OPTISCHE ANORDNUNG MIT SPEKTRAL SELEKTIVEM ELEMENT
Die Erfindung betrifft eine optische Anordnung im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, vorzugsweise im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, mit mindestens einem spektral selektiven Element zum Einkoppeln des Anregungslichts mindestens einer Lichtquelle in das Mikroskop und zum Ausblenden des am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslichts bzw. der Anregungswellenlange aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Licht.
Sowohl bei der konventionellen wie auch bei der konfokalen Laser-Scanning- Mikroskopie werden in den Strahlengang einer für Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle Farbstrahlteiler mit einer ganz besonderen Transmissions- und Reflexionscharakteristik verwendet. Dabei handelt es sich ganz überwiegend um dichroitische Strahlteiler. Mit einem solchen Element wird die Fluoreszenzanregungswellenlänge λ,jM (bzw. λlN2 , λ,n3 ... , λ.llln bei der Verwendung von mehreren Lasern) in den Beleuchtungsstrahlengang reflektiert, um die Fluoreszenzverteilung im Objekt anzuregen und dann zusammen mit dem am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslicht den Strahlengang bis hin zum Farbstrahlteiler zu durchlaufen. Das Anregungslicht mit den Wellenlängen λlN1 , λlN2 , λ,n3 , .... , λ,nn wird am Farbstrahlteiler zurück in den Laser reflektiert, nämlich aus dem Detektionsstrahlengang heraus. Das
Fluoreszenzlicht mit den Wellenlängen λf|Uθ1 , -λ,uo2 , λfluo3 ,... , λf,uon passiert den Farbstrahlteiler und wird - gegebenenfalls nach weiterer spektraler Aufteilung - detektiert.
Farbstrahlteiler sind üblicherweise durch ein Interferenzfilter realisiert und werden je nach den verwendeten Wellenlängen für die Anregung bzw. für die Detektion gezielt bedampft. An dieser Stelle sei angemerkt, daß gemäß voranstehender Beschreibung des Standes der Technik unter einem Dichroit ein Wellenlängen-separierbares Element verstanden wird, welches das Licht unterschiedlicher Wellenlänge aufgrund der Wellenlänge und nicht aufgrund der Polarisation trennt.
In der Praxis ist die Verwendung von Farbstrahlteilern zunächst einmal insoweit nachteilig, als es sich hierbei um in der Herstellung aufwendige und daher teure optische Bausteine handelt Des weiteren ist nachteilig, daß Farbstrahlteiler eine feste Wellenlangencharakteπstik aufweisen und daher nicht mit beliebiger
Flexibilität hinsichtlich der Wellenlange des Anregungslichts verwendet werden können Bei einem Wechsel der Wellenlange des Anregungslichts müssen auch die Farbstrahlteiler ausgewechselt werden, so beispielsweise bei einer Anordnung mehrerer Farbstrahlteiler in einem Filterrad Dies ist abermals aufwendig und daher teuer und erfordert im übrigen eine ganz besondere Justage der einzelnen Farbstrahlteiler
Die Verwendung eines Farbstrahlteilers bringt den weiteren Nachteil mit sich, daß durch Reflexion bedingte Lichtverluste auftreten, insbesondere Lichtverluste von Fluoreszenzhcht, welches gerade detektiert werden soll Der spektrale Transmιssιons-/Reflexιonsbereιch ist bei Farbstrahlteilern recht breit (λ,n ± 20 nm) und keineswegs ideal „steil" Folglich laßt sich das Fluoreszenzhcht aus diesem spektralen Bereich nicht ideal detektieren
Bei Verwendung von Farbstrahlteilern ist die Anzahl der gleichzeitig einkoppelbaren Laser begrenzt, nämlich beispielsweise auf die Anzahl der in einem Filterrad angeordneten und kombinierbaren Farbstrahlteiler
Üblicherweise werden maximal drei Laser in den Strahlengang eingekoppelt Wie bereits zuvor ausgeführt, müssen sämtliche Farbstrahlteiler, also auch die in einem Filterrad angeordneten Farbstrahlteiler, exakt justiert werden, was einen ganz erheblichen Aufwand in der Handhabung mit sich bringt Alternativ können geeignete Neutralstrahlteiler eingesetzt werden, die das
