WO2001008799A1 - Mikrofluidischer reaktionsträger mit drei strömungsebenen und transparenter deckschicht - Google Patents

Mikrofluidischer reaktionsträger mit drei strömungsebenen und transparenter deckschicht Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic reaction carrier which, depending on the embodiment, enables purely fluidic or also light-controlled synthesis and analysis of oligomers or polymers.
  • any other application as a miniaturized chemical or biochemical synthesis and analysis platform is conceivable, for example, for use in combinatorial chemistry.
  • Microfluidic systems are generally still at the beginning of their development. However, they are already an important area e.g. in the field of micropumps or microvalves. The focus of current work in this area is on the production of miniaturized structures, preferably using methods from semiconductor technology. Microdosing systems link microminiaturized pumps and valves with sensors for control and regulation circuits. Such systems are currently being developed and tested for special applications, e.g. for drug dosing or the dosing of the smallest amounts of liquid in a free jet according to the principle of an inkjet printer. These are used, for example, for the production of “polymer probe arrays” by spraying various biochemical substances onto defined positions on a carrier body.
  • microfluidic systems for example in chemical microreactors or in bioreactors, but also in chemical analysis systems, has so far been little investigated. If there is a need for very rapid mixing, very high mixing rates can be achieved by using specially designed vortex sections or by using a mixer that is also miniaturized.
  • the development of micromixers has not yet reached market maturity and is still largely at an experimental stage.
  • the interaction of fluid and wall, as it is important for the microfluidic reaction carrier according to the invention, has not yet been examined in detail.
  • the implementation of complete microfluidic analysis systems has so far only been carried out in a few cases, for example in systems for analyzing the heavy metal content in groundwater.
  • Various established silicon technologies such as, for example, isotropic and anisotropic etching, are preferably used for the production of test and functional samples of such microfluid analysis systems.
  • micro-injection molding miniaturized hot stamping processes (hot molding) or the so-called LIGA (light-induced galvano-molding) technology.
  • hot molding miniaturized hot stamping processes
  • LIGA light-induced galvano-molding
  • the reaction carrier according to the invention contains a structure of microchannels of different sizes, geometries and functions. Some of the microchannels are used for
  • the reaction carrier is flowed through either in a two- or a three-dimensional structure.
  • the two-dimensional design variant consists of at least one supply and one discharge channel in one flow plane. These two channels are connected by several channels running approximately perpendicularly thereto, these vertical connecting channels serving as preferred reaction areas.
  • the reaction channels thus created can likewise be subdivided into smaller channels, each reaction channel comprising one or more reaction areas. These reaction areas can for example be arranged along the channel.
  • the more complex three-dimensional version consists of three flow levels.
  • the feed channels are each arranged parallel to one another in a first flow level and the discharge channels are each arranged parallel to one another in a third flow level, feed and discharge channels being arranged in a perpendicular projection either parallel to one another or at an angle to one another, this angle preferably being approximately equal to 90 ° is chosen.
  • vertical channels are also arranged, which form a third flow level and connect the feed channels of the first to the discharge channels of the third level.
  • reaction channels together form a reaction area. This creates the technical requirements for a very fast, efficient and therefore inexpensive provision of a large number of reaction areas, for example for the integrated synthesis of a large number of polymer probes and the analysis of a large number of polymer fragments by means of these probes.
  • the fluids are discharged from the reaction areas without any contact of these fluids with another
  • Reaction area of the entire reaction carrier would take place. Most of all, this is relevant for reactions whose waste products could damage or destroy other reaction areas.
  • All three variants of the microfluidic reaction carrier according to the invention each have a top layer on the top and bottom.
  • at least one of the cover layers is transparent, in order to enable light-controlled photoactivation in the individual reaction areas by individual exposure, e.g. by means of a programmable light source matrix, as described in patent application 199 07 080.6.
  • All three variants are preferably carried out with two transparent cover layers in order to enable permanent optical process control in the reaction support and the measurement of detection reactions in transmitted light.
  • the more complex three-dimensional structure with the feed and discharge channels rotated by an angle enables the individual flushing of each individual reaction area from the vertically arranged microchannels. This is done by flushing a supply channel with fluid and removing fluid at a discharge channel. The fluid flows through the feed channel into the vertical microreaction channels and through the discharge channel back out of the reaction carrier. In the same way, several reaction areas can also be flushed simultaneously, and this even with different fluids.
  • the microfluidic reaction carrier according to the invention with the "cross structure" caused by the angled arrangement thus opens up a variety of applications in combinatorial chemistry or DNA analysis.
  • Another application is the alternating flow of feedstocks to all feed and discharge channels, the function of the fluid feed and removal of the feed and discharge channels changing from cycle to cycle. If, for example, each channel is flushed with a different building block of a polymer probe to be synthesized, a large variety of oligomer or polymer probes can be used in the individual by using the cross structure in a few cycles
  • reaction areas of a reaction carrier are generated.
  • the synthesis of any specific individual probe in a reaction area is possible without problems through the individual control of a reaction area described above.
  • the microfluidic reaction support according to the invention with the cross structure thus offers the possibility of efficient wet-chemical oligomer probe or polymer probe synthesis of “probe arrays”. This procedure is referred to below as fluidic multiplexing. In-situ synthesis by means of process monitoring as well as the integrated synthesis and analysis are possible.
  • microfluidic reaction carrier is integrated as a solid component in a device and between applications e.g. is dry cleaned and only needs to be changed for maintenance purposes. If the microfluidic reaction carrier is replaced after each use, however, direct integration is not sensible. Rather, it is then advisable to arrange the components in the system accordingly.
  • the invention also relates to the supply of the microfluidic reaction carrier with the corresponding fluids.
  • a new, integrated valve system was also designed for this purpose. This allows a large number of fluids to be quickly provided at the feed and discharge channels of the microstructure.
  • This fluid supply system is designed for the application of the microfluidic reaction carrier according to the invention for the construction of oligomer or polymer probe arrays in the reaction areas.
  • the supply system is the same in the connections and components for the “upper” and “lower” feed and discharge channels. From one side, all channels are individually supplied via a multiplex valve described below. All channels are brought together at the associated other channel end, this joining being used for the supply and discharge with uniform purging of all reaction areas.
  • oligomer or polymer probes in the reaction areas, these are all cycles apart from the supply of the specific individual building blocks, for example consisting of one or more nucleotides in the case of DNA synthesis. If you want to reach all reaction areas and not select them specifically, it is better to choose a flow-optimized feed, such as dual branching, than via the multiplex valve with the higher risk of carry-over.
  • the valve is required to feed the specific modules. This connects the microchannels of the reaction carrier on one side with a maximum equal number of individual tanks as well as a collective connection on the other side. In one position of the valve, a tank is connected to one or more channels of the reaction carrier.
  • the fluid of a tank is to get into more than one channel or a channel bundle of the reaction carrier in one cycle, only one channel and then further channels are supplied serially.
  • the collective connection corresponds to the merging of the channels on the opposite side of the reaction carrier. It is used for the efficient flushing of the valve and reaction carrier.
  • connection of the microfluidic reaction carrier to its fluid supply and disposal is an important element. If the reaction carrier is cleaned and reused again and again in the specific application, a complex connection technology, for example to the multiplex valve, can be provided. • Here, in particular with a large number of channels, an implementation analogous to the semiconductor processor technology with a large number of smallest channels in so-called "legs" is possible. In terms of flow technology, this version has the disadvantage of the risk of deposits in the bends and kinks of the individual microchannels. Backwashing can be provided here to avoid carryover. In the application variant, in which the reaction carrier is replaced after each application, fast connections that do not seal are necessary.
  • a flat connection can be made to the end face of the reaction support with a continuous bend-free channel. The risk of carry-over is therefore minimal.
  • a second alternative is to press the underside of the reaction carrier onto the fluid supply. Suitable chemical-resistant seals must be provided.
  • One aspect of the invention is to be understood as a cleaning, in particular a complete regeneration of the reaction carrier. In the regenerated state, this can then be used again for a new polymer synthesis.
  • chemical cleaning it is preferable to ensure that the connection point necessary for the connection of a first polymer component is not destroyed.
  • the predetermined breaking point required for chemical cleaning can be split by chemical (e.g. wet chemical, photochemical, electrochemical) or by biological (e.g. enzymatic) transformation. This can be done through a one-step or multi-step process.
  • the predetermined breaking point is preferably provided during the first surface derivatization of the microfluidic reaction carrier - preferably in the linker system that connects the surface with the first polymer component. It is ensured in each case that the predetermined breaking point cannot be broken by the analytes or reagents used, neither during synthesis nor during analysis.
  • the predetermined breaking point is broken by a single transformation.
  • these are base-labile linkers, acid-labile linkers, oxidation-labile linkers or degradation with the aid of suitable enzymes.
  • the polymer or oligomer probes linked to the reaction support are cleaved or "digested" with a DNA or RNA-degrading enzyme or a peptide-cleaving enzyme, which leads to partial or complete degradation of the probes.
  • the reaction support can then be used again for the synthesis of new probes.
