WO2000034785A1 - Method and device for carrying out quantitative fluorescent marked affinity tests - Google Patents

Method and device for carrying out quantitative fluorescent marked affinity tests Download PDF

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WO2000034785A1
WO2000034785A1 PCT/DE1999/003917 DE9903917W WO0034785A1 WO 2000034785 A1 WO2000034785 A1 WO 2000034785A1 DE 9903917 W DE9903917 W DE 9903917W WO 0034785 A1 WO0034785 A1 WO 0034785A1
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WO
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measuring container
sample
measuring
base plate
biochemical
Prior art date
Application number
PCT/DE1999/003917
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German (de)
French (fr)
Inventor
Andreas Katerkamp
Markus Meusel
Frank Grawe
Angela Zellmer
Karsten Schult
Dieter Trau
Original Assignee
Institut für Chemo- und Biosensorik Münster E.V.
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Publication date
Application filed by Institut für Chemo- und Biosensorik Münster E.V. filed Critical Institut für Chemo- und Biosensorik Münster E.V.
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for carrying out quantitative fluorescence-labeled affinity tests according to the preamble of claim 1.
  • the invention can be used for all ligand-receptor systems, such as protein-protein interactions, antigen-antibody bonds, nucleic acid hybridizations, protein-DNA interactions and others.
  • reaction partners contained or to be used in samples can take place simultaneously or simultaneously.
  • a homogeneous reaction can take place, the reaction speed of which depends, among other things, on the concentration of the reactants used and on the energy which can be used for activation. For example, an increase in temperature can lead to an increase in the reaction rate for a homogeneous reaction.
  • a heterogeneous reaction can also take place which, in terms of the reaction rate, can be influenced not only by the activation energy but also by the mass transfer of the free reaction partners in the sample to the surface on which another reaction partner is immobilized. It follows that at constant concentration and constant temperature, the reaction rate of the heterogeneous reactions is decisive for the mass transport the free reaction partner is dependent on the surface on which the other partner is immobilized.
  • the biochemical immune sensors or the corresponding tests are generally based on heterogeneous reactions, so that a targeted influence on the already mentioned mass transport to the surface, in particular to increase the reaction speed and consequently to reduce the required measuring time, is desired.
  • a sample container can be used according to the solution described there, which is arranged separately from the actual measuring location, the so-called cuvette-shaped recording area.
  • the procedure is such that evanescent field excitation is carried out optically is used to measure the intensity of a fluorescence, the fluorescence generated by quasi monochromatic light from a light source on a marking substance.
  • a fluorescence-producing marker substance is used, which is linked to a chemical or biochemical partner of a general receptor-ligand system, which can bind to at least one of the partners of this receptor-ligand system while such an affinity test is being carried out.
  • at least one of the partners is immobilized on a surface of a measuring container and, as already mentioned in the introduction to the description, a heterogeneous reaction with rapid mass transport to the surface is then triggered.
  • the intensity of the generated fluorescent light can then be measured with a suitable light-sensitive detector, which is arranged below the base plate of such a measuring container.
  • a chemical - or - labeled with a fluorophore biochemical sample is introduced into a measuring container and after filling the measuring container, the sample is set in a circular flowing movement in the measuring container, so that the reaction rate of the heterogeneous reaction can be accelerated accordingly.
  • the increase or decrease in the intensity of the fluorescent light is then measured to determine the concentration of at least one of the chemical or biochemical substances.
  • the sample In order to ensure quasi-static conditions during the measurement, the sample should be uniform, i.e. circular motion with constant speed and zero acceleration, at least during the measurement.
  • At least the drive that is to be used for this should be arranged outside the actual measuring container. Since the optical detector which is to be used for measuring the intensity of the fluorescent light is arranged below the base plate of the measuring container, it is certainly expedient to place the corresponding rotary drive over the
  • a drive in which electromagnets, permanent magnets or an electromagnetic coil arrangement are used in order to set the sample to which magnetic bodies are added in a circular flowing movement by utilizing magnetic or electromagnetic forces .
  • at least one permanent magnet or a stationary electromagnet can be attached to a rotor which is rotatably arranged above the measuring container. When this rotor is rotated, magnetic or electromagnetic forces then act on the magnetic bodies which are contained in the sample in the measuring container and the sample is set into a flowing movement in accordance with the rotational movement.
  • stator on which there is an electromagnetic coil arrangement, the individual coils of which are arranged separately from one another and are sequentially influenced by an electronic control system, so that almost the same effect can be achieved.
  • the possibility of mechanically setting the sample received in the measuring container in a desired circular flowing movement can be done, for example, in such a way that the measuring container is closed at the top by an elastic membrane.
  • a rotating element can be placed on this membrane, on which protrusions acting on the membrane are formed, which press in the elastic membrane and thus extend into the actual sample.
  • the sample can be stirred mechanically and at the same time the measuring container used can be kept closed.
  • the actual measurement can advantageously be carried out in such a way that only the increase or decrease decrease (negative increase) in the intensity of the measured fluorescent light and from this the concentration of the respective chemical or biochemical substance to be determined is determined because of the direct proportionality.
  • it only has to be carried out within a time interval which can be predetermined in accordance with the respective chemical or biochemical assay format. The required measuring time can be shortened accordingly.
  • the determination of the fluorescence intensity can be measured not only in a time-resolved but also in a spatially resolved manner.
  • This has a particularly advantageous effect if at least one of the partners of the respective receptor-ligand system is immobilized in a radially symmetrical arrangement on the base plate of the measuring container.
  • a movable diaphragm in connection with a light-sensitive detector or a linear or areal arrangement of light-sensitive detectors, such as CCD lines or CCD arrays can be used.
  • This version is particularly favorable if the base plate of the measuring container is divided into different segments in a radially symmetrical manner and various such partners are immobilized on the individual segments, so that the concentration of several chemical - or biochemical substances can be determined.
  • the measuring container can be filled with the sample in various ways, e.g. by capillary action, by pressure or suction action, preferably from the side of the measuring container, and combinations of these effects can also be used.
  • Such a membrane can e.g. consist of fibrous material, cellulose, nitrocellulose, polypropylene, polycarbonate, polyvinyl difluoride or of a hydrogel or of nuclear track membranes or of glass fibers.
  • Such membranes are used for example in dip stick technology and can e.g. the
  • a device according to the invention is formed using such layers or membranes, the desired sample pretreatment can be carried out directly in the device, so that additional effort can be avoided and such a device, which is easy to handle, is available to the end user be put.
  • sample receiving space which is either connected directly to the measuring container or to the measuring container via at least one functional layer or membrane, so that the sample can be taken from the sample receiving space into the measuring container, if necessary, if necessary A corresponding sample preparation can be carried out.
  • the measuring container can additionally be connected to a sample collection space, which advantageously contains an absorbent material, so that the sample liquid can be easily transported by capillary force during filling.
  • a sample collection space which advantageously contains an absorbent material, so that the sample liquid can be easily transported by capillary force during filling.
  • the sample (whole blood, plasma or serum, water, urine or other) is mixed with a fluorophore-labeled reactant.
  • the corresponding partner is immobilized on the surface of the measurement area formed on the base plate.
  • a correspondingly labeled detector antibody is added to the sample and the capture antibody immobilized on the surface of the base plate on the measurement area ensures binding of the respective analyte and the detector antibody.
  • the device according to the invention can be manufactured much more simply and cost-effectively because of the lower limitation of the usable volume within the measuring container compared to the flow measuring cell described in DE 196 28 002 C2, since a height limitation, which was necessary for the convective mass transport in the known flow measuring cell, is eliminated.
  • the inside of the measuring container should advantageously have a fillable height in the range 0.001 to 50 mm.
  • FIG. 1 flow profiles along two sections in the mass transfer through a conventional flow cell
  • FIG. 2 flow profiles along two cuts which can be achieved in a device according to the invention during mass transport;
  • Figure 3 schematically shows the structure of an example of a device according to the invention with a rotating element for generating a circular flowing movement of a sample
  • Figure 4 shows another example of a device according to the invention with a rotating element with permanent magnet and magnetic bodies in the measuring container, for generating a circular flowing movement of the sample;
  • FIG. 5 shows a further example of a device according to the invention with a rotating element, shaft bushing and blades in the measuring container, for generating a circular flowing movement of the sample;
  • Figure 6 shows a radially symmetrical in different
  • FIG. 7 shows a schematically illustrated construction of a measuring arrangement with the optical elements
  • FIG. 8 shows an example of a device according to the invention with an integrated sample receiving and sample collection space
  • FIG. 9 shows the example shown in FIG. additionally absorbent material that can be used in the sample collection area
  • FIG. 10 shows a schematic illustration of a possible arrangement of the layers or membranes for a measuring container and a sample collection space, in which the liquid transport of a sample for filling can be achieved by means of a capillary force effect, and
  • FIG. 11 shows an example in which a measuring container to be used according to the invention is completely enclosed by a functional layer or a membrane.
  • FIG. 1 shows a cuvette-shaped receiving area of a flow measuring cell, as is known from DE 196 28 002 Cl.
  • the mass transport of the sample liquid takes place translationally through the channel, with a quasi-rectangular cross-section, as indicated by the arrows in the upper illustration.
  • the flow profiles occurring in accordance with the drawn sections are shown in the lower left and right representations, it being clearly recognizable that the flow velocity of the sample liquid is greatest in the middle of the flow measuring channel (section cd), so that precisely in the area in which the a partner of the receptor-ligand system, which is immobilized on the floor of the river channel to which the other partner is to connect, the flow velocity and consequently also the mass transfer is relatively small.
  • the measuring container 2 advantageously having a circular base plate 3 on which the corresponding measuring area is formed.
  • the circular design of the base plate 3 in connection with the outer surface of the measuring container 2 means that turbulence can occur only slightly.
  • the flow profile shown shows a sample flowing circularly into a circular measuring container that the sample is quasi-nit moved in the center.
  • the tangential flow velocity increases during the circular movement in the radially outer direction until a maximum is reached and then drops gently in the direction of the outer edge of the measuring container to at least close to zero.
  • the measurement of the fluorescent light should therefore, as below regarding FIG. 6 explained further, locally limited in the region of the maximum flow velocity, of the circularly moving sample.
  • FIG. 3 shows another possibility for generating the circularly flowing movement of the sample in the measuring container 2.
  • the measuring container 2 is closed at the top with an elastic, flexible membrane 11.
  • a circular, rotating element 5, on which a plurality of projections 10 are formed, can be placed on this membrane 11, so that the projections 10 press the membrane 11 in and immerse it in the sample liquid. If the rotating element 5 is now set in rotation with a suitable dreamer drive, the desired circularly flowing movement in the sample can be achieved in the measuring container 2 and it is nevertheless ensured that the measuring container 2 remains closed.
  • a measuring container 2 is used again, which is closed at the bottom with a transparent base plate 3, which will be explained in more detail later, and also at the top with a cover 6.
  • Magnetic bodies 9, with which the sample can be mixed after filling or during filling, are contained in the measuring container 2.
  • the magnetic bodies can also be located on the measuring container 2 before filling.
  • the magnetic bodies 9 are advantageously relatively small in size and consequently influence the measurement result only very slightly, if at all.
  • a plurality of permanent magnets 4 are attached to the rotating element 5 at the same distance from the axis of rotation of the rotating element 5, the magnetic force effect of which is sufficient to transmit the rotary movement of the rotating element 5 to the magnetic bodies 9 contained in the sample and consequently also to the sample , so that this is put into a circular flowing movement.
  • suitable electromagnets can also be used, which can be supplied with electrical energy, for example, via flexible lines or sliding contacts.
