durch gezielte Rekombination in das Zellgenom möglich und zwar an eine Stelle, die zu einer Erzeugung von Protein unter Kontrolle zellulärer Sequenzen führt.
Andererseits ist auch der Einsatz von DNA auf einem geeigneten Expressions- vektor möglich.
Der Begriff "Protein der TGF-ß-Superfamilie mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität" bedeutet ein Protein, das im reifen Anteil die charakteristischen konservierten 7 Cysteine enthält. Dazu zählen Mitglieder der TGF-ß-, der Aktivin-, der BMP- und der GDF- Familie und insbesondere MP52 sowie Fragmente davon mit grundsätzlich derselben Aktivität. Die entsprechenden Nukleo- tid- und Proteinsequenzen sind aus den oben genannten Referenzen, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird, zu entnehmen. Umfaßt sind bevorzugt Homodimere der genannten Proteine aber auch Heterodimere aus verschie- denen Familienmitgliedern. Bevorzugt umfaßt sind Proteine, die denselben Rezeptormechanismus und/oder dieselbe Signalübertragung wie die Mitglieder der BMP- und/oder GDF-Familie, insbesondere von MP52, besitzen. Umfaßt ist auch die Kombination von verschiedenen Proteinen der TGF-ß-Superfamilie mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität. Das knorpel- und/oder kno- cheninduzierende Potential kann in bekannten Versuchen wie z.B. in vivo durch Induktion von Knorpel und/oder Knochen nach Implantation des Proteins mit einer geeigneten Trägermatrix in die Rattenmuskulatur; vgl. z.B. Sampath, T. K. et al., J. Biol. Chem. 267 ( 1 992) 20352-20362 und/oder in vitro durch Induktion von Alkalischer Phosphatase Aktivität auf ROB-C26 Zellen; vgl. Yamaguchi, A. et al., J. Cell Biol. 1 1 3 ( 1 991 ) 681 -687 und/oder W-20-1 7 Zellen; vgl. : Thies, R.S, et al. Endocrinol. 1 30 ( 1 992) 1 31 8- 1 324 und/oder Stimulation der Expression von Proteinen der extrazellulären Matrix, vgl. : Hock, J.M. et al. Endocrinol. 1 26 ( 1 990) 421 -426 und/oder in Versuchen wie sie bei Chen, P. et al., Exp. Cell Res. 1 95 ( 1 991 ) 509-51 5 und/oder Vukicevic, S., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 ( 1 989) 8793-8797 beschrieben sind, überprüft werden. Das Protein kann als reifes Protein aber auch als Vorläufer-Protein oder Protein mit verschiedenen Prozessierungen im Propeptidanteil und/oder mit zusätzlichen oder verän- derten N- und/oder C-terminalen Aminosäuresequenzen, welche die biologische Aktivität im wesentlichen nicht beeinflussen, vorliegen.
Andererseits sind auch Fusionsproteine möglich, wo neben dem für das reife Protein kodierenden Anteil oder Fragmente(n) davon auch noch funktionelle Signal- oder/und Propeptidanteile von anderen Proteinen, insbesondere der TGF- ß Superfamilie, insbesondere auch der Aktivin-, BMP- und GDF-Proteine umfaßt sind. Die entsprechenden Nukleotid- und Proteinsequenzen sind aus den oben genannten Referenzen zu entnehmen, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Wichtig ist, daß der richtige Leserahmen für das reife Protein erhalten bleibt. So ist z.B. der Austausch von Propeptidanteilen durch entsprechende Anteile anderer Proteine bei Mol. Endocrinol. 5 ( 1 991 ), 149-1 55 und Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 ( 1 993) , 2905-2909 beschrieben.
Das Protein in der erfindungsgemäßen Verbindung oder das hiervon kodierte Protein kann substituierte oder eingefügte Aminosäuren enthalten oder deletiert sein, ebenfalls unter der Voraussetzung, daß die Aktivität nicht wesentlich beeinflußt wird, und aus verschiedenen Spezies, wie z.B. Mensch, Maus, Ratte, Rind oder Schwein isoliert sein. Ferner kann das Protein durch im Stand der Technik bekannte Methoden, beispielsweise Glycosylierungen, Phosphatierun- gen, Sulfatierungen und Veresterung mit Fetten modifiziert sein, ebenfalls unter der Bedingung, daß sich daraus keine wesentliche Veränderung der Aktivität ergibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist A ein Protein aus der GDF- oder BMP-Familie oder ein Fragment davon.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Komponente A charakterisiert durch ein Protein, das (a) den reifen Anteil und gegebenenfalls weitere funktionelle Anteile der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Proteinsequenz enthält, (b) Teile des reifen Anteils von (a) enthält, die im wesentlichen dieselbe Aktivität aufweisen, insbesondere reife Proteine mit verändertem N-Termi- nus,
(c) Teile entsprechend (a) oder (b) enthält, die aufgrund der Herkunft des Proteins aus anderen Wirbeltieren von SEQ ID NO. 1 abweichen, aber im wesentlichen dieselbe Aktivität aufweisen,
(d) neben Teilen des reifen Proteins gemäß (a), (b) oder (c) noch Teile eines anderen Proteins aus der TGF-/?-Superfamilie in Form eines Fusionsproteins enthält, (e) neben monomeren reifen Proteinen gemäß (a) bis (d) noch ein Monomer eines anderen Proteins aus der TGF-/?-Superfamilie unter Ausbildung von Heterodimeren enthält, (f) neben dimeren reifen Proteinen gemäß (a) bis (e) noch mindestens ein Dimer eines anderen Proteins aus der TGF-/?-Superfamilie enthält.