  • Suitable enzymes are nucleases such as exonucleases or endonucleases, which attack a strand of nucleic acid from the ends or within the probe strand and leave nucleotides or nucleosides as cleavage products.
  • nucleases such as exonucleases or endonucleases
  • RNAsen such as RNAse H etc.
  • the regeneration of a reaction carrier with DNA probes can also be achieved by using DNAsen (DNAse I, DNAse II, etc.), whereby both single-stranded and double-stranded DNA can be degraded.
  • Peptide-cleaving enzymes can also be used as a predetermined breaking point for the degradation of peptide probes or peptide sequence sections.
  • Multi-stage process The predetermined breaking point is broken in a multi-stage process, ie the predetermined breaking point is masked in a form. This requires that this masking is first removed in one or more steps before in the subsequent step the predetermined breaking point can then ultimately be broken.
  • a masked photolabile linker can be used, in which an o-nitro function necessary for the photolability is only generated by an upstream transformation. This can e.g. by oxidation of an amino function. This - not necessarily specific - oxidation step can be carried out enzymatically or wet-chemically. Once the o-nitro function has been generated, the predetermined breaking point can then be split by exposure to light.
  • a double-stranded DNA sequence can be generated in a first step by adding an analyte complementary to the linker, which is then recognized in the following step by a special enzyme (restriction enzyme) and specifically cleaved.
  • a special enzyme restriction enzyme
  • RNA section is used as a probe “base”
  • chemical regeneration of the reaction carrier can also take place in several stages.
  • the synthesis is first carried out using 2'-OH-protected phosphitamide building blocks. After hybridization and analysis, the protective group of the RNA section is split off for regeneration, resulting in a free 2'-OH group.
  • the ribose sugar can then be cleaved in a subsequent chemical reaction step using periodate or other oxidizing agents and the probe can be removed from the reaction carrier by ⁇ -elimination.
  • microfluidic reaction carrier according to the invention is constructed in several layers, as is also customary in semiconductor microtechnology. A distinction can be made between a division of the microstructure into functional layers and construction-related layers.
  • a three-dimensional structure consists of at least five functional layers. These functional layers are described in more detail below. In production, several of these functional layers can often be integrated into a construction-related layer using suitable manufacturing processes.
  • the functional layers of the two-dimensional structure contain a middle structure layer into which the microflow structure comprising channels, reaction areas and reservoirs is introduced. It is connected to an upper and a lower cover layer and can be made of glass, plastic or silicon. Depending on the version, the material used can be transparent or opaque. For example, Futoran glass from Schott, silicon or Teflon is recommended as the opaque material.
  • the three-dimensional structures consist of five functional layers.
  • a first, "upper” top layer an underlying structure of microchannels for fluid supply and discharge in a manner analogous to the two-dimensional structure, a middle plane of vertical (preferably at least a factor of 10) smaller microchannels, which serve as reaction areas.
  • Bottom there is again a level for fluid supply and a cover layer, both of which are designed analogously to the "top”.
  • the reaction support is constructed in mirror image to a middle level Feed and discharge structures are possible in the middle layer as well as in the top layer.
  • the middle layer with the vertical microchannels as reaction areas for example, suitable silicon wafers from semiconductor technology with etched "pores" from Siemens or fused glass fibers (fiberglass wafers ) from Schott with etched cores and a size ratio between wall thickness and channel cross section of preferably 1 to 5 can be used.
  • the middle functional level can be supplemented by an upper and a lower intermediate layer. This prevents or impedes an undesired inflow of fluids (hydrophilic or hydrophobic barriers).
  • Bonding processes are used as connection technologies for silicon, glass and fiberglass wafers (with and without core).
  • the parts, such as the various wafers, are manufactured using etching techniques as well as sawing and polishing.
  • Processes such as injection molding, hot stamping or LIGA are used to use plastics such as Teflon, which is opaque, and COC or polystyrene, which is transparent.
  • the connection of components is e.g. by means of gluing or ultrasonic welding or by mechanical pressure sealing using a holder or a frame.
  • the top cover layer closes off the underlying microflow structure to the outside. This creates the microchannels.
  • the layer is designed to be translucent for the entry of light into these channels.
  • microlenses in glass from the company Mikroglas or Kunststoff (IMM Mainz) can also be used.
  • a honeycomb structure made of melted glass fibers, which was developed by Schott or ITT, for example, and is used for night vision devices, for example.
  • long bundles of glass fibers are heated so that they melt together and form a unit. In this way, a "rod" is created, from which it is then removed and oiled. These can then be bonded with glass or silicon or glued or welded with plastics.
  • the intended use of the microfluidic reaction carrier according to the invention is used as follows: First, a group of reaction areas is controlled by the microchannels of a two- or three-dimensional microstructure. After the reaction there, the reaction products formed in the individual reaction areas are discharged through microchannels without the reaction products flowing through a further reaction area.
  • a control of the reaction areas in the described three-dimensional cross structure for the purely fluidic synthesis of oligomers or polymers from mono-, oligo- or polymers, or also to accelerate the light-controlled synthesis or a combined wet-chemical and light-controlled synthesis of oligomers or polymers by the described intelligent multiplexing of the input materials can be used.
  • reaction areas and microchannels are visually checked using transparent cover layers as a platform for in-situ synthesis, permanent process control and regulation of the processes in the microstructure.
  • Light signals from detection reactions which arise in the reaction areas by chemical (e.g. luminescence), biochemical (e.g. bioluminescence) or light-induced (e.g. fluorescence) reactions can be integrated in an integrated ' synthesis and analysis device surrounding the fluidic microprocessor, as described in the patent application 19924327.1 is described.
  • Absorption measurements in the reaction carrier are also possible by detecting light signals which cross the microchannels and reaction areas in the transmitted light process or are reflected in the rear light process. This can be used, for example, for extended qualitative quality assurance.
  • reaction products are removed from each reaction area without another reaction area coming into contact with the reaction products. This enables reactions to be carried out for synthesis and analysis in the reaction areas which produce reaction products (end products or intermediates) which would be harmful to other reaction areas.
  • the three-dimensional microchannels Compared to planar surfaces, the three-dimensional microchannels have a larger surface that can be used as a solid phase.
  • the use of microstructures reduces the amount of fluid required for the reactions and at the same time increases the reaction speed. This applies both to covalent bonds and, for example, to the hybridization times in applications in DNA, RNA, PNA, LNA analysis or in protein applications.
  • Transparent cover layers enable photoreactions, for example for the light-controlled synthesis of DNA, RNA, PNA, LNA or proteins, etc.
  • the transparent cover layers enable permanent process control for the regulation of the reactions as well as the fluidics in the reaction carrier. This significantly reduces errors in both production and detection, which increases the number of measurements that can be evaluated per use of material and time.
  • a suitable design of the geometry of the individual reaction areas and of the microchannels between the reaction areas allows the beam paths to be influenced in a targeted manner, taking into account the refractive indices that occur in the reaction support.
  • the fluidic microprocessors according to the invention can be designed as simple components for single use. In principle, inexpensive plastic structures are preferred here, but glass and silicon or material combinations are also possible. The fast and inexpensive production will enable a variety of individual applications, in which e.g. probe arrays can be specifically synthesized and analyzed on the Internet, taking sequence and gene databases into account.
  • reaction areas are always three-dimensional and have a considerably larger surface area than the planar base area.
  • H ph between are located in the middle Sch i ent 4 u Reaction channels in the reaction areas 204.
  • the cover layers 20 and 30 are optionally transparent or opaque.
  • 5a , 5b and 5c again show the representations of FIGS. 4a, 4b and 4c.
  • the sectional views of the micro-S illustrate grapplture 200 the course of flow through the feed and discharge channels 202 and 203, as well as the reaction channels 201 in the reaction areas 204.
  • Fig. 6 shows the representation of a single two-dimensional flow structure analogous to Figure 1 with modified cross sections of the feed channels 2 and the discharge channels 3 for targeted flow control.
  • the reaction channels 4, each with at least one reaction area, are in here
  • FIG. 7 a shows, analogously to FIG. 6, a single two-dimensional flow structure with cross sections of the feed channels 2 and the discharge channels 3 that have changed in the height of the channels for targeted flow influencing.
  • the reaction channels 4, each with at least one reaction area, are in here
  • FIG. 8 shows the representation of a three-dimensional flow structure analogous to FIG. 2 and 3 with altered uerterrorismen Q of the feed channels 102 and the discharge channels 103 for the targeted influencing the flow.
  • FIG. 9 shows a representation analogous to FIG. 8, the reaction areas 104 having different sizes corresponding to the size of the feed channels 102 and discharge channels 103.
  • 10a , 10b and 10c show a representation analogous to FIGS. 3a, 3b and 3c, the feed channels 102 and the discharge channels 103 changing in height and thus influencing the flow.
  • the reaction regions 104 and the reaction channels 101 are uniformly long, owing to the thickness of the middle structural layer 40.
  • 11a, 11b, 11c, 11d and 11e show a three-dimensional cross structure of the flow in a representation analogous to FIGS. 4a, 4b, 4c, 4d and 4e and 5a, 5b and 5c with changed cross sections of the feed channels 202 and discharge channels 203 targeted flow control.
