WO2001019980A1 - Verfahren zum anbinden von nukleinsäuren an eine festphase - Google Patents

Verfahren zum anbinden von nukleinsäuren an eine festphase Download PDF

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WO2001019980A1
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solid phase
nucleic acid
nucleic acids
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Holger Rauth
Richard Reinhardt
Eckard Nordhoff
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the invention relates to methods for attaching or immobilizing nucleic acids to a solid phase and for purifying the bound nucleic acids, the solid phase being coated with hydrophilic and hydrophobic groups, and / or a hydrophilic water-containing polymer matrix.
  • nucleic acids used in particular DNA
  • nucleic acids obtained with conventional methods must therefore be purified before further use.
  • sequencing PCR polymerase chain reaction
  • undesired by-products, excess primers, unincorporated nucleotides and salts of the reaction buffer have to be separated, since they could interfere with the sequencing reaction.
  • a purification must take place before the desired DNA is processed further, in which the cell debris is separated off after lysis.
  • the desired DNA must then be freed of impurities such as RNA, proteins, salts and the like before use, for example for a restriction digest or a sequencing reaction.
  • nucleic acid solution used must be free of other constituents which absorb in the same waveband as the desired product, for example RNA, for an error-free determination.
  • nucleic acids in particular DNA
  • MALDI-MS Mass assisted laser desorption / ionization-mass spectrometry; matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry
  • the sample molecules are largely free of accompanying substances, such as buffer substances. Metal cations, excess primers, peptides, lipids, detergents and the like are, which could interfere with the analysis.
  • a nucleic acid for performing a MALDI-MS analysis is advantageously converted into the ammonium form. In this way, discrete analyte signals and a good signal / noise ratio can be achieved, and discrimination of the sample signal by accompanying substances is avoided.
  • the purification can be done manually using complex techniques. To cope with a larger number of samples, however, it is necessary to provide a suitable, technically simple and inexpensive purification process which can be automated in order to cope with the required throughput.
  • the QIAquickPCR Purification Kit from Qiagen uses a special binding buffer to adsorb DNA onto a silica membrane.
  • the binding buffer means that only DNA of a certain length is adsorbed and excess primers and nucleotides can be separated. After washing the DNA, it is then eluted from the column using a suitable eluent.
  • a liquid phase which contains dissolved DNA is placed on a gel matrix, the macromolecules depending on their size penetrating into the network of the matrix to different depths. Smaller molecules penetrate deeper than larger molecules and are thus held back longer on the column. Molecules larger than the largest pores of the swollen gel matrix used cannot penetrate the gel grains and migrate past them, so that they leave the column first. Due to the different sizes of the desired DNA on the one hand and primers and nucleotides on the other hand, a purification can take place.
  • a commonly used material for the gel matrix is Pharmacia's Sephacryl.
  • Another method of purifying DNA is preparative isolation using gel electrophoresis.
  • the molecules are separated according to their size.
  • the desired band with the molecules of interest is cut out and these are then eluted directly from the gel.
  • This process is also difficult to automate, the limiting step being the cutting out of the desired band. So far, this method could only be used for manual use.
  • Another method for purifying nucleic acids is magnetic separation by means of specific binding of the nucleic acids to a functionalized surface.
  • a specific binding only certain DNA fragments are specifically bound to particles via high-affinity interactions or covalent binding.
  • biotinylated products are bound to magnetic particles equipped with immobilized streptavidin via high-affinity interactions.
  • particles which have a primer on their surface Under suitable hybridization conditions, only fragments with a sequence complementary to this primer are then bound.
  • these methods require complex preparation of both the solid phases and the molecules to be purified, for example by derivatization, and are limited to molecules prepared in this way.
  • WO 94/1 1 1 03 describes such a method using magnetizable polymer particles which have specific affinity ligands on their surface.
  • EP 0 885 958 describes a method for isolating DNA using at least two different magnetic particles which carry partners of a specific binding pair, for example probes, biotin or streptavidin.
  • US Patent 5,405,951 describes a method in which DNA is bound to silica surfaces using chaotropic salts.
  • chaotropic salts are hazardous to health.
  • the method described in US Pat. No. 5,405,951 requires working at an elevated temperature.
  • US Patent 5,705,628 describes a method in which DNA is bound using a binding buffer to magnetic microparticles which have a surface provided with carboxyl groups.
  • a binding buffer to magnetic microparticles which have a surface provided with carboxyl groups.
  • carboxyl groups due to the low yield, a relatively large number of particles are required per sample and the carboxyl group modification only allows the use of a few special types of particles.
  • the object of the invention was therefore to provide a method for immobilizing / binding or purifying nucleic acids which at least has the disadvantages of the methods known in the prior art partially avoided and which in particular enables simple and cost-efficient purification of a large number of samples.
  • a method for binding nucleic acids to a solid phase which is characterized in that a solution containing nucleic acids is brought into contact with a solid phase which has hydrophobic and hydrophilic groups on the surface in the presence of a salt and polyethylene glycol , with the nucleic acids being bound to the surface.
  • the nucleic acid molecules bind to said surface and are thus available for solid-phase-supported washing processes, during which interfering substances can be effectively separated and, if necessary, the sample molecules can be converted into the ammonium form which is favorable for mass spectrometry.
  • nucleic acids can be isolated from solutions, the term nucleic acid also being understood to mean their salts.
  • the binding of the nucleic acids to the surface of the solid phase is preferably reversible and non-specific and is therefore not limited by special high-affinity binding pairs, such as streptavidin / avidin, or to nucleic acids with certain sequence segments which are bound to the surfaces, for example by hybridization. Rather, according to the invention, nucleic acids are bound independently of the sequence, so that a universal binding matrix for nucleic acids is obtained.
  • the method is technically simple to carry out and can be automated with little effort, so that a high sample throughput is possible at low cost.
  • the immobilization and also the elution of the nucleic acids from the surface can be carried out at room temperature. Furthermore, it was surprisingly found that nucleic acids can be bound to said surfaces in high yield. The consequence of this is that fewer particles per Sample must be used as in known methods, whereby a further simplification and cost reduction can be achieved.
  • the part of the solid phase used which has been brought into contact with the solution preferably has a proportion of> 1%, in particular> 5%, preferably> 10% and ⁇ 90%, in particular ⁇ 50% and preferably ⁇ 30%, of hydrophobic chemical surface groups on. It should be noted that from a certain proportion of hydrophobic surface groups, which can be determined by the person skilled in the art for the respective solid phase, a clumping of solid phase particles in aqueous solution occurs, with the result that the solid hare is no longer resuspendable.
  • the surface on the solid phase can be provided by derivatization or by coating. This procedure has the advantage that the material for the solid phase can be freely selected.
  • the hydrophobic chemical groups are preferably organic hydrocarbon-containing groups and can have cyclic, linear and / or branched structures.
  • the surface preferably carries C ⁇ -0 30 alkyl groups, or C 5 -C 30 aryl groups, in particular C 6 - C 24 alkyl groups as functional, hydrophobic groups.
  • the alkyl groups are particularly preferably selected from C 8 alkyl, C 18 alkyl and mixtures thereof, octadecyl ligands being most preferred.
  • the surface also has hydrophilic chemical groups, e.g. Hydroxyl or / and oxide groups, which may already be present in one of the pre-coatings or intermediate coatings mentioned below.
  • hydrophilic groups e.g. Hydroxyl or / and oxide groups
  • especially small particles with an exclusively hydrophobic surface tend to clump in aqueous solutions.
  • hydrophilic groups in particular hydroxyl radicals
  • the hydroxyl groups can be inorganic hydroxyl groups, e.g. Silicic acid groups, and / or organic hydroxyl groups, e.g. B. mono- or polysaccharides such as agarose.
  • hydrophilic groups include carbonyl, carboxyl, ester, amino, thiol, sulfate, sulfonyl and similar groups and combinations of such groups.
  • Polyol derivatives, such as polyalkylene glycol derivatives, can also be used as hydrophilic groups.
