WO1999034195A1 - Verfahren zum nachweis von reaktionen mittels koinzidenzanalyse - Google Patents

Verfahren zum nachweis von reaktionen mittels koinzidenzanalyse Download PDF

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WO1999034195A1
WO1999034195A1 PCT/EP1998/008425 EP9808425W WO9934195A1 WO 1999034195 A1 WO1999034195 A1 WO 1999034195A1 EP 9808425 W EP9808425 W EP 9808425W WO 9934195 A1 WO9934195 A1 WO 9934195A1
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time
sample
coincidence
analysis
fluorescence
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PCT/EP1998/008425
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Manfred Eigen
Thorsten Winkler
Jens Stephan
Petra Schwille
Andre Koltermann
Ulrich Kettling
Klaus DÖRRE
Jan Bieschke
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Evotec Biosystems Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of association, dissociation, linkage or cleavage reactions and conformation changes by means of coincidence analysis.
  • Finding molecules with specific properties such as binding, inhibition or catalytic properties is a central task in drug development and in biotechnological applications. Molecules with such properties can either be discovered or designed. In this sense, “discovery” means the isolation and screening of substances, while the molecular design uses rational or evolutionary techniques.
  • the rational design requires well-founded insights into molecular biophysics to enable a prediction of the structure-function relationship.
  • principles of Darwinian evolution are applied at the molecular level in the evolutionary design and new or modified molecules are generated by a combination of mutation, amplification and selection.
  • the use of evolutionary techniques in biotechnology - so-called evolutionary biotechnology - was proposed by Eigen and Gardiner at the beginning of the eighties (Pure Appl. Chem.
  • fluorescence-based techniques such as fluorescence resonance energy transfer (FRET), fluorescence quenching, fluorescence polarization, time-resolved fluorescence techniques and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) - have been very well received.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • fluorescence correlation spectroscopy fluorescence fluctuations of individual molecules of a measuring volume element, in particular in the femtoliter range, are measured and z.
  • Fluorescence cross correlation spectroscopy or so-called two-color FCS is also the subject of several publications.
  • the two-color FCS was proposed by Eigen and Rigler (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 5740 - 5747) in the early 1990s and is also discussed in the international patent application published under WO 94/16313. Applications of this technique in the investigation of hybridization kinetics have been described by Schwüle et al. (Biophysical Journal, Vol. 72, 1878-1886, 1997).
  • the applications of fluorescence cross-correlation described in the literature show that analysis times of 30 to 120 s are necessary in order to enable the amplitudes of the cross-correlation function and diffusion times to be determined with sufficient accuracy. Such long analysis times are not or only partially suitable for a high-throughput screen mg.
  • the signal will be for the entire period during which the time differences are continuously below the visually determined Threshold values are considered as belonging together and evaluated as a proportion of fluorescence, which has been called "burst" in scientific parlance for some time.
  • the signal filtered in this way is then evaluated in relation to the fluorescence lifetime.
  • the authors only use signal components with more than 25 time differences below the visually determined threshold.
  • the object of the following invention is to provide a method which enables reliable and rapid detection of association, dissociation, linking and cleavage reactions and conformation changes with the smallest sample volumes.
  • the invention thus relates to a method for the detection of association, dissociation, linking or cleavage reactions and conformation changes of analytes in a sample by means of coincidence analysis, whereby
  • the sample contains at least two analytes labeled with different fluorescent dyes and / or at least one analyte labeled with at least two different fluorescent dyes
  • the sample is illuminated by at least one laser to excite the fluorescent emission of the at least two dyes, which emanates from the sample and consists of at least one measuring volume element
  • V-derived fluorescence signals are detected using at least two detection units, the signals detected in the detection units or time traces derived therefrom are broken down into any, but essentially simultaneous, time segments with freely selectable time channel widths, the number of signals contained in at least one time segment and / or the time intervals between signals are determined in the time segments for at least one time period of the first detection unit, a coincidence analysis of the determined data is carried out with at least one substantially simultaneous time period of the second detection unit, at least one statistic of the results of the coincidence analysis is created, and / or the results are subjected to a threshold value analysis, this or at least a combination of several Statistics based on the presence of features which are characteristic
  • time channel widths are greater than the longest fluorescence lifetime of the at least two dyes and / or the time channel widths are less than the passage time of the at least one sample molecule through the measurement volume.
  • the detection units should have different spectral detection sensitivities.
  • the measuring volume element should be V ⁇ 10 "12 l.
  • a laser which emits electromagnetic radiation of at least one wavelength which is suitable for exciting the at least two dyes contained in the sample.
  • the coincidence analysis is carried out online and / or the time for carrying out the respective measurement is individually adjusted during the measurement.
  • N (mj) denotes the number of photons in the time period m of the detector j, i the total number of detection units used and n the number of time periods within the time track.
  • sample volume and measurement volume may also be desirable for the sample volume and measurement volume to be moved relative to one another. Furthermore, it can be preferred to investigate systems in which particles occur whose molecular weight differs by less than a factor of 2.
  • the implementation of the method according to the invention first comprises the labeling of the sample molecules to be examined by at least two analytes labeled with different fluorescent dyes and / or an analyte labeled with at least two different fluorescent dyes.
  • the spectrally independent emission radiation from the at least two different fluorescent dyes is detected in a confocal detection method on independent detectors, a detector preferably being assigned to each dye.
  • the photon signals generated on the detectors are recorded by a measurement card simultaneously in as many time tracks as detectors and are preferably scanned in parallel or simultaneously with freely selectable time channel widths. Synchronized time axes are thus preferably provided, which are divided into freely selectable time channels and in which the photon signals are stored depending on their arrival in time.
  • the frequency beyond the statistical mean of signals coinciding in the synchronized time tracks is calculated by means of a suitable algorithm.
  • this coincidence Kj is calculated by a normalized multiplication of the i detector channels used with freely selectable temporal resolution.
  • N (mj) denotes the number of photons in the time channel m of the detector j, i the total number of detector channels or detector units used and n the number of time channels or time segments within the time track.
  • K 1. If photons are detected at the same time in the at least two time traces that go beyond the random measure, K> 1. The higher K is over 1, the more coincidences occur in the two time tracks, i. H. the more sample molecules with at least two dyes are detected.
  • This measurement principle is illustrated in Figure 9 using the example of a sample that contains two different fluorescent dyes.
  • a particularly noteworthy advantage for the development of homogeneous assays based on the method according to the invention is the general applicability and flexibility of the method.
  • the target design for conventional single-color FCS for example, is limited by the need to differentiate positive and negative samples via the diffusion times of the fluorescent molecules.
  • Other fluorescence techniques such as FRET or fluorescence quenching are thereby limited that two fluorophores must be in suitable spatial proximity to each other. However, they can be quite suitable for the detection of changes in conformation. Fluorescence polarization requires an altered fluorophore flexibility in order to be able to detect a reaction.
  • Assays based on the method according to the invention are not subject to these limitations.
  • the screening for enzymatic activity as well as for inhibitors of enzymatic processes is significantly simplified. Using the principles of evolutionary biotechnology in combination with the method according to the invention and new mutagenesis techniques opens up possibilities for the design or optimization of a large number of catalytic functions.
  • the method according to the invention is a real-time process, so that on-line fitting is possible during the measurement.
  • most samples should generally be negative, since a specific enzyme activity is a relatively rare event in any library.
  • a threshold value for the coincidence for clearly negative samples can be defined. All samples with a coincidence value below this threshold value can be sent directly to another analysis with the same analysis time.
  • a two-color excitation light is generated in only one light source, less adjustment effort is required. There is an increase in stability with regard to the congruence of the two confocal volume elements. Interfering wavelengths outside the spectral excitation ranges or within the emission ranges of the two marker fluorophores can be filtered out by suitable optical filters. The relative intensities and beam diameter for both colors can also be adjusted using suitable filters and pinholes.
  • a fundamental advantage of the described method is the possibility of very fast characterization. Measuring times achieved so far are in the range of a few milliseconds per sample.
  • Another advantage of the coincidence analysis method according to the invention is the possibility of evaluating the measurement data during the data acquisition (on-line) with the aid of a suitable measurement value acquisition / processor card.
  • a mathematical modeling is omitted.
  • the measuring time is adapted online.
  • This adaptive measurement time algorithm enables a further reduction in the total measurement time.
  • the uniqueness of the result is preferably checked at times which are shorter than the average necessary measurement time. This can be done, for example, by checking whether the coincidence value determined at this point in time can be uniquely assigned to an event, ie, for example, a Gaussian distribution shown in FIG. 7 or FIG. 8 for positive or negative samples. All samples with a coincidence value below or possibly above a threshold value to be determined can be sent for further analysis immediately. This specification of a certain level of significance can also lead to a considerable reduction in the measurement time.
  • the fluorescence fluctuation required for the coincidence analysis is brought about by a controlled movement of the sample molecules relative to the confocal volume.
  • this is achieved either by moving the sample (applying vibrations or inducing a flow) with stationary optics, or by moving the measuring focus in the stationary sample (confocal scanning), or by a combination of both.
  • the controlled movement allows the targeted setting of the optimal length of stay of a molecule for fluorescence detection.
  • the number of fluctuations per unit time can thus be increased in a targeted manner, which leads to a significant increase in the signal quality. Additional effects include increasing the effective measurement volume, which increases the sensitivity of the method and leads to a reduction in photobleaching, as well as standardization the duration of stay in the measurement focus for different molecules, which reduces the signal scatter.
  • the variant of a controlled movement of the sample with stationary optics was demonstrated in the form of the application of vibrations.
  • the sample holder was mounted on a piezoelectric positioning table and e.g. with frequencies up to 250 Hz oscillating in the spatial plane perpendicular to the optical axis.
  • frequencies between 100 and 200 Hz there was a significantly increased signal-to-background ratio with a concomitant reduction in the measurement time required for an evaluation.
  • the temporal width of the time channels and the frequency of the periodic relative movements can have an advantageous effect on the measured values. It was shown (FIG. 10) that the time channel width should preferably be chosen to be greater than the triplet state lifetime of the fluorophores and / or less than the average passage time of the molecules through the measurement volume.
  • Another fundamental advantage of the method of coincidence analysis according to the invention is the possibility of also being able to examine systems in which particles occur whose molecular weight differs by less than a factor of 2. If one examines such systems, for. B. with the fluorescence correlation analysis in which the diffusion times are determined, this leads to problems in the uniqueness of the distinction. In contrast, a clear distinction is possible in the method according to the invention by determining the coincidence between time traces of spectrally separated detectors.
  • the coincidence can also take place by determining the amplitude G (0) of the cross-correlation function.