Insbesondere umfaßt diese Ausführungsform das reife Protein MP52 oder funktionelle Anteile bzw. Fragmente davon, wobei die aktive Form vorzugsweise als Dimer vorliegt. Besonders bevorzugt sind funktionelle Teilbereiche bzw. Abschnitte bzw. Fragmente, die mindestens den Bereich der sieben konservierten Cysteine enthalten.
Eine "biokompatible" und "bioaktive" Trägermatrix bedeutet im osteologischen Sinne eine Calciumphosphat-Keramik, welche einerseits ohne schädliche Gewebereaktionen wie bindegewebige Abkapselungen, Entzündungen und Gewebe- entartungen in den Knochen integriert werden kann und andererseits ein direktes Aufwachsen von Knochen auf bzw. in die Oberflächenstruktur des Implantats stimuliert. Die eigentliche "Bioaktivität" einer Trägermatrix liegt jedoch erst dann vor, wenn histologisch wie klinisch nachweisbar eine Stimulation des Knochenwachstums zustande kommt. Für die erfindungsgemäße hochporöse bioaktive Trägermatrix (wie z.B. Cerasorb®) auf der Basis von Trical-ciumphosphat, insbesondere von ß- und auch σ-TCP, liegen klinische Erfahrungen vor. Eine herausragende Stellung bezüg-lich Bioaktivität oder Osteoinduktivität nimmt das phasen- reine und offen mikroporöse /?-TCP ein, welches allein durch die vorhersagbare chemische Auflösung im Knochenlager ein lonenmilieu erzeugt, das zur Stimulation der Osteoblastentä-tigkeit beiträgt und in situ als Substrat für die Osteo- blastentätigkeit dient. Verläuft die chemische Auflösung oder Resorption der Trägermatrix simultan mit der Primärphase des Knochenaufbaus ("woven bone phase"), besteht die hervorragende Möglichkeit der Wiedergewinnung der Festigkeit und Struktur des umgebenden Knochenlagers. Voraussetzung hierfür ist die Abwesenheit unstöchiometrischer oft unphysiologisch reagie-render Nebenphasen. Für phasenreines /?-TCP kann dies nachge-wiesen werden, es ist daher allein schon osteoinduktiv wirksam. Besonders bevorzugt sind kristallogra- phisch phasenreine a- oder /?-TricaIciumphosphat-Keramiken mit einer interkon- nektierenden Mikroporosität im Bereich von 20-60 % ihres Volumens. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt die Primärkorngröße der kristallo- graphisch phasenreinen a- oder ?-Tricalciumphosphat-Keramik im Bereich von 1 0-40 μm. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt dieses Implantatmaterial in Form einer injizierbaren Suspension vor. Es wird dadurch beispielsweise ermöglicht, das Material minimal-invasiv zu applizieren. Dabei verursacht die Suspension dieser Matrix in für die medizinische Anwendung geeigneten Flüssigkeiten wie Wasser, Serum, Plasma und Blut, keine Riesenzell- oder Bindegewebeinfiltration in das Implantat.
Der wesentliche Gegenstand der Erfindung ist also ein Implantatmaterial aus zwei Komponenten A und B, in welchem die osteopoetische Wirkung der Komponente A durch eine osteoinduktive Wirkung der Komponente B synergistisch verstärkt wird. Der Verbindung liegt die vorteilhafte Kombination von Wirkungsmechanismen zweier Komponenten, d.h. knorpel- und/oder knocheninduzierendes Protein oder Proteingemisch und osteoinduktiver Trägermatrix zugrunde. Ein solches erfindungsgemäßes Implantatmaterial vermeidet kontraproduktive Effekte gegenüber der osteopoetischen Wirkung der Proteine A, den manche biokompa- tible, aber nicht bioaktive Implantatmaterialien zeigen. So eignen sich Trägermaterialien wie HA auf Grund ihrer langsamen Biodegradabilität oft nicht zum Einsatz einer Protein-stimulierten Osteosynthese. Rasch biodegradable Trägerke- ramiken wie Phosphatgläser und metastabile Phasen bzw. Phasengemische der CaP aber auch chemisch umgewandelte Matrizen, welche z.B. aus Korallen gewonnen werden, wirken allein schon durch die Aktivierung von Makrophagen oder/und Osteoklasten kontraproduktiv auf die Protein-stimulierte Osteosynthese. Ferner zeigte sich, daß die Belegung der Matrixoberfläche geeigneter Trägermaterialien mit physiologisch inerten Proteinfüllstoffen wie Kollagen, sich Resorptionsund damit Bioaktivitäts-hemmend auswirkte. Überraschenderweise erwiesen sich Mischungen von Trägermaterialien auf der Basis von mikroporösem phasenreinem TCP, vorzugsweise /5-TCP, mit Homogenaten von rotem Knochenmark oder Blut, trotz der erheblichen Belegung der Matrixoberfläche mit Proteinen, als Osteosynthese-fördernd. Somit stellen die erfindungsgemäßen Implantationsmaterialien eine Optimierung dieser Befunde dar. Die minimale Matrixbelegung mit der Protein- oder DNA-Komponente A gewährleistet den Erhalt der bioaktiven, also eigenständigen osteoinduktiven Eigenschaften der Trägermatrix B und wird von dieser durch ihre interkonnektierende Mikroporenstruktur zwangsläufig in dem Maße freigesetzt und damit biologisch wirksam, wie es dem chemischen Abbau der Matrix am Implantationsort entspricht. Das erfindungsgemäße osteo- poetisch wirkende Protein A allein würde ohne die Kombination mit einer geeigneten Matrix durch Verstoffwechselung, Abtransport durch Körperflüssigkeiten oder ggf. Phagozytose rasch die biologische Wirkung am Implantationsort verlieren. Die Phasenreinheit der Trägermatrix mit definierter Mikroporenstruktur gewährleistet eine vorhersagbare Resorption und damit ein "controlled release" auch der Proteinkomponente A oder einer dafür kodierenden DNA. Eine solche Wirkungsbeziehung zwischen Matrix B und Protein A stellt zweifelsfrei eine synergistische Wirkungsverstärkung der beiden Komponenten A und B dar.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Implantatmaterialien, bei dem das Protein A oder die DNA als Lösung in einem physiologisch unbedenklichen, mit Wasser misch- baren Lösungsmittel oder in entsprechenden Lösungsmittelgemischen in die mikroporöse Struktur der biokompatible Matrix B so aufgebracht wird, daß eine homogene Verteilung der Komponente A in und/oder auf der mikroporösen Struktur der Matrix erreicht wird.