Fluoreszenzhcht gemeinsam mit dem am Objekt gestreuten/reflektierten Anregungshcht effizient zum Detektor leiten Die Verluste bei der Lasereinkopplung sind dabei jedoch erheblich
Zur Dokumentation des Standes der Technik wird lediglich beispielhaft auf die DE 196 27 568 A1 verwiesen, die eine optische Anordnung zur konfokalen
Mikroskopie zeigt Dabei handelt es sich im Konkreten um eine Anordnung zur zeitgleichen konfokalen Beleuchtung einer Objektebene mit einer Vielzahl
geeignet divergierender Leuchtpunkte sowie zugehörigen Abbildungsghedem und einer Vielzahl von Pinholes zur konfokalen kontrastreichen Abbildung in einem Beobachtungsgerat, wobei es sich dabei um ein Mikroskop handeln kann Die Einkopplung mehrerer Lichtquellen erfolgt dort über ein diffraktives Element Mehrere optische Tellerelemente bzw Farbstrahlteiler sind im Detektionsstrahlengang angeordnet, wodurch sich ein ganz erheblicher apparativer Aufwand ergibt
Hinsichtlich der Verwendung aktiver optischer Elemente im Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskops wird ergänzend auf die US 4,827, 125 und die US 5,410,371 verwiesen, wobei diese Druckschriften die grundsätzliche Verwendung eines AOD (Acousto-Optical-Deflector) und eines AOTF (Acousto- Optical-Tunable-Filter) zeigen, und zwar stets mit dem Zweck, einen Strahl abzulenken oder abzuschwächen
Der vorliegenden Erfindung egt nun die Aufgabe zugrunde, eine optische Anordnung im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, vorzugsweise im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning- Mikroskops, derart auszugestalten und weiterzubilden, daß das Einkoppeln des Anregungslichts unterchiedhcher Anregungswellenlange möglich ist, ohne bei einem Wechsel der Wellenlange des Anregungslichts einen Wechsel oder eine besondere Justage der dort verwendeten optischen Elemente vornehmen zu müssen Des weiteren soll die Anzahl der erforderlichen optischen Elemente weitestmog ch reduziert sein Schließlich soll eine ideale Detektion des Fluoreszenzhchts möglich sein
Die erfindungsgemaße optische Anordnung im Strahlengang einer zur
Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, vorzugsweise im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, lost die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale der nebengeordneten Patentansprüche 1 und 2 Danach ist eine gattungsgemaße optische Anordnung dadurch gekennzeichnet, daß durch
das spektral selektive Element Anregungshcht unterschiedlicher Wellenlangen ausblendbar sowie entsprechend einkoppelbar ist Alternativ ist die optische Anordnung dadurch gekennzeichnet, daß das spektral selektive Element auf die auszublendende Anregungswellenlange einstellbar ist
Erfindungsgemaß ist erkannt worden, daß man im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, insbesondere im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, den dort bislang verwendeten Farbstrahlteiler durch ein ganz besonderes spektral selektives Element ersetzen kann, namhch durch ein spektral selektives Element, welches geeignet ist, Anregungshcht unterschiedlicher Wellenlangen auszublenden oder einzublenden bzw einzukoppeln Dieses spektral selektive Element dient einerseits zum Einkoppeln des Anregungslichts mindestens einer Lichtquelle in das Mikroskop und andererseits zum Ausblenden des am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslichts bzw der entsprechenden Anregungswellenlange aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Licht Insoweit kommt dem spektral selektiven Element eine Doppelfunktion zu, wobei beide Funktionen quasi zwangsgekoppelt sind