  • the amplitude G (0) is sufficient, statements about the concentration to be able to make the molecule to be examined and so, such as. B. in embodiment 1 and in Figure 5, to determine the activity of a restriction endonuclease.
  • the coincidence analysis can also be implemented by a logical AND or multiplication element at the hardware level.
  • the method according to the invention can also be used to reduce the substrate concentration down to the sub-picomolar range.
  • Figure 1 shows typical cross-correlation curves obtained from samples with or without restriction endonuclease activity at different analysis times.
  • FIG. 2 shows the mean values of the respective individual cross correlation points and their standard deviations, which were obtained from samples with or without restriction endonuclease activity.
  • the histograms shown in FIG. 3 show the distributions of the evaluated cross-correlation amplitudes G (0), which were obtained from samples with or without restriction endonuclease activity using pinhole diaphragms of different diameters.
  • Figure 4 illustrates the influence of the substrate concentration on the overlap between the distribution functions of samples with and without enzymatic activity.
  • FIG. 5 shows the application of the method according to the invention for simulated high-throughput screening for restriction endonuclease activity while determining the parameter G (0).
  • FIG. 6 illustrates a preferred embodiment of the optical structure using a two-color fluorescence cross correlation spectrometer.
  • Fig. 9 shows schematically a measuring principle.
  • Fig. 11 illustrates a preferred embodiment of the optical structure with a device for moving the sample in the form of exposure to vibrations
  • Figure 1 shows typical cross-correlation curves obtained from samples with or without restriction endonuclease activity at different analysis times.
  • the assays were carried out using 10 nM labeled DNA substrate, which was incubated for 3 hours at 37 ° C. with 0.25 U / ⁇ l EcoRI (lower thin lines) or without the addition of enzyme (upper lines in bold).
  • the correlation times were 760 ms (dotted lines) and 120 s (solid lines).
  • the pinhole used had a diameter of 30 ⁇ m.
  • the excitation intensities were 19 kW / cm 2 (488 nm) and 15 kW / cm 2 (633 nm).
  • the cross-correlation curve obtained with short analysis times is noisier than the cross-correlation curve obtained with long analysis times. Nevertheless, the characteristic diffusion times and particle numbers agree sufficiently to allow the statement that the curves obtained contain the same information.
  • FIG. 2 shows the mean values of the respective individual cross-correlation values ⁇ and their standard deviations, which were obtained from samples with or without restriction endonuclease activity.
  • the assays were carried out using 1 nM labeled DNA substrate, which was incubated for 3 hours at 37 ° C. with 0.25 U / ⁇ l EcoRI (lower thin line) or with 0.25 U / ⁇ l HindIII (upper line in bold) .
  • the correlation times were 1.6 s.
  • the pinhole used had a diameter of 30 ⁇ m.
  • the excitation intensities were 38 kW / cm 2 (488 nm) and 31 kW / cm 2 (633 nm). It can be seen that the standard deviations are drastically increased at ⁇ values below 0.01 ms.
  • the histograms shown in FIG. 3 show the distributions of the evaluated cross-correlation amplitudes G (0), which were obtained from samples with or without restriction endonuclease activity using pinhole diaphragms of different diameters.
  • the bars indicate the number of G (0) values that are in a bin width of 0.0015 (30 ⁇ m), 0.0026 (10 ⁇ m) or 0.00062 (60 ⁇ m).
  • the main part of the figure shows the distribution functions of samples with (dotted bars) or without (solid bars) enzymatic activity with an optimal pinhole diameter (30 ⁇ m); the overlap between the Gaussian curves is 0.6%. It is 2.4% with a pinhole diameter of 10 ⁇ m or 3.4% with a pinhole diameter of 60 ⁇ m.
  • the assays were carried out using 10M labeled DNA substrate, which was incubated for 3 hours at 37 ° C. with 0.25 U / ⁇ l EcoRI (dotted bars) or with 0.25 U / ⁇ l Hindlll (solid bars). The correlation times were 1.6 s.
  • the excitation intensities were 38 kW / cm 2 (488 nm) and 31, respectively kW / cm 2 (633 nm).
  • the optimal pinhole diameter determined apparently reflects the compromise between the increase in detection efficiency with increasing pinhole diameter (due to an increased length of stay of the fluorophores in focus) and the decrease in signal-to-noise ratio with increasing pinhole diameter (due to an increased fluorescence background).
  • Figure 4 illustrates the influence of the substrate concentration on the overlap between the distribution functions of samples with and without enzymatic activity.
  • the assays were carried out as described in the legend to FIG. 3 using a pinhole diameter of 30 ⁇ m.
  • the separation of the distribution functions increased with increasing concentration.
  • FIG. 5 shows the application of the method according to the invention for a simulated high-throughput screen mg on restriction endonuclease activity.
  • the samples were screened cyclically (a total of 500 measurements).
  • the left part of FIG. 5 shows the distribution functions of samples with (BamHI, open bars) and without (Hindlll, black bars) specific endonuclease activity with analysis times of 760 ms (la), 1.6 s (2a), 3.6 s (3a) and 7.6 s (4a).
  • the distribution functions of the cross-correlation amplitudes G (0) were evaluated as described in the legend to FIG. 3.
  • the bin width was 0.0015.
  • FIG. 5 illustrates the separation efficiency of the method according to the invention by means of Gauss fitting with a pure substrate (solid line), Hindlll (solid line in bold), BamHI (dotted line in bold), EcoRI (dotted line) and Sspl (dashed line) ).
  • the overlap was 2.6 - 5.4% (760 ms), 0.1% (1.6 s), ⁇ 0.002% (3.6 s) and «10 " 5 % (7.6 s).
  • the assays were carried out in a volume of 5 ⁇ l using 10 nM labeled DNA substrate was carried out, which was incubated for 3 hours at 37 ° C.
  • FIG. 6 shows the optical structure of a two-color fluorescence cross correlation spectrometer.
  • the emitted fluorescent light is collected by the microscope objective, separated from the excitation beam path by means of a dichroic mirror and focused on a pinhole by means of a lens.
  • the pinhole of variable diameter is arranged in the image plane of the lens and can be adjusted in the x, y and z directions.
  • the fluorescence emission is parallelized, separated into a green and red fraction by a dichroic mirror and refocused on two avalanche photodiodes.
  • FIG. 7 A variant of the method according to the invention was introduced in FIG. 7, which was used for a controlled movement of the sample with stationary optics in the form of an application of vibrations.
  • the sample holder was mounted on a piezoelectric positioning table and oscillated accordingly.
  • Samples were used which contained 10 nM double-stranded DNA substrate and to which restriction endonuclease EcoRI was added in one embodiment or no such enzyme was added in another embodiment.
  • the upper part of the figure shows that with an analysis time of 50 ms (3900 measurements each, frequencies 75 Hz (x) and 49 Hz (y)) an overlap between signals of the two different sample types of approx. 3% could be achieved.
  • the lower part of the figure shows that with an analysis time of 100 ms (1800 measurements each, frequencies 75 Hz (x) and 49 Hz (y)) an overlap of only 0.4% could be achieved. It is thus clearly shown that a shortening of the measuring time and an increased data accuracy can be achieved by using a forced movement of the fluorescent particles.
  • FIG. 8 shows histograms from 300 measurements of the coincidence value for samples from pure substrate (10 nM double-labeled double-stranded DNA, black bars) and a sample already cut by restriction endonuclease (10 nM double-labeled double-stranded DNA, dotted bars) at an oscillation frequency of 216 Hz shown.
  • Figures A-D show different analysis times. The distributions were fitted by a Gaussian function. To determine the measurement error, the standard deviations and the overlap of the fit functions were determined.
  • Figure 9 schematically illustrates a measuring principle.
  • different dyes diffuse independently through the sample solution.
  • the occurrence of one dye in the measurement volume is therefore independent of the behavior of the other dye, and the photon events in one time track are statistical in nature and completely independent of the photon events that are recorded in the other time track.
  • both dyes are bound together and now diffuse together through the sample solution. If the complex occurs in the measurement volume, photon events are registered in the two measurement tracks at the same time (ie in the same time channel m).
  • FIG. 10 shows the detection reliability as a function of the temporal width of the time channels (a) and the periodic relative movement (b), which sample and measurement volumes are subjected to.
  • a test sample was used (10 nM, dsDNA labeled twice with the dyes Rhodamine Green and Cy-5) and 300 independent measurements with a measurement time of 500 ms each were carried out for different combinations of values.
  • ⁇ / ⁇ x c With time channel widths that are in the range of the triplet state lifetime of the dye molecules ( ⁇ 5 ⁇ s), ⁇ / ⁇ x c increases . Similarly, ⁇ / ⁇ x ⁇ - increases when the time channel width comes into the range of the average passage time of the molecules through the measurement volume. However, if the frequency of the relative movement is increased, this upper limit on time channel widths can be reduced.
  • Fig. 10b shows the dependence of the relative standard deviation ⁇ / ⁇ x c on the frequency of the relative movement between sample volume and measurement volume. (The y-frequency is always given. If it is not zero, it always goes with a frequency of 3 Hz in the x-direction).
  • Curves are plotted for different measuring times, the channel width was 12.5 ⁇ s. With only a low frequency of the relative movement, a very strong drop in the relative standard deviation can be seen. The curve shows a moderate decrease in ⁇ / ⁇ x c with increasing frequency. In the range of 3 - 246 Hz, ⁇ / ⁇ x c is reduced again by a factor of 2, whereby further improvements can be expected when applying even higher frequencies. The relative standard deviations decrease with increasing measuring time.
  • FIG. 11 shows the optical structure of a two-color fluorescence cross-correlation spectrometer with a device for moving the sample in the form of exposure to vibrations.
  • the sample holder is connected to a two-dimensionally movable piezo actuator, which in turn is mounted on a mechanical high-precision xy sliding table.
  • the emitted fluorescent light is collected by the microscope objective, separated from the excitation beam path by means of a dichroic mirror and focused on a pinhole by means of a lens.
  • the pinhole of variable diameter is arranged in the image plane of the lens and can be adjusted in the x, y and z directions.
  • the fluorescence emission is parallelized, separated into a green and red fraction by a dichroic mirror and refocused on two avalanche photodiodes.