  • FIG. 5 shows a further example of a device according to the invention with a measuring container 2.
  • a mechanical stirring element 15 is accommodated in the measuring container 2, which is closed at the top by the cover 6, in which a shaft is guided to the outside via an opening, not shown here, with a seal in the cover 6, to which, for example, a rotating element 5 or another suitable rotary drive can attack.
  • the rotating element 5 or the rotary drive already mentioned can then be arranged outside the measuring container 2.
  • Shaft and rotating element can also be a unit that is sealed to cover the measuring container 2.
  • the mechanical stirring element 15 should be able to be arranged and fixed in the interior of the measuring container 2 in such a way that impairment of the partner immobilized on the base plate 3 when the mechanical stirring element 15 rotates can be avoided.
  • the mechanical stirring element 15 can, however, also consist of a ferromagnetic material and, like the magnetic bodies already mentioned, can be set in rotation, on the one hand there being the possibility that 5 permanent magnets or stationary electromagnets are present on the rotating element. If the rotating element 5 is now rotated, cause the electromagnetic or magnetic field of the magnets that the mechanical stirring element 15 also rotates.
  • a coil arrangement generating a rotating electromagnetic field can also be used to effect the rotation of the mechanical stirring element 15.
  • the entire mechanical stirring element 15 can be inside the measuring container 2, that is also below the upper cover 6, which consequently has no opening through which a shaft is guided to the outside. must have been completed. All that is required is storage for the mechanical stirring element 15, which can preferably be formed in the center of the circular base plate 3 and in the center of the cover 6, for example in the form of a needle bearing.
  • FIG. 6 shows a possible variant of the invention, in which a radially symmetrical division of the measuring area 21 on the base plate 3 into individual measuring points 22 is shown.
  • the individual measuring points 22 can be used for the immobilization of different substances, so that several different substances can be taken into account simultaneously in connection with the time- and location-resolved measurement of the fluorescence intensities.
  • a circular area is shown, in which magnetic bodies are arranged, which are used for filling mixed with the sample and with which the circular flowing movement of the sample in the measuring container 2 can be achieved, as in the example according to FIG.
  • the maximum lies on the radius R ⁇ around the center of the measuring container 2.
  • the center points of the measuring points 22 should therefore also lie on the radius R m .
  • the measuring range is limited by the outer edges of the measuring points 22, the diameter of which results from the difference R a - R 1 .
  • the size of the measuring points 22 is still too large to meet the conditions of the highest possible flow velocity with almost the same flow velocities, it is easiest to select the imaging of the fluorescent light on optical detectors accordingly, so that only fluorescent light from one area which fulfills these conditions, can strike an optical detector or only appropriate light components are taken into account.
  • the simplest way is to use optical diaphragms with corresponding openings which can be moved or rotated accordingly.
  • only individual detectors of a detector array can be selectively used or taken into account, with which these conditions are met for the incident fluorescent light. It should work with flow velocities in the maximum of the flow profile (see Figure 2) in the range of 5 to 1000 mm / s and be measured in areas of a laminar flow.
  • a measurement setup is shown schematically in FIG.
  • At least one of the partners of a receptor-ligand system to which the other fluorescence-labeled partner can bind is immobilized above the interface, that is to say on the surface of the base plate 3.
  • the fluorescence intensity which is excited by the laser light beam 1, changes.
  • An optical detector 12 with which the intensity of the fluorescent light can be measured, is arranged below the measuring container 2.
  • a lens system consisting of two optical lenses 13 is arranged in the measuring container 2 and detector 12, with which the fluorescent light of the individual measuring points 22 can be imaged on the light-sensitive detector 12.
  • a diaphragm 14, in which at least one recess is present, is movably arranged above the detector 12. The aperture 14 can be moved, preferably rotated, that the light of a measuring point 22 strikes the light-sensitive detector 12, so that a local assignment of the fluorescence intensity measured at that moment to the respective measuring point 22 can be achieved.
  • an element consisting of a plurality of individual detectors arranged flatly can advantageously be used in order to be able to carry out a spatially resolved measurement with the individual light-sensitive detectors without using an aperture.
  • filters 19 and 20 can be arranged in the light beam paths in order to use the
  • Filter 20 to achieve a quasi-monochromatic fluorescence excitation and in particular to exclude stray light from the light source 23 from the fluorescence light with the filter 19.
  • the base plate 3 instead of forming the base plate 3 as a prism, there is also the possibility, in a form not shown here, of applying or inserting an optical transmission grating onto or into the base plate 3 so that the light beam 1 is diffracted in such a way that total reflection of the interface (base plate / sample ) entry.
  • FIG. 8 shows an example of a device according to the invention which can be made available to a user as a compact element.
  • the sample is filled into a sample receiving space 16 and can fill the actual measuring container 2 via a suitable connection.
  • Another connection can be used, for example redundant Sample liquid or the sample liquid as a whole, get into a sample collection chamber 17 after the measurement has been carried out.
  • the device shown here can otherwise be designed to be closed, so that undesired leakage of sample liquid can be avoided.
  • Sample receiving space 16 and sample collecting space 17 are arranged here laterally next to the measuring container 2, so that the filling and possibly also the removal of the sample from or to the side of the measuring container 2 is made possible. At least the filling should, however, always take place from the side, regardless of whether a sample receiving space 16 is present.
  • the sample can also be introduced into the measuring container 2 in the simplest form by means of a conventional syringe by means of a pump.
  • a rotating element 5 is indicated, which is at least in the vicinity of the
  • Brought measuring container 2 and can be set in rotation, so that the desired circular flowing movement of the sample in the measuring container 2 can be achieved as described in other examples.
  • FIG. 9 The example of a device according to the invention shown in FIG. 9 is essentially identical to that according to FIG. It is only additionally shown that an absorbent material 18 can be inserted into the sample collection space 17, the suction force effect in connection with capillary forces being able to be used to fill the measuring container 2.
  • FIG. 10 shows the possible use of functional layers or membranes 7 and 8. In this case, the sample can, for example, get from the sample receiving space 16 through the membrane or layers 7 and 8 into the measuring container 2, it being possible to achieve a specific sample preparation by appropriate choice of material or a specific incubation.
  • a membrane or layer 8 which uses a circular recess in the middle, which can represent the actual measuring container 2.
  • the measuring container 2 is closed at the top and has a bottom plate 3 at the bottom, on the surface of which a partner of the receptor-ligand system can be immobilized.
  • a closed system can also be obtained in this way if the membrane or layer 8 is also enclosed in a liquid-tight manner.

Abstract

The invention relates to a method and device for carrying out quantitative fluorescent marked affinity tests. According to the invention, a fluorescence is provoked by means of an optical evanescent field excitation with a marking substance bound to a chemical or biochemical partner of a general receptor-ligand system. One of the partners of the receptor-ligand system is immobilized on an optically transparent base plate used as a measuring area of a measuring container (2). The intensity of the fluorescent light is measured. According to the invention, the reaction rate should be increased by influencing the transport of substances to the surface, the measuring speed should be decreased, and the measuring precision and sensitivity should be increased. To these ends, a sample which is mixed with a chemical or biochemical substance that is fluorogen-marked according to biochemical assay is poured into the measuring container (2), is subsequently mixed in a circular flowing movement in said measuring container (2), and the intensity of the fluorescent light is measured in a temporally resolved manner according to the affinity test format in order to determine the concentration of at least one chemical or biochemical substance.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung von quantitativen Fluoreszenz markierten Affinitätstests Method and device for carrying out quantitative fluorescence-labeled affinity tests
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung von quantitativen Fluoreszenz markierten Affinitätstests nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a method and a device for carrying out quantitative fluorescence-labeled affinity tests according to the preamble of claim 1.
Grundsätzlich kann die Erfindung für alle Ligand-Re- zeptor Systeme, wie Protein-Protein-Wechselwirkungen, Antigen-Antikörper Bindungen, Nukleinsäure-Hybridis- ierungen, Protein-DNA-Wechselwirkungen u.a., angewendet werden.In principle, the invention can be used for all ligand-receptor systems, such as protein-protein interactions, antigen-antibody bonds, nucleic acid hybridizations, protein-DNA interactions and others.
Bei der Durchführung solcher biochemischen Affinitätstests können allein oder parallel gleichzeitig verschiedene Reaktionen der jeweils in Proben enthaltenen bzw. zu verwendenden Reaktionspartner ablaufen. Zum einen kann eine homogene Reaktion ablaufen, deren Reaktionsgeschwindigkeit unter anderem von der Konzentration der verwendeten Reaktionspartner und von der zur Aktivierung ausnutzbaren Energie abhängt. So kann beispielsweise eine Temperaturerhöhung zu einer Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit für eine homogene Reaktion führen.When such biochemical affinity tests are carried out, different reactions of the reaction partners contained or to be used in samples can take place simultaneously or simultaneously. On the one hand, a homogeneous reaction can take place, the reaction speed of which depends, among other things, on the concentration of the reactants used and on the energy which can be used for activation. For example, an increase in temperature can lead to an increase in the reaction rate for a homogeneous reaction.
Parallel hierzu kann aber auch eine heterogene Reaktion ablaufen, die bezüglich der Reaktionsgeschwindigkeit neben der Aktivierungsenergie auch vom Stofftransport der freien Reaktionspartner in der Probe zur Oberfläche an der ein anderer Reaktionspartner immobilisiert ist, beeinflußbar ist. Daraus folgt, daß bei konstanter Konzentration und konstant gehaltener Temperatur die Reaktionsgeschwindigkeit der heterogenen Reaktionen maßgebend vom Stofftransport der freien Reaktionspartner zur Oberfläche, an der der jeweilige andere Partner immobilisiert ist, abhängig ist.Parallel to this, however, a heterogeneous reaction can also take place which, in terms of the reaction rate, can be influenced not only by the activation energy but also by the mass transfer of the free reaction partners in the sample to the surface on which another reaction partner is immobilized. It follows that at constant concentration and constant temperature, the reaction rate of the heterogeneous reactions is decisive for the mass transport the free reaction partner is dependent on the surface on which the other partner is immobilized.
Die biochemischen Immunsensoren bzw. die entsprechenden Tests basieren in der Regel auf heterogenen Reaktionen, so daß eine gezielte Einflußnahme auf den bereits erwähnten Stofftransport zur Oberfläche, insbesondere zur Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und demzufolge zur Verringerung der erforderlichen Meßzeit, gewünscht wird.The biochemical immune sensors or the corresponding tests are generally based on heterogeneous reactions, so that a targeted influence on the already mentioned mass transport to the surface, in particular to increase the reaction speed and consequently to reduce the required measuring time, is desired.
Bei der Durchführung solcher Tests wird die bekannte Tatsache, daß die Messung der pro Zeiteinheit auf der Oberfläche, beispielsweise einer Meßzelle gebildeten Immunkomplexe, eine sehr empfindliche und mit geringer Fehlerquote behaftete Meßmethode darstellt, ausgenutzt .When carrying out such tests, the known fact that the measurement of the immune complexes formed per unit of time on the surface, for example a measuring cell, is a very sensitive and low-error measuring method is used.
Es ist weiter bekannt, daß bei der Durchführung solcher Immuntests der jeweilige Stofftransport zur Oberfläche, an der der jeweils andere Partner eines solchen Komplexes immobilisiert ist, durch einen relativ schnellen Prozeß und nicht durch den langsamen Prozeß der Diffusion erfolgen sollte. Unter diesen Bedingungen entspricht nämlich die Rate der an der Oberfläche einer Meßzelle gebildeten Immunkomplexe, direkt der Konzentration des Bindungspartners im Probenvolumen.It is also known that when carrying out such immunoassays, the respective mass transport to the surface on which the other partner of such a complex is immobilized should take place by a relatively fast process and not by the slow process of diffusion. Under these conditions, the rate of the immune complexes formed on the surface of a measuring cell corresponds directly to the concentration of the binding partner in the sample volume.