Alternativ zu der Fähigkeit des spektral selektiven Elements, Anregungshcht unterschiedlicher Wellenlangen ausblenden zu können, ist das spektral selektive Element auf die jeweils einzublendende oder auszublendende Anregungswellenlange einstellbar ist Auch insoweit ist aufgrund der voranstehend geschilderten Doppelfunktion eine Zwangskopplung auf einfache Weise gewährleistet, namhch dadurch, daß mit Hilfe des spektral selektiven Elements das Anregungshcht in den Beleuchtungsstrahlengang einkoppelbar und daß exakt die Wellenlange des Anregungslichts, namhch die Anregungswellenlange, aufgrund der hier vorgesehenen Einstellbarkeit aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Licht ausblendbar ist, so daß zur Detektion das vom Objekt kommende Detektionshcht (=Fluoreszenzhcht) verbleibt
In vorteilhafter Weise kann es sich bei dem spektral selektiven Element - zur Begünstigung der voranstehend erörterten Doppelfunktion - um ein passives
Element bzw. Bauteil handeln. Dazu könnte das spektral selektive Element als transparentes optisches Gitter oder als holographisches Element ausgeführt sein. Ebenso ist es denkbar, das spektral selektive Element als passiven AOD (Acousto-Optical-Deflecor) oder als passiven AOTF (Acousto-Optical-Tunable- Filter) auszuführen.
In ganz besonders vorteilhafter Weise, nämlich zur konkreten Realisierung der Einstellbarkeit des spektral selektiven Elements auf die auszublendende Anregungswellenlänge, kann es sich bei dem spektral selektiven Element um ein aktives Bauteil handeln, so bspw. um ein akustooptisch und/oder elektrooptisch arbeitendes Element. Im Konkreten kommt hier als spektral selektives Element ein AOD (Acousto-Optical-Deflector) oder ein AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) in Frage.
Anstelle des im Stand der Technik üblichen Farbstrahlteilers wird hier ein aktives spektral selektives Element verwendet, so beispielsweise ein AOD oder ein AOTF. Die Aufgabe dieser aktiven Bauteile besteht darin, das Anregungslicht der Lichtquelle bzw. des Lasers oder der Laser λlN1 , λ,n2 , λ,n3 , λlNn in den
Beleuchtsstrahlengang und somit in das Mikroskop einzukoppeln, um danach per Beam-Scanning die Fluoreszenzverteilung im Objekt anzuregen. Bei der Detektion kann das vom Objekt kommende Fluoreszenzlicht nahezu ungestört das aktive spektral selektive Element passieren. Dabei wird das vom Objekt gestreute oder reflektierte Licht mit den Anregungswellenlängen der Lichtquelle bzw. des Lasers oder der Laser aus dem Detektionsstrahlengang weitgehend herausreflektiert.
Zur Einkopplung einer Lichtquelle bzw. eines Lasers oder mehrerer Laser mit verschiedenen Wellenlängen λ,nι , λlN2 ,... , λlNn kann ein AOD mit entsprechenden Frequenzen v-i , v2 ,... , vn vorzugsweise simultan beschaltet werden, so daß die verschiedenen Laserstrahlen nach dem Durchgang durch den AOD koaxial mit der optischen Achse verlaufen. Hinsichtlich der Verwendung des AOD ist wesentlich, daß dort eine Frequenz vn eine
Wellenlänge λ,nn, selektiert, die aus dem eigentlichen Strahlengang abgelenkt wird. Der Ablenkungswinkel φ ist dabei durch die Formel
Φ = λ,||n Vn / 2f
definiert, wobei f die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Schallwelle im AOD ist. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht mit einer spektralen Verteilung um die Wellenlängen λf|U01 , λflUo2 ,... , λf|UOn zusammen mit dem am Objekt gestreuten bzw. reflektierten Anregungslicht mit den Wellenlängen λlM1 , λlN2 ,... , λlNn durchläuft nun den AOD in umgekehrter Richtung. Jedoch wird gemäß der Umkehrbarkeit des Lichtwegs das Anregungslicht mit den Wellenlängen λ,nι , λlN2 ,... , λ,nn wegen der spezifischen Einstellung des AOD aus dem Detektionsstrahlengang in Richtung des Lasers abgelenkt (1. Ordnung). Somit kann das „spektral verbleibende" Fluoreszenzlicht um die Wellenlängen λfluo1 , λflU02 ,... , λfluon - verglichen mit einem herkömmlichen Farbstrahlteiler - auf verbesserte Weise detektiert werden (0. Ordnung). Dadurch läßt sich jedenfalls die Justage der Einkopplung unterschiedlicher Laser einfacher als im Stand der Technik (dort unter Anwendung herkömmlicher Farbstrahlteiler in einem Filterrad) vornehmen.