  • the arrangement and the ratio of hydrophobic and hydrophilic groups in the area of the surface provided for binding the nucleic acids is adjusted so that the respective particles no longer clump together in aqueous solution, but the binding of the nucleic acid still takes place effectively.
  • the functional groups and their arrangement can be selected by the person skilled in the art in accordance with the respective parameters, such as the particle size, the particle density, the analyte, etc. It is possible, for example, to apply the hydrophilic groups in separate microareas delimited from the hydrophobic groups. However, a "mixed surface" in which the hydrophobic and hydrophilic groups are present next to one another is preferred.
  • the hydrophilic groups can also be introduced by suitably substituted organic molecules, for example hydroxy-substituted alkyls.
  • An example of a the preferred mixing surface is an alkyl / OH surface, in particular a C 18 alkyl / OH surface.
  • Said surfaces can be applied to the solid phase directly or by means of a preliminary or intermediate coating.
  • Suitable pre-coatings are, for example, a polysilicic acid matrix and / or a monosaccharide matrix.
  • Other suitable pre-coatings are partners of a specific binding pair, for example streptavidin / avidin, to which the actual active layer is then applied.
  • the binding of the hydrophobic or / and hydrophilic groups to the solid phase or the binding of the hydrophobic or / and hydrophilic coating to the pre-coating and the binding of the pre-coating to the solid phase can e.g. covalent, e.g. by esterification, adsorptively or via high affinity interactions.
  • a precoating consisting of polysilicic acid and monosaccharide is applied to a solid phase, for example j / iron oxide particles with a diameter in the nanometer or micrometer range.
  • This pre-coating is then equipped with hydrophobic groups, in particular alkyl groups and possibly also with hydrophilic groups. Particularly good results have been obtained with particles which have 10 to 15% alkyl groups, in particular octadecyl groups per silica matrix (mol / mol) and 0.2% octadecyl groups per monosaccharide unit (mol / mol).
  • any solid phase known to the person skilled in the art can be used as the solid phase, such as, for example, microtiter plates, vessels, such as Eppendorf tubes, Greiner tubes, Nunc tubes, etc.
  • Solid particles with a diameter of> 1 nm to ⁇ 1 mm are preferably used as the solid phase, as a result of which a favorable specific surface area per gram of particles is accessible.
  • the method according to the invention allows the use of a wide variety of solid phase materials.
  • the solid phase material used is preferably silica, a plastic such as polystyrene, or a magnetic or magnetizable material, and in particular--iron oxide. If a magnetic solid phase is used, further advantages can be obtained. Magnetic separation is relatively easy to carry out and can be easily automated.
  • paramagnetic or para- and ferromagnetic particles are used as the solid phase, clumping of the solid particles can also be further reduced.
  • Small magnetic particles with a diameter in the nm or ⁇ m range are usually used for magnetic particle technology (eg from Dynal, Oslo, Norway), in which the problem of clumping is particularly severe.
  • the purification according to the invention can, however, be carried out without clumping, since the hydrophobic groups are provided with a sufficient number of hydrophilic groups, in particular hydroxyl groups.
  • binding buffer contains a salt and polyethylene glycol.
  • An alkali, alkaline earth metal and / or ammonium salt is preferably used as the salt, which as cation, in particular a Li, Na, K, Rb, Cs, Fr, Be, Mg, Ca, Sr -, Ba-, Ra- and / or NH 4 -lon contains.
  • the salt used according to the invention preferably contains a halide anion, in particular a chloride anion.
  • the polyethylene glycol (PEG) used preferably has an average molecular weight of 1,000 to 20,000 g / mol, in particular 6,000 to 1,500 g / mol.
  • an alcohol in particular methanol, ethanol, propanol and / or butanol, particularly preferably ethanol or / and 2-propanol, is preferably added to the binding buffer.
  • the alcohol content in the binding buffer can be up to 50% by weight, preferably 30 to 40% by weight.
  • the salt is preferred for the process according to the invention in a concentration of ⁇ 5 mmol / l, in particular of 5 mmol / l to 4 mol / l, in particular up to 3 mol / l and the polyethylene glycol is preferably used in a concentration of 5 to 40%.
  • the stated concentrations of salt and PEG are final concentrations and relate to the binding conditions, ie to the final mixture, which comprises the sample and binding buffer and, if appropriate, further diluents, such as water.
  • Nucleic acids that can be purified using the method according to the invention include e.g. Single-stranded DNA, double-stranded DNA, RNA, LNA and nucleic acid-protein, nucleic acid-PNA and nucleic acid-sugar adducts or complexes. Preference is given to immobilizing nucleic acids which are amplification products, for example from a PCR reaction, or which have been obtained by amphfication with the aid of cells, for example by means of an overnight culture, or which are sequencing reaction products, primer extension reaction products, gas chain reaction products. products, residual endonuclease digestion products, etc. However, synthetically produced nucleic acids can also be bound.
  • the selective binding of the single and double-stranded nucleic acids to said surface can be set.
  • a selectivity> 70%, in particular> 80% and particularly preferably> 90% can be achieved with a concentration of monovalent cations of 0.5 to 4 mol / l, divalent cations ⁇ 5 mmol / l and PEG ⁇ 15 %
  • By weight bind selectively ds nucleic acids> 80 bp even in the presence of ss nucleic acids.
  • the binding of ss nucleic acids is achieved by adjusting the concentration divalent cations> 5 mmol / l and ⁇ 1 00 mmol / l and PEG from 1 0 to 30 wt .-%.
  • the combination of both methods enables the selective purification of SS and DS nucleic acids.
  • Double-stranded nucleic acids can also be fractionated by size by adjusting the salt and PEG concentrations within the ranges mentioned above.
  • the use of a final combination of PEG of 15-40% (w / w) and a salt content of 10 to 1000 mmol / l has proven to be advantageous.
  • the invention relates to a method for isolating and / or purifying nucleic acids, comprising the steps
  • the separation of the solid phase from the solution is possible by magnetic means and can therefore be easily automated.
  • the solid phase is preferably washed once before use.
  • the solid phase is preferably washed once before use.
  • diluted binding buffer BP
  • a solution of 0.5 mol / l EDTA pH 8 - 9 can also be used.
  • a further improvement of the purification can be obtained by washing the separated solid phase, on the surface of which the nucleic acid is bound, with a buffer solution which dissolves impurities bound to the solid phase but not nucleic acid bound to the solid phase.
  • the composition of the washing solution is selected depending on the application and the surface.
  • a suitable washing solution is, for example, 50-70% (vol / vol) ethanol or 2-propanol, possibly with additions of EDTA, CDTA and TRIS in millimolar concentrations.
  • washing solution containing ammonium acetate in at least one washing step is preferred, e.g. B. 0.05 to 5 mol / l ammonium acetate in 60 to 80% ethanol. It is often also advantageous to carry out several washing steps with different washing buffers for purification.
  • the nucleic acid molecules or their salts bound on said surface are preferably separated off by means of an elution solution, wherein any liquid which detaches the nucleic acid from the solid phase can be used as the elution solution.
  • the choice of the elution solution depends on the type of surface used and the analyte and on the subsequent use of the analyte.
  • Preferred as elution solution are bidistilled water, pH 7 to 8, an aqueous TRIS solution with a TRIS concentration of 1 to 100 mmol / l, preferably with a pH of 7 to 9, a formamide solution, a loading buffer for electrophoresis , a matrix solution, e.g. B. 3-hydroxypicolinic acid in water (1 - 200 mmol / l) used for MALDI-MS etc.
  • a magnetic solid phase can in turn be separated off by magnetic means, whereby complete automation of the method according to the invention can be achieved.
  • the nucleic acids isolated or / and purified by the methods according to the invention can be used directly for a further analysis, for example a mass spectrometry (MS) analysis.
  • MS mass spectrometry
  • the previous elaborate manual cleaning using columns is not necessary. Rather, it is possible to automatically and automatically purify a large number of samples inexpensively and quickly for an MS analysis, in particular a MALDI-MS analysis or an ESI (electrospray ionization) MS analysis.