Informationen zur Herstellung von Proteinen der TGF-ß Superfamilie, deren Expression in geeigneten Wirtszellen und Reinigung sind aus den zahlreichen bereits zitierten Publikationen und Patentschriften zu entnehmen. Insbesondere verwiesen sein soll für die Bereitstellung von MP52/GDF-5 oder aktiven Fragmenten davon auf die WO 95/0481 9 und die DE 1 952541 6.3 sowie auf Hotten et al. (Growth Factors 1 3 ( 1 996) 65-74) .
Erfolgt die Herstellung der Proteine in Bakterien, wobei die Proteine, wie es z.B. bei MP52 der Fall ist, in Form von Einschlußkörpern ("inclusion bodies") vorliegen, werden sie nach an sich bekannten Methoden renaturiert, um das Protein, beispielsweise MP52, in einer aktiven Form zu erhalten. In E.coli exprimierte MP52-ähnliche Proteine können zu einem aktiven Protein zurückgefalten werden vgl. : Kriegistein, K. et al., J. Neuroscience Res. 42 ( 1 995) 724-732. Genaue Verfahren sind auch beschrieben in der japanischen Patentanmeldung Hei- 7( ' 95)-93664 sowie in der DE 1 952541 6.3. Weitere eigene Untersuchungen sowie Untersuchungen von Ruppert, R. et al. (Eur. J. Biochem. 237, 295-302 ( 1 996)) haben ergeben, daß z.B. BMP-2 ebenfalls in E.coli exprimiert und zum Dimer gefaltet werden kann.
Die Herstellung der DNA erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden, wie sie z. B. in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. , Greene Publishing Associates and Wiley-Intersience, Wiley & Sons, 1 987-1 996) oder in Molecular Cloning (Sambrook et al. , second edition, Cold Spring Harbor Labora- tory Press 1 989) beschrieben sind.
Zur Herstellung der Trägermatrix B kann das folgende Verfahren nach DE 38 10 803 C2 verwendet werden: Homogene stöchiometrische Mischungen von CaCO3 und CaHPO4 werden entsprechend dem Zustandsdiagramm (Phasendiagramm) des Systems CaO und P205 (Trömel, Stahl und Eisen 63 ( 1 943) 21 ; Welch, J. Chem. Soc. ( 1 961 ) 4442) in kompaktierten Formkörpern in verschiedenen Schritten Sintertemperaturen bis 1 350 °C unterworfen, wobei dem Sintersystem Wasser und CO2 entzogen werden. Zwischen den Sinterprozessen werden die Zwischenstufen der Sintersynthese der Zerkleinerung, Mikronisierung, Rekom- paktierung im Fall der Formkörper-Herstellung bzw. Pelletisierung im Fall der Granulat-Herstellung zugeführt. Die Sinterprozesse werden bzgl. Zeit- und Temperaturgang so geführt, daß koexistierende Nachbarphasen des TCP gemäß Phasendiagramm, d.h. insbesondere das Tetra-Calciumphosphat einerseits und das Di-Calciumphosphats andererseits, vermieden werden. Metastabile Phasen des termodynεmisch stabilen /?-Ca3(PO4)2 oder ?-TCP können je nach Verwendungszweck durch Lenkung der Sinterprozesse entweder gezielt vermieden oder gezielt koexistent gemacht oαer gar allein vorherrschend αargestellt werden.
Eine homogene Einbringung und Verteilung der Komponente A im Porengefüge der Trägermatrix B setzt einige Verfahrensprinzipien voraus, die eine solche Verteilung ermöglichen, ohne daß die Komponenten selbst durch die Prozesse verändert werden.
So ist ohne weiteres verständlich, daß eine Kombination von A mit B simultan zum keramischen Sinterprozess wegen der hohen Prozesstemperaturen unmöglich ist.