Aufbauend auf dieser Erkenntnis wurde in DE 196 28 002 Cl ein entsprechendes Verfahren und eine hierfür geeignete Vorrichtung beschrieben, bei der ein lineares Fließsystem verwendet wird. Dabei erfolgt der Stofftransport zur Oberfläche, maßgebend, nicht dif- fusionslimitiert , bedingt durch einen küvettenförmi- gen Aufnahmebereich, der ähnlich wie ein Fließkanal ausgebildet ist und eine geringe Höhe (50 μm) aufweist, durch den die Probe mit einem Volumenstrom von ca. 1 μl/s geführt wird. Ein größerer Volumenstrom wäre zwar wünschenswert, kann aber nicht realisiert werden, da nur mit kleinem Probenvolumina von ca. 100 μl gearbeitet werden kann, wobei eine Meßdauer von ca. 100 s erreicht werden sollte.Based on this finding, a corresponding method and a device suitable therefor were described in DE 196 28 002 Cl, in which a linear flow system is used. The material is transported to the surface, decisive, not dif- fusion-limited, due to a cuvette-shaped receiving area, which is similar to a flow channel and has a low height (50 μm) through which the sample is passed at a volume flow of approx. 1 μl / s. A larger volume flow would be desirable, but cannot be realized, since only small sample volumes of approx. 100 μl can be used, and a measurement duration of approx. 100 s should be achieved.
Für den Ablauf von homogenen Reaktionen kann nach der dort beschriebenen Lösung ein Probencontainer benutzt werden, der getrennt vom eigentlichen Meßort, dem sogenannten küvettenförmigen Aufnahmebereich, ange- ordnet ist.For the course of homogeneous reactions, a sample container can be used according to the solution described there, which is arranged separately from the actual measuring location, the so-called cuvette-shaped recording area.
Ausgehend hiervon ist es daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung vorzuschlagen, bei der durch Beeinflussung des Stofftransportes zur Oberfläche, die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht und demzufolge die Meßgeschwindigkeit verkürzt und die Meßgenauigkeit und Empfindlichkeit erhöht werden kann.Proceeding from this, it is therefore an object of the invention to propose a method and a device in which, by influencing the mass transport to the surface, the reaction speed increases and consequently the measuring speed is shortened and the measuring accuracy and sensitivity can be increased.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit den Merkmalen des Anspruchs 1 für ein Verfahren und den Merkmalen des Anspruchs 14 für eine entsprechende Vorrichtung gelöst . Vorteilhafte Ausgestaltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung, ergeben sich durch Nutzung, der in den untergeordneten Ansprüchen genannten Merkmale .According to the invention, this object is achieved with the features of claim 1 for a method and the features of claim 14 for a corresponding device. Advantageous embodiments and developments of the invention result from the use of the features mentioned in the subordinate claims.
Erfindungsgemäß wird dabei, aufbauend auf bekannten optischen Meßverfahren, so vorgegangen, daß auf opti- schem Wege eine Evaneszenzfeldanregung durchgeführt wird, um die Intensität einer Fluoreszenz, die durch quasi monochromatisches Licht einer Lichtquelle an einem Markierungsstoff erzeugte Fluoreszenz zu messen. Dabei wird ein solcher Fluoreszenz hervorrufen- der Markierungsstoff, der an einen chemischen oder biochemischen Partner eines allgemeinen Rezeptor-Ligand Systems, der während der Durchführung eines solchen Affinitätstestes an zumindest einen der Partner dieses Rezeptor-Ligand Systems anbinden kann, verwen- det . Vor der Durchführung eines solchen Tests wird zumindest einer der Partner auf einer Oberfläche eines Meßbehälter immobilisiert und anschließend, wie bereits in der Beschreibungseinleitung erwähnt, eine heterogene Reaktion mit schnellem Stofftransport zur Oberfläche ausgelöst.According to the invention, building on known optical measuring methods, the procedure is such that evanescent field excitation is carried out optically is used to measure the intensity of a fluorescence, the fluorescence generated by quasi monochromatic light from a light source on a marking substance. In this case, such a fluorescence-producing marker substance is used, which is linked to a chemical or biochemical partner of a general receptor-ligand system, which can bind to at least one of the partners of this receptor-ligand system while such an affinity test is being carried out. Before such a test is carried out, at least one of the partners is immobilized on a surface of a measuring container and, as already mentioned in the introduction to the description, a heterogeneous reaction with rapid mass transport to the surface is then triggered.
Für die Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Meßbehälter, dessen Bodenplatte aus einem für das Anregungslicht und das Fluoreszenzlicht transparentem Material besteht, verwendet, wobei das Anregungslicht in einem Winkel auf die transparente Bodenplatte gerichtet wird, bei dem Totalreflexion an der Grenzfläche (Bodenplatte/Probe) auftritt und demzufolge ein evaneszentes Feld mit definierter Ein- dringtiefe oberhalb der Oberfläche der Bodenplatte erzeugt werden kann.To carry out a method according to the invention, a measuring container is used, the base plate of which consists of a material which is transparent to the excitation light and the fluorescent light, the excitation light being directed at an angle onto the transparent base plate, in the case of total reflection at the interface (base plate / sample) occurs and consequently an evanescent field with a defined penetration depth can be generated above the surface of the base plate.
Die Intensität des generierten Fluoreszenzlichtes kann dann mit einem geeigneten lichtempfindlichen Detektor, der unterhalb der Bodenplatte eines solchen Meßbehälters angeordnet ist, gemessen werden.The intensity of the generated fluorescent light can then be measured with a suitable light-sensitive detector, which is arranged below the base plate of such a measuring container.
Bei der Erfindung ist es wichtig, daß in Abhängigkeit des jeweiligen durchzuführenden biochemischen Assays eine mit einem Fluorophor markierte chemische - oder biochemische Substanz versetzte Probe in einen Meßbehälter eingeführt wird und nach der Befüllung des Meßbehälters die Probe im Meßbehälter in eine kreisförmige strömende Bewegung versetzt wird, so daß die Reaktionsgeschwindigkeit der heterogenen Reaktion entsprechend beschleunigt werden kann. Zur Bestimmung der Konzentration mindestens eines der chemischen oder biochemischen Substanzen wird dann der Anstieg oder das Abnehmen der Intensität des Fluoreszenzlich- tes gemessen.In the invention it is important that, depending on the particular biochemical assay to be carried out, a chemical - or - labeled with a fluorophore biochemical sample is introduced into a measuring container and after filling the measuring container, the sample is set in a circular flowing movement in the measuring container, so that the reaction rate of the heterogeneous reaction can be accelerated accordingly. The increase or decrease in the intensity of the fluorescent light is then measured to determine the concentration of at least one of the chemical or biochemical substances.
Um quasi statische Verhältnisse bei der Messung zu sichern, sollte die Probe gleichförmig, d.h. mit konstanter Geschwindigkeit und einer Beschleunigung gleich null, zumindest während der Messung, in kreisförmige Bewegung versetzt werden.In order to ensure quasi-static conditions during the measurement, the sample should be uniform, i.e. circular motion with constant speed and zero acceleration, at least during the measurement.
Es ist auch möglich, aus der Differenz der Fluoreszenzintensität zu zwei verschiedenen Zeitpunkten die Konzentration zu bestimmen.It is also possible to determine the concentration from the difference in the fluorescence intensity at two different times.
Bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist es zweckmäßig, nach dem Einführen der jeweiligen Probe in den Meßbehälter den Ablauf von homoge- nen Reaktionen in der Probe abzuwarten, bevor die Probe in kreisförmige strömende Bewegung versetzt wird. Dies kann für die verschiedenen durchführbaren Assayformate ohne weiteres zeitlich berücksichtigt werden, da die hierfür erforderliche Zeit, wie eben- falls bereits erwähnt, lediglich von der jeweiligen Konzentration der verschiedenen Reaktionspartner und der zur Verfügung stehenden Energie, d.h. im wesentlichen von der Temperatur abhängig ist, ermittelt werden kann . Aus Sicherheitsgründen ist es auch zweckmäßig, den eigentlichen Meßbehälter, bis auf mindestens eine Öffnung, die zur Einführung der Probe dient, allseitig abgeschlossen auszubilden, wobei diese Tatsache bei der Ausbildung der Elemente, die zur Erreichung der kreisförmigen strömenden Bewegung der Probe Verwendung finden sollen, berücksichtigt werden muß.When carrying out a method according to the invention, it is expedient to wait for homogeneous reactions in the sample to take place after the respective sample has been introduced into the measuring container before the sample is set into a circular flowing movement. This can easily be taken into account in terms of time for the various assay formats that can be carried out, since the time required for this, as already mentioned, depends only on the concentration of the different reactants and the energy available, ie essentially on the temperature. can be determined. For safety reasons, it is also expedient to design the actual measuring container to be sealed on all sides except for at least one opening which is used for introducing the sample, this fact being used in the formation of the elements which are to be used to achieve the circular flowing movement of the sample. must be taken into account.
Dabei sollte zumindest der Antrieb, der hierfür ver- wendet werden soll, außerhalb des eigentlichen Meßbehälters angeordnet werden. Da der optische Detektor, der zur Messung der Intensität des Fluoreszenzlichtes verwendet werden soll, unterhalb der Bodenplatte des Meßbehälters angeordnet ist, ist es sicher zweckmä- ßig, den entsprechenden Rotationsantrieb über demAt least the drive that is to be used for this should be arranged outside the actual measuring container. Since the optical detector which is to be used for measuring the intensity of the fluorescent light is arranged below the base plate of the measuring container, it is certainly expedient to place the corresponding rotary drive over the
Meßbehälter an der der Bodenplatte gegenüberliegenden Seite anzuordnen.Arrange the measuring container on the side opposite the base plate.
In einer geeigneten Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein Antrieb verwendet werden, bei dem Elektromagnete, Permanentmagnete oder eine elektromagnetische Spulenanordnung verwendet werden, um die Probe, der magnetische Körper zugesetzt sind, durch Ausnutzung magnetischer bzw. elektromagnetischer Kräfte in kreisförmige strömende Bewegung zu versetzen. Dabei können beispielsweise an einem Rotor, der oberhalb des Meßbehälters drehbar angeordnet ist, mindestens ein Permanentmagnet oder ein stationär angeordneter Elektromagnet befestigt sein. Bei Drehung dieses Rotors wirken dann magnetische bzw. elektromagnetische Kräfte auf die magnetischen Körper, die in der Probe im Meßbehälter enthalten sind und die Probe wird entsprechend der Rotationsbewegung in strömende Bewegung versetzt. Anstelle eines solchen Rotors kann aber auch ein Stator verwendet werden, an dem eine elektromagnetische Spulenanordnung vorhanden ist, deren einzelne getrennt voneinander angeordnete Spulen sequentiell von einer elektronischen Steuerung beeinflußt, ein- und ausgeschaltet werden, so daß nahezu der gleiche Effekt erreicht werden kann.In a suitable device for carrying out the method according to the invention, a drive can be used in which electromagnets, permanent magnets or an electromagnetic coil arrangement are used in order to set the sample to which magnetic bodies are added in a circular flowing movement by utilizing magnetic or electromagnetic forces . In this case, for example, at least one permanent magnet or a stationary electromagnet can be attached to a rotor which is rotatably arranged above the measuring container. When this rotor is rotated, magnetic or electromagnetic forces then act on the magnetic bodies which are contained in the sample in the measuring container and the sample is set into a flowing movement in accordance with the rotational movement. Instead of such a rotor, however, it is also possible to use a stator on which there is an electromagnetic coil arrangement, the individual coils of which are arranged separately from one another and are sequentially influenced by an electronic control system, so that almost the same effect can be achieved.