In weiter vorteilhafter Weise könnte ein Nachschalten weiterer AOTF die einzelnen Wellenlängen in ihrer Leistung nach der Strahlzusammenführung selektiv regeln.
Zur Einkopplung einer Laserlichtquelle mit verschiedenen Wellenlängen λfjm , λfin2 ,.-. , λfjHn kann ein AOTF mit entsprechenden Frequenzen v-, , v2 vn simultan geschaltet sein, so daß die verschiedenen Wellenlängen in ihrer Anregungsleistung variieren und auf die Anwendung hin optimierbar sind. Die Zuführung des Laserlichts kann mittels Lichtleitfaser erfolgen.
Jedenfalls wird die Lichtquelle bzw. der Laser koaxial aus der Richtung der 1. Ordnung des Kristalls eingekoppelt. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht mit einer spektralen Verteilung um die Wellenlängen λiuo1 , λfiuo2 ,... , λfluon gemeinsam mit dem am Objekt gestreuten bzw. reflektierten Anregungslicht mit den Wellenlängen λ_-m , λfΛa ,... , A-tuin durchlaufen nun den AOTF in umgekehrte Richtung. Gemäß der Umkehrbarkeit des Lichtwegs wird das Anregungslicht mit den Wellenlängen λfΛi_, λfΛl2 ,... , λtiin wegen der spezifischen Einstellung des
AOTF aus dem Detektionsstrahlengang in Richtung der Lichtquelle bzw des Lasers abgelenkt Somit kann auch hierbei das „spektral verbleibende" Fluoreszenzhcht um die Wellenlangen λfluo1 , λfluo2 , , λ|U0n in einer - verglichen zum herkömmlichen Farbstrahlteiler - verbesserten Weise detektiert werden (0 Ordnung)
Sowohl unter Verwendung eines AOD oder AOTF als auch unter Verwendung eines transparenten Gitters wird sich das Fluoreszenzhcht nach dem Duchgang durch das jeweilige aktive Element aufgrund der auftretenden Dispersion spektral auffächern Insoweit ist es von Vorteil, ein oder mehrere entsprechende „inverse" Elemente nachzuschalten, so daß die ungewunschte spektrale Auffacherung wieder rückgängig gemacht wird Auch ist es denkbar, weitere optische Elemente zur Fokussierung oder zum Ausblenden unerwünschter Strahlanteile dem jeweiligen Element (AOD, AOTF oder transparentes Gitter) vor- bzw nachzuschalten Der dadurch wiedervereinigte Detektionsstrahl kann dann in herkömmlicher Weise durch nachgeschaltete Farbstrahlteiler spektral zerlegt und auf die verschiedenen Detektoren abgebildet werden
Grundsätzlich ist eine Anordnung im Sinne eines „Multibanddetektor" denkbar Hierzu wird auf die Patentanmeldung DE 43 30 347 1-42 verwiesen, deren Inhalt hier ausdrücklich hinzugezogen und insoweit als bekannt vorausgesetzt wird Zwischen der Scan-Einheit und dem AOD bzw dem transparenten Gitter (bei mehreren Lichtquellen bzw Lasern mehrerer Wellenlangen) bzw dem AOTF (bei einer Lichtquelle bzw einem Laser mit verschiedenen Wellenlangen) ist das Anregungs-Pinhole angeordnet, wobei dieses identisch mit dem Detektions-Pinhole ist In vorteilhafter Weise wird dabei die Eigenschaft des Kristalls, den Lichtstrahl der 0 Ordnung durch den Prismeneffekt spektral aufzufächern, zur Detektion genutzt Das dispersive Element des Multibanddetektors ist dabei mit dem Farbstrahlteiler zu einem Bauteil vereinigt, wodurch alle weiteren, dem herkömmlichen Detektionsstrahlengang nachgeordneten und mit weiteren Verlusten in der Fluoreszenzintensitat behafteten Farbstrahlteiler entfallen