  • the reaction channels in the reaction areas 204 are unchanged
  • FIG. 12a shows the representation of FIG. 5c of the cross structure with two detail variants 12b and 12c.
  • the detail 12b shows the structure of the cover layers 10 and 20 and a middle layer 40 with the reaction areas in the reaction channels 201 and the feed channels 202 and
  • the reaction channels 201 from variant 12b are each replaced by a three-layer microstructure. This comprises two layers 301 and 303 for smoothing and stabilizing the inflow and outflow 202 and 203 and an actual reaction layer 302 made of further microchannels or, for example, a glass fleece.
  • FIG. 13 shows a connection variant of the micro cross structure 200 according to FIGS. 4a, 4b, 4c, 4d, 4e and 5a, 5b and 5c with two micro-flow channel variants 401 and 402. Both variants connect a channel for the fluid supply 400 to all parallel channels 202 and 203 of the two levels. In this way, all reaction areas 204 can be simultaneously on different access points
  • Drain variants can be flushed with fluid.
  • FIG. 14 shows a representation analogous to FIG. 13 with two valves 500 integrated into the fluid supply. These supply the microchannel structure 200 via the channels in one level 202 and the other level 203. As a result, the reaction channels in the reaction areas 204 can be flushed with fluid become.
  • reaction areas 204 can be flushed with fluid simultaneously. Due to the valve position and the direction of flow through the reaction channels, any desired fluid supply cycles can be realized quickly. For this purpose, only the valves 500 need to be adjusted and subjected to negative or positive pressure.
  • the uniform feeds 400, here with the channel variant 402, can also be integrated into the fluid cycles.
  • 15a shows an embodiment variant of the valve 500 from FIG. 14 with further sectional representations 15b and 15c.
  • the valve is designed horizontally using micro technology. It essentially consists of a disk 509 and a plate 600. The plate is connected to the microstructure 200 via channels 601 to 604, so that either the fluids of the supply channels or the
  • Micro tanks can be pumped into the channels 202 of the microstructure behind the channels 501 to 504.
  • the assignment can be changed in series by turning the valve disc 509.
  • this valve 500 can also be connected to both channel structures 202 and 203 of the cross structure 200.
  • the reaction channels can thus be individually wetted with fluid.
  • the individual microchannels 601 to 604 are selectively connected analogously to the rigid mergers 401 and 402 from FIG. 13, for example for uniform rinsing during cleaning or other uniform steps, e.g. in the case of spatially resolved synthesis in the reaction carrier.
  • 16a shows a further embodiment variant of the multiplex valve 500 with the sectional illustration 16b.
  • the individual supply channels 501 to 516 are arranged in a circle around the reaction carrier 200.
  • the principle corresponds to Fig.15a, 15b, 15c. However, more or larger connections can be made with it.
  • the disk 509 is again on a two-layer base plate 600 and 610.
  • Fig. 17 shows a fluidic reaction carrier in cross section, which is received by a clamping device, which is provided with two opposing clamping jaws 701 and 702 with an integrated flow guide 703, this flow guide manages in a flow plane 202 without bending, etc. in the channels.
  • a clamping device which is provided with two opposing clamping jaws 701 and 702 with an integrated flow guide 703, this flow guide manages in a flow plane 202 without bending, etc. in the channels.
  • the same arrangement is also possible for the channels 203.
  • a narrow sealing surface 705 is also shown.
  • Fig. 18 shows a further connection variant with flow guide 703 with bends 704 in at least two levels. A wide sealing surface is also shown
  • Fig. 19 shows a further connection variant with flow guide 703 with bends 704 in at least two levels.
  • Micro legs 721 analogous to a processor from semiconductor technology, connect the receiving base 720 to the reaction carrier 200 or the channels 202.
  • the channels 203 can be connected in an analog manner.
  • the micro-legs 721 seal by gluing or inserting.
  • FIG. 20 shows, using the example of the micro-legs 721 from FIG. 19, a backwash 803 to avoid deposits in a bend in the flow and the associated risk of carryover.
  • These micro legs 721 are anchored in the reaction support in the lower cover layer 10.
  • a row of cleaning legs 801 can be used to specifically flush liquid into the corners 803 via the channels 802 and thereby prevent or remove deposits.

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein mikrofluidischer Reaktionsträger, der eine rein fluidische oder auch eine lichtgesteuerte Synthese und Analyse von Oligomeren oder Polymeren ermöglicht. Der Reaktionsträger enthält eine Strömungskanalstruktur für das Durchleiten von Fluiden, wobei Zuführungen u. zu ihnen parallele Ableitungskanüle unter einem Winkel zur Ebene der Strömungskanalstruktur (Reaktionsbereiche) liegen.

Description

MIKROFLUIDISCHER REAKTIONSTRÄGER MIT DREI STRÖMUNGSBENEN UND TRANSPARENTER DECK SCHICHT
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein mikrofluidischer Reaktionsträger, der je nach Ausführungsform eine rein fluidische oder auch eine lichtgesteuerte Synthese und Analyse von Oligomereπ oder Polymeren ermöglicht. Es ist darüber hinaus prinzipiell jede andere Anwendung als miniaturisierte chemische oder biochemische Synthese- und Analyseplattform beispielsweise zur Anwendung in der Kombinatorischen Chemie denkbar.
Mikrofluidische Systeme stehen allgemein noch am Anfang ihrer Entwicklung. Jedoch stellen sie schon jetzt ein wichtiges Gebiet z.B. im Bereich der Mikropumpen oder Mikroventile dar. Der Schwerpunkt derzeitiger Arbeiten auf diesem Gebiet liegt in der Herstellung miniaturisierter Strukturen bevorzugt unter Einsatz von Verfahren aus der Halbleitertechnik. Mikrodosiersysteme verknüpfen mikrominiaturisierte Pumpen und Ventile mit Sensoren für Ansteuer- und Regelschaltungen. Solche Systeme werden derzeit für spezielle Anwendungen entwickelt und erprobt, z.B. für die Medikamentendosierung oder die Dosierung von kleinsten Flüssigkeitsmengen im Freistrahl nach dem Prinzip eines Tintenstrahldruckers. Diese werden beispielsweise für die Herstellung von „Polymersonden-Arrays" verwendet, indem verschiedene biochemische Substanzen auf definierte Positionen eines Trägerkörpers aufgespritzt werden.
Die Vermischung von Medien in Mikrofluidsystemen, etwa in chemischen Mikroreaktoren oder in Bioreaktoren, aber auch in chemischen Analysesystemen ist bisher noch wenig untersucht. Besteht die Notwendigkeit einer sehr raschen Vermischung, so lassen sich jedoch durch den Einsatz speziell konstruierter Wirbelstrecken, oder durch die Verwendung eines ebenfalls miniaturisierten Mischers sehr hohe Mischungsraten erzielen. Die Entwicklung von Mikromischern hat noch keine Marktreife erreicht und befindet sich größtenteils noch im experimentellen Stadium. Die Interaktion von Fluid und Wand, wie sie für den erfindungsgemäßen mikrofluidischen Reaktionsträgers von Bedeutung ist, wurde bisher noch nicht näher untersucht. Die Realisierung kompletter Mikrofluidaπalyse-Systeme wurde bisher nur in einigen Fällen durchgeführt, z.B. in Systemen zur Analyse des Schwermetallgehalts im Grundwasser. Für die Herstellung von Test- und Funktionsmustern solcher Mikrofluidanalyse-Systeme werden bevorzugt verschiedene etablierte Silizium- Technologien, wie zum Beispiel isotropes und anisotropes Ätzen, verwendet.
Ein großer Nachteil der Silizumtechnik ist der relativ hohe Materialpreis. Deshalb werden aktuell verschiedene kostengünstige Technologien entwickelt, welche die Herstellung von MikroStrukturen als „Wegwerfartikel" erlauben. Drei dieser Verfahren sind Mikro-Spritzguß, miniaturisierte Heißprägeverfahren (hot molding) oder die sogenannte LIGA (Lichtinduzierte Galvanoabformung) Technik. Diese Verfahren erlauben im Versuchsstadium die Herstellung von MikroStrukturen mit Abmessungen kleiner 1 μm.
Heute werden diese Entwicklungen beispielsweise in der DNA-Analytik angewendet. Hierbei ist das aktuelle Forschungsthema eine möglichst schnelle und daher hochparallele Detektion. Die Kombination von Hybridisierung als Nachweisprinzip und optischer Signaldetektion ist am weitesten fortgeschritten. In den USA wird die Entwicklung dieser miniaturisierten Detektions-Chips mit enormem Aufwand vorangetrieben. Die Leistungsfähigkeit in der Analyse liegt hier im Bereich von 104 bis maximal 105 Basen pro Stunde. Ziel ist daher die Entwicklung einer Technologie, mit Hilfe deren man im Bereich von 108 und mehr Basen pro Stunde analysieren und die ermittelten Daten so aufbereiten kann, daß eine sinnvolle Interaktion zwischen Bediener und dem einzusetzenden Gerät möglich ist. Das Herzstück eines solchen Gerätes ist der Gegenstand dieser Erfindung und soll im folgenden als mikrofluidischer Reaktionsträger beschrieben werden. Dieser erfinduπgsgemäße Reaktionsträger soll beispielsweise das zentrale Bauteil von Systemen zur automatischen Fragmentsynthese und -analyse von Oligo- bzw. Polymeren darstellen. Ein solches System ist in der Patentanmeldung 19924327.1 beschrieben.