Es besteht aber auch die Möglichkeit, die im Meßbe- hälter aufgenommene Probe, auf mechanischem Wege in eine gewünschte kreisförmige strömende Bewegung zu versetzen. Dabei kann beispielsweise so vorgegangen werden, daß der Meßbehälter nach oben durch eine elastische Membran abgeschlossen ist. Dieser Membran kann ein rotierendes Element aufgesetzt werden, an dem auf die Membran wirkende Vorsprünge ausgebildet sind, die die elastische Membran eindrücken und so in die eigentliche Probe hineinreichen. Es kann also bei Drehung des rotierenden Elementes ein Rühren der Pro- be auf mechanischem Wege erreicht werden und gleichzeitig der verwendete Meßbehälter geschlossen gehalten sein.However, there is also the possibility of mechanically setting the sample received in the measuring container in a desired circular flowing movement. This can be done, for example, in such a way that the measuring container is closed at the top by an elastic membrane. A rotating element can be placed on this membrane, on which protrusions acting on the membrane are formed, which press in the elastic membrane and thus extend into the actual sample. Thus, when the rotating element rotates, the sample can be stirred mechanically and at the same time the measuring container used can be kept closed.
Ähnlich kann auch verfahren werden, wenn im eigentli- chen Meßbehälter schaufelförmig ausgebildete Elemente vorhanden sind, die an einer durch die Abdeckung des Meßbehälters geführte Welle befestigt sind, an der ein Drehantrieb angesetzt werden kann, wenn die Probe in die gewünschte Bewegung versetzt werden soll . Bei einer entsprechenden Abdichtung ist auch hier gesichert, daß ein Austritt von Probenflüssigkeit verhindert werden kann.A similar procedure can also be followed if the actual measuring container has vane-shaped elements which are attached to a shaft which is guided through the cover of the measuring container and to which a rotary drive can be attached if the sample is to be set into the desired movement. With an appropriate seal, it is also ensured here that sample liquid can be prevented from escaping.
Die eigentliche Messung kann vorteilhaft so durchge- führt werden, daß lediglich der Anstieg bzw. das Ab- sinken (negativer Anstieg) der Intensität des gemessenen Fluoreszenzlichtes gemessen und daraus wegen der direkten Proportionalität die Konzentration der jeweiligen zu bestimmenden chemischen bzw. biochemi- sehen Substanz ermittelt wird. Bei der Messung in dieser Form, muß sie lediglich innerhalb eines, dem jeweiligen chemischen- oder biochemischen Assayformat entsprechend vorgebbaren Zeitintervalls durchgeführt werden. So kann die erforderliche Meßzeit entspre- chend verkürzt werden.The actual measurement can advantageously be carried out in such a way that only the increase or decrease decrease (negative increase) in the intensity of the measured fluorescent light and from this the concentration of the respective chemical or biochemical substance to be determined is determined because of the direct proportionality. When measuring in this form, it only has to be carried out within a time interval which can be predetermined in accordance with the respective chemical or biochemical assay format. The required measuring time can be shortened accordingly.
Es besteht aber auch die Möglichkeit, lediglich mindestens zwei Fluoreszenzintensitätssignale in einem vorgebbaren Zeitabstand voneinander auszunutzen und nach Dif erenzbildung auf die jeweilige Konzentration der entsprechenden Substanz zu schließen.However, there is also the possibility of using only at least two fluorescence intensity signals at a predeterminable time interval from one another and, after formation of a difference, inferring the respective concentration of the corresponding substance.
Die Bestimmung der Fluoreszenzintensität kann aber nicht nur zeit- sondern auch ortsaufgelöst gemessen werden. Dies wirkt sich insbesondere vorteilhaft aus, wenn mindestens einer der Partner des jeweiligen Rezeptor-Ligand Systems in radialsymmetrischer Anordnung auf der Bodenplatte des Meßbehälters immobilisiert ist. Hierfür können, wie nachfolgend noch bei der Beschreibung der Ausführungsbeispiele zurückzukommen sein wird, eine bewegliche Blende in Verbindung mit einem lichtempfindlichen Detektor oder eine lineare oder flächenhafte Anordnung von lichtempfindlichen Detektoren, wie z.B. CCD-Zeilen oder CCD-Ar- rays , Verwendung finden. Besonders günstig ist diese Ausführung, wenn die Bodenplatte des Meßbehälters radialsymmetrisch in verschiedene Segmente eingeteilt ist und auf den einzelnen Segmenten verschiedene solcher Partner immobilisiert sind, so daß nahezu gleichzeitig die Konzentration mehrerer chemischer - bzw. biochemischer Substanzen bestimmt werden kann.The determination of the fluorescence intensity can be measured not only in a time-resolved but also in a spatially resolved manner. This has a particularly advantageous effect if at least one of the partners of the respective receptor-ligand system is immobilized in a radially symmetrical arrangement on the base plate of the measuring container. For this purpose, as will be returned below in the description of the exemplary embodiments, a movable diaphragm in connection with a light-sensitive detector or a linear or areal arrangement of light-sensitive detectors, such as CCD lines or CCD arrays, can be used. This version is particularly favorable if the base plate of the measuring container is divided into different segments in a radially symmetrical manner and various such partners are immobilized on the individual segments, so that the concentration of several chemical - or biochemical substances can be determined.
Die Befüllung des Meßbehälters mit der Probe kann auf verschiedenem Wege, z.B. durch Kapillarkraftwirkung, durch Druck- oder Saugkraftwirkung bevorzugt von der Seite des Meßbehälters erreicht werden, wobei auch Kombinationen dieser genannten Wirkungen ausgenutzt werden können .The measuring container can be filled with the sample in various ways, e.g. by capillary action, by pressure or suction action, preferably from the side of the measuring container, and combinations of these effects can also be used.
In vielen Fällen kann es vorteilhaft sein, die Probe vor dem Befüllen des Meßbehälters durch funktionelle Schichten oder entsprechende Membranen zu führen, um an der Probe eine Separation oder Filtration zu erreichen .In many cases it can be advantageous to pass the sample through functional layers or appropriate membranes before filling the measuring container in order to achieve separation or filtration on the sample.
Es kann aber unter Berücksichtigung der jeweilig durchzuführenden biochemischen Assays mit solchen Schichten oder Membranen auch die Freisetzung von chemischen - oder biochemischen Substanzen erreicht werden. In anderer Ausnutzung können solche Schichten oder Membranen auch für einen spezifischen Rückhalt von chemischen - oder biochemischen Substanzen aus der Probe ausgenutzt werden.However, taking into account the respective biochemical assays to be carried out with such layers or membranes, the release of chemical or biochemical substances can also be achieved. In another use, such layers or membranes can also be used for specific retention of chemical or biochemical substances from the sample.
Eine solche Membran kann z.B. aus fibrösem Material, Cellulose, Nitrocellulose, Polypropylen, Polycarbo- nat , Polyvinyldifluorid oder aus einem Hydrogel oder aus Kernspurmembranen oder aus Glasfasern bestehen. Solche Membranen werden beispielsweise in der Dip- Stick-Technologie eingesetzt und können z.B. dieSuch a membrane can e.g. consist of fibrous material, cellulose, nitrocellulose, polypropylene, polycarbonate, polyvinyl difluoride or of a hydrogel or of nuclear track membranes or of glass fibers. Such membranes are used for example in dip stick technology and can e.g. the
Funktion des Conjugate-Release erfüllen. Der Flüssigkeitstransport der Probe durch eine solche Membran erfolgt translatorisch mit überwiegend Kapillarkraftwirkung. Für die Separation zellulärer Blutbestand- teile und/oder zur Erzeugung von Blut-Plasma kann z.B. eine Membran, die unter der Bezeichnung Plasma SEP kommerziell erhältlich ist, verwendet werden.Fulfill the function of the conjugate release. The liquid transport of the sample through such a membrane takes place in a translatory manner with a predominantly capillary force effect. For the separation of cellular blood components and / or for the generation of blood plasma For example, a membrane that is commercially available under the name Plasma SEP can be used.
Wird eine erfindungsgemäße Vorrichtung unter Verwen- düng solcher Schichten bzw. Membranen ausgebildet, so kann die jeweils gewünschte Probenvorbehandlung unmittelbar in der Vorrichtung durchgeführt werden, so daß zusätzlicher Aufwand vermieden werden kann und eine solche Vorrichtung dem letztendlichen Anwender, die einfach handhabbar ist, zur Verfügung gestellt werden.If a device according to the invention is formed using such layers or membranes, the desired sample pretreatment can be carried out directly in the device, so that additional effort can be avoided and such a device, which is easy to handle, is available to the end user be put.
Dabei ist es weiter vorteilhaft, die Probe in einem Probenaufnahmeraum vorzuhalten, der entweder direkt mit dem Meßbehälter oder über mindestens eine funk- tionelle Schicht oder Membran mit dem Meßbehälter verbunden ist, so daß die Probe aus dem Probenaufnahmeraum bei Bedarf in den Meßbehälter, gegebenenfalls bei Durchführung einer entsprechenden Probenvorberei- tung, gelangen kann.It is furthermore advantageous to keep the sample in a sample receiving space, which is either connected directly to the measuring container or to the measuring container via at least one functional layer or membrane, so that the sample can be taken from the sample receiving space into the measuring container, if necessary, if necessary A corresponding sample preparation can be carried out.
Der Meßbehälter kann zusätzlich mit einem Probensammelraum verbunden sein, in dem günstigerweise ein saugfähiges Material enthalten ist, so daß der Pro- benflüssigkeitstransport während der Befüllung ohne weiteres durch Kapillarkraftwirkung erfolgen kann. Bei bekannter Aufnahmekapazität des saugfähigen Materials im Probensammelraum und bekanntem Probenvolumen im Probenaufnahmeraum kann eine definierte Befüllung mit einem gewünschten Probenvolumen in den eigentlichen Meßbehälter erreicht werden, da der Flüssigkeitstransport, bei Erreichen der Saugkapazitätsgren- ze des saugfähigen Materials endet.The measuring container can additionally be connected to a sample collection space, which advantageously contains an absorbent material, so that the sample liquid can be easily transported by capillary force during filling. With a known absorption capacity of the absorbent material in the sample collection space and a known sample volume in the sample reception space, a defined filling with a desired sample volume can be achieved in the actual measuring container, since the liquid transport ends when the suction capacity limit of the absorbent material is reached.