In ganz besonders vorteilhafter Weise kann die voranstehend erörterte Technik in Kombination mit einer in der Wellenlange variabel durchstimmbaren Laserhchtquelle - z B Farbstofflaser, OPO (optisch parametπsierter Oszillator), Elektronenstrahlkol sionshchtquelle - äußerst flexible Fluoreszenzmikroskopie- Anwendungen ermöglichen Die Einstellung bzw Kontrolle der Anregungswellenlange kann direkt mit der Ansteuereinheit eines der zuvor beschriebenen spektral selektiven Elemente gekoppelt sein, so daß nur diese Anregungswellenlange koaxial in den Anregungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt und wiederum nur diese Wellenlange aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet wird Die Kopplung bzw Zwangskopplung der Lichtquelle mit dem strahlteilenden Element kann entweder manuell oder automatisch oder gar nach einer vorgebbaren Vorschrift erfolgen, wobei diese Möglichkeit dem jeweiligen Anforderungsprofil anzupassen ist beispielsweise kann nach jeder gescannten Bildebene die Anregungswellenlange sowie der Strahlteiler in geeigneter Weise verändert werden Somit lassen sich Mehrfarbenfluoreszenzobjekte detektieren Eine zeilenweise Umschaltung ist ebenso denkbar
Zusammenfassend lassen sich die Vorteile der erfindungsgemaßen Lehre nebst vorteilhafter Ausgestaltung wie folgt zusammenfassen
Die spektral selektiven Elemente sind für alle Wellenlangen außer für die selektierten Anregungswellenlangen λlN1 , λlN2 , λ,nn „transparent" Der „spektrale Verlust" ist minimal, da vom spektral selektiven Element nur der selektierte spektrale Bereich von typischerweise λ,nn ± 2 nm abgelenkt wird Dadurch wird der spektrale Bereich für die Detektion vergrößert Somit können nahezu beliebig viele unterschiedliche Wellenlangenbereiche simultan eingekoppelt und genutzt werden Die spektral „verlorene Fluoreszenzintensitat", die durch die spektral selektiven Elemente bedingt ist, ist geringer als bei herkömmlichen Farbstrahlteilern Mit anderen Worten liegen hier reduzierte Intensitatsverluste im interessierenden Bereich vor Die aktiven spektral selektiven Elemente sind flexibel einstellbar, so daß prinzipiell beliebig viele Lichtquellen bzw Laser mit unterschiedlichen Wellenlangen auch simultan in das Mikroskop einkoppelbar sind Dies ermöglicht die verbesserte
Anwendung bei Multi-Color FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung). Folglich ist dann nur noch eine Limitierung der spektralen Aufspaltung desFluoreszenzlichts, bspw. durch „Cross-Talk", gegeben. Herkömmliche Sperrfilter können komplett entfallen, so daß weitere Verluste von Fluoreszenzlicht in der Detektion vermieden sind.
Schließlich ist es auch denkbar, daß ein anderes aktives holographisches Element dem spektral selektiven Element nachgeschaltet ist und dabei die Aufgabe des Strahlscanners ausübt. Beide Elemente können zu einem einzigen Bauteil zusammengefaßt sein.