  • accompanying substances such as buffer substances, metal cations, excess primers, peptides, lipids, detergents and the like, can be removed.
  • the nucleic acid is advantageously converted into the ammonium form in order to carry out a MALDI-MS analysis, e.g. B. by an ion exchange Na + for NH 4 + , which can be carried out while the nucleic acids are bound to the surface.
  • a MALDI-MS analysis e.g. B. by an ion exchange Na + for NH 4 + , which can be carried out while the nucleic acids are bound to the surface.
  • the type of connection according to the invention thus enables a purification procedure, ie the nucleic acid is in an accessible form and not as a precipitate.
  • Small DNA molecules are of particular interest for analysis with MALDI-MS. According to the invention, the purification of small DNA molecules above a minimum size of approximately 5 nucleotides, in particular> 10 nucleotides, is possible.
  • the components which interfere with the MALDI-MS analysis such as buffer substances and metal cations, and any excess primer that may be present, are effectively removed.
  • the DNA molecules are also converted into the ammonium form compatible for MALDI-MS analysis and can be eluted either in pure water or in an aqueous matrix solution and thus transferred directly to the MALDI target.
  • a modification of the composition of the binding and washing buffers and the sequential use of particles also allow larger DNA molecules to be excluded from the purification, as a result of which a predetermined molecular weight range can be selected selectively, e.g. B.> 60 bp and ⁇ 1 00 bp.
  • a predetermined molecular weight range can be selected selectively, e.g. B.> 60 bp and ⁇ 1 00 bp.
  • volume range in which the method according to the invention can be used. Volumes from ml to the upper nl range are possible, in particular from ⁇ 1 0 ml, preferably ⁇ 1 ml and particularly preferably ⁇ 1 00 / l and> 1 00 nl, preferably> 1 ⁇ ⁇ .
  • the volume range can be set for the respective application, a concentrated sample being obtained with a small volume.
  • sequence nucleic acids linked according to the invention by known methods.
  • the sequencing conditions of known methods often represent elution conditions, i.e. the nucleic acid is then not bound to the solid phase during the actual sequencing.
  • connection conditions again for the purification of the sequencing products after completion of the sequencing reaction, in particular by adding suitable buffers.
  • the solid phase, in particular beads does not need to be separated for the sequencing reaction and subsequent purification. It has been found that the solid phases, in particular particles, often do not survive the thermal cycling often used for sequencing without damage. In such a case, new, unused beads are added after the sequencing reaction.
  • the invention further comprises a method for synthesizing nucleic acids, nucleic acids bound according to the invention being extended by at least 1 nucleotide according to known methods.
  • An example of such a reaction is the so-called primer extension reaction, ie the extension of a primer (ssDNA) by at least 1 nucleotide.
  • the extension can be done while the nucleic acid is attached to the Solid phase is bound.
  • the extension can also take place here while the nucleic acid is not bound to the solid phase and the binding of the extended nucleic acid can then be achieved again after that the extension reaction binding conditions can be set, for example by adding buffer.
  • the solid phase does not have to be separated off during the entire reaction.
  • the nucleic acids immobilized according to the method according to the invention can also be used to selectively bind further molecules to be detected, for example nucleic acids or DNA-binding proteins, and can therefore be used in appropriate assays.
  • the invention also encompasses a method for the detection of an analyte in a sample, wherein a solution containing nucleic acids is brought into contact with a solid phase, which has hydrophobic and hydrophilic chemical groups, in the presence of a salt and polyethylene glycol, the nucleic acids being bound to the surface are then brought into contact with the solid phase containing bound nucleic acid with the sample and detects the analyte via the binding to the bound nucleic acid molecules.
  • the invention also comprises a reagent kit for carrying out the method according to the invention, the binding buffer containing salt and polyethylene glycol and a solid phase, the surface of which has hydrophobic and hydrophilic groups.
  • a reagent kit preferably also contains washing and elution buffers.
  • the invention provides a method for binding nucleic acids to a solid phase, which is characterized in that a
  • Solution containing nucleic acids with a solid phase, which a comprises hydrophilic water-containing polymer matrix, is brought into contact in the presence of dehydrating reagents, the nucleic acids being reversibly and non-sequence-bound to the solid phase.
  • hydrophilic water-containing polymer matrices enables a large binding capacity with regard to nucleic acids to be obtained and also the isolation of very small DNA fragments, for example with a length of 10 to 100 bp, in particular 30 to 70 Bp can be done.
  • size-selective binding of nucleic acids is possible depending on the selection of the hydrophilic, water-containing polymer matrix.
  • the hydrophilic water-containing polymer matrix is preferably first brought into contact with a solution containing nucleic acids and then a water- removing agent is added in a second step.
  • Suitable dehydrating agents are salts, in particular chaotropic salt buffers with a high concentration, and polyethylene glycol. Preferred salts and polyethylene glycols and their concentration are as described above.
  • the polymer matrix preferably contains from 1 to 90, more preferably from 10 to 50% by weight of water.
  • the hydrophilic water-containing polymer matrix preferably contains a hydrophilic water-soluble polymer, in particular a hydrophilic water-soluble organic polymer.
  • a hydrophilic water-soluble polymer in particular a hydrophilic water-soluble organic polymer.
  • Polysaccharides are particularly suitable, in particular
  • polysaccharides with terminal hydroxyl groups such as dextran or Strength.
  • Dextran is particularly preferred.
  • the hydrophilic water-containing polymer matrix is particularly advantageously provided as a shell polymer around a magnetic core, for example in the form of dextran magnetite particles.
  • the hydrophilic water-containing polymer matrix can contain hydrophilic and / or hydrophobic groups on its surface.
  • An embodiment is preferred in which a solid phase is used which has both hydrophobic and hydrophilic groups, as described above, on the surface and at the same time comprises a hydrophilic water-containing polymer matrix.
  • a solid phase with a hydrophilic water-containing polymer matrix can be used in the same way as described above in a method for isolating and / or purifying nucleic acids or in a method for detecting an analyte in a sample. In addition, it can be used to determine the nucleic acid sequence or to synthesize nucleic acids.
  • FIG. 1 shows an agarose gel of PCR products purified according to the invention and of PCR products which were purified using COOH-coated particles:
  • FIG. 1 a shows a yield comparison using an NH 4 CI
  • Binding buffer (left) and a NaCl binding buffer (right) for PCR products purified according to the invention C1 8 / OH beads
  • PCR products which were purified using COOH-coated particles COOH beads
  • Figure 1 b shows a further yield comparison with NH 4 CI binding buffer.
  • Figure 2 (consisting of Fig. 2a, 2b and 2c) shows the insulation and
  • FIG. 2a shows the MALDI time-of-flight mass spectrum of PCR products with 47 or 48 base pairs purified according to the invention.
  • FIG. 2b shows the MALDI time-of-flight mass spectrum of an 80 bp PCR product purified according to the invention.
  • FIG. 2 c shows the MALDI time-of-flight mass spectrum of a 24-nucleotide long DNA single strand purified according to the invention.
  • MALDI single-charged molecular ions of the species (M + H) + and, in addition, with reduced frequency, also double-charged molecular ions of the species (M + 2H) 2 + are formed.
  • MALDI mass spectrometry separates PCR products and detects them in the form of single strands.
  • the signals of complementary single strands are often only partially resolved due to small differences in mass.
  • the size of the PCR products can nevertheless be determined by comparing the measured average masses with estimated values or values calculated on the basis of known sequences.
  • the (M + H) + signals of non-separated primers would be registered in the spectra at the positions marked with the arrows.
  • Magnetic particles the surface of which has hydrophobic and hydrophilic groups, are first washed three times with 1 50 ⁇ ⁇ EDTA solution (0.5 mol / l, pH 8) by magnetic separation of the particles and discarding the supernatant. After the last washing, the particles are taken up in EDTA solution and mixed. The mass concentration is 20 mg / ml.