Möglich ist dagegen die Penetration der mikroporösen Keramikgefüge, sowohl Formteile als auch Granulatkörner, mit Lösungen von den erfindungsgemäßen Proteinen A oder der dafür kodierenden DNA in geeigneten Lösungsmitteln, wobei die Kapillarkräfte der offenen Keramikgefüge wirksam werden. 3ei der Auswahl der Lösungsmittel kommen naturgemäß nur solche in Frage, welche die Natur der Komponenten A und B des Biomaterials nicht verändern. So sind zum Beispiel saure Lösungsmittel ungeeignet, welche zwar hervorragende Lösungs- mittel f ür osteopoetische Proteine sind, die Calciumphospate dagegen angreifen und chemisch verändern. Andererseits verhält sich Wasser gegenüber der Keramik neutral, vermag jedoch die Proteinkomponente A oft nur unvollständig zu lösen. Ein Penetrieren mittels Suspensionen dürfte einer homogenen Verteilung in der Trägermatrix wegen der mikroporösen Struktur entgegenstehen.
Ein Penetrationsprozess der Trägermatrix über die Lösungsphase, welche nahe- liegenderweise durch Verdampfung ausgetrieben wird, führt ebenfalls nicht zur vollkommen homogenen Verteilung von A in B, da sich beim Verdunsten des Lösungsmittels an der Oberfläche der porösen Keramik ein Stofftransport der gelösten Phase von Innen nach Aussen mit der Folge der Anreicherung an der Oberfläche ergibt.
Eine Lösung für diese komplexe Aufgabenstellung einer homogenen Dotierung der Trägermatrix mit der Komponente A kann erfindungsgemäß durch folgende Verfahrensprinzipien bewerkstelligt werden:
- Entfernung des Lösungsmittels nach Abkühlung einer leicht erwärmten, mit den Proteinen A gesättigten Lösung. Hierdurch wird die Löslichkeit der Proteine im Lösungsmittel unterschritten und es kommt zur Abscheidung der Proteine im Gefüge des Trägers. Die Restlösung verarmt dadurch an Protein und der beschriebene Anreicherungseffekt wird entsprechend reduziert. Diese Möglichkeit ist durch den geringen Temperaturspielraum naturgemäß sehr eingeschränkt, macht aber insbesondere dann einen Sinn, wenn man im Hinblick auf einen gewissen "Startereffekt" der Osteo- poese einen Gehaltsgradienten des Proteins im Keramikgefüge wünscht.
- Entfernung einer Protein- oder DNA-haltigen Flüssigkeitsmischung, bestehend aus organischem Lösungsmittel und/oder Wasser, durch Sublimation, entsprechend der critical point-Trocknung. Durch den direkten Übergang der erstarrten Lösungsmittelmischung in den gasförmigen Zustand wird ein Transport des Proteins oder der DNA über die Flüssigphase verhindert, wodurch eine gleichmäßige Verteilung des präzipitierten Proteins oder der DNA im Keramikgefüge erreicht wird. Homogene Präzipitation von Protein im keramischen Trägergefüge aus einer Protein- enthaltenden organischen Lösung durch Zuführung von z.B. Wasser, wodurch es zu einer raschen Präzipitation des Proteins und somit zur in situ Deposition im Keramikgefüge kommt. Diese Methode ist vielsei- tig einsetzbar und funktioniert bei Stoffpaarungen, bei denen das Protein im organischen Lösungsmittel löslich ist, das reine Lösungsmittel mit Wasser mischbar ist, nicht jedoch die Protein-haltige Lösung. Hierzu können z.B. Acetonitril/Wasser, Propandiol-1 ,2/Wasser oder Propa- noI/Wasser u.a. eingesetzt werden.
Homogene Präzipitation von DNA im keramischen Trägergefüge aus einer DNA-haltigen Salzlösung (zum Beispiel 0, 1 M NaCI oder 0,25 M NaAc) durch Zuführung von alkoholischer Lösung, wie beispielsweise absoluter Ethanol, wodurch es zu einer raschen Präzipitation der DNA im Keramikgefüge kommt. Die dotierte Trägermatrix kann bei Bedarf mit 70 % Ethanol gewaschen werden.
Die erfindungsgemäßen Implantatmaterialien können auf ihre Wirksamkeit in gängigen Testsystemen wie z.B. dem bereits erwähnten Tiermodell der Ratte, dem Hund und dem Kaninchen oder aber bei Primaten getestet werden.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind daher eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Implantatmaterial gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch wie physiologisch verträglichen Hilfs-, Verdünnungs- und/oder Füllstoffen, ebenso wie die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in einer pharmazeutisch wirksamen Konzentration gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch wie physiologisch verträglichen Hilfs-, Verdünnungsund/oder Füllstoffen zur lokalen Behandlung von Knorpel- und/oder Knochen- Erkrankungen und/oder von Schädigungen des Knorpel- und/oder Knochengewe- bes verursacht durch Verletzung, Operation, Degeneration oder Überbelastung, bei Wirbeltieren, insbesondere Säugern wie Menschen. Mit den erfindungsgemäßen Verbindungen können Erkrankungen die mit einem Knochenverlust einhergehen, wie er z.B. bedingt ist durch Alter, Stoffwechselerkrankungen oder entzündliche Prozesse, gezielt behandelt werden.