Grundsätzlich lassen sich unterschiedliche Lichtquellen verwenden, solange sie zur Fluoreszenzanregung geeignet sind. So kommt bspw. eine Weißlichtquelle, eine Lichtquelle zur Verwendung eines optisch parametrisierten Oszillators, eine Elektronenstrahlkollisionslichtquelle oder eine Laserlichtquelle in Frage, wobei die Laserlichtquelle in der Wellenlänge variabel durchstimmbar sein kann. Laserlichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen oder eine mehrere Laser umfassende Lichtquelle ist bzw. sind verwendbar.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die den Patentansprüchen 1 und 2 nachgeordneten Patentansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Er indung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
Fig. 1 in einer schematischen Darstellung eine gattungsbildende opti sehe Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser- Scanning-Mikroskops zur Dokumentation des der Erfindung zu grundeliegenden Standes der Technik,
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in einer schematischen Darstellung ein erstes
Ausfuhrungsbei
in einer schematischen Darstellung ein zweites Ausfuhrungsbeispiel einer erfindungsgemaßen optischen
Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning- Mikroskops, wobei dort drei Laser mit unterschiedlichen Anregungswellenlangen einkoppelbar sind,
in einer schematischen Darstellung ein drittes Ausfuhrungsbespiel einer erfindungsgemaßen optischen
Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning- Mikroskops, wobei dort die Einkopplung von drei Laserhchtquellen über ein transparentes Gitter erfolgt,
in schematischer Darstellung, vergrößert und teilweise, den Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang, wobei dem aktiven spektral selektiven Element zur Strahlzusammenfuhrung dienende Mittel nachgeschaltet sind,
in schematischer Darstellung, vergrößert und teilweise, den
Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang, wobei dort eine Dispersionskorrektur erfolgt,
in einer schematischen Darstellung die prinzipielle
Funktionsweise eines AOD oder AOTF,
in einer schematischen Darstellung ein weiteres
Ausfuhrungsbeispiel einer erfindungsgemaßen optischen Anordnung, wobei dort eine zusätzliche spektrale Auffacherung vor einem Multibanddetektor stattfindet und
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Fig. 9 in einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel aus
Fig. 8, wobei dort im Detektionsstrahlengang vor dem Multibanddetektor ein variables Spaltfilter angeordnet ist.
Fig. 1 dokumentiert den Stand der Technik und zeigt dabei eine herkömmliche optische Anordnung im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, wobei es sich hier um eine optische Anordnung im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops handelt. Der Laserscanner 1 ist dabei lediglich symbolisch dargestellt. Bei der den Stand der Technik betreffenden Darstellung sind als Lichtquellen insgesamt drei Laser 2 vorgesehen, die mit ihrem Anregungslicht 3 über spektral selektive Elemente 4 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 des Mikroskops einkoppeln. Bei den spektral selektiven Elementen 4 handelt es sich im Konkreten um einen Spiegel 6 sowie um Farbstrahlteiler 7. Jedenfalls wird das Anregungslicht 3 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 eingekoppelt und gelangt über einen weiteren Spiegel 8 als Anregungslicht 9 zum Laserscanner 1.
Das von dem ebenfalls lediglich symbolisch dargestellten Objekt 10 zurückkommende Licht - hier handelt es sich um das am Objekt gestreute und reflektierte Anregungslicht 9 einerseits und um das vom Objekt 10 ausgesandte Fluoreszenzlicht 1 1 - gelangt über den Spiegel 8 zu dem spektral selektiven Element 4, wobei es sich hier um den Farbstrahlteiler 7 handelt. Von dort aus wird das Anregungslicht 9 bzw. die Anregungswellenlänge aus dem über den Detektionsstrahlengang 12 vom Objekt 10 kommenden Licht 13 ausgeblendet und gelangt als zurückkommendes Anregungslicht 9 zurück zu den Lasern 2. Das durch den Farbstrahlteiler 7 nicht abgelenkte Detektionslicht 14 gelangt unmittelbar zu dem Detektor 15.
