WO2001016151A1 - Acide nucleique a photocouplage reversible et phosphoroamidite - Google Patents
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Classifications
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
Definitions
- the invention of this application relates to a reversible photoligating nucleic acid and phosphoramidite. More specifically, the invention of this application is useful for applications such as antisense DNA, antigene DNA, optical gene diagnosis and treatment, analysis of DNA-protein interaction, and the formation and specificity of linked structures of bio-related molecules.
- New photoreversible nucleic acids capable of controlling chemical cleavage by light and phosphoramidites useful in their synthesis, and methods of photoligation and photocleavage using these. is there. Background art
- linked structures such as DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-PNA, and DNA-protein
- the control of their cleavage are controlled by antisense DNA, antigene DNA, gene diagnostic therapy, DNA- It is extremely important for elucidating the interaction of proteins and the like, and controlling biomolecular structures based on this.
- the invention of this application solves the above-mentioned problems of the conventional technology, selectively provides a high coupling yield, and enables specific photocleavage of the coupling portion, thereby achieving optical coupling. It is an object of the present invention to provide a new technical means that can freely and reversibly control photolysis and photolysis. Disclosure of the invention
- the invention of the present application is characterized in that the system of the reversible photoligating nucleic acid and the bio-related polymer is irradiated with light to form a coupling structure therebetween.
- the present invention provides a photocleaving method characterized by cleaving the linking structure between a reversible photoligating nucleic acid and a bio-related polymer by irradiation with short-wavelength light.
- FIG. 1 is an absorption spectrum diagram showing an example of a reversible photocoupling and photocleavage reaction.
- the reversible photoligating nucleic acid of the formula (1) ie, the photoligating nucleoside-containing DNA of the present invention, has a vinyl group at the 5-position of the pyrimidine ring. It has a characteristic structure. Presence of vinyl group in this structure Light-control of the linkage and cleavage of biologically relevant macromolecules such as DNA, RNA, PNA, proteins, etc. is enabled. This reversible photoligating nucleic acid can also be called a functional nucleic acid containing vinylcytosine.
- the reversible photoligating nucleic acid may have other substituents permitted on the bilimidine ring-nucleoside moiety, and may have an amino group (NH 2 ), a hydroxyl group ( ⁇ H) may be protected by an acceptable protecting group.
- the invention of this application includes these conductors.
- the photoligating nucleic acid of the present invention represented by the formula (1) can be easily prepared, for example, by passing through the phosphoramidite represented by the formula (2) by the route of step 1 and step 2 of the following formula. Can be synthesized.
- step 1 5-cytosine amidite is reacted by reacting an amiditizing agent with a 5-vinyldoxydzidine DMT r form. It is carried out by synthesizing the precursor and then reacting with 1,2,4-triazole. The following are shown as amiditizing agents in this case.
- step 2 the reaction is carried out, for example, by synthesizing a DNA oligomer by a solid-phase synthesis method using a DNA synthesizer.
- Linkage by light can be achieved by irradiating light in the coexistence of a partner bio-related polymer, that is, DNA, RNA, PNA, or a protein.
- photocleavage is performed as a specific cleavage at the joint by irradiating light of shorter wavelength.
- optical coupling can be generated by photoexcitation having a longer wavelength than 330 nm, and cleavage can be generated by photoexcitation having a single wavelength than 320 nm.
- the method of light irradiation is selected from various means, and for example, a transilluminator can be used.
- a functional nucleic acid containing vinylcytosine as a reverse photoligating nucleic acid was synthesized.
- the CH 3 CN solution (0.1 M, 3 mL) of the vinyl cytosine amidite obtained in step 1 was attached to a fully automatic DNA synthesizer, and then DNA oligomers were synthesized by the phase synthesis method, excised, deprotected, and purified by high-performance liquid chromatography.
- the invention of this application gives a selectively high ligation yield, enables specific photocleavage of the linking part, and enables optical connection and photocleavage freely.
- New technological tools are provided that can be controlled reversibly.