Schädigungen des Knorpel- oder Knochengewebes sind denkbar nach Verletzungen, beispielsweise auch Sportverletzungen, Unfällen, Überbelastungen des Bewegungsapparates oder können operationsbedingt, beispielsweise durch Bohrlöcher im Knochen nach Entfernung von Schrauben für künstliche Befestigungsapparaturen oder nach Resektion von Tumorgewebe, auftreten. Besonders bevorzugt ist die gezielte lokale Behandlungen von Knochenfrakturen. Möglich sind auch die Verlängerung von Gliedmaßen. Von besonderem Interesse sind auch Anwendungen im Zahn- oder Kieferbereich, wie z.B. die Behandlung von Parodontose, Sinuslift oder Zystenfüllung im Kieferbereich. Anwendungen sind auch in der kosmetischen Chirurgie zu finden, insbesondere in der plastischen Chirurgie im Gesichtsbereich. Die erfindungsgemäßen Verbindungen ermöglichen auch die Fixierung zweier beweglicher Knochenteile wie z.B. die Verbindung zweier Rückenwirbel über eine neu gebildete Knochenbrücke wie es z.B. bei Bandscheibenproblemen von Vorteil sein kann. Umfaßt sind die genannten Behandlungsmethoden ferner im veterinärmedizinischem Bereich.
Die Dosis liegt je nach Art der Proteinkomponente und in Abhängigkeit von der Applikationsart, dem Krankheitsbild und dem Zustand des Patienten im Bereich von 1 0 μg bis 1 00 mg. Die Menge der Trägermatrix richtet sich nach der Größe des zu behandelnden Knochen- bzw. Knorpeldefektes.
Bei der Verwendung von größeren gepreßten Trägermatrixes wird die mechanische Befestigung durch z.B. Stahlstangen und -schrauben notwendig.
Mit dem dieser Erfindung zugrundeliegenden synergistischen Effekt durch Kombi- nation von Wirkungsmechanismen zweier Komponenten in einer Verbindung, d.h. knorpel- und/oder knocheninduzierendes Protein und osteoinduktive Trägermatrix, können sehr gute Ergebnisse bei Behandlungen erreicht werden. Ein Vorteil der eπindungsgemäßen Implantatmaterialien ist die Möglichkeit, Heilungsprozesse, die knorpel-/und oder knocheninduzierende Reaktionen voraussetzen, wesentlich zu verbessern und zu beschleunigen. Dies hat vorteilhafterweise eine deutliche Reduzierung der Leidenszeit bei Patienten, verkürzte Arbeitszeitausfälle und Reduktion der Krankenhausaufenthaltskosten zur Folge. Ein weiterer wirtschaftlicher Aspekt ist gegeben durch die wirkungsvolle Behandlung der Volkskrankheit Parodontose, welche mit dem vorzeitigen Zahnverlust einhergeht. Wirtschaftlich steht somit der durch Parodontose-Behandlung mögliche Zahnerhalt dem kostspieligen vorzeitigen Zahnersatz gegenüber.
Es folgt eine kurze Beschreibung der Figuren:
SEQ ID NO. 1 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des Vorläuferproteins des humanen TGF-ß-Proteins MP52. Der Beginn des reifen Proteins liegt vorzugs- weise im Bereich der Aminosäuren 361 -400, besonders bevorzugt bei Aminosäure 381 oder 382. Der reife Proteinanteil enthält die sieben konservierten Cysteine an den Positionen 400, 429, 433, 465, 466, 498 und 500.
Figur 1 und 2 zeigen die osteoinduktive Wirkung der erfindungsgemäßen Träger- matrix im Vergleich zu einer biokompatiblen, aber nicht bioaktiven Matrix.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischen
Entwicklung von Pharmaka mbH
(B) STRASSE: Czernyring 22
(C) ORT: Heidelberg
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 69115
(A) NAME: GerontoCare GmbH Biomaterials & Medical
Devices
(B) STRASSE: Rossbergring 107
(C) ORT: Reinheim/odw.
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 64354
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG:
Verbindungen mit verbesserter knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivitaet
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30
(EPA)
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: DE 19647853.7
(B) ANMELDETAG: 19-NOV-1996
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 501 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 1:
Met Arg Leu Pro Lys Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp 1 5 10 15
Leu Asp Leu Glu Phe Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly 20 25 30
Gin Arg Pro Gin Gly Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys 35 40 45
Glu Arg Pro Pro Leu Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser 50 55 60
Tyr Gly Gly Gly Ala Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr 65 70 75 80
Gly Gin Thr Gly Gly Leu Thr Gin Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys
85 90 95
Leu Pro Pro Arg Pro Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro 100 105 110
Gin Thr Arg Gin Ala Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gin Leu 115 120 125
Pro Gly Gly Lys Ala Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe 130 135 140
Leu Leu Lys Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu 145 150 155 160
Pro Phe Arg Pro Pro Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu
165 170 175
Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val 180 185 190 Lys Leu Glu Ala Gly Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys 195 200 205
Gly Gin Asp Asp Arg Gly Pro Val Val Arg Lys Gin Arg Tyr Val Phe 210 215 220
Asp Ile Ser Ala Leu Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg 225 230 235 240
Ile Leu Arg Lys Lys Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly
245 250 255
Gly Gly Arg Ala Ala Gin Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg 260 265 270
Gin Pro Ala Ser Leu Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly 275 280 285
Ser Gly Trp Glu Val Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys 290 295 300
Asn Ser Ala Gin Leu Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg 305 310 315 320
Ala Val Asp Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gin Val
325 330 335
His Glu Lys Ala Leu Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp 340 345 350
Leu Phe Phe Asn Glu Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gin Asp Asp Lys Thr 355 360 365
Val Tyr Glu Tyr Leu Phe Ser Gin Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu 370 375 380
Ala Thr Arg Gin Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys 385 390 395 400 Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp
405 410 415
Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu 420 425 430
Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val 435 440 445
Ile Gin Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr 450 455 460
Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp 465 470 475 480
Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gin Tyr Glu Asp Met Val Val Glu
485 490 495
Ser Cys Gly Cys Arg 500
Figur 1 und 2 zeigen die osteoinduktive Wirkung der erfindungsgemäßen Trägermatrix im Vergleich zu einer biokompatiblen, aber nicht bioaktiven Matrix.