  • the samples to be examined are placed in a microtiter plate (e.g. 96 well).
  • a microtiter plate e.g. 96 well.
  • 40 ⁇ ⁇ binding buffer 2.5 mol / l NaCl, 20% (w / w) PEG6000
  • 1 0 ⁇ ⁇ of the particle suspension are added, mixed and incubated at room temperature for 1 min.
  • microtiter plate with the samples is then placed in a magnetic holder for 2 min, the supernatant is discarded, and the particles are washed twice with 150 ⁇ l washing buffer (40% ethanol) and then dried in air for 2 to 5 min.
  • microtiter plate is removed from the magnet holder and the particles are resuspended in 20 ml elution buffer (1 mmol / l Tris-HCL) and incubated for 5 min. The microtiter plate is then again placed in the magnetic holder and the eluate is removed after 2 minutes.
  • Example 2 dsDNA isolation and purification from cell culture
  • Cells from an overnight culture were pelleted and the supernatant discarded.
  • the cell pellet was taken up in 40 ⁇ ⁇ resuspending buffer (50 mmol / l Tris-HCl, pH 8, 10 mmol / l EDTA, 100 ⁇ g / ml RNAse A) and mixed.
  • 40 ⁇ l of lysis buffer 200 mmol / l NAOH, 1% (w / w) SDS
  • the supernatant was transferred to a fresh microtiter plate.
  • Magnetic particles according to the invention were washed three times with 150 ⁇ l EDTA solution (0.5 mol / l pH 8) by magnetic separation of the particles and discarding the supernatant. After the last washing, the particles were taken up in EDTA solution and mixed. The mass concentration was 20 mg / ml.
  • Binding buffer 2.5 mol / l NaCl, 20% (w / w) PEG 6000
  • 10 ⁇ l of the particle suspension were added. After the mixture had been mixed, the mixture was incubated at room temperature for 5 min.
  • the microtiter plate with the samples was then placed in a magnetic holder for 10 minutes, the supernatant was discarded and the particles were washed twice with 120 ⁇ l washing buffer (70% ethanol, 10 mmol / l Tris-HCl, pH 8, 1 mmol / l EDTA ) washed and then air-dried for 5 min.
  • 120 ⁇ l washing buffer (70% ethanol, 10 mmol / l Tris-HCl, pH 8, 1 mmol / l EDTA
  • microtiter plate was then removed from the magnet holder and the particles resuspended in 50 ⁇ l elution buffer (1 mmol / l Tris-HCL, pH 8), incubated for 5 min and the plate was then placed back in the magnet holder and the eluate was removed after 2 min.
  • the DNA contained in the eluate could be used for concentration determinations, DNA sequencing etc. without further purification.
  • FIG. 1 shows the agarose gel of purified 100 bp PCR products.
  • the purification was carried out on the one hand according to the invention and on the other hand using COOH-coated particles (cf. US Pat. No. 5,705,628). Before the purification, 100 pmol of a 32 nucleotide ssDNA was added to the PCR products.
  • the desired nucleic acid was obtained in a purified form and unwanted substances including the 32 nucleotides ssDNA were separated.
  • the yield in the process according to the invention is significantly higher than that of the COOH-coated particles.
  • PCR reactions were carried out in 40 ⁇ l reaction volumes in 96-well titer plates. Magnetic particles were magnetically separated before use, the supernatant solution being pipetted off and the particles resuspended in an aliquot of the binding buffer. After completion of the amplification reaction, 5 ⁇ l of the suspension of the magnetic particles were added to each reaction vessel, followed by 50 ⁇ l of binding buffer, specifically for the PCR products with 47/48 bp (see FIG.
  • the resulting suspension was mixed well and left to stand for 10 minutes.
  • the particles were then magnetically separated, the supernatant was pipetted off, and 1 05 ⁇ l of 65% (vol / vol) ethanol / 35% (vol / vol) H 2 0 (Washing solution 1) replaced.
  • the magnetic particles were moved twice through the washing solution.
  • the supernatant was then successively replaced by 1 1 5, 1 25 and 1 35 ⁇ l 1, 5 M ammonium acetate in 30% (vol / vol) H 2 0, 70% (vol / vol) ethanol, the particles being replaced five times by the new washing solution 2 were moved.
  • the supernatants were discarded.
  • the particles were washed twice with 1 45 ⁇ l 80% (vol / vol) ethanol / 20% (vol / vol) H 2 0 (washing solution 3), the particles being moved twice through the solution. After the last supernatant had been pipetted off, the particles were left to stand in air for 10 minutes to evaporate off the remaining ethanol. The particles were then resuspended in 5 ⁇ l of 1 mM Tris-HCl, pH 7.5 (elution solution).
  • the particles were separated magnetically and 0.5 .mu.l of the supernatant was transferred to a freshly cleaned MALDI sample carrier and there with 0.5 .mu.l matrix solution (200 mM 3-hydroxypicolinic acid in 30% (vol / vol) acetonitrile / 70% H) 2 0 (vol / vol)) mixed. After evaporation of the solvent, the sample was analyzed in a Bruker Reflex II MALDI time-of-flight mass spectrometer.
  • the washing procedure differed from the above in that the first wash was omitted and the washing solution 2 was replaced with 100 mM ammonium acetatin 30% (vol / vol) H 2 O / 70% (vol / vol) ethanol
  • the elution and subsequent analysis of the purified product were carried out as described above.

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase beschrieben, bei dem eine Nukleinsäure enthaltende Lösung mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist oder/und eine hydrophile wasserhaltige Polymermatrix umfasst in Gegenwart wasserentziehender Reagenzien, insbesondere in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykols in Kontakt gebracht wird, wobei die Nukleinsäure an die Oberfläche gebunden wird.

Description

Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Anbinden bzw. Immobilisieren von Nukleinsäuren an eine Festphase sowie zum Aufreinigen der gebundenen Nukleinsäuren, wobei die Festphase mit hydrophilen und hydrophoben Gruppen belegt ist, oder/und eine hydrophile wasserhaltige Polymermatrix.
Für viele Arbeitstechniken ist es erforderlich, daß die eingesetzten Nukleinsäuren, insbesondere DNA, frei von störenden Begleitsubstanzen sind. Mit herkömmlichen Verfahren erhaltene Nukleinsäuren müssen deshalb vor einer Weiterverwendung in den meisten Fällen aufgereinigt werden. Beispielsweise müssen vor einer Sequenzierung von PCR (Polymerasekettenreaktion) -Produkten unerwünsche Nebenprodukte, überschüssiger Primer, nicht eingebaute Nukleotide und Salze des Reaktionspuffers abgetrennt werden, da sie die Sequenzierreaktion stören könnten. Auch bei einer Vervielfältigung von DNA mit Hilfe von Zellen muß vor der Weiterverarbeitung der gewünschten DNA eine Aufreinigung erfolgen, bei der das Zelldebris nach einer Lyse abgetrennt wird. Die gewünschte DNA muß dann vor der Verwendung, z.B. für einen Restriktionsverdau oder eine Sequenzierreaktion, von Verunreinigungen, wie RNA, Proteinen, Salzen und dgl. befreit werden. Auch für eine quantitative Bestimmu ng vo n Nukleinsäuren , beispielsweise über UV- Absorptionsmessungen, ist zunächst eine Aufreinigung erforderlich, da für eine fehlerfreie Bestimmung die verwendete Nukleinsäurelösung frei von anderen Bestandteilen sein muß, die im gleichen Wellenbereich wie das gewünschte Produkt absorbieren, beispielsweise RNA, Primer, Nukleotide und dgl. Auch bei einer Konzentrationsbestimmung durch fluorimetrische Messungen müssen aufgereinigte Nukleinsäuren verwendet werden, damit es nicht zu unspezifischer, das Ergebnis verfälschender Fluoreszenz kommt. Bei massenspektrometrischen Untersuchungen von Nukleinsäuren, insbesondere DNA, beispielsweise mit MALDI-MS (Matrix assisted Laser Desorption/lonisation-MassSpectrometry; Matrix-unterstützteLaserdesorp- tion/lonisations-Massenspektrometrie) ist es nötig, daß die Probemoleküle weitgehend frei von Begleitstoffen, wie etwa Puffersubstanzen, Metallkationen, Primerüberschüssen, Peptiden, Lipiden, Detergentien und dgl., sind, welche die Analyse stören könnten. Weiterhin wird eine Nukleinsäure zur Durchführung einer MALDI-MS-Analyse vorteilhafterweise in die Ammoniumform überführt. Auf diese Weise lassen sich diskrete Analyt- Signale und ein gutes Signal/Rausch-Verhältnis erreichen, und die Diskriminierung des Probensignals durch Begleitstoffe wird vermieden.