  • Type II restriction endonucleases (EC 3.1.21.4) EcoRI (25 U / ⁇ l), BamHI (10 U / ⁇ 1), Sspl (8 U / ⁇ l) and Hindlll (25 U / ⁇ l) were from Stratagene (La Jolla , CA) acquired; enzyme activities are given in parentheses. Fluorescence-labeled 66 nt oligonucleotides Cy5-ATGGCTAATGACCGAGAATAGGGATCCGAA
  • GATACGAGCGCAAAGCCCGTAGGTACCAATATTGAATTCGGATCCCTAT TCTCGGTCATTAGCCAT were synthesized by MWG-Biotech (Ebersberg, Germany) and HPLC-purified; the first oligonucleotide has a fluorescent marker Cy5 (Amersham, UK) at the 5 'terminus, while the second oligonucleotide is labeled with Rhodamine Green RhG (Molecular Probes). Hybridization of the two complementary strands results in recognition sites for BamHI (single underlined), EcoRI (double underlined) and Sspl (dotted).
  • the hybridization of the complementary strands was carried out at concentrations of 1 ⁇ M in 100 mM KOAc, 25 mM Tris acetate, pH 7.6, 10 mM MgOAc, 0.5 mM ⁇ -mercaptoethanol, 10 ⁇ g / ml BSA while heating the solution to 94 ° C. and then cooling to 23 ° C. with a temperature gradient of 1.2 ° C./min.
  • the result was a double-labeled DNA double strand with recognition sites for BamHI, EcoRI and Sspl.
  • Endonuclease assays were carried out at 37 ° C for 3 hours.
  • the reaction buffer contained 150 mM KOAc, 37.5 mM Tris acetate, pH 7.6, 15 mM MgOAc, 0.75 mM ⁇ -mercaptoethanol, 515 ⁇ g / ml BSA, 0.05% Triton X-100, 0.5% Glycerol, 1 - 20 nM labeled DNA substrate and excess portions (0.08 - 0.25 U / ⁇ l) of restriction enzymes BamHI, EcoRI, Sspl and Hindlll.
  • Optical construction Optical construction:
  • the measurements were carried out using a two-color fluorescence cross correlation spectrometer (Dual-color ConfoCor, C. Zeiss, Oberkochen, Germany).
  • the confocal measuring volume of 0.44 fl was formed by superimposing the foci of an argon-ion laser (488 nm) and a helium-neon laser (633 nm).
  • the fluorescence emission signals were detected separately using two avalanche photodiodes; There was a confocal pinhole in the emission beam path.
  • the spectrometer was equipped with a thermostat. The focus was positioned 100 ⁇ m above the bottom of the respective sample vessel. The measuring temperature was 22 ° C.
  • the samples were presented in sample carriers in microtiter plate format. These were either plastic films sealed without contamination (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) or commercial cover glass chambers (Nunc, Denmark).
  • the parameter ⁇ Diff has an inversely proportional relationship to the diffusion coefficient D.
  • the experimental data were obtained using the Access 2.0 program from EVOTEC BioSystems GmbH using a non-linear least-square Processed Marquardt-Fit. G (0) was the only free parameter when evaluating the cross-correlation measurements.
  • the structure parameter z 0 / r 0 was determined by means of autocorrelation measurements on a free dye solution; the average diffusion time ⁇ Diff of the substrate was determined by means of a 60 s measurement without the addition of enzyme. Both parameters were specified in the fitting of the cross correlation data.
  • a typical set of cross-correlation measurements contained 100 curves, which were recorded using accumulation times between 760 ms and a few seconds.
  • the amplitude G (0) which was obtained by means of fitting, was plotted in a histogram from each set (for details see FIG. 3).
  • the analysis showed that the G (0) distribution functions can be approximated using the Gauss function.
  • the mean values of the Gaussian functions correspond to the average concentrations of the fluorophores, while the level deviations reflect the scatter of the individual measurements.
  • the overlap area of the suffered Gauss functions was determined by integrating the Gauss functions. The overlap areas have been standardized so that a 100% overlap corresponds to Gauss functions with an identical mean and an identical standard deviation.
  • Embodiment 2 Embodiment 2
  • the endonuclease assays were carried out for EcoRI according to embodiment 1. A sample to which no restriction endonuclease was added was used as a reference.
  • the experimental setup is shown in Figure 11. Fluorescence excitation was carried out by epi-illumination of a water immersion objective (UPLAPO 60x / 1.2W; Olympus, Japan) with the wavelengths 476/483 nm and 647 nm of a krypton ion laser (INNOVA 90-K; Coherent, Palo Alto, USA) was operated in multiline mode.
  • the dichroic beam splitter A (AHF) analysis technology, Tübingen) reflects at ⁇ 502 nm and 585-655 nm and transmits at 502-585 and> 655nm.
  • Additional laser lines above 531 nm and 568 nm are removed with a specially designed excitation / notch filter (> OD 5; AHF analysis technology).
  • Matched relative laser excitation energies for both wavelengths can be obtained by combining a colored glass absorption filter (BG 40, Andover Corporation, Salem, USA) and an attenuation filter (OD 0.6; Spindler & Hoyer, Göttingen).
  • the samples were placed in commercial coverslip chambers (Nunc, Denmark).
  • the sample holder is connected to a two-dimensionally movable piezo positioning element (Piezo system Jena), which in turn is mounted on a mechanical high-precision xy sliding table (März Reifen, Wetzlar).
  • the fluorescence photons are at the dichroic beam splitter B spectrally separated (585DCLP02; Omega Optical, Brattleboro, USA) and after optical filtering in the red (667EFLP; Omega) and green channel (535RDF45; Omega), imaged on two avalanche photodiodes (APD) (SPCM-AQ 131-FS; EG&G Optoelectronics, Canada).
  • APD avalanche photodiodes
  • the digital pulses of the APDs are either from a dual input multiscaler PC card (MCD-, FAST Com-Tec, Kunststoff) for the analysis of time tracks with high temporal resolution or from an on-board processor PC card (Adwin-) LD; Jäger Meßtechnik, Lorsch), which can be programmed for online data processing, 'added.
  • the photon count signals of the two detectors were recorded simultaneously by a measurement card and simultaneously scanned with a selectable time channel width. From the two time tracks obtained in this way, simultaneous channels were then multiplied together, then the sum of all products was formed, and for normalization divided by both time track (individual) sums and multiplied by the total time channel number:
  • n the total number of time channels contained in a time track
  • N ⁇ m the number of photon count events in time track 1 in time channel m
  • N 2 (m) the number of photon count events in time track 2 indicates time channel m.
  • K obtained is the evaluation measure for the sample under consideration. Only the number of coincident events is evaluated. For signals that are completely independent of one another, K is 1 because of the normalization. If photon signals occur simultaneously in both time tracks in excess of the random measure, K> 1. The higher K is over 1, the more coincidences, i.e. photons registered at the same time, appear in the two time tracks. The latter is a measure of the proportion of the molecules to which both dye species are bound.

Abstract

Verfahren zum Nachweis von Reaktionen sowie Konformationsänderungen von Analyten in einer Probe mittels Koinzidenzanalyse, wobei: die Probe mindestens zwei mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert wird, und zur Anregung der Fluoreszenzemission von mindestens einem Laser beleuchtet wird, die Fluoreszenzsignale mittels mindestens zweier Detektionseinheiten detektiert werden, und die jeweiligen Signale in beliebige, simultane Zeitabschnitte mit frei wählbaren Zeitkanalbreiten zerlegt werden, die Anzahl der in mindestens einem Zeitabschnitt enthaltenen Signale und/oder die Zeitintervalle zwischen Signalen in den Zeitabschnitten ermittelt werden, für mindestens einen Zeitabschnitt der ersten Detektionseinheit eine Koinzidenzanalyse der ermittelten Daten mit mindestens einem zeitgleichen Zeitabschnitt der zweiten Detektionseinheit durchgeführt wird, eine Statistik der Resultate der Koinzidenzanalyse erstellt wird, und/oder die Resultate einer Schwellwertanalyse unterzogen werden, diese oder eine Kombination mehrerer Statistiken nach dem Vorhandensein von charakteristischen Merkmalen bewertet wird.

Description

VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON REAKTIONEN MITTELS KOINZIDENZANALYSE
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Assoziations-, Dissoziations-, Verknüpfüngs- oder Spaltreaktionen sowie Konformationsänderungen mittels Koinzidenzanalyse.
Das Auffinden von Molekülen mit spezifischen Eigenschaften, wie Bindungs-, Inhibitions- oder katalytischen Eigenschaften, ist eine zentrale Aufgabe in der Wirkstoffentwicklung .und in biotechnologischen Anwendungen. Moleküle mit derartigen Eigenschaften können entweder entdeckt oder entworfen werden. In diesem Sinne bedeutet "Entdecken" die Isolierung und das Screening von Substanzen während das molekulare Design auf rationale oder evolutive Techniken zurückgreift. Das rationale Design erfordert fundierte Einblicke in die molekulare Biophysik, um eine Vorhersage der Struktur-Funktion-Beziehung zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu werden im evolutiven Design Prinzipien der Darwinschen Evolution auf molekularer Ebene angewendet und neue bzw. veränderte Moleküle durch eine Kombination von Mutation, Amplifikatiαn und Selektion erzeugt. Die Anwendung evolutiver Techniken in der Biotechnologie - sog. evolutive Biotechnologie - wurde von Eigen und Gardiner zu Beginn der achtziger Jahre vorgeschlagen (Pure Appl. Chem. 56, 967-978, 1984) und hat inzwischen eine breite Akzeptanz gefunden. Leider ist jedoch in vielen evolutiven Ansätzen der Prozeß der Selektion nicht unmittelbar an die Amplifϊkation geknüpft. Selektionsprozesse müssen daher oftmals künstlich eingeführt werden. Dies kann beispielsweise im sog. Hochdurchsatzscreenmg (HTS) in Kombination mit einem geeigneten Assay erfolgen.
HTS-Prozesse unterliegen ökonomischen Beschränkungen. Zur Prozessierung einer Vielzahl von Proben ist es daher erforderlich, daß die Analysezeit der einzelnen Probe extrem gering ist. In den letzten Jahren erfolgten daher große Anstrengungen in der Miniaturisierung, Parallelisierung und Automatisierung der Screeningtech- nologie sowie in der Entwicklung von homogenen Assays und der Integration hochsensitiver und schnell arbeitender Detektionsvorrichtungen. Unter der Vielzahl alternativer Detektionsprinzipien haben fluoreszenzbasierende Techniken - wie Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET), Fluoreszenzquenching, Fluoreszenzpolarisation, zeitaufgelöste Fluoreszenztechniken und Fluoreszenzkorrelations- spektrokopie (FCS) - starken Anklang gefunden.
Im Rahmen der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie werden Fluoreszenzfluktuationen von einzelnen Molekülen eines insbesondere im Femtoliter-Bereich liegenden Meßvolumenelementes gemessen und z. B. durch Evaluierung der Autokorrela- tionsfunktion der Einfarben-Fluoreszenzsignale molekulare Diffusionscharakteristiken ermittelt. Die Grundlagen der FCS und ihre Anwendung auf insbesondere biologische Fragestellungen sind in vielfältigen Artikeln und Patentanmeldungen beschrieben (z. B. Eigen und Rigler, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 5740 - 5747, 1994; WO 94/16313).