Der erfinduπgsgemäße Reaktionsträger beinhaltet eine Struktur aus Mikrokanälen unterschiedlicher Größe, Geometrie und Funktion. Ein Teil der Mikrokanäle dient der
Fluidzufuhr und -abfuhr. Alle weiteren Kanäle dienen als Reaktionsbereiche, wobei je nach Anwendung optional auch Fluidreservoirs etc. in die Mikrostruktur integriert werden können. Der Reaktionsträger wird entweder in einer zwei- oder einer dreidimensionalen Struktur durchströmt. Die zweidimensionale Ausführungsvariante besteht aus mindestens jeweils einem Zuführungs- und einem Abführungskanal in einer Strömungsebene. Diese beiden Kanäle sind durch mehrere etwa senkrecht hierzu verlaufende Kanäle verbunden, wobei diese senkrechten Verbindungskanäle als bevorzugte Reaktionsbereiche dienen. Die somit entstehenden Reaktionskanäle können ebenfalls wieder in kleinere Kanäle unterteilt sein, wobei jeder Reaktionskanal einen oder mehrere Reaktionsbereiche umfaßt. Diese Reaktionsbereiche können zum Beispiel entlang des Kanals angeordnet sein.
Die komplexere dreidimensionale Ausführungsvariante besteht aus drei Strömungsebenen. Die Zuführungskanäle sind jeweils zueinander parallel in einer ersten Strömungsebene und die Abführungskanäle jeweils zueinander parallel in einer dritten Strömungsebene angeordnet, wobei Zuführungs- und Abführungskanäle in einer senkrechten Projektion entweder parallel zueinander oder unter einem Winkel zueinander angeordnet sind, wobei dieser Winkel vorzugsweise annähernd gleich 90° gewählt wird. An den Kreuzungspunkten der Kanäle in deren senkrechter Projektion in der gewinkelten Anordnung oder entlang der Kanäle in der parallelen Anordnung sind außerdem senkrechte Kanäle angeordnet, die eine dritte Strömungsebene bilden und die Zuführungskanäle der ersten mit den Abführungskanälen der dritten Ebene verbinden. Diese Verbindungskanäle sind wesentlich enger als die Zuführungs- und Abführungskanäle. Damit wird ein Überströmen der Reaktionsbereiche in den Zuführungs- und Abführungskaπälen ohne Eindringen von Fluid in die Reaktionskanäle ermöglicht. Mehrere Reaktionskanäle zusammen bilden einen Reaktionsbereich. Damit sind die technischen Voraussetzungen für eine sehr schnelle, effiziente und damit kostengünstige Bereitstellung einer Vielzahl von Reaktionsbereichen geschaffen, zum Beispiel für die integrierte Synthese einer Vielzahl von Polymersonden und die Analyse einer Vielzahl von Poiymerfragmenten mittels dieser Sonden.
In allen Ausführungsvarianten werden die Fluide aus den Reaktionsbereichen abgeführt, ohne daß dabei ein Kontakt dieser Fluide mit einem anderen
Reaktionsbereich des gesamten Reaktionsträgers erfolgen würde. Dies ist vor allem bei Reaktionen relevant, deren Abfallprodukte andere Reaktionsbereiche schädigen oder zerstören könnten.
Alle drei Varianten des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Reaktionsträgers haben auf der Ober- und der Unterseite jeweils eine Deckschicht. Bei der zweidimensionalen Struktur sowie bei den parallelen Zuführungs- und Abführungskanälen der dreidimensionalen Struktur ist mindestens eine der Deckschichten transparent ausgebildet, um eine lichtgesteuerte Photoaktivierung in den einzelnen Reaktionsbereichen durch individuelle Belichtung z.B. mittels einer programmierbaren Lichtquellenmatrix zu ermöglichen wie sie in der Patentanmeldung 199 07 080.6 beschrieben ist. Alle drei Varianten werden bevorzugt mit zwei transparenten Deckschichten ausgeführt um eine permanente optische Prozesskontrolle im Reaktionsträger sowie die Messung von Nachweisreaktioπen im Durchlicht zu ermöglichen.
Für lichtabhängige Photoaktivierung sind verschiedene Schutzgruppen bekannt und verfügbar, die zum Teil auch bei der Synthese von Microarrays zur Anwendung kommen. Hierzu zählen als Beispiele MeNPOC, NPPOC und dessen Derivate sowie einige ältere Schutzgruppen, wie sie von Pillai (Synthesis, 1 980); Hadrisan und Pillai (Proc. Indian nat. Sei. Acad. 53, 1 987) oder Birr et al (Liebigs Ann. Chem. 763, 1 972) beschrieben wurden.
Außerdem sind auch Methoden bekannt, bei denen die Photoaktivierung indirekt über die lichtabhängige Aktivierung einer Säure (Photosäure) zu einer anschließenden ortsaufgelösten Abspaltung einer säurelabilen Schutzgruppe wie z.B. DMT führt (siehe Gao et al in WO 9941007) . Einen ähnlichen Mechanismus kann man sich zunutze machen, wenn man geeignete Photolacke auf den Reaktionsträger aufbringt (siehe McGall in PNAS 93, S. 13555-1 3560, 1 996) . Über diese chemischen Methoden hinaus ist außerdem denkbar, die Synthese durch Photoaktivierung und Photo-Deaktivierung von Enzymen zu steuern.
Die komplexere dreidimensionale Struktur mit den um einen Winkel gedrehten Zuführungs- und Abführungskanälen ermöglicht das individuelle Bespülen jedes einzelnen Reaktionsbereiches aus den senkrecht angeordneten Mikrokanälen. Dies erfolgt indem jeweils ein Zuführungskanal mit Fluid bespült und an einem Abführungskanal Fluid abgeführt wird. Das Fluid fließt durch den Zuführuπgskanal in die senkrechten Mikroreaktionskanäle und durch den Abführungskanal wieder aus dem Reaktionsträger hinaus. Genauso können auch mehrere Reaktionsbereiche gleichzeitig und dies sogar mit unterschiedlichen Fluiden bespült werden. Damit erschließt der erfindungsgemäße mikrofluidische Reaktionsträger mit der durch die gewinkelte Anordnung bedingten "Kreuzstruktur" eine Vielfalt an Anwendungen aus der Kombinatorischen Chemie oder der DNA-Analytik.
Eine weitere Anwendung ist das abwechselnde Beströmen zunächst aller Zuführungsund Abführungskanäle mit Einsatzstoffen, wobei die Funktion der Fluidzufuhr und - abfuhr der Zuführungs- und Abführungskanäle von Zyklus zu Zyklus wechselt. Wird beispielsweise jeder Kanal mit einem anderen Baustein einer zu synthetisierenden Polymersonde bespült, so kann durch die Anwendung der Kreuzstruktur in wenigen Zyklen eine große Vielfalt an Oligomer- oder Polymersonden in den einzelnen
Reaktionsbereichen eines Reaktionsträgers erzeugt werden. Die Synthese beliebig spezifischer Einzelsondeπ in einem Reaktionsbereich ist durch die zuvor beschriebene Einzelansteuerung eines Reaktionsbereiches in Ergänzung problemlos möglich. Damit bietet der erfindungsgemäße mikrofluidische Reaktionsträger mit der Kreuzstruktur die Möglichkeit zur effizienten naßchemischen Oligomersonden- oder Polymersondensynthese von „Sonden-Arrays". Diese Vorgehensweise soll im folgenden als fluidisches Multiplexen bezeichnet werden. Auch die In-situ-Synthese mittels Prozessüberwachung sowie die integrierte Synthese- und Analyse sind damit möglich.