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Description
明 細 書
可逆的光連結性核酸とフォスフォロアミダイ 卜 技術分野
この出願の発明は、 可逆的光連結性核酸とフォスフォロアミダイ 卜に関するものである。 さ らに詳しく は、 この出願の発明は、 アン チセンス D N A、 アンチジーン D N A、 光遺伝子診断治療、 D N A 一蛋白質相互作用の解析等への応用に有用で、 生体関連分子の連結 構造の形成や特異的な解裂を光によ り制御できる新しい可逆的光連 結性核酸とその合成において有用なフォスフォロアミダイ ト、 さ ら にはこれらを用いた光連結と光解裂の方法に関するものである。 背景技術
従来よ り、 生体機能の解明や生理活性機序、 そして生理活性物質 の創製にとって、 D N A、 R N A、 P N A、 蛋白質等の相互の連結 や局所的解裂を制御することが重要であると認識されている。
たとえば、 D N A — D N A、 D N A— R N A、 D N A— P N A、 D N A—蛋白質等の連結構造の形成と、 それらの解裂を制御するこ とは、 アンチセンス D N A、 アンチジーン D N A、 遺伝子診断治療 、 D N A—蛋白質等の相互作用の解明や、 これに基づく 生体分子構 造のコン トロールにとって極めて重要である。
このため、 従来よ り、 これらの連結や解裂のための手段について の検討が進められており、 光を照射することによる方法も検討され てきている。
しかしながら、 これまで報告されている例においては、 連結収率 は 4 0 %前後と低く 、 また副反応も多いという問題がある。 さ らに
また、 連結部分だけを特異的に光解裂させた例は知られていない。 そこで、 この出願の発明は、 以上のとおりの従来の技術の問題点 を解消し、 選択的に高い連結収率を与え、 連結部の特異的な光解裂 をも可能と して、 光連結と光解裂とを自由自在に可逆的に制御する ことのできる新しい技術的手段を提供するこ とを課題と している。 発明の開示
この出願の発明は、 上記の課題を解決するものと して、 第 1 には 次式 （ 1 )
また、 第 2には、 次式 （ 2 )
で表わされるフォスフォロアミダイ 卜を提供する。
さ らにこの出願の発明は、 第 3には、 前記の可逆的光連結性核酸 と生体関連高分子との系に光照射して両者の連結構造を形成するこ とを特徴とする光連結方法を、 第 4には、 可逆的光連結性核酸と生 体関連高分子との連結構造を短波長の光照射によ り解裂することを 特徴とする光解裂方法を提供する。
この出願の発明の上記のとおりの可逆的光連結性核酸、 すなわち 光連結性ヌク レオシ ド含有 D N Aの光照射によ り、 1 ) D N A— D N A、 D N A— R N A、 D N A— P N A、 D N A—蛋白質等の連結 と解裂反応が可能になり、 a ) アンチセンス D N A、 b ) アンチジ ーン D N A、 c ) 光遺伝子診断治療、 d ) D N A—蛋白相互作用解 析等への利用が拓かれる。
そして、 この出願の発明によれば、 9 5 %以上という極めて高 い連結収率が得られ、 しかも光によって、 連結部分の特異的解裂も 可能となる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 可逆的な光連結と光解裂の反応の例を示した吸収スぺク トル図である。 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、 以下 にその実施の形態について説明する。
この発明の前記式 （ 1 ) の可逆的光連結性核酸、 すなわち光連結 性ヌク レオシ ド含有 D N Aは、 ピリ ミジン環の 5位にビニル基を持
つ特徴のある構造を有している。 この構造におけるビニル基の存在 力 相手となる生体関連高分子、 たとえば、 D N A、 R N A、 P N A、 蛋白質等との連結と解裂を光制御できるようにしている。 また 、 この可逆的光連結性核酸は、 ビニルシ トシンを含む機能性核酸と 呼ぶこともできる。 そして、 この可逆的光連結性核酸は、 ビリ ミ ジ ン環ゃヌク レオシ ド部分に許容される他の置換基を有していてもよ く 、 またアミノ基 （ N H 2 )、 ヒ ドロキシ基 （〇 H ) は、 許容される 保護基によ リ保護されていてもよい。 この出願の発明はこれらの誘 導体も包含している。
式 （ 1 ) で表わされるこの発明の光連結性の核酸は、 たとえば次 式のステップ 1 およびステップ 2の経路によって、 前記式 （ 2 ) で 表わされるフォスフォロアミダイ トを経由することによって簡便に 合成することができる。
〇
〇 N P I—
2-Cynanoeth l Ν,Ν,ΝΉ'- 2-し ynanoethyl Ν,Ν- tetraisopropylphosphorodiamidite dusopropvlchlorophosphoroamidite またステップ 2では、 D N A合成機において固相合成法で D N A オリ ゴマーを合成すること等によ り実施される。
光による連結は、 相手となる生体関連高分子、 つまり D N A、 R N A、 P N A、 あるいは蛋白質の共存下に光照射することで可能と される。 一方、 光解裂については、 よ り短波長の光を照射すること で連結部での特異的な解裂と して実施される。 具体的には、 たとえ ば 3 3 0 n mよ り も長波長の光励起によ り光連結を生じさせ、 3 2 0 n mよ り単波長の光励起によ り解裂を生じさせることができる。 光の照射の方法と しては各種の手段から選択され、 たとえば トラ ンスイルミネーターを用いるこ とができる。