Die Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie oder sog. Zweifarben-FCS ist ebenfalls Gegenstand einiger Veröffentlichungen. Die Zweifarben-FCS wurde zu Beginn der neunziger Jahre von Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 5740 - 5747) vorgeschlagen und wird ebenfalls in der unter WO 94/16313 veröffentlichten internationalen Patentanmeldung erörtert. Applikationen dieser Technik bei der Untersuchung von Hybridisierungskinetiken wurden von Schwüle et al. (Biophysical Journal, Vol. 72, 1878 - 1886, 1997) beschrieben. Die in der Literatur beschriebenen Anwendungen der Fluoreszenzkreuzkorrelation zeigen, daß Analysezeiten von 30 bis 120 s notwendig sind, um eine hinreichend genaue Bestimmung der Amplituden der Kreuzkorrelationsfunktion und Diffusionszeiten zu ermöglichen. Derartig lange Analysezeiten sind nicht oder nur bedingt für ein Hochdurchsatzscreenmg geeignet.
In der Literatur sind ferner verschiedene Signalverarbeitungsverfahren beschrieben worden, um Signale vom Hintergrundrauschen zu trennen.
In Tellinghuisen et al. (Analytical Chemistry 66, No. 1, 64 - 72, 1994) wird ein Verfahren für die Fluoreszenz-Lebensdauerspektroskopie beschrieben, das dazu dienen soll, die von der Lichtquelle, in diesem Fall von einem Laser stammenden Photonen aus dem Gesamtsignal herauszufiltern. Dazu wird der Signalzählerstrom mit dem Triggersignal, d.h. dem Anregungspuls des gepulsten Lasers, verglichen. Kommt ein Photon im Rahmen der Lichtgeschwindigkeit zeitgleich mit dem Anregungspuls an, so wird es als Streulichtpuls identifiziert und gelöscht.
In Keller et al. (Applied Spectroscopy 50, No. 7, 12A - 32A, 1996) wird ein weiteres Verfahren für die Analyse von Fluoreszenzlebensdauern beschrieben. In diesem Verfahren werden die Zeitdifferenzen zwischen am Detektor eintreffenden, zeitlich aufeinanderfolgenden Impulsen bestimmt, indem die Anzahl von Triggerpulsen, die mit 100 kHz erzeugt werden, zwischen zwei aufeinanderfolgenden Photonen gezählt wird. Diese Zahlen werden in aufeinander folgenden Kanälen eines MCS (engl. "multichannel sealer") gespeichert. Anschließend wird dieses MCS-Signal einer zeitlichen, schnellen Fouriertransformation (FFT) zur Glättung unterworfen. Liegen nach der FFT wenigstens 5 Zeitdifferenzen des geglätteten Signals unterhalb eines visuell bestimmten Schwellenwertes, so wird das Signal für die gesamte Zeitdauer, während der die Zeitdifferenzen kontinuierlich unterhalb des visuell bestimmten Schwellenwertes liegen, als zusammengehörig erachtet und als Fluoreszenzanteil, im wissenschaftlichen Sprachgebrauch seit einiger Zeit "burst" genannt, bewertet. Anschließend wird das so gefilterte Signal in bezug auf die Fluoreszenzlebensdauer ausgewertet. Allerdings verwenden die Autoren hier nur Signalanteile, bei denen mehr als 25 Zeitdifferenzen unterhalb des visuell bestimmten Schwellenwertes liegen.
Aufgabe der folgenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches bei kleinsten Probenvolumina eine zuverlässige und schnelle Detektion von Assoziati- ons-, Dissoziations-, Verknüpfungs- und Spaltreaktionen sowie Konformationsänderungen ermöglicht.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Die weiteren Patentansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Nachweis von Assoziations-, Dissoziations-, Verknüpfungs- oder Spaltreaktionen sowie Konformationsänderungen von Analyten in einer Probe mittels Koinzidenzanalyse, wobei
die Probe mindestens zwei mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierte Analyte und/oder mindestens einen mit mindestens zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Analyten enthält, die Probe zur Anregung der Fluoreszenzemission der mindestens zwei Farbstoffe von mindestens einem Laser beleuchtet wird, die von der Probe ausgehenden, aus mindestens einem Meßvolumenelement V stammenden Fluoreszenzsignale mittels mindestens zweier Detektionseinheiten detektiert werden, die jeweils in den Detektionseinheiten detektierten Signale oder hiervon abgeleitete Zeitspuren in beliebige, im wesentlichen jedoch simultane, Zeitabschnitte mit frei wählbaren Zeitkanalbreiten zerlegt werden, die Anzahl der in mindestens einem Zeitabschnitt enthaltenen Signale und/oder die Zeitintervalle zwischen Signalen in den Zeitabschnitten ermittelt werden, für mindestens einen Zeitabschnitt der ersten Detektionseinheit eine Koinzidenzanalyse der ermittelten Daten mit mindestens einem im wesentlichen zeitgleichen Zeitabschnitt der zweiten Detektionseinheit durchgeführt wird, mindestens eine Statistik der Resultate der Koinzidenzanalyse erstellt wird, und/oder die Resultate einer Schwellwertanalyse unterzogen werden, diese oder mindestens eine Kombination mehrerer Statistiken nach dem Vorhandensein von Merkmalen, welche für eine Assoziations,- Dissoziations,- Verknüpfungs- oder Spaltreaktion oder Konformationsänderungen charakteristisch sind, bewertet wird.
Weiterhin kann es bevorzugt sein, daß die Zeitkanalbreiten größer als die längste Fluoreszenzlebensdauer der mindestens zwei Farbstoffe sind und/oder die Zeitkanalbreiten kleiner als die Durchtrittszeit des mindestens einen Probenmoleküls durch das Meßvolumen sind.
Die Detektionseinheiten sollten in einer bevorzugten Ausführungsform unterschiedliche spektrale Detektionsempfindlichkeiten aufweisen.
Weiterhin sollte das Meßvolumenelement V < 10" 12 l betragen.
Es kann weiterhin bevorzugt sein, die Probe mittels eines Lasers zu beleuchten, der elektromagnetische Strahlung mindestens einer Wellenlänge emittiert, die geeignet ist, die mindestens zwei in der Probe enthaltenen Farbstoffe anzuregen. Es ist jedoch auch möglich, Laser zu verwenden, die mehr als eine Wellenlänge emittieren, oder mehrere Laser zur Anregung der Fluoreszenzemission einzusetzen.
Es kann ebenfalls bevorzugt sein, daß die Koinzidenzanalyse online durchgeführt wird und/oder die Zeit zur Durchführung der jeweiligen Messung während der Messung individuell angepaßt wird.
Weiterhin kann es bevorzugt sein, im Rahmen der Koinzidenzanalyse die Koinzidenz durch Bestimmung der Amplitude G(0) der Kreuzkorrelationsfunktion zu ermitteln.
Es kann ebenfalls bevorzugt sein, im Rahmen der Koinzidenzanalyse die Koinzidenz durch logische UND- Verknüpfung zu ermitteln.
Weiterhin kann es wünschenswert sein, die Koinzidenz durch Multiplikation gemäß nachfolgender Formel zu ermitteln:
Figure imgf000008_0001
wobei N(mj) die Anzahl Photonen im Zeitabschnitt m des Detektors j, i die Gesamtzahl der verwendeten Detektionseinheiten und n die Anzahl der Zeitabschnitte innerhalb der Zeitspur bezeichnet.
Es kann auch wünschenswert sein, daß Probenvolumen und Meßvolumen relativ zu einander bewegt werden. Weiterhin kann es bevorzugt sein, Systeme zu untersuchen, in denen Partikel auftreten, deren Molekulargewicht sich um weniger als den Faktor 2 unterscheidet.
Vorzugsweise umfaßt die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zunächst die Markierung der zu untersuchenden Probenmoleküle durch mindestens zwei mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierte Analyte und /oder einen mit mindestens zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Analyten.
Die spektral unabhängigen Emissionsstrahlungen der mindestens zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe werden in einem konfokalen Nachweisverfahren auf unabhängigen Detektoren detektiert, wobei vorzugsweise jedem Farbstoff ein Detektor zugeordnet wird. Die auf den Detektoren erzeugten Photonensignale werden von einer Meßkarte simultan in genausovielen Zeitspuren wie Detektoren aufgenommen und vorzugsweise parallel bzw. simultan mit frei wählbaren Zeitkanalbreiten gerastert. Es werden somit bevorzugt synchronisierte Zeitachsen bereitgestellt, die in frei wählbare Zeitkanäle unterteilt sind und in welchen die Photonensignale je nach zeitlichem Eintreffen gespeichert werden.
Es wird erfindungsgemäß die über das statistische Mittel hinausgehende Häufigkeit an koinzidiert in den synchronisierten Zeitspuren auftretenden Signalen mittels eines geeigneten Algorithmus berechnet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird diese Koinzidenz Kj durch eine normierte Multiplikation der verwendeten i Detektorkanäle mit frei wählbarer zeitlicher Auflösung berechnet. Hierzu werden bevorzugt jeweils zeitgleiche Kanäle dieser Zeitspuren der verwendeten spektral getrennten Detektorkanäle j=l, i miteinander multipliziert, anschließend die
Summe über alle Produkte gebildet und diese normiert und mit der Gesamtzahl n der in einer Zeitspur enthaltenen Zeitkanäle bzw. Zeitabschnitte multipliziert:
Figure imgf000010_0001
J m
Hierbei bezeichnet N(mj) die Anzahl Photonen im Zeitkanal m des Detektors j, i die Gesamtzahl der verwendeten Detektorkanäle bzw. Detektoreinheiten und n die Anzahl der Zeitkanäle bzw. Zeitabschnitte innerhalb der Zeitspur.
Der so erhaltene Wert K ist ein mögliches Bewertungsmaß für die untersuchte Probe. Für völlig voneinander unabhängige Signale ist K=l. Werden in den mindestens zwei Zeitspuren über das Zufallsmaß hinausgehend zeitgleich Photonen detektiert, ist K>1. Je höher K über 1 liegt, desto mehr Koinzidenzen in den beiden Zeitspuren treten auf, d. h. desto mehr Probenmoleküle mit mindestens zwei Farbstoffen werden detektiert. In Abbildung 9 ist dieses Meßprinzip am Beispiel einer Probe, die zwei unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe enthält, verdeutlicht.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es somit nicht notwendig eine Korrelation durchzuführen, wie es z. B. eine fundamentale Voraussetzung für die Einfarben- FCS ist. Gleichzeitig erübrigt sich das für die FCS unerläßliche Anfitten der Meßkurven. Weiterhin kann so die anfallende Menge an Daten auf das Minimum von einem Wert pro Probe reduziert werden (z. B. ist K2-l direkt proportional zur Konzentration an doppelt markierten Molekülen).