Für die rein fluidische Reaktionssteuerung sind keine lichtdurchlässigen Deckschichten notwendig, jedoch ebenfalls sinnvoll für die optische Prozesskontrolle und die Erfassung von Nachweisreaktionen. Die Detektion kann hierbei ebenfalls entweder im Durchlicht oder auch im Rücklicht von einer Seite erfolgen. Kombiniert man die dreidimensionale Kreuzstruktur mit ihren um einen Winkel gedreht angeordneten Zuführungs- und Abführungskanälen mit der lichtgesteuerten Photoaktivierung der Reaktionsbereiche aus Mikrokanälen, so kann man die Effizienz der Synthese von Oligomer- oder Polymersonden noch weiter erhöhen. Sowohl die Lichtquellenmatrix als Lichtquelle als auch der benötigte Detektor können in den mikrofluidischen Reaktionsträger integriert werden. Gleiches gilt für die Integration einer CCD-Matrix als zweite gegenüberliegende Deckschicht. Auch eine direkter Anschluß einer programmierbaren Lichtquellenmatrix als Deckschicht ist möglich. Dies ist insbesondere dann naheliegend, wenn der mikrofluidische Reaktionsträger als festes Bauteil in ein Gerät integriert ist und zwischen den Anwendungen z.B. chemisch gereinigt wird und nur zu Wartungszwecken gewechselt werden muß. Wird der mikrofluidische Reaktionsträger nach jeder Verwendung ausgewechselt, so ist eine direkte Integration jedoch nicht sinnvoll. Vielmehr empfiehlt es sich dann, die Komponenten im System entsprechend anzuordnen.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Versorgung des mikrofluidische Reaktionsträgers mit den entsprechenden Fluiden. Hierzu wurde ein ebenfalls neuartiges, integriertes Ventilsystem konzipiert. Dies erlaubt eine schnelle Bereitstellung einer Vielzahl an Fluiden an den Zuführungs- und Abführungskanälen der Mikrostruktur. Dieses Fluidversorguπgssystem ist für die Anwendung des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Reaktionsträgers für den Aufbau von Oligomer- oder Polymersondenarrays in den Reaktionsbereichen konzipiert. Das Versorgungssystem gleicht sich in den Anschlüssen und Komponenten für die „oberen" und die „unteren" Zuführungs- und Abführuπgskanäle. Von der einen Seite her werden alle Kanäle individuell über ein im folgenden beschriebenes Multiplexventil versorgt. Am jeweils dazugehörigen anderen Kanalende werden alle Kanäle zusammengeführt, wobei diese Zusammenführung für die Zu- und Abführung bei einheitlicher Bespülung aller Reaktionsbereiche verwendet wird. Bei der Synthese von Oligomer- oder Polymersonden in den Reaktionsbereichen sind dies alle Zyklen außer der Zuführung der spezifischen einzelnen Bausteine, beispielsweise bestehend aus einem oder mehreren Nukleotideπ im Fall der DNA-Synthese. Will man alle Reaktioπsbereiche erreichen und nicht spezifisch auswählen, so ist es besser, eine strömungsoptimierte Zuführung wie beispielsweise eine duale Verästelung zu wählen, als über das Multiplexventil mit dem höheren Verschleppungsrisiko. Für das Zuführen der spezifischen Bausteine benötigt man jedoch das Ventil. Dieses verbindet die Mikrokanäle des Reaktionsträgers auf der einen Seite mit einer maximal gleich großen Anzahl an individuellen Tanks sowie einem Sammelanschluß auf der anderen Seite. In einer Position des Ventils wird jeweils ein Tank mit einem oder mehreren Kanälen des Reaktionsträgers verbunden. Soll das Fluid eines Tanks in einem Zyklus in mehr als einen Kanal bzw. ein Kanalbündel des Reaktionsträgers gelangen, so wird erst ein Kanal und anschließend weitere Kanäle seriell versorgt. Der Sammelanschluß entspricht der Zusammenführung der Kanäle auf der jeweils gegenüberliegenden Seite des Reaktionsträgers. Er dient der effizienten Spülung von Ventil und Reaktionsträger.
Die Anschlüsse des mikrofluidischen Reaktionsträgers an seine Fluidversorgung und Fluidentsorgung ist ein wichtiges Element. Wird der Reaktionsträger in der spezifischen Anwendung immer wieder gereinigt und wiederverwendet, so kann eine aufwendiger Anschlußtechnik, beispielsweise an das Multiplexventil vorgesehen werden. • Hierbei ist, insbesondere bei einer großen Anzahl von Kanälen, eine Ausführung analog der Halbleiterprozessortechnik mit einer Vielzahl an kleinsten Kanälen in sogenannten "Beinen" möglich. Diese Ausführung hat strömungstechisch den Nachteil der Gefahr von Ablagerungen in den Biegungen und Knicken der einzelnen Mikrokanäle. Hier kann eine Hinterspülung wie zur Vermeidung von Verschleppungen vorgesehen werden. Bei der Anwendungsvariante, in welcher der Reaktionsträger nach jeder Anwendung ausgewechselt wird, sind schnelle und ohne Klebung dichtende Anschlüsse notwendig. Dabei kann zum Beispiel flächig an der Stirnseite des Reaktionsträgers mit durchgehendem bieguπgsfreiem Kanalverlauf angeschlossen werden. Somit ist das Verschleppungsrisiko minimal. Eine zweite Alternative ist das Aufpressen der Unterseite des Reaktionsträgers auf die Fluidzuführung. Geeignete chemikalienbeständige Dichtungen sind dabei jeweils vorzusehen.
Unter einem Aspekt der Erfindung soll unter einer Reinigung insbesondere eine vollständige Regenerierung des Reaktionsträgers verstanden werden. Im regenerierten Zustand kann dieser dann wieder zu einer neuen Polymersynthese benutzt werden. Bei der chemischen Reinigung ist vorzugsweise zu beachten, dass die für die Anbindung eines ersten Polymerbausteins notwendige Anknüpfungsstelle nicht zerstört wird. Die für die chemische Reinigung notwendige Sollbruchstelle kann durch chemische (z.B. nasschemische, photochemische, elektrochemische) oderdurch eine biologische (z.B. enzymatische) Transformation gespalten werden. Dies kann durch einen ein- oder mehrstufigen Prozess erfolgen. Vorzugsweise wird die Sollbruchstelle bei der ersten Oberflächenderivatisierung des mikrofluidischen Reaktionsträgers - vorzugsweise im Linkersystem, das die Oberfläche mit dem ersten Polymerbaustein verbindet - bereitgestellt. Es ist jeweils sichergestellt, dass die Sollbruchstelle weder während der Synthese noch während der Analyse durch die verwendeten Analyten oder Reagenzien gebrochen werden kann. Einstufiger Prozess:
Die Sollbruchstelle wird durch eine einzige Transformation gebrochen. Beispiele hierfür sind basenlabile Linker, säurelabile Linker, oxidationslabile Linker oder der Abbau mit Hilfe von geeigneten Enzymen.
Neben einer chemischen Reinigung kann damit auch eine enzymatische Reinigung des Reaktionsträgers durchgeführt werden. Hierbei werden die mit dem Reaktionsträger verknüpften Polymer- bzw. Oligomersonden mit einem DNA- bzw. RNA-abbauenden Enzym oder einem Peptid-spaltenden Enzym gespalten bzw. "verdaut", wodurch es zu einem teilweisen oder vollständigen Abbau der Sonden kommt. Im Anschluss kann der Reaktionsträger erneut zur Synthese neuer Sonden verwendet werden.
Als Enzyme kommen Nucleasen wie Exonucleasen oder Endonucleasen in Frage, die einen Nucleinsäurestrang von den Enden bzw. innerhalb des Sondenstrangs angreifen und Nucleotide bzw. Nucleoside als Spaltprodukte hinterlassen. Im Falle von RNA ist die Verwendung von RNAsen (wie RNAse H usw.) möglich, die bei Ausbildung eines RNA-DNA-Doppelstrangs selektiv den RNA-Teil zerschneiden, wodurch bei RNA-Sonden die gesamte Sonde und bei RNA-Teilabschnitten als Sollbruchstelle der RNA-Abschnitt gespalten wird. Die Regeneration eines Reaktionsträgers mit DNA-Sonden kann ebenfalls durch Einsatz von DNAsen (DNAse I, DNAse II, etc.) erreicht werden, wodurch sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige DNA abgebaut werden kann.
Ebenfalls können Peptid-spaltende Enzyme für den Abbau von Peptidsonden bzw. Peptid-Sequenzabschnitten als Sollbruchstelle eingesetzt werden.
Mehrstufiger Prozess: Die Sollbruchstelle wird in einem mehrstufigen Prozess gebrochen, d.h. die Sollbruchstelle ist in einer Form maskiert. Hierzu ist notwendig, dass diese Maskierung in einem oder mehreren Schritten zunächst entfernt wird, bevor im darauffolgenden Schritt die Sollbruchstelle dann letzendlich gebrochen werden kann.
Als ein Beispiel kann ein maskierter photolabiler Linker verwendet werden, in dem durch eine vorgeschaltete Transformation eine für die Photolabilität notwendige o-Nitrofunktion erst generiert wird. Das kann z.B. durch Oxidation einer Aminofunktion erfolgen. Dieser - nicht notwendigerweise spezifische - Oxidationsschritt kann enzymatisch oder nasschemisch erfolgen. Ist die o-Nitrofunktion erzeugt, kann dann die Spaltung der Sollbruchstelle durch Lichteinstrahlung erfolgen.
Als eine weitere Lösung kann in einem ersten Schritt eine doppelsträngige DNA-Sequenz durch Zugabe eines zum Linker komplementären Analyten erzeugt werden, die dann im folgenden Schritt durch ein spezielles Enzym (Restriktionsenzym) erkannt und spezifisch abgespalten wird.