Für die Durchführung der verschiedenen biochemischen Assays bestehen vielfältige Möglichkeiten. Im einfachsten Fall wird die Probe (Vollblut, Plasma oder Serum, Wasser, Urin oder andere) mit einem Fluorophor markierten Reaktanten versetzt . Der entsprechende korrespondierende Partner ist auf der Oberfläche der Bodenplatte ausgebildeten Meßareal immobilisiert. Für die Durchführung, z.B. eines herkömmlichen Sandwich- Immunoassys zur Bestimmung hochmolekularer Verbindungen, wird der Probe z.B. ein entsprechend markierter Detektorantikörper zugefügt und der an der Oberfläche der Bodenplatte auf dem Meßareal immobilisierte Fängerantikörper sorgt für eine Bindung des jeweiligen Analyten und des Detektorantikörpers.For carrying out the various biochemical Assays have a variety of options. In the simplest case, the sample (whole blood, plasma or serum, water, urine or other) is mixed with a fluorophore-labeled reactant. The corresponding partner is immobilized on the surface of the measurement area formed on the base plate. For the implementation, for example a conventional sandwich immunoassy for the determination of high molecular compounds, a correspondingly labeled detector antibody is added to the sample and the capture antibody immobilized on the surface of the base plate on the measurement area ensures binding of the respective analyte and the detector antibody.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung läßt sich wegen der geringeren Begrenzung des ausnutzbaren Volumens innerhalb des Meßbehälters, gegenüber der in DE 196 28 002 C2 beschriebenen Durchflußmeßzelle wesentlich einfacher und kostengünstiger herstellen, da eine Höhenbegrenzung, die für den konvektiven Stofftransport bei der bekannten Durchflußmeßzelle erforderlich war, wegfällt.The device according to the invention can be manufactured much more simply and cost-effectively because of the lower limitation of the usable volume within the measuring container compared to the flow measuring cell described in DE 196 28 002 C2, since a height limitation, which was necessary for the convective mass transport in the known flow measuring cell, is eliminated.
Der Meßbehälter sollte vorteilhaft in seinem Inneren eine befüllbare Höhe im Bereich 0,001 bis 50 mm aufweisen .The inside of the measuring container should advantageously have a fillable height in the range 0.001 to 50 mm.
Nachfolgend soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below on the basis of exemplary embodiments.
Dabei zeigen:Show:
Figur 1 Strömungsprofile entlang zweier Schnitte beim Stofftransport durch eine herkömmliche Durchflußmeßzelle; Figur 2 Strömungsprofile entlang zweier Schnitte, die beim Stofftransport in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung erreicht werden können;Figure 1 flow profiles along two sections in the mass transfer through a conventional flow cell; FIG. 2 flow profiles along two cuts which can be achieved in a device according to the invention during mass transport;
Figur 3 schematisch den Aufbau eines Beispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem rotierenden Element, zur Erzeugung einer kreisförmigen strömenden Bewegung einer Probe;Figure 3 schematically shows the structure of an example of a device according to the invention with a rotating element for generating a circular flowing movement of a sample;
Figur 4 ein weiteres Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem rotierenden Element mit Permanentmagnet und magnetischen Körpern im Meßbehälter, zur Erzeugung einer kreisf rmigen strömenden Bewegung der Probe;Figure 4 shows another example of a device according to the invention with a rotating element with permanent magnet and magnetic bodies in the measuring container, for generating a circular flowing movement of the sample;
Figur 5 ein weiteres Beispiel einer erfindungsgemä- ßen Vorrichtung mit einem rotierenden Element, Wellendurchführung und Schaufeln im Meßbehälter, zur Erzeugung einer kreisförmigen strömenden Bewegung der Probe ;FIG. 5 shows a further example of a device according to the invention with a rotating element, shaft bushing and blades in the measuring container, for generating a circular flowing movement of the sample;
Figur 6 einen radialsymmetrisch in verschiedeneFigure 6 shows a radially symmetrical in different
Segmente unterteilten Meßbehälter;Segmented measuring container;
Figur 7 ein schematisch dargestellten Aufbau einer Meßanordnung, mit den optischen Elementen;FIG. 7 shows a schematically illustrated construction of a measuring arrangement with the optical elements;
Figur 8 ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit integriertem Probenaufnähme- und Probensammelraum;FIG. 8 shows an example of a device according to the invention with an integrated sample receiving and sample collection space;
Figur 9 das in Figur 8 gezeigte Beispiel mit zu- sätzlich im Probensammelraum einsetzbaren saugfähigem Material;9 shows the example shown in FIG. additionally absorbent material that can be used in the sample collection area;
Figur 10 eine schematische Darstellung für eine mögliche Anordnung der Schichten bzw. Membranen für einen Meßbehälter und einem Probensammelraum, bei dem der Flüssigkeitstransport einer Probe zur Befüllung mittels Ka- pillarkraftwirkung erreichbar ist undFIG. 10 shows a schematic illustration of a possible arrangement of the layers or membranes for a measuring container and a sample collection space, in which the liquid transport of a sample for filling can be achieved by means of a capillary force effect, and
Figur 11 ein Beispiel, bei dem ein erfindungsgemäß zu verwendender Meßbehälter von einer funktioneilen Schicht bzw. einer Membran vollständig umschlossen ist.FIG. 11 shows an example in which a measuring container to be used according to the invention is completely enclosed by a functional layer or a membrane.
Bei der Figur 1 ist ein küvettenförmiger Aufnahmebereich einer Durchflußmeßzelle, wie sie aus DE 196 28 002 Cl bekannt ist, dargestellt. Der Stofftransport der Probenflüssigkeit erfolgt translatorisch durch den Kanal, mit quasi rechteckigem Querschnitt, wie dies mit den Pfeilen in der oberen Darstellung angedeutet ist . Die entsprechend der eingezeichneten Schnitte auftretenden Strömungsprofile sind in den linken und rechten unteren Darstellungen gezeigt, wobei eindeutig erkennbar ist, daß die Strömungsgeschwindigkeit der Probenflüssigkeit in der Mitte des Durchflußmeßkanales (Schnitt cd) am größten ist, so daß gerade in dem Bereich, in dem der eine Partner des Rezeptor-Ligand Systems, der auf dem Boden des Flußkanals immobilisiert ist, an den der andere Partner anbinden soll, die Strömungsgeschwindigkeit und demzufolge auch der Stofftransport relativ klein ist.1 shows a cuvette-shaped receiving area of a flow measuring cell, as is known from DE 196 28 002 Cl. The mass transport of the sample liquid takes place translationally through the channel, with a quasi-rectangular cross-section, as indicated by the arrows in the upper illustration. The flow profiles occurring in accordance with the drawn sections are shown in the lower left and right representations, it being clearly recognizable that the flow velocity of the sample liquid is greatest in the middle of the flow measuring channel (section cd), so that precisely in the area in which the a partner of the receptor-ligand system, which is immobilized on the floor of the river channel to which the other partner is to connect, the flow velocity and consequently also the mass transfer is relatively small.
Im Gegensatz dazu können, wie dies aus den Darstel- lungen in Figur 2 hervorgeht, bessere Ergebnisse er- reicht werden, wenn die Probe in einem Meßbehälter 2 in kreisförmig strömende Bewegung versetzt wird, wobei der Meßbehälter 2 günstigerweise eine kreisförmige Bodenplatte 3 , auf dem das entsprechende Meßareal ausgebildet ist, aufweist. Die kreisförmige Ausbildung der Bodenplatte 3 in Verbindung mit der äußeren Mantelfläche des Meßbehälters 2 führt dazu, daß Turbulenzen nur geringfügig auftreten können.In contrast, as can be seen from the illustrations in FIG. 2, better results can be achieved. be sufficient if the sample in a measuring container 2 is set in a circular flowing movement, the measuring container 2 advantageously having a circular base plate 3 on which the corresponding measuring area is formed. The circular design of the base plate 3 in connection with the outer surface of the measuring container 2 means that turbulence can occur only slightly.
Insbesondere in der rechten unteren Darstellung von Figur 2 ist anhand des gezeigten Strömungsprofils einer kreisförmig in einen kreisrunden Meßbehälter strömende Probe verdeutlicht, daß im Zentrum die Probe quasi nit bewegt wird. Die tangentiale Strömungs- geschwindigkeit bei der kreisförmigen Bewegung in radial äußeren Richtung bis zur Erreichung eines Maximums ansteigt und dann in Richtung des äußeren Randes des Meßbehälters weich bis zumindest nahe Null abfällt.In particular, in the lower right-hand illustration of FIG. 2, the flow profile shown shows a sample flowing circularly into a circular measuring container that the sample is quasi-nit moved in the center. The tangential flow velocity increases during the circular movement in the radially outer direction until a maximum is reached and then drops gently in the direction of the outer edge of the measuring container to at least close to zero.
Die Messung des Fluoreszenzlichtes sollte demzufolge, wie nachfolgend bzgl . Figur 6 noch weiter erklärt, lokal begrenzt im Bereich des Strömungsgeschwindig- keitsmaximums , der kreisförmig bewegten Probe erfol- gen.The measurement of the fluorescent light should therefore, as below regarding FIG. 6 explained further, locally limited in the region of the maximum flow velocity, of the circularly moving sample.
In der Figur 3 wird eine weitere Möglichkeit für die Erzeugung der kreisförmig strömenden Bewegung der Probe im Meßbehälter 2 gezeigt . Bei diesem Beispiel kann auf die Zugabe magnetischer Körper in die Probe verzichtet werden, da es sich um ein ausschließlich mechanisches System handelt . Der Meßbehälter 2 ist bei diesem Beispiel oben mit einer elastischen flexiblen Membran 11 abgeschlossen. Auf diese Membran 11 kann ein kreisförmiges, rotierendes Element 5, an dem mehrere Vorsprünge 10 ausgebildet sind, aufgesetzt werden, so daß die Vorsprünge 10 die Membran 11 eindrücken und in die Probenflüs- sigkeit eintauchen. Wird nunmehr das rotierende Element 5 mit einem geeigneten Dreahntrieb in Drehung versetzt, kann die gewünschte kreisförmig strömende Bewegung in der Probe im Meßbehälter 2 erreicht werden und es ist dabei trotzdem gesichert, daß der Meß- behälter 2 geschlossen bleibt.FIG. 3 shows another possibility for generating the circularly flowing movement of the sample in the measuring container 2. In this example, there is no need to add magnetic bodies to the sample, since it is an exclusively mechanical system. In this example, the measuring container 2 is closed at the top with an elastic, flexible membrane 11. A circular, rotating element 5, on which a plurality of projections 10 are formed, can be placed on this membrane 11, so that the projections 10 press the membrane 11 in and immerse it in the sample liquid. If the rotating element 5 is now set in rotation with a suitable dreamer drive, the desired circularly flowing movement in the sample can be achieved in the measuring container 2 and it is nevertheless ensured that the measuring container 2 remains closed.
Bei dem in der Figur 4 gezeigten Beispiel wird wieder ein Meßbehälter 2 verwendet, der nach unten mit einer transparenten Bodenplatte 3, auf die später noch ge- nauer zurückzukommen sein wird, und nach oben mit einer Abdeckung 6 ebenfalls abgeschlossen ist . Im Meßbehälter 2 sind magnetische Körper 9, mit denen nach Befüllung oder während des Befüllens die Probe versetzt werden kann, enthalten. Die magnetischen Körper können sich auch vor der Befüllung am Meßbehälter 2 befinden. Die magnetischen Körper 9 sind günstigerweise relativ kleinformatig und beeinflussen demzufolge das Meßergebnis, wenn überhaupt, nur äußerst geringfügig. Über dem Meßbehälter 2 ist ein rotierendes Element 5, das mit einem hier nicht dargestellten Drehantrieb parallel über der Oberfläche des Meßbehälters 2 gedreht werden kann, vorhanden. Bei diesem Beispiel sind am rotierenden Element 5 mehrere Permanentmagnete 4 im gleichen Abstand von der Drehachse des rotierenden Elementes 5 befestigt, deren Magnetkraftwirkung ausreicht, die Drehbewegung des rotierenden Elementes 5 auf die in der Probe enthaltenen magnetischen Körper 9 und demzufolge auch auf die Probe zu übertragen, so daß diese in kreis- förmig strömende Bewegung versetzt wird. Anstelle der Permanentmagnete 4 können aber auch geeignete Elektromagnete verwendet werden, die z.B. über flexible Leitungen oder Schleifkontakte mit Elektroenergie versorgt werden können.In the example shown in FIG. 4, a measuring container 2 is used again, which is closed at the bottom with a transparent base plate 3, which will be explained in more detail later, and also at the top with a cover 6. Magnetic bodies 9, with which the sample can be mixed after filling or during filling, are contained in the measuring container 2. The magnetic bodies can also be located on the measuring container 2 before filling. The magnetic bodies 9 are advantageously relatively small in size and consequently influence the measurement result only very slightly, if at all. Above the measuring container 2 there is a rotating element 5, which can be rotated parallel to the surface of the measuring container 2 with a rotary drive, not shown here. In this example, a plurality of permanent magnets 4 are attached to the rotating element 5 at the same distance from the axis of rotation of the rotating element 5, the magnetic force effect of which is sufficient to transmit the rotary movement of the rotating element 5 to the magnetic bodies 9 contained in the sample and consequently also to the sample , so that this is put into a circular flowing movement. Instead of the permanent magnets 4, however, suitable electromagnets can also be used, which can be supplied with electrical energy, for example, via flexible lines or sliding contacts.