Erfindungsgemäß ist durch das spektral selektive Element 4 zurückkommendes Anregungslicht 3 unterschiedlicher Wellenlängen ausblendbar. Dies ist insbesondere in Fig. 4 dargestellt.
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Alternativ - in ebenfalls erfindungsgemaßer Weise - ist das spektral selektive Element 4 auf die auszublendende Anregungswellenlange einstellbar Dies laßt sich den Ausfuhrungsbeispielen aus den Fig 2, 3 und 8, 9 besonders gut entnehmen
Bei dem in Fig 2 gezeigten Ausfuhrungsbeispiel ist lediglich ein Laser 2 vorgesehen, dessen Anregungs cht 3 unterschiedliche Wellenlängen aufweisen kann Jedenfalls gelangt das Anregungshcht 3 über einen Spiegel 6 und über ein zusätzliches optisches Element, namhch über eine Linse 16 zu einem AOTF 17, der als spektralselektives Element arbeitet Von dort aus gelangt das
Anregungshcht 3 wiederum über ein zusätzliches optisches Element - im hier gewählten Ausfuhrungsbeispiel eine Linse 18 - und über einen Spiegel 8 zum Laserscanner 1 Vom Objekt 10 reflektiert, gelangt das zurückkommende Licht - reflektiertes Anregungshcht 9 und Detektionshcht 11 - über den Spiegel 8 und die Linse 18 zurück in den AOTF 17 und wird dort entsprechend der
Beschaltung des AOTF 17 teilweise ausgeblendet Im Konkreten wird namhch das Detektionshcht bzw Fluoreszenzhcht 11 über den Detektionsstrahlengang 12 zum Detektor 15 gefuhrt (0 Ordnung) Das zurückkommende Anregungshcht 9 wird dagegen über die Linse 16 und den Spiegel 6 zurück zum Laser 2 gefuhrt und ist somit aus dem Detektionsstrahlengang 12 ausgeblendet
Ähnlich verhalt es sich bei dem in Fig 3 gezeigten Ausfuhrungsbeispiel, wobei dort gleichzeitig drei Laser 2 über zusätzliche optische Elemente, hier Linsen 16, ihr Anregungshcht 3 über ein AOD 19, eine weitere nachgeschaltete Linse 18 und einen Spiegel 8 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 einkoppeln Von dort aus gelangt das Anregungshcht 3 zum Laserscanner 1 und zum Objekt 10
Das vom Objekt kommende Licht 13 umfaßt bei dem voranstehend genannten Ausfuhrungsbeispiel Fluoreszenzhcht 11 und zurückkommendes Anregungshcht 9, wobei dort der AOD 19 das zurückkommende Fluoreszenzhcht als Detektionshcht 14 zu dem Detektor 15 fuhrt Das zurückkommende Anregungs cht 9 wird ausgeblendet und gelangt über Linsen 16 zu den jeweiligen Lasern 2
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Das in Fig 4 gezeigte Ausfuhrungsbeispiel umfaßt als spektral selektives Element 4 ein transparentes Gitter 20, wobei über das transparente Gitter 20 gleichzeitig drei Laser 2 ihr Anregungshcht 3 in den Beleuchtungsstrahlengang 5 des Mikroskops einkoppeln Wesentlich ist hier jedenfalls, daß das transparente Gitter 20 das vom Objekt 10 zurückkommende Anregungshcht 9 aus dem
Detektionsstrahlengang ausblendet, so daß dieses Licht zurück zu den Lasern 2 gelangt Das zu detektierende Fluoreszenzhcht 11 gelangt über den Detektionsstrahlengang 12 zum Detektor 15
Fig 5 zeigt die Möglichkeit einer Dispersionskorrektur wobei das vom Objekt zuruckkomende Licht 13 in den AOTF 17 oder AOD 19 gelangt Dort wird das zurückkommende Detektionshcht 14 - zwangsweise - spektral aufgefächert und über nachgeschaltete Elemente - AOD/AOTF - parallehsiert und schließlich konvergiert Das spektral vereinigte Detektionshcht 14 gelangt von dort zu dem in Fig 5 nicht gezeigten Detektor 15