Bei Verwendung eines RNA-Teilabschnitts als Sonden-"Sockel" kann eine chemische Regeneration des Reaktionsträgers ebenfalls in mehreren Stufen erfolgen. Dabei wird zunächst die Synthese unter Verwendung von 2'-OH- geschützten Phosphitamidbausteinen durchgeführt. Nach Hybridisierung und Analyse wird für die Regeneration die Schutzgruppe des RNA-Teilabschnitts abgespalten, woraus eine freie 2'-OH-Gruppe resultiert. Daraufhin kann in einem folgenden chemischen Reaktionsschritt mit Hilfe von Perjodat oder anderen Oxidationsmitteln der Ribosezucker gespalten und die Sonde durch ß-Eliminierung vom Reaktionsträger entfernt werden.
Den vorstehend beschriebenen Prozessen der Reinigung (Rezeptorabspaltung) kommt im Rahmen der Erfindung selbständige Bedeutung unabhängig von einer speziellen Träger-Ausgestaltung zu. Der Anmelder behält sich vor, ggf. selbständige Patentansprüche zu der beschriebenen Technologie der Reinigung bzw. Rezeptorabspaltung aufzustellen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Rezeptorabspaltung bzw. Molekülabspaltung im vorstehend erläuterten Sinne auch dazu durchgeführt werden kann, abgespaltene Moleküle zu sammeln und für weitere chemische Prozesse, z.B. für einen Syntheseschritt, einzusetzen. In diesem Sinne können die Reinigungsprozesse als Schritte zur Gewinnung von auf einem Träger synthetisierten Molekülen betrachtet werden.
Der Aufbau des erfindungsgemäßen mikrofluidische Reaktionsträger erfolgt wie dies auch in der Halbleiter-Mikrotechnik üblich ist in mehreren Schichten. Hierbei kann zwischen einer Einteilung der MikroStruktur in funktionale Schichten und konstruktionsbedingte Schichten unterschieden werden.
Während es in einer zweidimensionalen Struktur mindestens drei funktionale Schichten gibt, besteht eine dreidimensionale Struktur aus mindestens fünf funktionalen Schichten. Diese funktionalen Schichten sind nachfolgend näher beschrieben. In der Produktion lassen sich oft mehrere dieser funktionalen Schichten mittels geeigneter Herstellungsverfahren in eine konstruktionsbedingte Schicht integrieren.
Die funktionalen Schichten der zweidimensionalen Struktur enthalten eine mittlere Strukturschicht, in welche die Mikroströmuπgsstruktur aus Kanälen, Reaktionsbereichen und Reservoirs eingebracht ist. Sie wird mit einer oberen und einer unteren Deckschicht verbunden und kann aus Glas, Kunststoff oder Silizium beschaffen sein. Je nach Ausführung kann das verwendete Material transparent oder auch lichtundurchlässig sein. Beispielsweise empfiehlt sich als lichtundurchlässiges Material Futoran-Glas der Firma Schott, Silizium oder Teflon.
Die dreidimensionalen Strukturen bestehen aus fünf Funktionalen Schichten. Einer ersten, „oberen" Deckschicht, einer darunterliegenden Struktur aus Mikrokanälen für die Fluidzuführung und Abführung in zur zweidimensionalen Struktur analogen Weise, einer mittleren Ebene aus senkrechten, (bevorzugt um mindestens den Faktor 10) kleineren Mikrokanälen, welche als Reaktionsbereiche dienen. Auf der „Unterseite" schließen sich wieder eine Ebene für Fluidversorgung und eine Deckschicht an, die beide analog zur „Oberseite" ausgebildet sind. Insgesamt ist der Reaktionsträger spiegelbildlich zu einer mittleren Ebene aufgebaut. Die Herstellung muß sich nicht unbedingt nach den funktionalen Schichten richten. So ist eine Integration der Zuführungs- und Abführungsstruktur sowohl in der mittleren Schicht als auch in der Deckschicht möglich. Für die mittlere Schicht mit den senkrechten Mikrokanälen als Reaktionsbereiche können beispielsweise geeignete Silizium-Wafer aus der Halbleitertechnik mit geätzten „Poren" der Firma Siemens oder zusammengeschmolzene Glasfasern (Fiberglas-Wafem) der Firma Schott mit herausgeätzten Seelen und einem Größenverhältnis zwischen Wandstärke und Kanalquerschnitt von vorzugsweise 1 zu 5 verwendet werden. Um die exakte Bespülung nur der „angesteuerten" Reaktionskanäle zu verbessern, kann die mittlere funktionale Ebene durch eine obere und eine untere Zwischenschicht ergänzt werden. Diese verhindert bzw. erschwert ein ungewolltes Einströmen von Fluiden (hydrophile bzw. hydrophobe Barrieren).
Die notwendigen Herstellungsverfahren unterscheiden sich je nach dem verwendeten Material. Bei Silizium-, Glas- und Fiberglaswafern (mit und ohne Seele) kommen als Verbindungstechniken Bonding-Verfahren zum Einsatz. Die Teile, wie zum Beispiel die verschieden Wafer, werden durch Ätztechniken sowie Sägen und Polieren hergestellt. Für die Verwendung von Kunststoffen wie Teflon, welches lichtundurchlässig ist, und COC oder Polystyrol, welches transparent ist, kommen Verfahren wie Spritzguss, Heißprägen oder LIGA zum Einsatz. Die Verbindung von Bauteilen erfolgt z.B. mittels Kleben oder Ultraschallschweißen oder durch mechanische Druckdichtung mittels einer Halterung oder eines Rahmens.
Die obere Deckschicht schließt die darunterliegende Mikroströmungsstruktur nach außen ab. Hierdurch entstehen die Mikrokanäle. Für den Eintrag von Licht in diese Kanäle ist die Schicht lichtdurchlässig ausgebildet. Für eine optimierte Optik können auch Mikrolinsen in Glas der Firma Mikroglas oder Kunststoff (IMM Mainz) verwendet werden. Möglich ist ebenfalls der Einsatz einer Wabenstruktur aus zusammengeschmolzenen Glasfasern, die z.B. von der Firma Schott oder ITT entwickelt wurde und beispielsweise bei Nachtsichtgeräten zum Einsatz kommt. Hierzu werden lange Glasfaserbündel so erhitzt, daß sie zusammenschmelzen und eine Einheit bilden. Auf diese Weise entsteht eine „Stange", von welcher dann in zur ise dü iben ab e ä t und oliert werden. Diese können anschließend mit Glas oder Silizium gebondet oder mit Kunststoffen verklebt bzw. verschweißt werden.
Der erfindungsgemäße mikrofluidische Reaktionsträger wird in seiner bestimmungsgemäßen Verwendung folgendermaßen eingesetzt: Zunächst wird eine Gruppe von Reaktionsbereichen durch die Mikrokanäle einer zwei- bzw. dreidimensionalen MikroStruktur angesteuert. Nach der dort erfolgten Reaktion werden die in den einzelnen Reaktionsbereichen entstehenden Reaktionsprodukte durch Mikrokanäle abgeführt, ohne daß dabei die Reaktionsprodukte einen weiteren Reaktionsbereich durchströmen. Dabei kann eine Ansteuerung der Reaktionsbereiche in der beschriebenen dreidimensionalen Kreuzstruktur zur rein fluidischen Synthese von Oligo- oder Polymeren aus Mono-, Oligo- oder Polymeren, oder auch zur Beschleunigung der lichtgesteuerten Synthese oder einer kombinierten nasschemischen und lichtgesteuerten Synthese von Oligomeren oder Polymeren durch das beschriebene intelligente Multiplexen der Einsatzstoffe genutzt werden.
Währenddessen erfolgt eine optische Kontrolle aller Reaktioπsbereiche und Mikrokanäle durch transparente Deckschichten als Plattform für eine In-Situ-Synthese, eine permanente Prozesskontrolle und Regelung der Abläufe in der MikroStruktur. Damit ist die Basis für eine umfassende Qualitätssicherung geschaffen. Lichtsignale von Nachweisreaktionen, welche in den Reaktionsbereichen durch chemische (z.B. Lumineszenz), biochemische (z.B. Biolumineszenz) oder lichtinduzierte (z.B. Fluoreszenz) Reaktionen entstehen, können in einem den fluidischen Mikroprozessor umgebenden integrierten ' Synthese- und Analyse-Gerät, wie es in der Patentanmeldung 19924327.1 beschrieben ist, erfaßt werden. Weiterhin möglich sind Absorptionsmessungen im Reaktionsträger durch die Erfassung von Lichtsignalen, welche die Mikrokanäle und Reaktionsbereiche im Durchlichtverfahren durchqueren oder im Rücklichtverfahren reflektiert werden. Dies kann zum Beispiel für eine erweiterte qualitative Qualitätssicherung genutzt werden.
Die Vorteile dieses erfindungsgemäßen mikrofluidischen Reaktionsträgers sind vielfältig: Zum einen werden die Reaktionsprodukte von jedem Reaktionsbereich abgeführt, ohne daß ein weiterer Reaktionsbereich mit den Reaktionsprodukten in Berührung kommt. Dies ermöglicht die Durchführung von Reaktionen für die Synthese und Analyse in den Reaktionsbereichen, welche Reaktionsprodukte (Endprodukte oder Zwischenprodukte) erzeugen, die für andere Reaktionsbereiche schädlich wären.