Ein besonders hervorzuhebender Vorteil für die Entwicklung von homogenen Assays auf der Basis des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die generelle Anwendbarkeit und Flexibilität der Methode. Das Targetdesign beispielsweise für konventionelle Einfarben-FCS ist limitiert durch die Notwendigkeit, positive und negative Proben über die Diffusionszeiten der fluoreszenten Moleküle zu unterscheiden. Andere Fluoreszenztechniken wie FRET oder Fluoreszenzquenching sind dadurch eingeschränkt, daß zwei Fluorophore sich in geeigneter räumlicher Nähe zueinander befinden müssen. Sie können jedoch zum Nachweis von Konformationsänderungen durchaus geeignet sein. Fluoreszenzpolarisation erfordert eine veränderte Fluoro- phorflexibilität, um eine Reaktion detektieren zu können. Auf dem erfindungsgemäßen Verfahren basierende Assays unterliegen nicht diesen Limitationen. Das Screening auf enzymatische Akiivität sowie auch auf Inhibitoren enzymatischer Prozesse wird entscheidend vereinfacht. Unter Anwendung der Prinzipien der evolutiven Biotechnologie in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und neuen Mutagenesetechniken eröffnen sich Möglichkeiten für das Design bzw. die Optimierung einer Vielzahl katalytischer Funktionen.
Abhängig von der gewünschten Toleranz für falsch-positive bzw. falsch-negative Resultate ist es möglich mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens Analysezeiten von weit unter 1 s zu erzielen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Echtzeitprozeß, so daß ein on-line Fitting während der Messung möglich ist. Im Falle des Screenings auf Restriktionsendonukleaseaktivität sollten i.d.R. die meisten Proben negativ sein, da eine spezifische Enzymaktivität in einer beliebigen Library ein relatives seltenes Ereignis darstellt. Bei Verwendung einer Gauß'schen Funktion für positive Proben und Festsetzung einer Toleranzschwelle, welche die Anzahl nicht- identifizierter positiver Proben in einem Screeninglauf definiert, kann ein Schwellwert für die Koinzidenz für eindeutig negative Proben definiert werden. Alle Proben mit einem Koinzidenzwert unterhalb dieses Schwellwertes können unmittelbar einer weiteren Analyse mit derselben Analysezeit zugeführt werden. Es resultiert somit eine verdoppelte Analysezeit, für die wiederum ein Schwellwert definiert wird. Da die Verteilungsfunktionen bei Vielfachen dieser Analysezeit signifikant besser separiert sind, werden die meisten Proben als falsch-posititive identifiziert. Positive Proben werden nochmaligen Analysen zugeführt, bis die gewünschte Signifikanz erreicht ist. Es ist somit möglich, mit im Einzelfall zu bestimmenden Analysezeiten unter Zugrundelegen eines gewünschten Signifikanzniveaus eine adaptive Auswertung durchzuführen (siehe z. B. Figuren 5 und 8).
Das erfindungsgemäße Verfahren und seine Ausführungsformen zeichnen sich durch folgende Vorteile aus:
Bei Erzeugung eines zweifarbigen Anregungslichtes in nur einer Lichtquelle wird ein geringerer Justageaufwand erforderlich. Es ergibt sich eine Erhöhung der Stabilität bezüglich der Deckungsgleichheit der beiden konfokalen Volumenelemente. Störende Wellenlängen außerhalb der spektralen Anregungsbereiche bzw. innerhalb der Emissionsbereiche der beiden Marker-Fluorophore können durch geeignete optische Filter herausgefiltert werden. Eine Anpassung der relativen Intensitäten und Strahldurchmesser für beide Farben kann ebenfalls unter Verwendung geeigneter Filter und Lochblenden erfolgen.
Ein grundlegender Vorteil des beschriebenen Verfahrens ist die Möglichkeit der sehr schnellen Charakterisierung. Bisher erreichte Meßzeiten liegen im Bereich von wenigen Millisekunden pro Probe. Für die Ermittlung des Meßwertes K ist die fundamentale untere zeitliche Grenze die Lebensdauer der verwendeten Fluorophore, im Gegensatz etwa zur Fluoreszenz-Korrelationsanalyse, wo die Beschränkung durch die Durchtrittszeit der zu untersuchenden Biomoleküle durch das Meßvolumen (=Diffusionszeit) gegeben ist.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der Koinzidenz-Analyse liegt in der Möglichkeit der Auswertung der Meßdaten während der Datenaufhahme (on-line) mit Hilfe einer geeigneten Meßwerterfassungs-/Prozessorkarte. Im Gegensatz z. B. zur Fluoreszenz-Korrelationsanalyse entfallt eine mathematische Modellierung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Meßzeit online angepaßt. Dieser adaptive Meßzeitalgorithmus ermöglicht eine weitere Reduzierung der Gesamtmeßzeit. Vorzugsweise bei Zeiten, die kürzer sind als die mittlere notwendige Meßzeit wird die Eindeutigkeit des Ergebnisses geprüft. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, daß geprüft wird, ob der zu diesem Zeitpunkt ermittelte Koinzidenzwert eindeutig einem Ereignis, d. h. z. B. einer in Figur 7 bzw. Figur 8 dargestellten Gaußverteilung für positive oder negative Proben zugeordnet werden kann. Alle Proben mit einem Koinzidenzwert unterhalb oder ggf. oberhalb eines festzulegenden Schwellenwertes können unmittelbar einer weiteren Analyse zugeführt werden. Diese Angabe eines bestimmten Signifikanzniveaus kann ebenfalls zu einer erheblichen Verkürzung der Meßzeit führen.
Es entfallen ebenfalls experimentelle Routinen zur Kalibrierung des Systems wie sie z. B. bei der Fluoreszenz-Korrelationsanalyse notwendig sind.
In einer weiteren Ausführungsform wird die für die Koinzidenzanalyse nötige Fluoreszenzfluktuation durch eine kontrollierte Bewegung der Probenmoleküle relativ zum konfokalen Volumen bewirkt. Technisch wird dies entweder durch eine Bewegung der Probe (Beaufschlagung von Schwingungen oder Induktion eines Flusses) bei stationärer Optik, oder durch Bewegung des Meßfokus in der stationären Probe (konfokales Scanning), oder durch eine Kombination von beidem erreicht. Gegenüber den in der FCS üblichen Fluktuationen aufgrund molekularer Diffusion erlaubt die kontrollierte Bewegung die gezielte Einstellung der für die Fluoreszenz- detektion optimalen Aufenthaltsdauer eines Moleküls im Fokus. Damit läßt sich die Anzahl der Fluktuationen pro Zeiteinheit gezielt erhöhen, was eine deutliche Steigerung der Signalgüte mit sich führt. Zusätzliche Effekte bestehen in der Vergrößerung des effektiven Meßvolumens, was u. a. die Sensitivität der Methode erhöht und zur Reduktion des Photobleachings führt, sowie in der Vereinheitlichung der Aufenthaltsdauer im Meßfokus für verschiedene Moleküle, was die Signalstreuung reduziert.
Demonstriert wurde die Variante einer gesteuerten Bewegung der Probe bei stationärer Optik in Form der Beaufschlagung von Schwingungen. Hierzu wurde der Probenträger an einen piezoelektrischen Positioniertisch montiert und z.B. mit Frequenzen bis zu 250 Hz oszillierend in der Raumebene senkrecht zur optischen Achse bewegt. Bereits bei Frequenzen zwischen 100 und 200 Hz ergab sich ein deutlich erhöhtes Signal-zu-Hintergrund Verhältnis mit einer damit einhergehenden Verringerung der für eine Bewertung notwendigen Meßzeit.
Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß die zeitliche Breite der Zeitkanäle und die Frequenz der periodischen Relativbewegungen die Meßwerte vorteilhaft beeinflussen können. Es zeigte sich (Figur 10), daß die Zeitkanalbreite vorzugsweise größer als die Triplettzustand-Lebensdauer der Fluorophore und/oder kleiner als die mittlere Durchtrittszeit der Moleküle durch das Meßvolumen gewählt werden sollte.
Ein weiterer, fundamentaler Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der Koinzidenz-Analyse besteht in der Möglichkeit, auch Systeme untersuchen zu können, in denen Partikel auftreten, deren Molekulargewicht sich um weniger als den Faktor 2 unterscheidet. Untersucht man solche Systeme z. B. mit der Fluoreszenz- Korrelationsanalyse, in welcher die Diffusionszeiten bestimmt werden, so führt dies zu Problemen in der Eindeutigkeit der Unterscheidung. Im erfindungsgemäßen Verfahren durch die Bestimmung der Koinzidenz zwischen Zeitspuren von spektral getrennten Detektoren ist hingegen eine eindeutige Unterscheidung möglich.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Koinzidenz auch durch Bestimmung der Amplitude G(0) der Kreuzkorrelationsfunktion erfolgen. Die Amplitude G(0) reicht aus, Aussagen über die Konzentration des zu untersuchenden Moleküls machen zu können und so, wie z. B. in dem Ausführungsbeispiel 1 und in Figur 5 dargestellt, die Aktivität einer Restriktionsen- donuklease zu bestimmen.
Die Koinzidenzanalyse kann in einer weiteren Ausführungsform auch durch ein logisches UND bzw. Multiplikationsglied auf Hardwareebene realisiert werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich darüber hinaus auch die Substratkonzentration bis in den subpikomolaren Bereich verringern.
Figur 1 zeigt typische Kreuzkorrelationskurven, die von Proben mit bzw. ohne Restriktionsendonukleaseaktivität bei verschiedenen Analysezeiten erhalten wurden.
Figμr 2 zeigt die Mittelwerte der jeweiligen einzelnen Rreuzkorrelationspunkte und ihre Standardabweichungen, die von Proben mit bzw. ohne Restriktionsendo- nukleaseaktivität erhalten wurden.
Die in Figur 3 dargestellten Histogramme zeigen die Verteilungen der evaluierten Kreuzkorrelationsamplituden G(0), die von Proben mit bzw. ohne Restriktionsendo- nukleaseaktivität unter Verwendung von Lochblenden unterschiedlichen Durchmessers erhalten wurden.