Bei der Aufarbeitung von wenigen Proben kann die Aufreinigung zwar manuell mit aufwendigen Techniken erfolgen. Zur Bewältigung einer größeren Anzahl von Proben ist es jedoch erforderlich, ein geeignetes, technisch einfaches und kostengünstiges Aufreinigungsverfahren bereitzustellen, das automatisiert werden kann, um den geforderten Durchsatz zu bewältigen.
Bisher sind verschiedene Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren bekannt. Bei der Reinigung über Säulen kommen unterschiedliche Techniken zum Einsatz. Beispielsweise wird beim QIAquickPCR Purification Kit von Qiagen DNA mit Hilfe eines speziellen Bindungspuffers an eine Silicamem- bran adsorbiert. Der Bindungspuffer bewirkt, daß nur DNA bestimmter Länge adsorbiert wird und überschüssiger Primer und Nukleotide abgetrennt werden können. Nach dem Waschen der DNA wird diese dann mit einem geeigneten Elutionsmittel von der Säule eluiert.
Bei der Ausschluß-Chromatographie wird eine flüssige Phase, welche gelöste DNA enthält, auf eine Gelmatrix gegeben, wobei die Makromoleküle in Abhängigkeit ihrer Größe verschieden tief in das Netzwerk der Matrix eindringen. Kleinere Moleküle dringen tiefer ein als größere Moleküle und werden somit länger auf der Säule zurückgehalten. Moleküle, die größer als die größten Poren der verwendeten gequollenen Gelmatrix sind, können die Gelkörner nicht durchdringen und wandern an diesen vorbei, so daß sie die Säule zuerst verlassen. Aufgrund der unterschiedlichen Größe von gewünschter DNA auf der einen Seite und Primern und Nukleotiden auf der anderen Seite, kann eine Aufreinigung erfolgen. Ein häufig verwendetes Material für die Gelmatrix ist Sephacryl von Pharmacia.
Bei den Säulentechniken wird das Eluat üblicherweise durch Zentrifugation erhalten, weshalb diese Techniken nur mit sehr hohem Aufwand automatisiert werden können. Damit sind Säulentechniken nicht für einen hohen Probendurchsatz geeignet. Darüber hinaus ist die Aufreinigung über Säulen mit einem komplexen apparativen Aufwand und damit mit hohen Kosten verbunden.
Ein weiteres Verfahren zur Aufreinigung von DNA ist die präparative Isolierung mittels Gelelektrophorese. Dabei werden die Moleküle nach ihrer Größe getrennt. Die gewünschte Bande mit den interessierenden Molekülen wird ausgeschnitten, und diese werden dann direkt aus dem Gel eluiert. Auch dieses Verfahren ist nur schwer zu automatisieren, wobei der limitierende Schritt das Ausschneiden der gewünschten Bande ist. Diese Methode konnte deshalb bisher nur für den manuellen Einsatz verwendet werden.
Ein weiteres Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren ist die Magnetseparation mittels spezifischer Bindung der Nukleinsäuren an eine funktiona- lisierte Oberfläche. Bei einer spezifischen Bindung werden gezielt nur bestimmte DNA-Fragmente über hochaffine Wechselwirkungen oder kovalente Bindung an Partikel gebunden. Beispielsweise werden an mit immobilisiertem Streptavidin ausgestattete Magnetpartikel über hochaffine Wechselwirkungen biotinylierte Produkte gebunden. Neben der Verwendung von Oberflächen, die einen Partner eines spezifischen Bindepaares tragen, können auch Partikel verwendet werden, die an ihrer Oberfläche einen Primer tragen. Unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen werden dann nur Fragmente mit zu diesem Primer komplementärer Sequenz gebunden. Diese Verfahren erfordern jedoch eine aufwendige Vorbereitung sowohl der Festphasen als auch der aufzureinigenden Moleküle, beispielsweise durch Derivatisierung und sind auf so vorbereitete Moleküle limitiert.
WO 94/1 1 1 03 beschreibt solch ein Verfahren unter Verwendung von magnetisierbaren Polymerpartikeln, die auf ihrer Oberfläche spezifische Affinitätsliganden tragen.
EP 0 885 958 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von DNA unter Verwendung von mindestens zwei verschiedenen Magnetpartikeln, die Partner eines spezifischen Bindepaares, beispielsweise Sonden, Biotin oder Streptavidin tragen.
US-Patent 5,405,951 beschreibt ein Verfahren, bei dem DNA unter Verwendung von chaotropen Salzen an Silicaoberflächen gebunden wird. Chaotrope Salze sind jedoch gesundheitsgefährdend. Zudem ist bei dem im US-Patent 5,405,951 beschriebenen Verfahren ein Arbeiten bei erhöhter Temperatur erforderlich.
US-Patent 5,705,628 beschreibt ein Verfahren, bei dem DNA unter Verwendung eines Bindepuffers an magnetische Mikropartikel gebunden wird, die eine mit Carboxylgruppen ausgestattete Oberfläche aufweisen. Allerdings werden dort aufgrund der geringen Ausbeute relativ viele Partikel pro Probe benötigt und die Carboxylgruppen-Modifikation erlaubt nur die Verwendung von wenigen, speziellen Partikelsorten.
Aufgabe der Erfindung war es somit, ein Verfahren zur Immobilisierung/An- bindung bzw. Aufreinigung von Nukleinsäuren bereitzustellen, welches die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Verfahren zumindest teilweise vermeidet und welches insbesondere eine einfache und kosteneffiziente Aufreinigung einer großen Anzahl von Proben ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Nukleinsäuren enthaltende Lösung mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist, in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykols in Kontakt gebracht wird, wobei die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden werden. Unter diesen Bedingungen binden die Nukleinsäuremoleküle an besagte Oberfläche und stehen somit fürfestphasengestützte Waschvorgänge bereit, während derer störende Substanzen effektiv abgetrennt werden können und bei Bedarf die Probenmoleküle in die für die Massenspektrometrie günstige Ammoniumform überführt werden können.
Mitdem erfindungsgemäßen Verfahren können Nukleinsäuren aus Lösungen isoliert werden, wobei unter dem Begriff Nukleinsäure auch deren Salze zu verstehen sind. Die Bindung der Nukleinsäuren an die Oberfläche der Festphase erfolgt bevorzugt reversibel und unspezifisch und ist somit nicht durch spezielle hochaffine Bindepaare, wie etwa Streptavidin/Avidin, oder auf Nukleinsäuren mit bestimmten Sequenzabschnitten begrenzt, die z.B. durch Hybridisierung an die Oberflächen gebunden werden. Die Bindung von Nukleinsäuren erfolgt erfindungsgemäß vielmehr sequenzunabhängig, so daß eine universelle Bindematrix für Nukleinsäuren erhalten wird . Das Verfahren ist technisch einfach durchzuführen und kann ohne großen Aufwand automatisiert werden, so daß ein hoher Probendurchsatz bei geringen Kosten möglich ist. Das Immobilisieren und auch das Eluieren der Nukleinsäuren von der Oberfläche kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Weiterhin wurde überraschenderweise festgestellt, daß Nukleinsäuren mit hoher Ausbeute an besagte Oberflächen gebunden werden können. Dies hat zur Folge, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren weniger Partikel pro Probe eingesetzt werden müssen als bei bekannten Verfahren, wodurch eine weitere Vereinfachung und Kostenverringerung erzielt werden kann.