Im Vergleich zu planaren Flächen haben die dreidimensionalen Mikrokanäle eine größere als Festphase nutzbare Oberfläche. Die Verwendung von MikroStrukturen reduziert die für die Reaktionen benötigte Fluidmenge und erhöht gleichzeitig die Reaktionsgeschwindigkeit. Dies gilt sowohl für kovalente Bindungen wie auch zum Beispiel für die Hybridisierungszeiten bei Anwendungen in der DNA, RNA, PNA, LNA- Analytik oder bei Proteinanwendungen.
Durch transparente Deckschichten werden Photoreaktionen zum Beispiel für die lichtgesteuerte Synthese von DNA, RNA, PNA, LNA oder Proteinen, etc. ermöglicht.
Außerdem wird durch die transparenten Deckschichten eine permanente Prozesskontrolle für die Regelung der Reaktionen sowie der Fluidik im Reaktionsträger ermöglicht. Dadurch werden die Fehler sowohl bei der Produktion als auch bei der Detektion deutlich reduziert, womit sich die Zahl der auswertbaren Messungen pro Material- und Zeiteinsatz erhöht.
Durch eine geeignete Auslegung der Geometrie der einzelnen Reaktionsbereiche sowie der Mikrokanäle zwischen den Reaktionsbereichen lassen sich die Strahlengänge unter Berücksichtigung der auftretenden Brechungsindizes im Reaktionsträger gezielt beeinflussen. Die erfindungsgemäßen fluidischen Mikroprozessoren können als einfache Komponenten für den einmaligen Gebrauch ausgeführt werden. Prinzipiell sind hier kostengünstige Kunststoff- Strukturen zu bevorzugen, aber auch Glas- und Silizium oder auch Materialkombinationen sind als Ausführungen möglich. Die schnelle und kostengünstige Produktion wird eine Vielfalt von individuellen Anwendungen ermöglichen, bei denen z.B. unter Berücksichtigung von Sequenz- und Gendatenbanken im Internet gezielt Sonden-Arrays synthetisiert und analysiert werden können.
Dabei finden die Reaktionen immer an den Wänden der Mikroreaktionskanäle statt.
Folglich sind die Reaktionsbereiche immer dreidimensional ausgeprägt und haben eine erheblich größere Oberfläche als die planare Grundfläche. Durch diese
Figure imgf000017_0001
ist.
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beispielsweise in der immuno.υyie,
30 Kombinatorischen Chemie.
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Fig.2
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transparent oder lichtundurchlässig.
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104 und die Fluidabführung 103.
Mikrokanälen 2U uι ι * r -Ϊ1 mit den Mikrokanälen 203, jeweils Fluidabführungsstruktur 31 mit den
H ph Dazwischen befinden sich in der mittleren Schient 4u Reaktionskanäle in den Reaktionsbereichen 204. Die Deckschichten 20 und 30 sind wahlweise transparent oder lichtundurchlässig. Fig.5a, 5b und 5c zeigen nochmals die Darstellungen der Fig. 4a, 4b und 4c. Dabei verdeutlichen die Schnittdarstellungen der MikroStruktur 200 den Strömungsverlauf durch die Zuführungs- und Abführungskanäle 202 und 203, sowie die Reaktionskanäle 201 in den Reaktionsbereichen 204. Fig. 6 zeigt die Darstellung einer einzelnen zweidimensionalen Strömungsstruktur analog Fig.1 mit veränderten Querschnitten der Zuführungskanäle 2 und der Abführungskanäle 3 zur gezielten Strömungsbeeinflussung. Die Reaktionskanäle 4 mit jeweils mindestens einem Reaktionsbereich sind hier im
Querschnitt unverändert, können aber auch modifiziert werden. Fig.7a zeigt analog zu Fig.6 eine einzelne zweidimensionale Strömungsstruktur mit in der Höhe der Kanäle veränderten Querschnitten der Zuführungskanäle 2 und der Abführungskanäle 3 zur gezielten Strömungsbeeinflussung. Die Reaktionskanäle 4 mit jeweils mindestens einem Reaktionsbereich sind hier im
Querschnitt ebenfalls verändert und nicht einheitlich in der Größe. Die Struktur wird durch die schräg angeordneten Deckschichten 10 und 20 geschlossen. Fig. 8 zeigt die Darstellung einer dreidimensionalen Strömungsstruktur analog Fig. 2 und 3 mit veränderten Querschnitten der Zuführungskanäle 102 und der Abführungskanäle 103 zur gezielten Strömungsbeeinflussung. Die
Reaktionskanäle in den Reaktionsbereichen 104 sind dabei in ihrer Größe unverändert. Fig. 9 zeigt eine zu Fig. 8 analoge Darstellung, wobei die Reaktionsbereiche 104 entsprechender der Größe der Zuführungskanäle 102 und Abführungskanäle 103 unterschiedliche Größe aufweisen.
Fig.10a, 10b und 10c zeigen eine zu Fig. 3a, 3b und 3c analoge Darstellung, wobei sich die Zuführungskanäle 102 und die Abführungskanäle 103 in ihrer Höhe verändern und damit die Strömung beeinflussen. Die Reaktionsbereiche 104 und die Reaktionskanäle 101 sind, bedingt durch die Dicke der mittleren Strukturschicht 40, einheitlich lang. Fig.11a, 11b, 11c, 11 d und 11e zeigen eine dreidimensionalen Kreuzstruktur der Strömung in einer zu Fig. 4a, 4b, 4c, 4d und 4e und 5a, 5b und 5c analogen Darstellung mit veränderten Querschnitten der Zuführungskanäle 202 und Abführungskanäle 203 zur gezielten Strömungsbeeinflussung. Die Reaktionskanäle in den Reaktionsbereichen 204 sind dabei von unveränderter
Größe.
Fig.12a zeigt die Darstellung der Fig. 5c der Kreuzstruktur mit zwei Detailvarianten 12b und 12c. Das Detail 12b stellt die Struktur aus den Deckschichten 10 und 20 sowie einer mittleren Schicht 40 mit den Reaktionsbereichen in den Reaktionskanälen 201 sowie den Zuführungskanälen 202 und den
Abführungskanälen 203 dar. Im Detail 12c sind die Reaktionskanäle 201 aus der Variante 12b jeweils durch eine dreischichtige MikroStruktur ersetzt. Diese umfaßt zwei Schichten 301 und 303 zur Glättung und Stabilisierung der Zu- und Abströmung 202 und 203 sowie einer eigentlichen Reaktionsschicht 302 aus weiteren Mikrokanälen oder beispielsweise einem Glasflies.
Fig.13 zeigt eine Anschlußvariante der Mikro-Kreuzstruktur 200 nach Fig. 4a, 4b, 4c, 4d, 4e und 5a, 5b und 5c mit zwei Mikroanströmungskanalvariaπten 401 und 402. Beide Varianten verbinden einen Kanal für die Fluidversorgung 400 jeweils mit allen parallelen Kanälen 202 und 203 der beiden Ebenen. So können sämtliche Reaktionsbereiche 204 gleichzeitig auf verschiedenen Zu- und
Abführungsvarianten mit Fluid bespült werden.
Fig.14 zeigt eine zu Fig.13 analoge Darstellung mit zwei in die Fluidversorgung integrierten Ventilen 500. Diese versorgen die Mikrokanalstruktur 200 über die Kanäle in der einen Ebene 202 und der anderen Ebene 203. Dadurch können die Reaktionskanäle in den Reaktionsbereichen 204 mit Fluid bespült werden.
Es können ein, mehrere oder alle Reaktionsbereiche 204 gleichzeitig mit Fluid bespült werden. Durch die Ventilstellung und die Strömungsrichtung durch die Reaktionskanäle können schnell beliebige Fluidversorgungs∑yklen realisiert werden. Hierzu sind nur die Ventile 500 zu verstellen und mit Unter- oder Überdruck zu beaufschlagen. Auch die einheitlichen Zuführungen 400, hier mit der Kanalvariante 402, können in die Fluidzyklen integriert werden. Fig.15a zeigt eine Ausführungsvariante des Ventils 500 aus Fig.14 mit weiteren Schnittdarstellungen 15b und 15c. Das Ventil ist horizontal in Mikrotechnik ausgeführt. Es besteht im wesentlichen aus einer Scheibe 509 und einer Platte 600. Die Platte ist mit der MikroStruktur 200 über Kanäle 601 bis 604 verbunden, so daß wahlweise die Fluide der Zuführungskanäle bzw. der
Mikrotanks hinter den Kanälen 501 bis 504 in die Kanäle 202 der MikroStruktur gepumpt werden können. Die Zuordnung kann durch Drehen der Ventilscheibe 509 seriell verändert werden. Dieses Ventil 500 kann gemäß Fig.14 auch an beide Kaπalstrukturen 202 und 203 der Kreuzstruktur 200 angeschlossen werden. Damit können die Reaktionskanäle individuell mit Fluid benetzt werden. Über eine zentrale Zuführung 510 im Ventil 500 werden analog zu den starren Zusammenführungen 401 und 402 aus Fig. 13 die einzelnen Mikrokanäle 601 bis 604 wahlweise verbunden, beispielsweise für einheitliche Bespülungen beim Reinigen oder anderen einheitlichen Schritten z.B. bei der ortsaufgelösten Synthese im Reaktionsträger.