Bei der in Fig 6 gezeigten Dispersionskorrektur wird das vom Objekt kommende Licht 13 mittels AOD 17/ AOTF 19 aufgefächert, wobei das aufgefächerte Detektionshcht 14 über ein weiteres passives spektral selektives Element 4 - AOTF 17 oder AOD 19 - über eine Linse 21 mit Feldkorrektur konvertiert und durch ein Detektionspinhole 22 oder durch einen Detektionsspalt zum Detektor 15 gelangt
Gemäß der Darstellung in Fig 7 handelt es sich bei dem spektral selektiven Element 4 um ein AOTF 17 oder ein AOD 19, wobei diese Elemente einen speziellen Kristall mit dispersionsfreier 0 Ordnung umfassen Dieser Kristall bzw dieses spektral selektive Element wird über ein Piezoelement 23 angeregt bzw beaufschlagt Fig 7 zeigt besonders deutlich, daß das vom Objekt kommende Licht 13 in dem AOTF 17 bzw AOD 19 aufgespalten wird, wobei das Detektionshcht 14 als dispersionsfreies Licht 0 Ordnung ungehindert durch den Kristall lauft Das vom Objekt zurückkommende Anregungs cht 9 wird dagegen als Licht 1 Ordnung abgelenkt und zurück zu den hier nicht gezeigten
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Lasern geführt.
Fig. 8 zeigt eine spezielle Detektion unter Ausnutzung der spektralen Auffächerung des spektral selektiven Elements 4, wobei hier im Konkreten ein AOTF 17 verwendet ist. Das vom Objekt 10 kommende Licht 13 wird im AOTF 17 spektral aufgespalten, wobei das Detektionshcht 14 über eine Linse 16 und einen Spiegel 6 zu einem Multibanddetektor 24 bzw. Spektrometer gelangt. Der Spiegel 6 führt zu einer Verlängerung der Strecke, so daß eine Auffächerung des zurückkomenden Detektionslichts 14 bis hin zum Multibanddetektor 24 begünstigt wird.
Das im AOTF 17 ausgeblendete Anregungslicht 9 gelangt über die Linse 16 und den Spiegel 8 zurück zum Laser 2.
Schließlich zeigt Fig. 9 in einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel aus Fig. 8, wobei dort - in Ergänzung - im Detektionsstrahlengang vor dem Multibanddetektor 24 ein variables Spaltfilter 25 angeordnet ist. Dieses Spaltfilter 25 ist im Detektionsstrahlengang 12 unmittelbar vor dem Detektor 15 angeordnet und im Detektionsstrahlengang positionierbar. Desweiteren ist der Spalt 26 des Spaltfilters 25 variabel, so daß auch insoweit eine spektrale Selektion des Detektionslichts 14 möglich ist.
Hinsichtlich weiterer Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Lehre, die den Figuren nicht zu entnehmen sind, wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung und die dort geschilderte Funktionsweise der Lehre und der vorteilhaften Ausgestaltungen verwiesen.
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Bezugszeichenliste
1 Laserscanner
2 Laser (Lichtquelle)
3 Anregungslicht
4 spektral selektives Element
5 Beleuchtungsstrahlengang
6 Spiegel
7 Farbstrahlteiler
8 Spiegel
9 Anregungs- und Detektionshcht
10 Objekt
11 Fluoreszenzlicht (Detektionshcht)
12 Detektionsstrahlengang
13 (vom Objekt kommendes) Licht
14 Detektionshcht (nicht abgelenktes Detektionshcht)
15 Detektor
16 Linse
17 AOTF
18 Linse
19 AOD
20 transparentes Gitter
21 Linse (mit Feldkorrektur)
22 Detektions-Pinhole
23 Piezoelement
24 Multibanddetektor (Spektrometer)
25 (variables) Spaltfilter
26 Spalt (von 25)