そこで以下に実施例を示し、 さ らに詳しく この出願の発明につ いて説明する。 実施例
<実施例 1 > (合成）
前記反応式のステップ 1 およびステップ 2に従ってこの発明の可
逆的光連結性核酸と してのビニルシ トシンを含む機能性核酸を合成 した。
( a ) ステップ 1
5 —ビニルデォキシゥリ ジン D M T r 体 （ 1 6 6 m g， 0. 2 9 8 m m o I ) の C H 3 C N溶液に、 アミダイ 卜化剤 （ 9 8. ◦ L 、 0. 3 0 9 m m o l ) と 0. 5 M亍 トラゾ一ルの入った C H 3C N 2. 0 m Lを加え、 反応混合物を 1 . 0 h攪拌した後、 抽出操作 を行い、 有機層を乾燥し、 C H 3C Nで共沸し、 ビニルシ トシンァ ミダイ ト前駆体を 2 2 8 m g定量的に得た。 次いで、 3塩化リ ン （ 0. 3 2 g , 2. 1 0 m m o l )、 1 , 2， 4 一 ト リァゾ一ル （ 0 • 6 6 7 g , 9. 6 フ 6 m m o I ) の C H 3 C N混合溶液にビニル シ トシンアミダイ ト前駆体を 0 °Cで 3回に分けて加え、 3時間撹拌 した。 その後、 抽出操作を行い、 有機層を乾燥し、 C H 3C Nで共 沸し、 ビニルシ トシンアミダイ トを 9 5. 7 m g ( 0. 1 1 8 mm o I ) フ 5 %の収率で得た。
表 1
Ή NMR (400 MHz, CDC13) δ 2.21 (ddd. J = 12.1 Hz, J = 7.4 Hz, J = 6.3 Hz, IH, Η-2'β),2.35 (ddd, J = 12.1 Hz, J = 6.1 Hz, J = 3.1 Hz, IH, Η-2'α), 2.95 (dd, J = 10.6 Hz, J = 3.4 Hz, 1H， H-5'), 3.38 (dd. J = 10.6Hz, J = 3.4 Hz, IH. H-5'), 3.71 (s, 6H, 0CH3 x 2), 3.90-3.99 (m, IH, H-4'): 4.45-4.48 (m， 3H, H-3'), 4.86 (dd, J = 10.2Hz, 2.0 Hz, IH, vmyl trans), 5.60-5.73 (m, IH, vinyl cis, H-1'), 6.29 (dd, J = 7.4 Hz, J = 6.1Hz, IH, H-1'), 6.73-6.77 (m, 4H, Η-β to 0CH3 x 4), 7.17-7.23 (m, 9H, phenyl), 7.29-7.32 (m, IH, CH=CH2), 7.58 (s, IH, H-6), 8.23 (bs, IH, NH). 31P NMR (CDCI3, 85% - H3P0, in D20 ext. 0 ppm) δ 149.811 & 150.386 (diastereomer of the products).
( b ) ステップ 2
ステップ 1 で得られたビニルシ トシンアミ ダイ 卜の C H 3 C N溶 液 （ 0. 1 M 3 m L ) を全自動 D N A合成機にと りつけ、 通常の固
相合成法によ り D N Aオリ ゴマーを合成し、 切り出し、 脱保護後、 高速液体ク ロマ トによ り精製した。
E S I — T〇 F法による分子量測定で化合物の同定を行った。 ぐ実施例 2 > (可逆的光連結と光解裂）
錶型となるオリ ゴマー （ 5 ， - C A C G C G A G C A C A - 3 ' 、 2 5 m M ) の存在下、 連結するオリ ゴマー （ 5 ' — T G T G C T 一 3 '、 2 0 m M ) 及びビニルシ トシンを含むオリ ゴマー （ 5 ' - V C G C G T G— 3 '、 2 0 m M ) を混合し、 5 0 0 m Mのカコ ジ ル酸緩衝液 （ 5 0 m M、 p H 7. 0 ) 中で 3 6 6 n mの波長で トラ ンスイルミネーターを用いて光照射を行った。 9 0 %以上の収率で オリ ゴマーを連結することに成功した （図 1 ； a )， b ))。
次にこの溶液に対し 3 0 2 n mの波長で トランスイルミネ一タ一 を用いて光照射を行ったところほぼ定量的にオリ ゴマーを解裂させ ることに成功した （図 "！ ； b )， c ))。
なお、 5 ' — V C G C G T G— 3 ' の分子量測定を E S I — T〇 F Fによって測定した。 結果は以下の表 2のとおりであった。
表 2
E S I -T O F Fmass calcd. for C60 H 75 N 23035 P 5 (M-H), 1832.36; found, 1832.34 産業上の利用可能性
以上詳し〈説明したとおり、 この出願の発明によって、 選択的に 高い連結収率を与え、 連結部の特異的な光解裂をも可能と して、 光 連結と光解裂とを自由自在に可逆的に制御することのできる新しい 技術的手段が提供される。
Claims
請求の範囲 次式 （ 1 )
2 . 次式 （ 2 )
3 . 請求項 1 の可逆的光連.結性核酸と生体関連高分子との系に光
照射して両者の連結構造を形成することを特徴とする光連結方法。
4 . 請求項 1 の可逆的光連結性核酸と生体関連高分子との連結構 造を短波長の光照射によ り解裂することを特徴とする光解裂方法。
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