In Figur 1 ist die Knochenbildung in den Poren einer bioinerten Matrix z.B. AI2O3 ( 1 in Fig. 1 ) schematisch dargestellt. Figur 3 zeigt im Gegensatz dazu die osteoinduktive Wirkung der erfindungsgemäßen Calciumphosphat-Matrix ( 1 in Fig. 2) in einer sonst identischen Implantationssituation:
In beiden Fällen wurden zylindrische Implantate ( 1 ) (Aussen - 0 : 6 mm) mit einer offen durchgängigen Makropososität (Porendurchmesser ca. 0,5 bis 0,7 mm 0) in den kompakten Knochen (Schienbeinknochen eines Hundes) implantiert. Der kompakte Lagerknochen (2) mit deutlich sichtbarer gerichteter "Lamellenstruktur" bildet nach kurzer Implantationszeit um das Implantat neuen Knochen, der den Zwischenraum zwischen Bohrloch im Knochen und den Aus- senrand des Implantates zu überbrücken (3) sucht. Ausserdem bildet sich auch in den Poren des Implantates neuer Knochen (4a in Fig. 1 und 4b in Fig. 2).
Der grundlegende Unterschied zwischen den beiden Implantatmaterialien besteht darin, daß sich der Knochen im osteoinduktiven Implantatmaterial (4b in Fig. 2) unmittelbar und spontan auf den Innenflächen der Poren bildet und die Trägermatrix als Nukleationsort benutzt und von dort aus den gesamten Implantatbereich ausfüllt. Im Gegensatz dazu wächst der Knochen im nicht-bioaktiven Material (Fig. 1 ) sehr zögernd durch die Porenmitten und vermeidet auch auf Dauer jeden direkten Kontakt mit dem Implantatmaterial. Aus diesen Unterschie- den ergibt sich eine sehr intensive und schnelle Verbundbildung beim osteoin- duktivem Material (Fig. 2) und eine zögernde, von Osteoklastentätigkeit begleitete unvollständige Verbundbildung beim "bioinerten" Material (Fig. 1 ) .

Claims

Patentansprüche
1 . Bioaktives Implantatmaterial für den Knochenersatz mit Knorpel- und/oder Knochen-bildender Aktivität bestehend aus zwei Komponenten A und B, dadurch gekennzeichnet, daß A ein auf B aufgebrachtes, osteoinduktives Protein oder Proteingemisch oder für ein oder mehrere derartige Proteine kodierende DNA ist und B ein Matrixmaterial aus Calciumphosphat ist, welches selbst osteo- gene Aktivität besitzt.
2. Implantatmaterial nach Anspruch 1 , wobei Komponente A ein oder mehrere homo- oder heterodimere Proteine der TGF-ß-Superfamilie mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität, vorzugsweise der GDF- oder BMP-Familie, oder Fragmente davon umfaßt oder dafür kodierende DNA-
Sequenzen.
3. Implantatmaterial nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Komponente A
(a) den reifen Anteil und gegebenenfalls weitere funktionelle Anteile der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Proteinsequenz enthält,
(b) Teile des reifen Anteils von (a) enthält, die im wesentlichen dieselbe Aktivität aufweisen, insbesondere reife Proteine mit veränderten N-Terminus,
(c) Teile entsprechend (a) oder (b) enthält, die aufgrund der Herkunft des Proteins aus anderen Wirbeltieren von SEQ ID NO. 1 abweichen, aber im wesentlichen dieselbe Aktivität aufweisen,
(d) neben Teilen des reifen Proteins gemäß (a), (b) oder (c) noch Teile eines anderen Proteins aus der TGF-/?-Superfamilie in Form eines Fusionsproteins enthält, (e) neben monomeren reifen Proteinen gemäß (a) bis (d) noch ein
Monomer eines anderen Proteins aus der TGF- ?-Superfamilie unter Ausbildung von Heterodimeren enthält, (f) neben dimeren reifen Proteinen gemäß (a) bis (e) noch mindestens ein Dimer eines anderen Proteins aus der TGF-/?-Superfamilie enthält.
4. Implantatmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , wobei B eine biode- gradable oder/und bioaktive Trägermatrix aus Tricaiciumphosphat-Keramik bedeutet, welche aus einer kristallographisch phasenreinen a- oder ß- Tricaiciumphosphat-Keramik miteinerinterkonnektierenden Mikroporosität im Bereich von 20-60 % ihres Volumens besteht und allein bereits kno- cheninduzierende Eigenschaften besitzt.