Bevorzugt weist der mit der Lösung in Kontakt gebrachte Teil der ver- wendeten Festphase einen Anteil von > 1 %, insbesondere > 5 % bevorzugt > 1 0 % und von < 90 %, insbesondere < 50 % und bevorzugt < 30 % an hydrophoben chemischen Oberflächengruppen auf. Dabei ist zu beachten, daß ab einem gewissen Anteil an hydrophoben Oberflächengruppen, der für die jeweilige Festphase ohne weiteres vom Fachmann bestimmt werden kann, ein Verklumpen von Festphasenpartikeln in wäßriger Lösung auftritt, mit der Folge, daß die Festhase nicht mehr resuspendierbar ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden kleine, insbesondere magnetische Partikel eingesetzt, die auf ihrer Oberfläche funktionelle, hydrophobe Gruppen, wie etwa Alkyl- oder Arylgruppen tragen, verwendet, woran Nukleinsäuren unspezifisch und reversibel gebunden werden können. Günstigerweise werden aus der Umkehrphasenchromatographie bekannte funktionelle Gruppen verwendet, da deren Immobilisierung und Handhabung gut verstanden und etabliert ist.
Es ist auch möglich, eine Festphase mit mehreren, voneinander z.B. durch inerte Bereiche abgegrenzten aktiven Oberflächenbereichen zu verwenden, um mehrere räumlich voneinander abgegrenzte Reagenzfelder bereitzustellen.
Besagte Oberfläche auf der Festphase kann, sofern nicht vorhanden, durch Derivatisierung oder durch Beschichtung bereitgestellt werden. Diese Verfahrensweise hat den Vorteil, daß das Material für die Festphase frei wählbar ist. Die hydrophoben chemischen Gruppen sind vorzugsweise organische Kohlenwasserstoff-enthaltende Gruppen und können cyclische, lineare oder/und verzweigte Strukturen aufweisen. Bevorzugt trägt die Oberfläche Cτ-030-Alkylgruppen, oder C5-C30-Arylgruppen, insbesondere C6- C24-Alkylgruppen als funktionelle, hydrophobe Gruppen. Besonders bevorzugt werden die Alkylgruppen ausgewählt aus C8-Alkyl, C18-Alkyl und Mischungen davon, wobei Octadecyl-Liganden am meisten bevorzugt sind.
Neben hydrophoben Gruppen weist die Oberfläche weiterhin hydrophile chemische Gruppen, z.B. Hydroxyl- oder/und Oxidgruppen, auf, die ggf. bei einer der unten genannten Vor- bzw. Zwischenbeschichtungen bereits vorhanden sein können. Wie oben ausgeführt neigen insbesondere kleine Partikel mit ausschließlich hydrophober Oberfläche zum Verklumpen in wäßrigen Lösungen. Dieses Problem kann vermieden werden, indem den funktioneilen hydrophoben Gruppen hydrophile Gruppen, insbesondere Hydroxylreste zur Seite gestellt werden. Die Hydroxylgruppen können anorganische Hydroxylgruppen, z.B. Kieselsäuregruppen, oder/und organische Hydroxylgruppen, z. B. Mono- oder Polysaccharide wie Agarose, umfassen. Weitere geeignete hydrophile Gruppen umfassen Carbonyl-, Car- boxyl-, Ester-, Amino-, Thiol-, Sulfat-, Sulfonyl- und ähnliche Gruppen und Kombinationen solcher Gruppen. Auch Polyolderivate, wie etwa Polyalkylen- glykolderivate können als hydrophile Gruppen eingesetzt werden.
Die Anordnung und das Verhältnis von hydrophoben und hydrophilen Gruppen in dem zur Anbindung der Nukleinsäuren vorgesehenen Bereich der Oberfläche wird so eingestellt, daß die jeweiligen Partikel in wäßriger Lösung gerade nicht mehr verklumpen, die Bindung der Nukleinsäure aber noch wirksam stattfindet. Die funktioneilen Gruppen sowie deren Anord- nung können vom Fachmann den jeweiligen Parametern, wie etwa der Partikelgröße, der Partikeldichte, dem Analyten etc. angepaßt ausgewählt werden. Es ist beispielsweise möglich, die hydrophilen Gruppen in von den hydrophoben Gruppen abgegrenzten, separaten Mikrobereichen aufzubringen. Bevorzugt ist jedoch eine "Mischoberfläche" , in der die hydrophoben und hydrophilen Gruppen nebeneinander vorliegen. Die hydrophilen Gruppen können auch durch geeignet substituierte organische Moleküle, z.B. Hydroxy-substituierte Alkyle eingebracht werden. Ein Beispiel für eine bevorzugte Mischoberfläche ist eine Alkyl/OH-Oberfläche, insbesondere eine C18-Alkyl/OH-Oberf lache.
Besagte Oberflächen können direkt oder mittels einer Vor- oder Zwischenbe- Schichtung auf die Festphase aufgebracht sein. Geeignete Vorbeschichtungen sind beispielsweise eine Polykieselsäurematrix oder/und eine Monosac- charidmatrix. Andere geeignete Vorbeschichtungen sind Partner eines spezifischen Bindepaares, beispielsweise Streptavidin/Avidin, auf die dann die eigentliche aktive Schicht aufgebracht wird. Die Bindung der hydropho- ben oder/und hydrophilen Gruppen an die Festphase bzw. die Bindung der hydrophoben oder/und hydrophilen Beschichtung an die Vorbeschichtung und die Bindung der Vorbeschichtung an die Festphase kann z.B. kovalent, z.B. durch Veresterung, adsorptiv oder über hochaffine Wechselwirkungen erfolgen. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Vorbeschichtung bestehend aus Polykieselsäure und Monosaccharid auf eine Festphase, beispielsweise j/-Eisenoxidpartikel mit einem Durchmesser im Nanometer- oder Mikrometerbereich aufgebracht. Diese Vorbeschichtung wird dann mit hydrophoben Gruppen, insbesondere Alkylgruppen und ggf. auch mit hydrophilen Gruppen, ausgestattet. Besonders gute Ergebnisse wurden mit Partikeln erhalten, die 1 0 bis 1 5% Alkylgruppen, insbesondere Octadecylgruppen pro Kieselsäure-Matrix (mol/mol) und 0,2 %o Octadecyl- gruppen pro Monosaccharid-Einheit (mol/mol) aufweisen.
Als Festphase kann jede dem Fachmann bekannte Festphase verwendet werden, wie etwa Mikrotiterplatten, Gefäße, wie etwa Eppendorf-Gefäße, Greiner tubes, Nunc Röhrchen etc. Bevorzugt werden als Festphase Feststoffpartikel mit einem Durchmesser > 1 nm bis < 1 mm eingesetzt, wodurch eine günstige spezifische Oberfläche pro Gramm Partikel zugänglich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt den Einsatz verschieden- ster Festphasenmaterialien. Bevorzugt wird als Festphasenmaterial Silica, ein Kunststoff wie etwa Polystyrol, oder ein magnetisches oder magnetisier- bares Material verwendet und insbesondere ^-Eisenoxid . Wenn eine magnetische Festphase verwendet wird, können weitere Vorteile erhalten werden. Eine Magnetseparation ist relativ einfach durchzuführen und kann leicht automatisiert werden. Wenn paramagnetische oder para- und ferromagnetische Partikel als Festphase verwendet werden, kann zudem ein Zusammenklumpen der Feststoffpartikel weiter vermindert werden. Üblicherweise werden für die magnetische Partikeltechnologie (z. B. der Firma Dynal, Oslo, Norwegen) kleine magnetische Partikel mit einem Durchmesser im nm- oder μm-Bereich verwendet, bei welchen das Problem des Verklumpens besonders stark ist. Die erfindungsgemäße Aufreinigung kann aber ohne Verklumpen durchgeführt werden, da den hydrophoben Gruppen in ausreichender Zahl hydrophile Gruppen, insbesondere Hydroxylgruppen zur Seite gestellt werden.