Fig.16a zeigt eine weitere Ausführungsvariante des Multiplexventils 500 mit der Schnittdarstellung 16b. Hier sind die einzelnen Versorgungskanäle 501 bis 516 kreisförmig um den Reaktionsträger 200 angeordnet. Das Prinzip entspricht Fig.15a, 15b, 15c. Es können damit jedoch mehr oder größere Anschlüsse realisiert werden. Die Scheibe 509 befindet sich wieder auf einer zweischichtigen Grundplatte 600 und 610.
Fig.17 zeigt einen fluidischen Reaktionsträger im Querschnitt, der durch eine Spannvorrichtung aufgenommen ist, die mit zwei gegenüberliegenden Spannbacken 701 und 702 mit einer integrierten Strömungsführung 703 versehen ist, wobei diese Strömungsführung in einer Strömungsebene 202 ohne Biegung etc. in den Kanälen auskommt. Die gleiche Anordnung ist auch für die Kanäle 203 möglich. Weiterhin dargestellt ist eine schmale Dichtfläche 705.
Fig.18 zeigt eine weitere Anschlußvariante mit Strömungsführung 703 mit Biegungen 704 in mindestens zwei Ebenen. Dargestellt ist weiterhin eine breite Dichtfläche
705 im Auflager 710. Fig.19 zeigt eine weitere Anschlußvariante mit Strömungsführung 703 mit Biegungen 704 in mindestens zwei Ebenen. Mikrobeine 721 analog zu einem Prozessor aus der Halbleitertechnik verbinden den Aufnahmesockel 720 mit dem Reaktionsträger 200 bzw. den Kanälen 202. Die Kanäle 203 können analog angeschlossen werden. Eine Dichtung erfolgt durch die Mikrobeine 721 durch verkleben oder einstecken.
Fig.20 zeigt am Beispiel der Mikrobeine 721 aus Fig.19 eine Hinterspülung 803 zur Vermeidung von Ablagerungen in einer Biegung der Strömung und der damit verbundenen Verschleppungsgefahr. Diese Mikrobeine 721 sind in dem Reaktionsträger in der unteren Deckschicht 10 verankert. Durch die zweite
Reihe an Reinigungsbeinen 801 kann gezielt Flüssigkeit über die Kanäle 802 in die Ecken 803 gespült werden und dadurch eine Ablagerung vermieden bzw. beseitigt werden.

Claims

Ansprüche
Mikrofiuidischer Reaktionsträger mit einer Mehrzahl von Reaktionsbereichen, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Reaktionstrager eine Strömungskanalstruktur für das Durchleiten von Fluiden enthält, wobei Zuführungskanäle und dazu parallele Abführungskanäle durch zu diesen unter einem Winkel angeordnete Verbindungskanäle miteinander verbunden sind und besagte Verbindungskanäle oder auch Teile der Zu- und Abführungskanäle als Reaktionsbereiche dienen.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Strömungskanalstruktur aus drei Strömuπgsebenen besteht, wobei die Zuführungskanäle zueinander parallel in einer ersten Strömuπgsebene liegen und die Abführungskaπäle zueinander parallel in einer dritten Strömuπgsebene liegen und zu diesen beiden Strömungsebenen senkrecht oder annähernd senkrecht die Verbindungskanäle mit den Reaktionsbereichen liegen.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in einer zu der ersten und der dritten Strömuπgsebene senkrechten Projektion die Zuführungskanäle der ersten Strömungsebene die Abführungskanäle derdritten Strömungsebene unter einem Winkel kreuzen.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Strömungskaπal individuell über ein Ventilsystem mit Fluid beströmt und entleert werden kann.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Abführung des Fluids jedes Reaktionsbereichs ohne Kontakt dieses Fluids zu den anderen Reaktionsbereichen erfolgt.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Strömungskanalstruktur einseitig mit einer transparenten Deckschicht versehen ist. Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Stromungskanalstruktur beidseitig mit einer transparenten Deckschicht versehen ist.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die transparenten Deckschichten aus Glas oder Kunststoff bestehen und in diese Deckschichten eine Struktur von Mikrolinsen derart integriert ist, daß das einfallende Licht auf die Reaktionsbereiche fokussiert wird und das ausfallende Licht einer Nachweisreaktion entsprechend gebündelt wird.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die transparenten Deckschichten aus einer Vielzahl von parallelen verschmolzenen Glasfasern bestehen, welche derart zu einer transparenten Wabenstruktur ausgebildet sind, daß das ein- und ausfallende Licht parallelisiert und ein seitliches reflexionsbedingtes Ausbreiten des Lichtes in der Deckschicht verhindert wird.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Wände zwischen den Zuführungskanälen und den Abführungskanälen lichtundurchlässig ausgeführt sind.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungskanäle aus einer Vielzahl von zusammengeschmolzenen Glasfaserbündeln bestehen, wobei die Glasfaserseelen herausgeätzt sind und somit Mikrokanäle bestehen.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Glasfaserbündel mit herausgeätzten Seelen nur im Bereich der Reaktionsbereich angeordnet werden.
Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungsebenen aus einer Siliziumschicht bestehen, in welche eine Vielzahl von kleinen Kanälen geätzt wurde. 14 Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Strömuπgsebenen so übereinander angeordnet werden, daß sich die Reaktionsbereiche in der zu den Strömungsebeneπ senkrechten Projektion nicht überlagern und individuell durch Licht photoaktiviert werden können und Licht ebenfalls ortsspezifisch für jeden der Reaktioπsbereiche detektiert werden kann.
15 Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine programmierbare Lichtquellenmatrix für die Synthese und Analyse in den Reaktionsträger integriert wird.
16 Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine Detektionseinheit in Form einer CCD-Matrix in den Reaktionsträger integriert wird.
1 7. Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von jeweils unterschiedlichen Rezeptoren an spezifische Bereiche an den Träger gebunden ist.
1 8. Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach Anspruch 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren ausgewählt sind aus Nukleinsäuren, wie DNA, RNA, Nukleinsäureanaloga, wie Peptid- nukleinsäuren (PNA), Peptiden und Sacchariden.
1 9. Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach Anspruch 17 oder 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren aus einzelnen Synthesebausteinen an dem Träger synthetisiert worden sind.
20. Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach einem der Ansprüche 17 - 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Rezeptor und Träger ein Baustein eingefügt ist, der eine Abspaltung des Rezeptors erlaubt.
21 . Mikrofiuidischer Reaktionsträger nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass nach Abspaltung des Rezeptors eine funktioneile Gruppe auf dem Träger zurückbleibt, welcher zur Synthese eines neuen Rezeptors geeignet ist.
22. Verwendung eines mikrofluidischen Reaktionsträgers nach einem der Ansprüche 6 bis 21 , wobei durch die transparente Deckschicht Lumineszenz- und Fluoreszenzmessungen im Rücklichtverfahren durchgeführt werden.
23. Verwendung eines mikrofluidischen Reaktionsträgers nach einem der Ansprüche 7 bis 22 , wobei jeder Reaktionsbereich über eine programmierbare Lichtquellenmatrix Licht definierter Wellenlänge ausgesetzt wird und über besagtes Licht und besagte Fluidversorgung biochemisch funktionalisiert wird und gleichzeitig über die zweite transparente Deckschicht alle Vorgänge im Reaktionsträger optisch überwacht werden.
24. Verwendung eines mikrofluidischen Reaktionsträgers nach einem der Ansprüche 7 bis 2 _ W0bei durch die beiden transparenten Deckschichten Lumineszenz- und Fluoreszenzmessungen sowie Absorptionsmessungen im Durchlichtverfahren durchgeführt werden.
25. Verwendung eines mikrofluidischen Reaktionsträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur naßchemischen Synthese von Oligomer- oder Polymersonden wie DNA, RNA, PNA, LNA und anderen.
26 Verwendung eines mikrofluidischen Reaktionsträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur integrierten Synthese und Analyse von Polymeren.
27 Verwendung eines mikrofluidischen Reaktionstragers nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur optischen Analyse der Hybridisierung von Polymersonden mit komplementären Fragmenten.
28 Verwendung eines mikrofluidischen Reaktionsträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur effizienten hochparallelen kombinierten naßchemischen und lichtgesteuerten Synthese von Oligomer- oder Poiymersonden wie DNA, RNA, PNA, LNA, Proteinen und anderen sowie zur anschließenden optischen Analyse der Hybridisierung mit komplementären Fragmenten.
29. Verwendung eines mikrofiuidischer Reaktionsträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur lichtgesteuerten Synthese von Oligomer- oder Polymersonden wie DNA, RNA, PNA, LNA und anderen sowie zur anschließenden optischen Analyse der Hybridisierung mit komplementären Fragmenten.
30. Verwendung eines mikrofluidischen Reaktionsträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur individuellen Benetzung und biochemischen Funktionalisierung jedes Reaktionsbereiches im Reaktionsträger.
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