In der Figur 5 ist ein weiteres Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem Meßbehälter 2 gezeigt . Dabei ist in dem nach oben mit der Abdeckung 6 abgeschlossenen Meßbehälter 2 ein mechanisches Rühr- element 15 aufgenommen, bei dem eine Welle über eine hier nicht dargestellte Öffnung mit Dichtung in der Abdeckung 6 nach außen geführt ist, an die beispielsweise ein rotierendes Element 5 oder ein anderer geeigneter Drehantrieb angreifen kann. Das rotierende Element 5 bzw. der bereits erwähnte Drehantrieb können dann außerhalb des Meßbehälters 2 angeordnet werden.FIG. 5 shows a further example of a device according to the invention with a measuring container 2. In this case, a mechanical stirring element 15 is accommodated in the measuring container 2, which is closed at the top by the cover 6, in which a shaft is guided to the outside via an opening, not shown here, with a seal in the cover 6, to which, for example, a rotating element 5 or another suitable rotary drive can attack. The rotating element 5 or the rotary drive already mentioned can then be arranged outside the measuring container 2.
Welle und rotierendes Element können auch eine Ein- heit darstellen, die zur Abdeckung des Meßbehälters 2 abgedichtet ist.Shaft and rotating element can also be a unit that is sealed to cover the measuring container 2.
Das mechanische Rührelement 15 sollte im Inneren des Meßbehälters 2 so angeordnet und fixiert werden kön- nen, daß eine Beeinträchtigung des an der Bodenplatte 3 immobilisierten Partners bei Drehung des mechanischen Rührelementes 15 vermieden werden kann.The mechanical stirring element 15 should be able to be arranged and fixed in the interior of the measuring container 2 in such a way that impairment of the partner immobilized on the base plate 3 when the mechanical stirring element 15 rotates can be avoided.
Das mechanische Rührelement 15 kann aber auch aus einem ferromagnetischen Material bestehen und wie die bereits erwähnten magnetischen Körper in Drehung versetzt werden, wobei zum einen die Möglichkeit besteht, daß am rotierenden Element 5 Permanentmagnete oder stationäre Elektromagnete vorhanden sind. Wird nun das rotierende Element 5 in Drehung versetzt, bewirken das elektromagnetische oder das magnetische Feld der Magnete, daß sich das mechanische Rührelement 15 ebenfalls in Drehung versetzt.The mechanical stirring element 15 can, however, also consist of a ferromagnetic material and, like the magnetic bodies already mentioned, can be set in rotation, on the one hand there being the possibility that 5 permanent magnets or stationary electromagnets are present on the rotating element. If the rotating element 5 is now rotated, cause the electromagnetic or magnetic field of the magnets that the mechanical stirring element 15 also rotates.
Es kann aber auch anstelle des rotierenden Elementes 5 eine ein rotierendes elektromagnetisches Feld erzeugende Spulenanordnung verwendet werden, um die Rotation des mechanischen Rührelementes 15 zu bewirken.However, instead of the rotating element 5, a coil arrangement generating a rotating electromagnetic field can also be used to effect the rotation of the mechanical stirring element 15.
Wird die Drehbewegung des mechanischen Rührelementes 15 durch elektromagnetische bzw. magnetische Kraftwirkung erreicht, kann das ganze mechanische Rührelement 15 innerhalb des Meßbehälters 2, also auch un- terhalb der oberen Abdeckung 6, die demzufolge keine Öffnung, durch die eine Welle nach außen geführt wird, aufweisen muß, abgeschlossen sein. Es ist lediglich eine Lagerung für das mechanische Rührelement 15 erforderlich, die bevorzugt im Zentrum der kreis- förmigen Bodenplatte 3 sowie im Zentrum der Abdeckung 6, beispielsweise in Form einer Nadellagerung ausgebildet sein kann.If the rotary movement of the mechanical stirring element 15 is achieved by electromagnetic or magnetic force action, the entire mechanical stirring element 15 can be inside the measuring container 2, that is also below the upper cover 6, which consequently has no opening through which a shaft is guided to the outside. must have been completed. All that is required is storage for the mechanical stirring element 15, which can preferably be formed in the center of the circular base plate 3 and in the center of the cover 6, for example in the form of a needle bearing.
Aus Figur 6 ist eine mögliche Variante der Erfindung, bei der eine radialsymmetrische Aufteilung des Meßareals 21 auf der Bodenplatte 3 in einzelne Meßpunkte 22 erfolgt ist, dargestellt. Dabei können die einzelnen Meßpunkte 22 für die Immobilisierung verschiedener Substanzen benutzt werden, so daß in Verbindung mit der zeit- und ortsaufgelösten Messung der Fluoreszenzintensitäten auch mehrere verschiedene Substanzen gleichzeitig berücksichtigt werden können. Im Zentrum des von oben betrachteten Meßbehälters 2 ist ein kreisförmiger Bereich dargestellt, in dem magne- tische Körper angeordnet sind, die bei der Befüllung mit der Probe versetzt und mit denen die kreisförmige strömende Bewegung der Probe im Meßbehälter 2 , wie beim Beispiel nach Figur 3 erreicht werden kann.FIG. 6 shows a possible variant of the invention, in which a radially symmetrical division of the measuring area 21 on the base plate 3 into individual measuring points 22 is shown. The individual measuring points 22 can be used for the immobilization of different substances, so that several different substances can be taken into account simultaneously in connection with the time- and location-resolved measurement of the fluorescence intensities. In the center of the measuring container 2 viewed from above, a circular area is shown, in which magnetic bodies are arranged, which are used for filling mixed with the sample and with which the circular flowing movement of the sample in the measuring container 2 can be achieved, as in the example according to FIG.
Dabei sollte generell, wie oben bereits erwähnt, immer in Bereichen gemessen werden, die zumindest in der Nähe des Strömungsgeschwindigkeitsmaximums liegen.In general, as already mentioned above, measurements should always be carried out in areas that are at least close to the maximum flow velocity.
Das Maximum liegt, wie in Figur 6 verdeutlicht, auf dem Radius R^, um den Mittelpunkt des Meßbehälters 2.As shown in FIG. 6, the maximum lies on the radius R ^ around the center of the measuring container 2.
Die Mittelpunkte der Meßpunkte 22 sollten demzufolge auch auf dem Radius Rm liegen. Der Meßbereich wird durch die äußeren Ränder der Meßpunkte 22, deren Durchmesser sich aus der Differenz Ra - R1 ergibt, begrenzt .The center points of the measuring points 22 should therefore also lie on the radius R m . The measuring range is limited by the outer edges of the measuring points 22, the diameter of which results from the difference R a - R 1 .
Sollte die Größe der Meßpunkte 22 trotzdem zu groß sein, um die Bedingungen einer möglichst hohen Strömungsgeschwindigkeit, bei gleichzeitig nahezu gleichen Strömungsgeschwindigkeiten zu erfüllen, ist es am einfachsten, die Abbildung des Fluoreszenzlichtes auf optischen Detektoren entsprechend zu selektieren, so daß lediglich Fluoreszenzlicht aus einem Bereich, der diese Bedingungen erfüllt, auf einen optischen Detektor einfallen kann oder nur entsprechende Lichtanteile berücksichtigt werden. Für die erste Alternative können am einfachsten optische Blenden, mit ent- sprechenden Öffnungen, die entsprechend bewegt oder drehbar sein können, verwendet werden. Bei der zweiten Alternative können selektiv lediglich einzelne Detektoren eines Detektorarrays ausgenutzt bzw. berücksichtigt werden, mit dem für das einfallende Fluoreszenzlicht diese Bedingungen erfüllt sind. Es sollte mit Strömungsgeschwindigkeiten im Maximum des Strömungsprofils (siehe Figur 2) im Bereich von 5 bis 1000 mm/s gearbeitet und in Bereichen einer laminaren Strömung gemessen werden.If the size of the measuring points 22 is still too large to meet the conditions of the highest possible flow velocity with almost the same flow velocities, it is easiest to select the imaging of the fluorescent light on optical detectors accordingly, so that only fluorescent light from one area which fulfills these conditions, can strike an optical detector or only appropriate light components are taken into account. For the first alternative, the simplest way is to use optical diaphragms with corresponding openings which can be moved or rotated accordingly. In the second alternative, only individual detectors of a detector array can be selectively used or taken into account, with which these conditions are met for the incident fluorescent light. It should work with flow velocities in the maximum of the flow profile (see Figure 2) in the range of 5 to 1000 mm / s and be measured in areas of a laminar flow.
In der Figur 7 ist schematisch ein Meßaufbau dargestellt. Dabei wird ein Strahl 1 einer monochromatisches Licht aussendenden Lichtquelle 23, die z.B. eine Laserlichtquelle mit bekannter Wellenlänge sein kann, auf den prismatisch ausgebildeten Bereich der Bodenplatte 3 eines Meßbehälters 2, in einem an der Grenzfläche (Bodenplatte 3/Probe) Totalreflexion bewirkenden Winkel, gerichtet. Über der Grenzfläche, also auf der Oberfläche der Bodenplatte 3 wird zumin- dest einer der Partner eines Rezeptor-Ligand Systems immobilisiert, an dem der jeweils andere fluoreszenzmarkierte Partner anbinden kann.A measurement setup is shown schematically in FIG. A beam 1 of a monochromatic light emitting light source 23, which e.g. can be a laser light source with a known wavelength, directed onto the prismatic region of the base plate 3 of a measuring container 2, at an angle causing total reflection at the interface (base plate 3 / sample). At least one of the partners of a receptor-ligand system to which the other fluorescence-labeled partner can bind is immobilized above the interface, that is to say on the surface of the base plate 3.
Je nach der Anzahl der angebundenen Partner des Re- zeptor-Ligand Systems ändert sich die Fluoreszenzintensität, die mit dem Laserlichtstrahl 1 angeregt wird.Depending on the number of connected partners of the receptor-ligand system, the fluorescence intensity, which is excited by the laser light beam 1, changes.
Unterhalb des Meßbehälters 2 ist ein optischer Detek- tor 12, mit dem die Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen werden kann, angeordnet.An optical detector 12, with which the intensity of the fluorescent light can be measured, is arranged below the measuring container 2.