Figur 4 verdeutlicht den Einfluß der Substratkonzentration auf den Überlapp zwischen den Verteilungsfunktionen von Proben mit und ohne enzymatische Aktivität.
Figur 5 zeigt die Applikation des erfindungsgemäßen Verfahrens für ein simuliertes Hochdurchsatzscreening .auf Restriktionsendonukleaseaktivität unter Bestimmung des Parameters G(0). Figur 6 verdeutlicht eine bevorzugte Ausführungsform des optischen Aufbaus unter Verwendung eines Zweifarben-Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektrometers .
Fig. 7 zeigt wie durch das erfindungsgemäße Verfahren die Meßzeiten deutlich verringert werden können.
Fig. 8 zeigt den Einfluß der Meßzeit auf den Überlapp zwischen den Verteilungsfunktionen von Proben mit und ohne enzymatische Aktivität.
Fig. 9 zeigt schematisch ein Meßprinzip.
Fig. 10 zeigt die Bedeutung der zeitlichen Breite der Zeitkanäle und der Frequenz der periodischen Relativbewegung für die Koinzidenzanalyse.
Fig. 11 verdeutlicht eine bevorzugte Ausführungsform des optischen Aufbaus mit einer Vorrichtung zur Bewegung der Probe in Form einer Beaufschlagung mit Schwingungen
Figur 1 zeigt typische Kreuzkorrelationskurven, die von Proben mit bzw. ohne Restriktionsendonukleaseaktivität bei verschiedenen Analysezeiten erhalten wurden. Die Assays wurden unter Verwendung von 10 nM markiertem DNA-Substrat, welches für 3 Stunden bei 37 °C mit 0.25 U/μl EcoRI (untere dünne Linien) bzw. ohne Zusatz von Enzym (obere Linien in Fettdruck) inkubiert wurde, durchgeführt. Die Korrelationszeiten betrugen 760 ms (gepunktete Linien) und 120 s (durchgezogene Linien). Die verwendete Lochblende wies einen Durchmesser von 30 μm auf. Die Anregungsintensitäten betrugen 19 kW/cm2 (488 nm) bzw. 15 kW/cm2 (633 nm). Die bei kurzen Analysezeiten erhaltene Kreuzkorrelationskurve ist verrauschter als die bei langen Analysezeiten erhaltene Kreuzkorrelationskurve. Dennoch stimmen die charakteristischen Diffüsionszeiten und Partikelzahlen hinreichend überein, um die Aussage zu erlauben, daß die erhaltenen Kurven dieselbe Information enthalten.
Figur 2 zeigt die Mittelwerte der jeweiligen einzelnen Kreuzkorrelations werte τ und ihre Standardabweichungen, die von Proben mit bzw. ohne Restriktionsendo- nukleaseaktivität erhalten wurden. Die Assays wurden unter Verwendung von 1 nM markiertem DNA-Substrat, welches für 3 Stunden bei 37 °C mit 0.25 U/μl EcoRI (untere dünne Linie) bzw. mit 0.25 U/μl Hindlll (obere Linie in Fettdruck) inkubiert wurde, durchgeführt. Die Korrelationszeiten betrugen 1.6 s. Die verwendete Lochblende wies einen Durchmesser von 30 μm auf. Die Anregungsintensitäten betrugen 38 kW/cm2 (488 nm) bzw. 31 kW/cm2 (633 nm). Es zeigt sich, daß die Standardabweichungen bei τ- Werten unterhalb von 0.01 ms drastisch erhöht sind.
Die in Figur 3 dargestellten Histogramme zeigen die Verteilungen der evaluierten Kreuzkorrelationsamplituden G(0), die von Proben mit bzw. ohne Restriktionsendo- nukleaseaktivität unter Verwendung von Lochblenden unterschiedlichen Durchmessers erhalten wurden. Die Balken bezeichnen die Anzahl der G(0)-Werte, die in einer Binweite von 0.0015 (30 μm), 0.0026 (10 μm) bzw. 0.00062 (60 μm) liegen. Der Hauptteil der Abbildung zeigt die Verteilungsfunktionen von Proben mit (gepunktete Balken) bzw. ohne (durchgezogene Balken) enzymatische Aktivität bei optimalem Lochblendendurchmesser (30 μm); der Überlapp zwischen den Gauß- kurven beträgt hier 0.6 %. Er beträgt 2.4% bei einem Lochblendendurchmesser von 10 μm bzw. 3.4 % bei einem Lochblendendurchmesser von 60 μm. Die Assays wurden unter Verwendung von lOnM gelabeltem DNA-Substrat durchgeführt, welches für 3 Stunden bei 37 °C mit 0.25 U/μl EcoRI (gepunktete Balken) bzw. mit 0.25 U/μl Hindlll (durchgezogene Balken) inkubiert wurde. Die Korrelationszeiten betrugen 1.6 s. Die Anregungsintensitäten betrugen 38 kW/cm2 (488 nm) bzw. 31 kW/cm2 (633 nm). Der ermittelte optimale Lochblendendurchmesser reflektiert offenbar den Kompromiß zwischen der Zunahme der Detektionseffizienz mit zunehmendem Lochblendendurchmesser (bedingt durch eine erhöhte Aufenthaltsdauer der Fluorophore im Fokus) und der Abnahme des Signal-Rausch- Verhältnisses mit zunehmendem Lochblendendurchmesser (bedingt durch einen erhöhten Fluoreszenzuntergrund).
Figur 4 verdeutlicht den Einfluß der Substratkonzentration auf den Überlapp zwischen den Verteilungsfunktionen von Proben mit und ohne enzymatische Aktivität. Die Assays wurden wie in der Legende zu Figur 3 beschrieben unter Verwendung eines Lochblendendurchmessers von 30 μm durchgeführt. Die Separation der Verteilungsfunktionen erhöhte sich mit zunehmender Konzentration.
Figur 5 zeigt die Applikation des erfindungsgemäßen Verfahrens für ein simuliertes Hochdurchsatzscreenmg auf Restriktionsendonukleaseaktivität. Die Proben wurden zyklisch gescreent (insgesamt 500 Messungen). Der linke Teil der Figur 5 zeigt die Verteilungsfunktionen von Proben mit (BamHI, offene Balken) und ohne (Hindlll, schwarze Balken) spezifische Endonukleaseaktivität bei Analysedauern von 760 ms (la), 1.6 s (2a), 3.6 s (3a) und 7.6 s (4a). Die Verteilungsfunktionen der Kreuzkorrelationsamplituden G(0) wurden wie in der Legende zu Figur 3 beschrieben evaluiert. Die Binweite betrug 0.0015. Der rechte Teil der Figur 5 verdeutlicht die Separationseffizienz des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels Gauß-Fitting bei reinem Substrat (durchgezogene Linie), Hindlll (durchgezogene Linie in Fettdruck), BamHI (gepunktete Linie in Fettdruck), EcoRI (gepunktete Linie) und Sspl (gestrichelte Linie). Der Überlapp betrug 2.6 - 5.4 % (760 ms), 0.1 % (1.6 s), < 0.002 % (3.6 s) bzw. « 10"5 % (7.6 s). Die Assays wurden in einem Volumen von 5 μl unter Verwendung von 10 nM gelabeltem DNA- Substrat durchgeführt, welches für 3 Stunden bei 37 °C mit 0.25 U/μl Hindlll, 0.1 U/μl BamHI, 0.25 U/μl EcoRI, 0.08 U/μl Sspl bzw. ohne Zugabe von Enzym inkubiert wurde. Die Anregungsinten- sitäten betrugen 19 kW/cm2 (488 nm) und 15 kW/cm2 (633 nm). Der Lochblendendurchmesser betrug 30 μm. Es zeigt sich, daß mit zunehmender Analysezeit die Verteilungsfunktionen schmaler wurden und somit die Mittelwerte klar zu separieren sind.
Figur 6 zeigt den optischen Aufbau eines Zweifarben-Fluoreszenzkreuzkorrela- tionsspektrometers. Zwei parallele Laserstrahlen eines Argon-Ionen-Lasers (488 nm) und eines Helium-Neon-Lasers (633 nm) passieren ein Wasserimmersionsobjektiv (40x, N.A. = 1.2) in einem Epi-Illuminationsaufbau, so daß die zwei übereinandergelagerten Foci in der Probe ein konfokales Meßvolumenelement in der Größenordnung von Femtolitern bilden. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird durch das Mikroskopobjektiv gesammelt, mittels dichroitischem Spiegel vom Anregungs-strahlengang separiert und mittels einer Linse auf eine Lochblende fokussiert. Die Lochblende variablen Durchmessers ist in der Bildebene der Linse angeordnet und kann in x-, y- und z-Richtung justiert werden. Die Fluoreszenzemission wird parallelisiert, durch einen dichroitischen Spiegel in eine grüne und rote Fraktion separiert und auf zwei Avalanche-Photodioden refokussiert.
In Figur 7 wurde eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens eingeführt, welche zu einer gesteuerten Bewegung der Probe bei stationärer Optik in Form einer Beaufschlagung von Schwingungen verwendet wurde. Hierzu wurde der Probenträger an einen piezoelektrischen Positioniertisch montiert und entsprechend oszilliert. Es wurden Proben eingesetzt, die 10 nM doppelsträngiges DNA-Substrat enthielten und denen ferner in einer Ausführungsform Restriktionsendonuklease EcoRI zugesetzt wurde oder in einer anderen Ausführungsform kein solches Enzym zugesetzt wurde. Der obere Teil der Abbildung zeigt, daß bei einer Analysenzeit von 50 ms (je 3900 Messungen, Frequenzen 75 Hz(x) und 49 Hz(y)) ein Überlapp zwischen Signalen der beiden verschiedenen Probentypen von ca. 3 % erzielt werden konnte. Im unteren Teil der Abbildung zeigt sich, daß bei einer Analysenzeit von 100 ms (je 1800 Messungen, Frequenzen 75 Hz(x) und 49 Hz(y)) ein Überlapp von sogar nur 0.4% erzielt werden konnte. Somit ist deutlich gezeigt, daß unter Anwendung einer erzwungenen Bewegung der fluoreszierenden Partikel eine Verkürzung der Meßzeit und eine erhöhte Datengenauigkeit erreicht werden kann.
In Figur 8 sind Histogramme aus jeweils 300 Messungen des Koinzidenzwertes für Proben aus reinem Substrat (10 nM zweifach markierte Doppelstrang-DNA, schwarze Balken) und bereits durch Restriktionsendonuklease geschnittene Probe (10 nM zweifach markierte Doppelstrang-DNA, gepunktete Balken) bei einer Oszillationsfrequenz von 216 Hz dargestellt. Die Abbildungen A-D zeigen verschiedene Analysenzeiten. Die Verteilungen wurden durch eine Gaußfünktion angefittet. Zur Bestimmung des Meßfehlers wurden die Standardabweichungen und der Überlapp der Fitftmktionen bestimmt.