Die Anbindung von Nukleinsäuren bzw. deren Salzen an besagte Oberfläche wird erfindungsgemäß durch einen Bindepuffer vermittelt. Dieser Bindepuffer enthält ein Salz sowie Polyethylenglykol. Als Salz wird bevorzugt ein Alkali-, Erdalkali- oder/und Ammoniumsalz verwendet, welches als Kation, insbesondere ein Li-, Na-, K-, Rb-, Cs-, Fr-, Be-, Mg-, Ca-, Sr-, Ba-, Ra- oder/und NH4-lon enthält. Als Anion enthält das erfindungsgemäß ver- wendete Salz bevorzugt ein Halogenidanion, insbesondere ein Chloridanion. Das verwendete Polyethylenglykol (PEG) weist bevorzugt eine mittlere Molmasse von 1 000 bis 20000 g/Mol, insbesondere von 6000 bis 1 5000 g/Mol auf.
Da die Viskosität mit steigendem PEG-Gehalt zunimmt, wird dem Bindepuffer bevorzugt ein Alkohol, insbesondere Methanol, Ethanol, Propanol und/oder Butanol, besonders bevorzugt Ethanol oder/und 2-Propanol zugegeben. Der Alkoholgehalt im Bindungspuffer kann bis zu 50 Gew.-% betragen, bevorzugt 30 bis 40 Gew.-%.
Im allgemeinen wird für das erfindungsgemäße Verfahren das Salz bevorzugt in einer Konzentration von < 5 mmol/l, insbesondere von 5 mmol/l bis 4 mol/l, insbesondere bis zu 3 mol/l und das Polyethylenglykol bevorzugt in einer Konzentration von 5 bis 40 %, eingesetzt. Die angegebenen Konzentrationen an Salz und PEG sind finale Konzentrationen und beziehen sich auf die Bindungsbedingungen, d h auf das endgültige Gemisch, das Probe und Bindungspuffer und ggf weitere Verdünnungsmittel, wie etwa Wasser, umfaßt.
Mit dem erfindungsgemaßen Verfahren ist es möglich, DNA über einen großen Molmassenbereich zu immobilisieren und aufzureinigen. Es ist sowohl möglich, nur wenige Basen große Einzelstrang-DNA aufzureinigen als auch mehrere 1 00 kb große Doppelstrang-DNA, insbesondere BACs, PACs und dgl
Nukleinsäuren, die mit dem erfindungsgemaßen Verfahren aufgereinigt werden können, umfassen z.B. Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA, RNA, LNA sowie Nukleinsaure-Protein-, Nukleinsaure-PNA- und Nukleinsaure- Zucker-Adukte oder Komplexe. Bevorzugt werden Nukleinsäuren immobilisiert, bei denen es sich um Amplifikationsprodukte, beispielsweise aus einer PCR-Reaktion, handelt oder die durch Amphfikation mit Hilfe von Zellen, z.B mittels einer Ubernacht-Kultur, erhalten wurden oder um Sequenzierreak- tιonsprodukte, Prιmer-Extensιonsreaktιonsprodukte, Lιgasekettenreaktιons- produkte, Restπktionsendonukleaseverdauprodukte, etc. Es können aber auch synthetisch hergestellte Nukleinsäuren gebunden werden.
Anhand der Konzentration der Bestandteile, insbesondere von Salz und PEG, laßt sich die selektive Anbindung der Einzel- und Doppelstrang-Nukleinsau- ren an besagte Oberflache einstellen. Dabei kann eine Selektivität > 70 %, insbesondere > 80 % und besonders bevorzugt > 90 % erzielt werden Bei einer Konzentration an einwertigen Kationen von 0, 5 bis 4 mol/l, zweiwerti- gen Kationen < 5 mmol/l und PEG < 1 5 Gew -% binden selektiv ds- Nukleinsauren > 80 bp auch in Gegenwart von ss-Nukleinsauren Die Anbindung von ss-Nukleinsauren gelingt durch Einstellen der Konzentration zweiwertiger Kationen > 5 mmol/l und < 1 00 mmol/l und PEG von 1 0 bis 30 Gew.-%. Die Kombination beider Methoden ermöglicht die selektive Aufreinigung von ss- und ds-Nukleinsäuren. Doppelstrang-Nukleinsäuren lassen sich durch Einstellen der Salz- und PEG-Konzentrationen innerhalb der zuvor genannten Bereiche auch nach Größe fraktionieren. Für kleine Nukleinsäuren, insbesondere DNA, hat sich die Verwendung einer finalen Kombination an PEG von 1 5 - 40 % (Gew. /Gew.) und einem Salzgehalt von 1 0 bis 1 000 mmol/l als vorteilhaft erwiesen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung oder/und Aufreinigung von Nukleinsäuren umfassend die Schritte
(a) Bereitstellen einer Nukleinsäure enthaltenden Lösung,
(b) Inkontaktbringen der Nukleinsäure enthaltenden Lösung mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberflä- ehe aufweist, in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykol, wobei die Nukleinsäure an die Oberfläche gebunden wird,
(c) Abtrennen der Festphase von der Lösung und
(d) gegebenenfalls Ablösen der Nukleinsäure von der Festphase.
Bei der bevorzugten Verwendung einer magnetischen Festphase ist das Abtrennen der Festphase von der Lösung durch magnetische Mittel möglich und kann somit leicht automatisiert werden.
Die Festphase wird bevorzugt einmal vor ihrem Einsatz gewaschen. Abhängig von Anwendung und Oberfläche kann z.B. zum Waschen der mit
Wasser (bevorzugt 1 : 1 ) verdünnte Bindungspuffer (BP) verwendet werden.
Es kann auch eine Lösung von 0,5 mol/l EDTA pH 8 - 9 eingesetzt werden.
Wenn eine anschließende Analyse der Probe beabsichtigt ist, kann es sinnvoll sein, die Festphase mit mehreren Puffern zu waschen, u.a. auch mit einem Ammoniumacetat-Puffer. Eine weitere Verbesserung der Aufreinigung kann dadurch erhalten werden, daß die abgetrennte Festphase, an deren Oberfläche die Nukleinsäure gebunden ist, mit einer Pufferlösung gewaschen wird, welche an die Festphase gebundene Verunreinigungen, nicht aber an die Festphase gebundene Nukleinsäure löst. Die Zusammensetzung der Waschlösung wird in Abhängigkeit der Anwendung und der Oberfläche ausgewählt. Als Waschlösung geeignet ist z.B. 50 - 70 % (vol/vol) Ethanol oder 2-Propanol, ggf. mit Zusätzen von EDTA, CDTA und TRIS in millimolaren Konzentrationen. Falls die Probe anschließend mit Massenspektrometrie analysiert werden soll, ist die Verwendung einer Ammoniumacetat enthaltenden Waschlösung in wenigstens einem Waschschritt bevorzugt, z. B. 0,05 bis 5 mol/l Ammoniumacetat in 60 bis 80 % Ethanol. Oftmals ist es auch vorteilhaft, zur Aufreinigung mehrere Waschschritte mit unterschiedlichen Waschpuffern durchzuführen.
Die auf besagter Oberfläche gebundenen Nukleinsäuremoleküle bzw. deren Salze werden bevorzugt mittels einer Elutionslösung abgetrennt, wobei als Elutionslösung jede Flüssigkeitverwendet werden kann, die die Nukleinsäure wieder von der Festphase ablöst. Die Wahl der Elutionslösung hängt von der Art der verwendeten Oberfläche und des Analyten sowie von der nachfolgenden Verwendung des Analyten ab. Bevorzugt werden als Elutionslösung bidestilliertes Wasser, pH 7 bis 8, eine wäßrige TRIS Lösung mit einer TRIS- Konzentration von 1 bis 1 00 mmol/l, bevorzugt mit einem pH-Wert von 7 bis 9, eine Formamidlösung, ein Loading Buffer für die Elektrophorese, eine Matrixlösung, z. B. 3-Hydroxypicolinsäure in Wasser ( 1 - 200 mmol/l) für MALDI-MS etc. verwendet.