Bei dem Meßbehälter 2 und Detektor 12 ist ein hier aus zwei optischen Linsen 13 bestehendes Linsensystem angeordnet, mit dem das Fluoreszenzlicht der einzelnen Meßpunkte 22 auf den lichtempfindlichen Detektor 12 abgebildet werden kann. Über dem Detektor 12 ist eine Blende 14, in der mindestens eine Aussparung vorhanden ist, beweglich angeordnet. Die Blende 14 kann dabei so bewegt, bevorzugt gedreht werden, daß das Licht eines Meßpunktes 22 auf den lichtempfindlichen Detektor 12 auftrifft, so daß eine örtliche Zuordnung der in diesem Moment gemessenen Fluoreszenzintensität zum jeweiligen Meßpunkt 22 erreicht werden kann.A lens system consisting of two optical lenses 13 is arranged in the measuring container 2 and detector 12, with which the fluorescent light of the individual measuring points 22 can be imaged on the light-sensitive detector 12. A diaphragm 14, in which at least one recess is present, is movably arranged above the detector 12. The aperture 14 can be moved, preferably rotated, that the light of a measuring point 22 strikes the light-sensitive detector 12, so that a local assignment of the fluorescence intensity measured at that moment to the respective measuring point 22 can be achieved.
Bei einem in Figur 7 nicht dargestellten Beispiel, kann günstigerweise ein aus mehreren flächig angeordneten einzelnen Detektoren bestehendes Element ver- wendet werden, um mit den einzelnen lichtempfindlichen Detektoren eine ortsaufgelöste Messung durchführen zu können, ohne dabei eine Blende zu benutzen.In an example not shown in FIG. 7, an element consisting of a plurality of individual detectors arranged flatly can advantageously be used in order to be able to carry out a spatially resolved measurement with the individual light-sensitive detectors without using an aperture.
Günstigerweise können Filter 19 und 20 in die Licht- Strahlengänge angeordnet werden, um einmal mit demConveniently filters 19 and 20 can be arranged in the light beam paths in order to use the
Filter 20 eine quasi monochromatische Fluoreszenzanregung zu erreichen und insbesondere mit dem Filter 19 Streulicht der Lichtquelle 23 aus dem Fluoreszenzlicht auszuschließen.Filter 20 to achieve a quasi-monochromatic fluorescence excitation and in particular to exclude stray light from the light source 23 from the fluorescence light with the filter 19.
Anstelle der Ausbildung der Bodenplatte 3 als Prisma, besteht auch in hier nicht dargestellter Form, die Möglichkeit auf oder in die Bodenplatte 3 ein optisches Transmissionsgitter auf- bzw. einzubringen, damit der Lichtstrahl 1 so gebeugt wird, daß Totalreflexion der Grenzfläche (Bodenplatte/Probe) eintritt.Instead of forming the base plate 3 as a prism, there is also the possibility, in a form not shown here, of applying or inserting an optical transmission grating onto or into the base plate 3 so that the light beam 1 is diffracted in such a way that total reflection of the interface (base plate / sample ) entry.
In der Figur 8 ist ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gezeigt, die einem Anwender als ein kompaktes Element zur Verfügung gestellt werden kann.FIG. 8 shows an example of a device according to the invention which can be made available to a user as a compact element.
Die Probe wird hierbei in einen Probenaufnahmeraum 16 eingefüllt und kann den eigentlichen Meßbehälter 2 über eine geeignete Verbindung befüllen. Über eine andere Verbindung kann, beispielsweise überflüssige Probenflüssigkeit oder die Probenflüssigkeit insgesamt, nach Durchführung der Messung in eine Proben- sammelkammer 17 gelangen. Dabei kann die hier gezeigte Vorrichtung ansonsten abgeschlossen ausgebildet werden, so daß unerwünschter Austritt von Probenflüssigkeit vermieden werden kann.The sample is filled into a sample receiving space 16 and can fill the actual measuring container 2 via a suitable connection. Another connection can be used, for example redundant Sample liquid or the sample liquid as a whole, get into a sample collection chamber 17 after the measurement has been carried out. The device shown here can otherwise be designed to be closed, so that undesired leakage of sample liquid can be avoided.
Probenaufnahmeraum 16 und Probensammelraum 17 sind hier seitlich neben dem Meßbehälter 2 angeordnet, so daß die Befüllung und gegebenenfalls auch die Entfernung der Probe von der bzw. zur Seite des Meßbehälters 2 ermöglicht wird. Zumindest die Befüllung sollte jedoch in jedem Fall von der Seite erfolgen, unabhängig davon, ob ein Probenaufnahmeraum 16 vorhan- den ist. So kann die Probe z.B. auch mittels einer Pumpe, in einfachster Form mittels einer herkömmlichen Spritze in den Meßbehälter 2 eingebracht werden.Sample receiving space 16 and sample collecting space 17 are arranged here laterally next to the measuring container 2, so that the filling and possibly also the removal of the sample from or to the side of the measuring container 2 is made possible. At least the filling should, however, always take place from the side, regardless of whether a sample receiving space 16 is present. For example, the sample can also be introduced into the measuring container 2 in the simplest form by means of a conventional syringe by means of a pump.
Bei dem hier gezeigten Beispiel ist ein rotierendes Element 5 angedeutet, das zumindest in die Nähe desIn the example shown here, a rotating element 5 is indicated, which is at least in the vicinity of the
Meßbehälters 2 gebracht und in Rotationsbewegung versetzt werden kann, so daß die gewünschte kreisförmige strömende Bewegung der Probe im Meßbehälter 2 so erreichbar wird, wie dies an anderen Beispielen bereits beschrieben wurde.Brought measuring container 2 and can be set in rotation, so that the desired circular flowing movement of the sample in the measuring container 2 can be achieved as described in other examples.
Das in Figur 9 gezeigte Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, ist im wesentlichen mit dem nach Figur 8 identisch. Es ist lediglich zusätzlich darge- stellt, daß ein saugfähiges Material 18 in den Probensammelraum 17 eingesetzt werden kann, wobei die Saugkraftwirkung in Verbindung mit Kapillarkräften zur Befüllung des Meßbehälters 2 ausgenutzt werden kann . In der Figur 10 ist die mögliche Verwendung von funktioneilen Schichten oder Membranen 7 und 8 dargestellt. Dabei kann die Probe z.B. aus dem Probenaufnahmeraum 16 durch die Membran bzw. Schicht 7 und 8 in den Meßbehälter 2 gelangen, wobei eine gezielte Probenvorbereitung durch entsprechende Materialauswahl oder eine gezielte Inkubation erreicht werden kann .The example of a device according to the invention shown in FIG. 9 is essentially identical to that according to FIG. It is only additionally shown that an absorbent material 18 can be inserted into the sample collection space 17, the suction force effect in connection with capillary forces being able to be used to fill the measuring container 2. FIG. 10 shows the possible use of functional layers or membranes 7 and 8. In this case, the sample can, for example, get from the sample receiving space 16 through the membrane or layers 7 and 8 into the measuring container 2, it being possible to achieve a specific sample preparation by appropriate choice of material or a specific incubation.
Bei dem in Figur 11 gezeigten Beispiel wird eine Membran oder Schicht 8 verwendet, die in der Mitte eine kreisförmige Aussparung, die den eigentlichen Meßbehälter 2 darstellen kann, verwendet. Der Meßbehälter 2 wird nach oben abgeschlossen und weist unten eine Bodenplatte 3, auf dessen Oberfläche ein Partner des Rezeptor-Ligand Systems immobilisiert werden kann, auf .In the example shown in FIG. 11, a membrane or layer 8 is used, which uses a circular recess in the middle, which can represent the actual measuring container 2. The measuring container 2 is closed at the top and has a bottom plate 3 at the bottom, on the surface of which a partner of the receptor-ligand system can be immobilized.
Auch so kann ein geschlossenes System erhalten wer- den, wenn auch die Membran oder Schicht 8 flüssigkeitsdicht umschlossen ist. A closed system can also be obtained in this way if the membrane or layer 8 is also enclosed in a liquid-tight manner.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Durchführung von quantitativen fluoreszenz-markierten Affinitätstests mittels optischer Evanescentfeldanregung, bei dem Licht mindestens einer nahezu monochromatisches Licht aussendenden Lichtquelle, mit einer an einem chemischen oder biochemischen Partner eines allgemeinen Rezeptor-Ligand Systems gebundenen Markierungsstoffes Fluoreszenz hervorrufenden Wellenlänge, an einer optisch transparenten Bodenplatte, als Meßareal eines Meßbehälters, auf der zumindest einer der Partner des Rezeptor-Ligand Systems immobilisiert ist, Totalreflexion er- fährt und die Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen wird, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß eine mit einer je nach biochemischem Assay fluorophormarkierten chemisch- oder biochemi- sehen Substanz versetzte Probe in den Meßbehälter (2) eingefüllt und danach im Meßbehälter (2) in kreisförmige strömende Bewegung versetzt und die Intensität des Fluorszenzlichtes zeitaufgelöst, je nach Affinitätstestformat, zur Bestim- mung der Konzentration mindestens einer chemischen oder biochemischen Substanz, gemessen wird.1. Method for carrying out quantitative fluorescence-labeled affinity tests by means of optical evanescent field excitation, in which light is emitted by at least one light source emitting almost monochromatic light, with a wavelength which causes fluorescence bound to a chemical or biochemical partner of a general receptor-ligand system, on an optically transparent wavelength Bottom plate, as the measuring area of a measuring container on which at least one of the partners of the receptor-ligand system is immobilized, undergoes total reflection and the intensity of the fluorescent light is measured, characterized in that one is chemically or biochemically labeled with a fluorophor, depending on the biochemical assay Substance-filled sample is poured into the measuring container (2) and then set into a circular flowing movement in the measuring container (2) and the intensity of the fluorescent light is time-resolved, depending on the affinity test tformat, for determining the concentration of at least one chemical or biochemical substance.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßbehälter (2) über mindestens eine Öffnung mit der Probe be- füllt und durch die der Bodenplatte (3) gegenüberliegende geschlossenen Abdeckung (6, 11) des Meßbehälters (2) hindurch die Probe in eine kreisförmige strömende Bewegung versetzt wird. 2. The method according to claim 1, characterized in that the measuring container (2) filled via at least one opening with the sample and through the bottom plate (3) opposite the closed cover (6, 11) of the measuring container (2) through the sample in a circular flowing motion.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die Probe im Anschluß an die Befüllung und nach Ablauf von chemischen- oder biochemischen Reaktionen im Pro- benvolumen in kreisförmige strömende Bewegung versetzt wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the sample is placed in a circular flowing movement in the sample volume after the filling and after the completion of chemical or biochemical reactions.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß der Anstieg oder das Absinken der Intensität des Fluoreszenzlichtes innerhalb mindestens eines vorgebbaren Zeitintervalls, je nach Affinitätstestformat, zur Bestimmung der chemischen - oder biochemischen Substanz (en) gemessen wird.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the increase or decrease in the intensity of the fluorescent light is measured within at least a predetermined time interval, depending on the affinity test format, for determining the chemical or biochemical substance (s).
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Differenz zweier in vorgebbaren Zeitabständen gemessener Fluoreszenzintensitätssignale, je nach Affinitätstest- format, zur Bestimmung der chemischen - oder biochemischen Substanz (en) herangezogen wird.5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the difference between two fluorescence intensity signals measured at predetermined time intervals, depending on the affinity test format, is used to determine the chemical - or biochemical substance (s).
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe zumindest während der Messung in eine gleichförmige, unbeschleunigte kreisförmige Bewegung versetzt wird.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the sample is at least during the measurement in a uniform, unaccelerated circular movement.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Probe magneti- sehe Körper zugegeben und die strömende Bewegung mittels eines stationären rotierenden oder zeitlich veränderlichen magnetischen oder elektromagnetischen Feldes in unmittelbarer Nähe des Meßbehälters (2) erzeugt wird. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the sample see magnetic body added and the flowing movement is generated by means of a stationary rotating or time-varying magnetic or electromagnetic field in the immediate vicinity of the measuring container (2).