Figur 9 illustriert schematisch ein Meßprinzip. In der linken Spalte diffundieren unterschiedliche Farbstoffe unabhängig durch die Probenlösung. Das jeweilige Auftreten eines Farbstoffes im Meßvolumen ist daher unabhängig von dem Verhalten des anderen Farbstoffs, und die Photonenereignisse in einer Zeitspur sind statistischer Natur und vollkommen unabhängig von den Photonenereignissen, die in der anderen Zeitspur aufgenommen werden. Der Koinzidenzwert in solch einem Falle ist genau K=l. In der rechten Spalte sind beide Farbstoffe aneinander gebunden und diffundieren nun gemeinsam durch die Probenlösung. Tritt der Komplex im Meßvolumen auf, so werden in den beiden Meßspuren zeitgleich (d.h. im selben Zeitkanal m) Photonenereignisse registriert. Diese Abhängigkeit der Signale aus den unabhängigen, spektral getrennten Detektoren führt zu einer Häufung von Koinzidenzen (d.h. zeitgleich registrierten Photonen), welche über das statistische Maß voneinander unabhängiger Signale hinausgeht. Der Koinzidenzwert in solch einem Falle beträgt K>1. Je höher der Anteil von miteinander verbundenen verschiedenen Farbstoffen ist, desto mehr unterscheidet sich K von 1. In Figur 10 ist die Detektionssicherheit in Abhängigkeit von der zeitlichen Breite der Zeitkanäle (a) und der periodischen Relativbewegung (b), welcher Proben- und Meßvolumen unterworfen werden, dargestellt. Um geeignete Wertebereiche dieser Parameter zu bestimmen, wurde eine Testprobe verwendet (10 nM, mit den Farbstoffen Rhodamine Green und Cy-5 zweifach markierte dsDNA) und für verschiedene Wertekombinationen je 300 unabhängige Messungen mit einer Meßzeit von je 500 ms durchgeführt. Als Maß für die Detektionssicherheit eine Probe mit zweifach markierten Molekülen richtig zu charakterisieren, wurde die relative Standardabweichung σ/Δxc aus der angepaßten Gaußverteilung abgeleitet. Sie gibt das Verhältnis aus der Standardabweichung σ und dem Abstand Δxc zwischen dem Verteilungszentrum (xc) und dem Zentrum, welches eine Verteilung besitzen würde, die eine Meßprobe ohne jegliche zweifach markierte Moleküle beschreibt (xc 0=l) an. Kleines σ/Δxc bedeutet hierbei einen kleinen Überlapp zwischen einer „positiven,, Verteilung und einer „negativen,, Verteilung und somit eine erhöhte Detektionssicherheit. In Abbildung 10 (a) ist σ/Δxc für unterschiedliche zeitliche Breiten der Zeitkanäle aufgetragen. Ein Plateau minimaler relativer Standardabweichung bildet sich bei mittleren Werten der Zeitkanalbreite. Bei Zeitkanalbreiten, die im Bereich der Triplettzustands-Lebensdauer der Farbstoffmoleküle liegen (< 5 μs), steigt σ/Δxc an. Ebenso steigt σ/Δx<- an, wenn die Zeitkanalbreite in den Bereich der mittleren Durchtrittszeit der Moleküle durch das Meßvolumen kommt. Allerdings kann bei Erhöhung der Frequenz der Relativbewegung diese obere Grenze an Zeitkanalbreiten herabgesetzt werden. Abb. 10b zeigt die Abhängigkeit der relativen Standardabweichung σ/Δxc von der Frequenz der Relativbewegung zwischen Probenvolumen und Meßvolumen. (Es ist immer die y-Frequenz angegeben. Ist diese nicht Null, geht sie immer mit einer Frequenz von 3 Hz in x-Richtung einher) Es sind Kurven für verschiedene Meßzeiten aufgetragen, die Kanalbreite betrug 12.5 μs. Bei einer nur geringen Frequenz der Relativbewegung ist schon ein sehr starker Abfall der relativen Standardabweichung zu sehen. Der Kurvenverlauf zeigt eine moderate Verkleinerung von σ/Δxc bei zunehmender Frequenz. Im Bereich von 3-246 Hz wird σ/Δxc nochmals um etwa einen Faktor 2 verringert, wobei bei der Anlegung von noch höheren Frequenzen noch weitere Verbesserungen zu erwarten sind. Die relativen Standardabweichungen nehmen mit zunehmender Meßzeit ab.
Figur 11 zeigt den optischen Aufbau eines Zweifarben-Fluoreszenzkreuzkorrela- tionsspektrometers mit einer Vorrichtung zur Bewegung der Probe in Form einer Beaufschlagung mit Schwingungen. Parallele Laserstrahlen eines Krypton-Ionen- Lasers mit den Wellenlängen 476/483nm und 647nm passieren ein Wasserimmersionsobjektiv (60x, N.A. = 1.2) in einem Epi-Illuminationsaufbau. Der Probenhalter ist mit einem zweidimensional beweglichen Piezostellelement verbunden, welches wiederum auf einem mechanischen Hochpräzisions-x-y- Verschiebetisch montiert ist. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird durch das Mikroskopobjektiv gesammelt, mittels dichroitischem Spiegel vom Anregungsstrahlengang separiert und mittels einer Linse auf eine Lochblende fokussiert. Die Lochblende variablen Durchmessers ist in der Bildebene der Linse angeordnet und kann in x-, y- und z-Richtung justiert werden. Die Fluoreszenzemission wird parallelisiert, durch einen dichroitischen Spiegel in eine grüne und rote Fraktion separiert und auf zwei Avalanche- Photodioden refokussiert.
Ausführungsbeispiel 1
Verwendete Materialien:
Typ II Restriktionsendonukleasen (E.C. 3.1.21.4) EcoRI (25 U/μl), BamHI (10 U/μ 1), Sspl (8 U/μl) und Hindlll (25 U/μl) wurden von der Fa. Stratagene (La Jolla, CA) erworben; die Enzymaktivitäten sind in Klammern angegeben. Fluoreszenzmarkierte 66 nt Oligonukleotide Cy5- ATGGCTAATGACCGAGAATAGGGATCCGAA
TTCAA ATTGGTACCTACGGGCTTTGCGCTCGTATC und RhG-
GATACGAGCGCAAAGCCCGTAGGTACCAATATTGAATTCGGATCCCTAT TCTCGGTCATTAGCCAT wurden durch die Fa. MWG-Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und HPLC-gereinigt; das erste Oligonukleotid weist am 5'-Terminus als Fluoreszenzmarker Cy5 (Amersham, UK) auf, während das zweite Oligonukleotid mit Rhodamine Green RhG (Molecular Probes) gelabelt ist. Bei Hybridisierung der beiden komplementären Stränge ergeben sich Erkennungsstellen für BamHI (einfach unterstrichen), EcoRI (doppelt unterstrichen) und Sspl (gepunktet).. Die Hybridisierung der komplementären Stränge erfolgte bei Konzentrationen von 1 μM in 100 mM KOAc, 25 mM Tris-Acetat, pH 7.6, 10 mM MgOAc, 0.5 mM ß-Mercaptoethanol, 10 μg/ml BSA unter Erhitzen der Lösung auf 94 °C und anschließendes Abkühlen auf 23 °C mit einem Temperaturgradienten von 1.2 °C/min. Als Resultat entstand ein zweifach-markierter DNA-Doppelstrang mit Erkennungsstellen für BamHI, EcoRI und Sspl.
Homogener Restriktionsendonuklease- Assay:
Endonuklease- Assays wurden für 3 Stunden bei 37 °C durchgeführt. Der Reaktionspuffer enthielt 150 mM KOAc, 37.5 mM Tris-Acetat, pH 7.6, 15 mM MgOAc, 0.75 mM ß-Mercaptoethanol, 515 μg/ml BSA, 0.05 % Triton X-100, 0.5 % Gly- cerol, 1 - 20 nM gelabeltes DNA-Substrat und überschüssige Anteile (0.08 - 0.25 U/ μl) an Restriktionsenzymen BamHI, EcoRI, Sspl und Hindlll. Optischer Aufbau:
Die Messungen erfolgten unter Verwendung eines Zweifarben-Fluoreszenzkreuz- korrelationsspektrometers (Dual-color ConfoCor, C. Zeiss, Oberkochen, Deutschland). Das konfokale Meßvolumen von 0.44 fl wurde durch Überlagerung der Foci eines Argon-Ionen-Lasers (488 nm) und eines Helium-Neon-Lasers (633 nm) gebildet. Die Fluoreszenzemissionssignale wurden separat unter Verwendung von zwei Avalanche-Photodioden detektiert; im Emissionsstrahlengang befand sich eine konfokal angeordnete Lochblende. Das Spektrometer war mit einem Thermostaten ausgestattet. Der Fokus wurde 100 μm über dem Boden des jeweiligen Probengefäßes positioniert. Die Meßtemperatur betrug 22 °C. Die Proben wurden in Probenträgern im Mikrotiterplattenformat vorgelegt. Hierbei handelte es sich entweder um kontaminationsfrei verschlossene Plastikfolien (Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie) oder um kommerzielle Deckglaskammern (Nunc, Dänemark).
Kreuzkorrelationsanalvse:
Der theoretische Hintergrund der Kreuzkorrelationsanalyse wurde detailliert von Schwüle et al. (Biophys. J. 72, 1878 - 1886, 1997) beschrieben. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Publikation wird Bezug genommen. Die Daten der Kreuzkorrelation wurden unter Verwendung eines dreidimensionalen Modells für einzelne diffundierende Partikel evaluiert (Rigler und Widengren, Bioscience 3, 180 - 183, 1990):
G(0) bezeichnet die Korrelationsamplitude bei τ = 0, welche proportional zur Konzentration zweifach-gelabelter Moleküle im zylindrischen Meßvolumen des Radius r0und der halben Länge z0 ist. Der Parameter τ Diff steht gemäß der Gleichung τ Dif = r0 2/4D in einem umgekehrt proportionalen Zusammenhang zum Diffusionskoeffizienten D. Die experimentellen Daten wurden unter Anwendung des Access 2.0 Programms der Fa. EVOTEC BioSystems GmbH mittels nicht-linearem Least- square Marquardt-Fit prozessiert. G(0) war der einzige freie Parameter bei der Evaluierung der Kreuzkorrelationsmessungen. Der Struktur-parameter z0/r0 wurde mittels Autokorrelationsmessungen an freier Farbstofflösung ermittelt; die durchschnittliche Diffusionszeit τDiff des Substrates wurde mittels einer 60 s Messung ohne Zusatz von Enzym bestimmt. Beide Parameter wurden im Fitting der Kreuzkorrelationsdaten vorgegeben.