5. Implantatmaterial nach Anspruch 4, wobei B eine biodegradable oder/und bioaktive Trägermatrix aus kristallographisch phasenreiner a- oder ß- Tricalciumphosphat-Keramik bedeutet, deren Primärkorngröße im Bereich von 10-40 μm liegt und die in einer für die medizinische Anwendung hergestellten Suspension in geeigneten Flüssigkeiten wie Wasser, Serum, Plasma und Blut keine Riesenzeil- oder Bindegewebeinfiltration in das Implantat verursacht.
6. Implantatmaterial nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer injizierbaren Suspension vorliegt.
7. Implantatmaterial nach Anspruch 4, 5 oder 6, wobei B eine biodegradable und bioaktive Trägermatrix aus kristallographisch phasenreiner a- oder ?-
Tricalciumphosphat-Keramik bedeutet, welche A in kontrolliert retardierter
Weise ("controlled release") in dem Maße freisetzt wie B dem chemischen
Abbau im Knochenlager unterliegt.
8. Verfahren zur Herstellung eines bioaktiven Implantatmaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Protein oder die DNA-Sequenz A als Lösung in einem physiologisch unbedenklichen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel oder in entsprechenden Lösungsmittelgemischen in die mikroporöse Struktur der biokompatible Matrix B so aufgebracht wird, daß eine homogene Verteilung von A in und/oder auf der mikroporösen Struktur der Matrix erreicht wird.
5
9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 8, wobei das Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch durch Sublimation, vorzugsweise durch Gefriertrocknung, entfernt wird.
ιo 1 0. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 8, wobei das Protein oder die DNA-Sequenz A durch in situ-Präzipitation in der Matrix B aus dem Lösungsmittel durch Zumischen eines präzipitierenden Lösungsmittels, vorzugsweise Wasser oder Ethanol, angereichert wird.
15 1 1 . Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Implantatmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 7 gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch wie physiologisch verträglichen Hilfs-, Verdünnungs- und/oder Füllstoffen.
20 1 2. Verwendung eines bioaktiven implantatmaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 1 zur lokalen Behandlung von Erkrankungen, die den Knorpel und/oder Knochen betreffen, oder/und von Schädigungen des Knorpel- und/oder Knochengewebes, die durch Verletzung, Operation, Degenera-
25 tion oder Überbelastung verursacht wurden.
1 3. Verwendung eines bioaktiven Implantatmaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 1 zur Behandlung von Knochendefekten wie z.B. Parodontose, 30 Sinuslift, Zystenfüllung im Kieferbereich, Knochenfrakturen, Knochenersatz sowie zum Einsatz in der kosmetischen und plastischen Chirurgie und zur Fixierung beweglicher Knochenteile.
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003525706A (ja) * 2000-03-10 2003-09-02 テクノロジィ ファイナンス コーポレイション（プロプライエタリー） リミテッド 非吸収性生理活性物質の本体を有する移植組織
WO2004041319A1 (ja) * 2002-11-07 2004-05-21 Pentax Corporation 骨形成治療デバイス
WO2007068489A2 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 Scil Technology Gmbh A moldable biomaterial for bone regeneration
US7763270B2 (en) 2002-09-10 2010-07-27 Scil Technology Gmbh Metal implant coated under reduced oxygen concentration with osteoinductive protein
EP2322234A1 (de) 2004-06-09 2011-05-18 Scil Technology GmbH In situ aushärtende Paste, deren Herstellung und Verwendung
EP2602264A1 (de) 2011-12-05 2013-06-12 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka mbH GDF-5-Mutant zur Induzierung der Knorpelbildung
US8546334B2 (en) 2001-11-19 2013-10-01 Scil Technology Gmbh Device having osteoinductive and osteoconductive properties
WO2021122545A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Merck Patent Gmbh Use of the gdf-5 mutant for the treatment of pain and cartilage destruction
US11324806B2 (en) 2018-10-19 2022-05-10 Warsaw Orthopedic, Inc. Sustained delivery of a growth differentiation factor

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6267798A (en) † 1997-02-07 1998-08-26 Stryker Corporation Matrix-free osteogenic devices, implants and methods of use thereof
DE19944681A1 (de) * 1999-08-20 2001-03-01 Metz Stavenhagen Peter Knochenersatzstoff zur Implantation im menschlichen oder tierischen Körper
US7067123B2 (en) 2003-04-29 2006-06-27 Musculoskeletal Transplant Foundation Glue for cartilage repair
US7901457B2 (en) * 2003-05-16 2011-03-08 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage allograft plug
EP1604694A1 (de) * 2004-06-09 2005-12-14 Scil Technology GmbH Kompositvorrichtung mit osteoinduktiven und osteokonduktiven Eigenschaften
US7837740B2 (en) * 2007-01-24 2010-11-23 Musculoskeletal Transplant Foundation Two piece cancellous construct for cartilage repair
US7815926B2 (en) 2005-07-11 2010-10-19 Musculoskeletal Transplant Foundation Implant for articular cartilage repair
WO2007035778A2 (en) 2005-09-19 2007-03-29 Histogenics Corporation Cell-support matrix and a method for preparation thereof
DE102005060761B4 (de) * 2005-12-16 2007-10-25 Alexakis, Antonis, Dr. med. dent. Formteil zur Neubildung von Knochenmaterial