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die strömende Bewegung der Probe mit rotierenden Elementen (5) mechanisch durch die der Bodenplatte (3) des Meßbehälters gegenüberliegende geschlossene Abdeckung (6, 11) hindurch erzeugt wird.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the flowing movement of the sample with rotating elements (5) is generated mechanically through the closed cover (6, 11) opposite the base plate (3) of the measuring container.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Bodenplatte (3) des Meßbehälters (2) mindestens ein Partner des Rezeptor-Ligand Systems in radialsymmetrischer Anordnung immobilisiert ist und das Fluoreszenzlicht entsprechend ortsaufgelöst gemessen wird.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that on the base plate (3) of the measuring container (2) at least one partner of the receptor-ligand system is immobilized in a radially symmetrical arrangement and the fluorescent light is measured in a correspondingly spatially resolved manner.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenz - licht unterhalb des Bereichs der maximalen Strömungsgeschwindigkeit des Strömungsprofils, der in kreisförmige Bewegung versetzten Probe gemessen wird.10. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the fluorescent light is measured below the range of the maximum flow velocity of the flow profile of the sample set in circular motion.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Fluoreszenzlicht selektiv unterhalb des Bereichs eines mittleren11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that fluorescent light selectively below the range of a middle
Radius R^, um den Mittelpunkt des kreisrunden Meßbehälters (2), in dem die Probe mit der größten Strömungsgeschwindigkeit bewegt wird, gemessen wird.Radius R ^, around the center of the circular measuring container (2), in which the sample is moved with the highest flow velocity, is measured.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Befüllung des Meßbehälters (2) von der Seite durch Kapillar- kraftwirkung, Druck- oder Saugkraftwirkung er- reicht wird. 12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that the filling of the measuring container (2) is achieved from the side by capillary action, pressure or suction.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Befüllen des Meßbehälters (2) die Probe durch mindestens eine funktioneile Schicht oder Membran (7, 8) geführt wird.13. The method according to claims 1 to 12, characterized in that the sample is passed through at least one functional layer or membrane (7, 8) before filling the measuring container (2).
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine funktioneile Schicht oder Membran (7, 8) zur Separation oder Filtration verwendet wird.14. The method according to claim 13, characterized in that at least one functional layer or membrane (7, 8) is used for separation or filtration.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine funktionelle Schicht oder Membran (7, 8) zur Freisetzung von chemischen oder biochemischen15. The method according to claim 13, characterized in that at least one functional layer or membrane (7, 8) for the release of chemical or biochemical
Substanzen zur Durchführung des jeweiligen biochemischen Assays verwendet wird.Substances used to carry out the respective biochemical assay.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine funktioneile Schicht oder Membran (7, 8) für einen spezifischen Rückhalt von chemischen oder biochemischen Substanzen aus der Probe verwendet wird.16. The method according to claim 13, characterized in that at least one functional layer or membrane (7, 8) is used for a specific retention of chemical or biochemical substances from the sample.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in den Messbehälter (2) von der Seite eingefüllt oder zur Seite entfernt wird.17. The method according to any one of claims 1 to 16, characterized in that the sample in the measuring container (2) is filled from the side or removed to the side.
18. Vorrichtung zur Durchführung von quantitativen Fluoreszenz markierten Affinitätstests mittels optischer Evanescentfeldanregung, bei der Licht mindestens einer nahezu monochromatisches Licht aussendenden Lichtquelle, mit einer an einem chemischen oder biochemischen Partner eines allgemeinen Rezeptor-Ligand Systems gebundenen Markierungsstoffes Fluoreszenz hervorrufenden Wellenlänge, auf eine optisch transparente Boden- platte, als Meßareal eines Meßbehälters, auf der zumindest einer der Partner des Rezeptor-Ligand Systems immobilisiert ist, gerichtet und die Intensität des Fluoreszenzlichtes mit einem Detektor gemessen wird, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß ein die Probe im Meßbehälter (2) in kreisförmige strömende Bewegung versetzendes Element (5) außerhalb des Meßbehälters (2) , gegenüber der Bodenplatte (3), angeordnet ist und der Meß- behälter (2) an der der Bodenplatte (3) gegenüberliegenden Seite mit einer Abdeckung (6, 11) abgeschlossen ist .18. Device for carrying out quantitative fluorescence-marked affinity tests by means of optical evanescent field excitation, in which light is emitted by at least one almost monochromatic light source, with one at a chemical or biochemical partner of a general receptor-ligand system-bound marker substance causing fluorescence, directed onto an optically transparent base plate, as measuring area of a measuring container, on which at least one of the partners of the receptor-ligand system is immobilized, and the intensity of the fluorescent light a detector is measured, characterized in that an element (5) which sets the sample in the measuring container (2) in a circular flowing movement is arranged outside the measuring container (2), opposite the base plate (3), and the measuring container (2) is on the side opposite the base plate (3) is closed with a cover (6, 11).
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß am rotierenden Element (5) mindestens ein Permanentmagnet oder ein stationärer Elektromagnet (4) angebracht ist.19. The apparatus according to claim 18, characterized in that at least one permanent magnet or a stationary electromagnet (4) is attached to the rotating element (5).
20. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine ein rotierendes elektromagnetisches Feld erzeugende Spulenanordnung in unmittelbarer Umgebung des Meßbehälters (2) vorhanden ist.20. The apparatus according to claim 18, characterized in that a coil arrangement generating a rotating electromagnetic field is present in the immediate vicinity of the measuring container (2).
21. Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß sich magnetische Körper (9) im Meßbehälter (2) befinden. 21. The apparatus according to claim 19 or 20, characterized in that there are magnetic bodies (9) in the measuring container (2).
22. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß innerhalb des Meßbehälters (2), gegenüber der Bodenplatte (3) ein mechanisches Rührelement (15) vorhanden ist, das in nicht dauerhaftem Kontakt mit dem rotierenden22. The apparatus according to claim 18, characterized in that a mechanical stirring element (15) is present within the measuring container (2), opposite the base plate (3), which is in non-permanent contact with the rotating
Element (5) außerhalb der Meßzelle (2) steht.Element (5) is outside the measuring cell (2).
23. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß am rotierenden Ele- ment (5) außerhalb des Meßbehälters (2) in Richtung auf die im Meßbehälter (2) aufgenommene Probe weisend, Vorsprünge (10) ausgebildet sind.23. The device according to claim 18, characterized in that projections (10) are formed on the rotating element (5) outside the measuring container (2) in the direction of the sample received in the measuring container (2).
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorsprünge (10) auf eine, den Meßbehälter (2) und die Probe gegenüber der Bodenplatte (3) nach oben abdeckende elastische Membran (11) wirken und über die Membran (11) in die Probe eintauchen.24. The device according to claim 23, characterized in that the projections (10) on one, the measuring container (2) and the sample with respect to the bottom plate (3) upwardly covering elastic membrane (11) and act on the membrane (11) in immerse the sample.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die als Meßareal fungierende Bodenplatte (3) kreisrund ist.25. Device according to one of claims 18 to 24, characterized in that the base plate (3) acting as the measuring area is circular.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Bodenplatte (3) mindestens ein Partner eines Rezeptor-Ligand Systems radialsymmetrisch immobilisiert ist.26. Device according to one of claims 18 to 24, characterized in that on the base plate (3) at least one partner of a receptor-ligand system is immobilized radially symmetrically.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Detektor (12) und Bodenplatte (3) ein abbildendes Linsensystem (13) angeordnet ist. 27. The device according to one of claims 18 to 26, characterized in that an imaging lens system (13) is arranged between the detector (12) and base plate (3).
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Detektor (12) und Bodenplatte (3) eine bewegliche Blende (14) angeordnet ist.28. Device according to one of claims 18 to 27, characterized in that a movable diaphragm (14) is arranged between the detector (12) and the base plate (3).
29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (12) eine lineare oder flächenhafte Anordnung von lichtempfindlichen Detektoren ist.29. Device according to one of claims 18 to 28, characterized in that the detector (12) is a linear or planar arrangement of light-sensitive detectors.
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Bodenplatte30. Device according to one of claims 18 to 29, characterized in that between the base plate
(3) und Detektor (12) mindestens ein optisches Filter (19) angeordnet ist.(3) and detector (12) at least one optical filter (19) is arranged.
31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang (1) des Lichts zwischen Lichtquelle (23) und Bodenplatte (3) mindestens ein optisches Filter (20) angeordnet ist.31. The device according to one of claims 18 to 30, characterized in that at least one optical filter (20) is arranged in the beam path (1) of the light between the light source (23) and the base plate (3).
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Bodenplatte (3) des Meßbehälters (2) aus einem transparenten Ma- terial in Form eines optischen Prismas ausgebildet ist.32. Device according to one of claims 18 to 31, characterized in that the base plate (3) of the measuring container (2) is formed from a transparent material in the form of an optical prism.
33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß auf oder in der transparenten Bodenplatte (3) ein optisches33. Device according to one of claims 18 to 32, characterized in that an optical on or in the transparent base plate (3)
Transmissionsgitter aufgebracht oder eingebracht ist . Transmission grid is applied or introduced.
34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Meßbehälter34. Device according to one of claims 18 to 33, characterized in that in front of the measuring container
(2) mindestens eine funktioneile Schicht oder Membran (7, 8) angeordnet ist, aus der die Probe in den Meßbehälter (2) gelangt.(2) at least one functional layer or membrane (7, 8) is arranged, from which the sample reaches the measuring container (2).
35. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßbehälter (2) mit einem Probenaufnahmeraum (16) , aus dem die Probe in den Meßbehälter (2) gelangt, verbunden ist .35. Device according to one of claims 18 to 33, characterized in that the measuring container (2) with a sample receiving space (16) from which the sample reaches the measuring container (2) is connected.
36. Vorrichtung nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus dem Probenaufnahmeraum (16) durch mindestens eine funktioneile Schicht oder Membran (7, 8) in den Meßbehälter (2) gelangt.36. Apparatus according to claim 34 or 35, characterized in that the sample from the sample receiving space (16) passes through at least one functional layer or membrane (7, 8) in the measuring container (2).
37. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßbehälter (2) mit einem Probensammelraum (17) verbunden ist.37. Device according to one of claims 18 to 36, characterized in that the measuring container (2) is connected to a sample collecting space (17).
38. Vorrichtung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß im Probensammelraum (17) ein saugfähiges Element (18) enthalten ist.38. Apparatus according to claim 35, characterized in that an absorbent element (18) is contained in the sample collecting space (17).
39. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 35 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß Probenaufnahmeraum (16) und/oder Probensammelraum (17) seitlich neben dem Meßbehälter (2) angeordnet und über je eine Öffnung mit dem Meßbehälter (2) verbunden ist/sind. 39. Device according to one of claims 35 to 38, characterized in that sample receiving space (16) and / or sample collecting space (17) is arranged laterally next to the measuring container (2) and is / are connected via an opening to the measuring container (2).
40. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßbehälter (2) in seinem Inneren eine befüllbare Höhe im Bereich von 0,001 bis 50 mm aufweist.40. Device according to one of claims 18 to 39, characterized in that the measuring container (2) has in its interior a fillable height in the range of 0.001 to 50 mm.
41. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Messpunkte (22) auf der Bodenplatte (3) unterhalb der in kreisförmige Bewegung versetzten Probe, im Bereich des Maximums des Strömungsprofiles angeordnet sind. 41. Device according to one of claims 18 to 40, characterized in that the measuring points (22) on the base plate (3) below the sample set in circular motion are arranged in the region of the maximum of the flow profile.
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