Statistische Evaluierung:
Ein typisches Set Kreuzkorrelationsmessungen enthielt 100 Kurven, welche unter Verwendung von Akkumulationszeiten zwischen 760 ms und wenigen Sekunden aufgenommen wurden. Aus jedem Set wurde die Amplitude G(0), welche mittels Fitting erhalten wurde, in einem Histogramm aufgetragen (Details siehe Figur 3). Die Analyse ergab, daß die G(0)-Verteilungsfünktionen mittels Gauß-Funktion approximiert werden können. Die Mittelwerte der Gauß-Funktionen korrespondieren mit den durchschnittlichen Konzentrationen der Fluorophore, während die Standabweichungen die Streuung der einzelnen Messungen widerspiegeln. Um ein Maß für die Unterscheidbarkeit der Verteilungsfunktionen zu erhalten, wurde die Überlappungsfläche der gelitteten Gauß-Funktionen durch Integration der Gauß- Funktionen ermittelt. Die Überlappungsflächen wurden standardisiert, so daß ein 100 % Überlapp Gauß-Funktionen mit identischem Mittelwert und identischer Standardabweichung entspricht. Ausführungsbeispiel 2
Verwendete Materialien:
Die verwendeten Materialien und Versuchsbedingungenen entsprachen im wesentliche in dem Ausführungsbeispiel 1 angegebenen. Allerdings wurde hier als Restriktionsendonuklease nur EcoRI verwendet.
Homogener Restriktionsendonuklease- Assay:
Die Endonuklease-Assays wurden für EcoRI gemäß Ausführungsbeispiel 1 durchgeführt. Als Referenz wurde eine Probe, der keine Restriktionsendonuklease zugesetzt wurde, verwendet.
Optischer Aufbau
Der Experimentelle Aufbau ist in Abbildung 11 dargestellt. Fluoreszenzanregung erfolgte durch Epi-illumination eines Wasserimmersionsobjektives (UPLAPO 60x/1.2W;Olympus, Japan) mit den Wellenlängen 476/483 nm und 647 nm eines Krypton-Ionen-Lasers (INNOVA 90-K; Coherent, Palo Alto, USA), der im Multili- nienmodus betrieben wurde. Der dichroitische Strahlteiler A (AHF) Analysentechnik, Tübingen) reflektiert bei <502 nm und 585-655 nm und transmittiert bei 502- 585 und >655nm. Zusätzliche Laserliniern ber 531 nm und 568 nm werden mit einem speziell angefertigten Anregungs-/Notch-Filter (>OD 5; AHF Analysentechnik) entfernt. Angepaßte relative Laseranregungsenergien für beide Wellenlängen erhält man durch die Kombination eines Farbglas-Absorptionsfilters (BG 40, Andover Corporation, Salem, USA) und eines Abschwächungsfilters (OD 0.6; Spindler &Hoyer, Göttingen). Die Proben wurden in kommerziellen Deckglaskammern vorgelegt (Nunc, Dänemark). Der Probenhalter ist mit einem zweidimensional beweglichen Piezostellelement (Piezosystem Jena) verbunden, welches wiederum auf einem mechanischen Hochpräzisions-x-y- Verschiebetisch (Märzhäuser, Wetzlar) montiert ist. Die Fluoreszenzphotonen werden am dichroitischen Strahlteiler B spektral separiert (585DCLP02;Omega Optical, Brattleboro, USA) und nach optischer Filterung im roten (667EFLP;Omega) und grünen Kanal (535RDF45;Omega), auf zwei Avalanche-Photodioden (APD) abgebildet (SPCM- AQ 131-FS; EG&G Optoelectronics, Kanada). Die digitalen Pulse der APDs werden entweder von einer Dual input Multiscaler PC-Karte (MCD-, FAST Com- Tec, München) für die Analyse von Zeitspuren mit hoher zeitlicher Auflösung oder von einer on-board- Prozessor PC-Karte (Adwin-)LD; Jäger Meßtechnik, Lorsch), welche für eine Online-Datenverarbeitung programmiert werden kann,' aufgenommen.
Koinzidenzanalyse:
Zur Ermittlung der Koinzidenz wurden die Photonenzählsignale der beiden Detektoren von einer Meßkarte simultan aufgenommen und simultan mit einer wählbaren Zeitkanalbreite gerastert. Von den so erhaltenen zwei Zeitspuren wurden nun jeweils zeitgleiche Kanäle miteinander multipliziert, dann die Summe über alle Produkte gebildet, und für eine Normierung durch beide Zeitspur-(Einzel)summen geteilt und mit der Zeitkanal-Gesamtzahl multipliziert:
∑ Nx(m)N2(m)
K(n) = m •n
∑N,(m)∑N2(™)
wobei m den Index des jeweiligen Zeitkanals (nach aufsteigender Zeit geordnet), n die Gesamtzahl der in einer Zeitspur enthaltenen Zeitkanäle, N^m) die Anzahl der Photonenzählereignisse in Zeitspur 1 in Zeitkanal m und N2(m) die Anzahl der Photonenzählereignisse in Zeitspur 2 in Zeitkanal m angibt. Auswertung
Der erhaltene Wert K ist das Bewertungsmaß für die betrachtete Probe. Es wird lediglich die Anzahl der koinzidenten Ereignisse bewertet. Für total voneinander unabhängige Signale ist K wegen der Normierung 1. Treten Photonensignale in beiden Zeitspuren über das Zufallsmaß hinausgehend gehäuft zeitgleich auf, ist K > 1. Je höher K über 1 liegt, desto mehr Koinzidenzen, d.h. zeitgleich registrierte Photonen, in den beiden Zeitspuren treten auf. Letzteres ist ein Maß für denjenigen Anteil der Moleküle, an welche beide Farbstoffspezies gebunden sind.
Statistische Auswertung
Es wurde ebenfalls eine Statistik über die Koinzidenzwerte aufgestellt. Die in je 300 Messungen von Proben aus reinem Substrat und je 300 Messungen von bereits durch Restriktionsendonuklease geschnittenen Proben bei einer Oszillationsfrequenz von 216 Hz und unterschiedlichen Analysezeiten ermittelten Koinzidenzwerte wurden in einem Histrogramm aufgetragen (siehe Figur 8). Die Analyse ergab, daß die Koinzidenzwerte durch eine Gauß-Funktion approximiert werden können. Die Mittelwerte der Gaußfunktion verringert um 1 korrespondieren mit den durchschnittlichen Konzentrationen an zweifach gelabeltem Substrat, während die Standardabweichungen die Streuung der einzelnen Messungen widerspiegeln. Um ein Maß für die Unterscheidbarkeit der Verteilungsfunktionen zu erhalten, wurde die Überlappungsfläche der gefitteten Gauß-Funktionen durch Integration der Gauß- Funktionen ermittelt. Die Überlappungsflächen wurden standardisiert, so daß ein 100 % Überlapp Gauß-Funktionen mit identischem Mittelwert und identischer Standardabweichung entspricht.

Claims

A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zum Nachweis von Assoziations,- Dissoziations,- Verknüpfungs- oder Spaltreaktionen sowie Konformationsänderungen von Analyten in einer Probe mittels Koinzidenzanalyse, wobei
- die Probe mindestens zwei mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierte Analyte und/oder mindestens einen mit mindestens zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Analyten enthält,
- die Probe zur Anregung der Fluoreszenzemission der mindestens zwei Farbstoffe von mindestens einem Laser beleuchtet wird,
- die von der Probe ausgehenden, aus mindestens einem Meßvolumenelement V stammenden Fluoreszenzsignale mittels mindestens zweier Detektionseinheiten detektiert werden,
- die jeweils in den Detektionseinheiten detektierten Signale oder hiervon abgeleitete Zeitspuren in beliebige, im wesentlichen jedoch simultane, Zeitabschnitte mit frei wählbaren Zeitkanalbreiten zerlegt werden,
- die Anzahl der in mindestens einem Zeitabschnitt enthaltenen Signale und/oder die Zeitintervalle zwischen Signalen in den Zeitabschnitten ermittelt werden,
- für mindestens einen Zeitabschnitt der ersten Detektionseinheit eine Koinzidenzanalyse der ermittelten Daten mit mindestens einem im wesentlichen zeitgleichen Zeitabschnitt der zweiten Detektionseinheit durchgeführt wird
- mindestens eine Statistik der Resultate der Koinzidenzanalyse erstellt wird, und/oder die Resultate einer Schwellwertanalyse unterzogen werden,
- diese oder mindestens eine Kombination mehrerer Statistiken nach dem Vorhandensein von Merkmalen, welche für eine Assoziations,- Dissoziations,- Verknüpfungs- oder Spaltreaktion oder Konformationsänderungen charakteristisch sind, bewertet wird.
2. Verfahren nach mindestens einem der Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeitkanalbreiten größer als die längste Fluoreszenzlebensdauer der mindestens zwei Farbstoffe sind.
3. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeitkanalbreiten kleiner als die Durchtrittszeit des mindestens einen Probenmoleküls durch das Meßvolumen sind.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektionseinheiten unterschiedliche spektrale Detektionsempfindlich- keiten aufweisen.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Meßvolumenelement V < 10"1 1 ist.
6. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe von mindestens einem Laser beleuchtet wird, der elektromagnetische Strahlung mindestens einer Wellenlänge emittiert, die geeignet ist, die mindestens 3zwei Farbstoffe anzuregen.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Koinzidenzanalyse online durchgeführt wird.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeit zur Durchführung der jeweiligen Messung während der Messung individuell angepaßt wird.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß im Rahmen der Koinzidenzanalyse die Koinzidenz durch die Amplitude G(0) der Kreuzkorrelation ermittelt wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß im Rahmen der Koinzidenzanalyse die Koinzidenz durch logische UND- Verknüpfung ermittelt wird.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Koinzidenz durch Multiplikation gemäß nachfolgender Formel ermittelt wird:
Figure imgf000031_0001
J »>
wobei N(mj) die Anzahl Photonen im Zeitabschnitt m des Detektors j, i die Gesamtzahl der verwendeten Detektionseinheiten und n die Anzahl der Zeitabschnitte innerhalb der Zeitspur bezeichnet.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß Probenvolumen und Meßvolumen relativ zu einander bewegt werden.
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß Systeme untersucht werden, in denen Partikel auftreten, deren Molekulargewicht sich um weniger als den Faktor 2 unterscheidet.
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