EP1880731A1 (de) 2006-07-18 2008-01-23 BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH Menschlicher Wachstums und Differenzierungsfaktor GDF-5
US7723291B2 (en) * 2006-07-27 2010-05-25 Warsaw Orthopedic, Inc. Release of BMP, bioactive agents and/or cells via a pump into a carrier matrix
US8178099B2 (en) * 2006-12-29 2012-05-15 Osteogenex Inc. Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
ES2402672T3 (es) * 2007-01-25 2013-05-07 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh Uso del GDF-5 para el mejoramiento o el mantenimiento del aspecto dérmico
US8435551B2 (en) 2007-03-06 2013-05-07 Musculoskeletal Transplant Foundation Cancellous construct with support ring for repair of osteochondral defects
US20090061002A1 (en) * 2007-09-05 2009-03-05 Venbrocks Rudolf A Calcium phospate based delivery of growth and differentiation factors to compromised bone
CA2717725A1 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Cancellous constructs, cartilage particles and combinations of cancellous constructs and cartilage particles
KR100991203B1 (ko) * 2010-05-10 2010-11-01 심영복 골형성 단백질의 정제 방법
EP2537538A1 (de) * 2011-06-22 2012-12-26 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka mbH Bioresorbierbarer Wundverband
US10077420B2 (en) 2014-12-02 2018-09-18 Histogenics Corporation Cell and tissue culture container
US10836807B2 (en) 2016-12-30 2020-11-17 Biogend Therapeutics Co., Ltd. Recombinant polypeptides and nucleic acid molecules, compositions, and methods of making and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4596574A (en) * 1984-05-14 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Biodegradable porous ceramic delivery system for bone morphogenetic protein
US4681763A (en) * 1985-06-11 1987-07-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Composition for stimulating bone growth
DE3810803A1 (de) * 1988-03-30 1989-10-12 Battelle Institut E V Verfahren zur herstellung eines synthetischen knochenmaterials mit koerpereigenen eigenschaften
WO1995004819A1 (de) * 1993-08-10 1995-02-16 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh NEUER WACHSTUMS-/DIFFERENZIERUNGSFAKTOR DER TGF-β-FAMILIE

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0448704B1 (de) 1989-10-17 1998-06-17 Stryker Corporation Osteogene vorrichtungen
WO1995032008A1 (en) 1994-05-24 1995-11-30 Implico B.V. A biomaterial and bone implant for bone repair and replacement
US5866155A (en) 1996-11-20 1999-02-02 Allegheny Health, Education And Research Foundation Methods for using microsphere polymers in bone replacement matrices and composition produced thereby

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4596574A (en) * 1984-05-14 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Biodegradable porous ceramic delivery system for bone morphogenetic protein
US4681763A (en) * 1985-06-11 1987-07-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Composition for stimulating bone growth
DE3810803A1 (de) * 1988-03-30 1989-10-12 Battelle Institut E V Verfahren zur herstellung eines synthetischen knochenmaterials mit koerpereigenen eigenschaften
WO1995004819A1 (de) * 1993-08-10 1995-02-16 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh NEUER WACHSTUMS-/DIFFERENZIERUNGSFAKTOR DER TGF-β-FAMILIE

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003525706A (ja) * 2000-03-10 2003-09-02 テクノロジィ ファイナンス コーポレイション（プロプライエタリー） リミテッド 非吸収性生理活性物質の本体を有する移植組織
US8546334B2 (en) 2001-11-19 2013-10-01 Scil Technology Gmbh Device having osteoinductive and osteoconductive properties
US8257728B2 (en) 2002-09-10 2012-09-04 Scil Technology Gmbh Metal implant coated under reduced oxygen concentration with osteoinductive protein
US7763270B2 (en) 2002-09-10 2010-07-27 Scil Technology Gmbh Metal implant coated under reduced oxygen concentration with osteoinductive protein
WO2004041319A1 (ja) * 2002-11-07 2004-05-21 Pentax Corporation 骨形成治療デバイス
EP2322234A1 (de) 2004-06-09 2011-05-18 Scil Technology GmbH In situ aushärtende Paste, deren Herstellung und Verwendung
WO2007068489A3 (en) * 2005-12-14 2007-08-02 Scil Technology Gmbh A moldable biomaterial for bone regeneration
WO2007068489A2 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 Scil Technology Gmbh A moldable biomaterial for bone regeneration
EP2602264A1 (de) 2011-12-05 2013-06-12 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka mbH GDF-5-Mutant zur Induzierung der Knorpelbildung
WO2013083649A1 (en) 2011-12-05 2013-06-13 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh Gdf-5 mutant for inducing cartilage formation
EP3168230A1 (de) 2011-12-05 2017-05-17 Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka GmbH Gdf-5-mutant zur induzierung der knorpelbildung
US9718867B2 (en) 2011-12-05 2017-08-01 Biopharma Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh GDF-5 mutant for inducing cartilage formation
US11324806B2 (en) 2018-10-19 2022-05-10 Warsaw Orthopedic, Inc. Sustained delivery of a growth differentiation factor
WO2021122545A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Merck Patent Gmbh Use of the gdf-5 mutant for the treatment of pain and cartilage destruction

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