Eine magnetische Festphase kann nach Ablösung der Nukleinsäure wiederum mit magnetischen Mitteln abgetrennt werden, wodurch eine vollständige Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens erreicht werden kann. Die mitden erfindungsgemäßen Verfahren isolierten oder/und aufgereinigten Nukleinsäuren können unmittelbar für eine weitere Analyse, z.B. eine Massenspektrometrie (MS)-Analyse verwendet werden. Die bisherige aufwendige manuelle Reinigung über Säulen ist nicht erforderlich. Vielmehr ist es möglich, eine hohe Anzahl von Proben kostengünstig und schnell für eine MS-Analyse, insbesondere eine MALDI-MS-Analyse oder eine ESI (Elektrospray-lonisation)-MS-Analyse automatisch aufzureinigen. Dabei können insbesondere Begleitstoffe, wie etwa Puffersubstanzen, Metallkationen, Primerüberschüsse, Peptide, Lipide, Detergentien und dgl. entfernt werden. Vorteilhafterweise wird die Nukleinsäure zur Durchführung einer MALDI-MS-Analyse in die Ammoniumform übeführt, z. B. durch einen lonenaustausch Na+ gegen NH4 + , der durchgeführt werden kann, während die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden sind. Die Art der erfindungsgemäßen Anbindung ermöglicht also eine Reinigungsprozedur, d.h. die Nukleinsäure liegt in zugänglicher Form und nicht als Präzipitat vor. Für eine Analyse mit MALDI-MS sind insbesondere kleine DNA-Moleküle von Interesse. Erfindungsgemäß ist die Aufreinigung von kleinen DNA Molekülen oberhalb einer Mindestgröße von ca. 5 Nukleotiden, insbesondere > 10 Nukleotiden möglich. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die bei der MALDI-MS-Analyse störenden Komponenten, wie etwa Puffersubstanzen und Metallkationen sowie evtl. vorhandene Primerüberschüsse effektiv abgetrennt. Die DNA-Moleküle werden zudem in die für eine MALDI-MS- Analyse kompatible Ammoniumform überführt und können wahlweise in reinem Wasser oder in einer wässrigen Matrixlösung eluiert werden und somit direkt auf das MALDI-Target transferiert werden. Eine Modifikation der Zusammensetzung der Bindungs- und Waschpuffer und der sequentielle Einsatz von Partikeln erlaubt es auch, größere DNA-Moleküle von der Aufreinigung auszuschließen, wodurch selektiv ein vorbestimmter Molmassenbereich ausgewählt werden kann, z. B. > 60 bp und < 1 00 bp. Durch Variation der Salz- und PEG-Konzentration ist es auch möglich, kleine Oligonukleotide, wie etwa Primer (ssDNA), Primer-Extensionsprodukte, effizient für eine Analyse mit MALDI-MS aufzureinigen.
Ein weiterer Vorteil ist der breite Volumenbereich, in dem mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gearbeitet werden kann. Es sind Volumina von ml- bis zum oberen nl-Bereich möglich, insbesondere von < 1 0 ml, bevorzugt < 1 ml und besonders bevorzugt < 1 00 /l und > 1 00 nl, bevorzugt > 1 μ\. Der Volumenbereich kann für die jeweilige Applikation eingestellt werden, wobei bei kleinem Volumen eine konzentrierte Probe erhalten wird.
Weiterhin ist es möglich, erfindungsgemäß angebundene Nukleinsäuren nach bekannten Verfahren zu sequenzieren. Die Sequenzierungsbedingun- gen von bekannten Verfahren stellen oftmals Elutionsbedingungen dar, d.h. während der eigentlichen Sequenzierung ist die Nukleinsäure dann nicht an die Festphase gebunden. In einem solchen Fall ist es vorteilhaft, für die Auf reinigung der Sequenzierprodukte nach Abschluß der Sequenzierreaktion wieder Anbindungsbedingungen, insbesondere durch Zugabe geeigneter Puffer einzustellen. Für die Sequenzierungsreaktion und anschließende Aufreinigung braucht die Festphase, insbesondere Beads, nicht abgetrennt werden. Es hat sich herausgestellt, daß die Festphasen, insbesondere Partikel, oftmals das zur Sequenzierung oft verwendete Thermocycling nicht unbeschadet überstehen. In einem solchen Fall werden nach der Sequenzier- reaktion neue, unverbrauchte Beads zugegeben.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Synthetisierung von Nukleinsäuren, wobei erfindungsgemäß gebundene Nukleinsäuren nach bekannten Verfahren um mindestens 1 Nukleotid verlängert werden. Ein Beispiel für eine solche Reaktion ist die sog. Primer Exteπsion Reaction, also die Verlängerung eines Primers (ssDNA) um mindestens 1 Nukleotid. Die Verlängerung kann durchgeführt werden, während die Nukleinsäure an die Festphase gebunden ist. Da aber auch bei der Verlängerung von Nukleinsäuren oftmals Bedingungen eingestellt werden, die Elutionsbedingun- gen entsprechen, kann auch hier das Verlängern stattfinden, während die Nukleinsäure nicht an die Festphase gebunden ist und die Anbindung der verlängerten Nukleinsäure dann anschließend dadurch wieder erreicht werden, daß nach der Verlängerungsreaktion Bindungsbedingungen, beispielsweise durch Pufferzugabe eingestellt werden. Die Festphase braucht während der gesamten Reaktion nicht abgetrennt zu werden.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierten Nukleinsäuren können auch verwendet werden, um selektiv weitere, nachzuweisende Moleküle, beispielsweise Nukleinsäuren oder DNA-bindende Proteine zu binden und können deshalb in entsprechenden Assays eingesetzt werden. Somit umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei man eine Nukleinsäuren enthaltende Lösung mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile chemische Gruppen aufweist, in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykols in Kontakt bringt, wobei die Nukleinsäuren an die Oberfläche gebunden werden, anschliessend die gebundene Nukleinsäure aufweisende Festphase mit der Probe in Kontakt bringt und den Analyten über die Bindung an die gebundenen Nukleinsäuremoleküle nachweist.
Schließlich umfaßtdie Erfindung auch einen Reagenzienkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der einen Salz und Polyethylenglykol enthaltenden Bindepuffer und eine Festphase, deren Oberfläche hydrophobe und hydrophile Gruppen aufweist. Bevorzugt enthält ein solcher Reagenzienkit zusätzlich Wasch- und Elutionspuffer.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäu- ren an eine Festphase bereit, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß eine
Nukleinsäuren enthaltende Lösung mit einer Festphase, welche eine hydrophile wasserhaltige Polymermatrix umfaßt, in Gegenwart von wasserentziehenden Reagenzien in Kontakt gebracht wird, wobei die Nukleinsäuren reversibel und sequenzunspezifisch an die Festphase gebunden werden.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß durch die Verwendung von hydrophilen wasserhaltigen Polymermatrices eine große Bindekapazität im Hinblick auf Nukleinsäuren erhalten werden kann und auch die Isolierung von sehr kleinen DNA-Fragmenten, beispielsweise mit einer Länge von 1 0 bis 100 Bp, insbesondere von 30 bis 70 Bp durchgeführt werden kann. Zudem ist in Abhängigkeit der Auswahl der hydrophilen wasserhaltigen Polymermatrix eine größenselektive Bindung von Nukleinsäuren möglich.
Bevorzugt wird beim erfindungsgemäßen Verfahren zuerst die hydrophile wasserhaltige Polymermatrix mit einer Nukleinsäuren enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht und in einem zweiten Schritt dann ein wasserentziehen¬ des Mittel zugegeben. Geeignete wasserentziehende Mittel sind Salze, insbesondere chaotrope Salzpuffer mit hoher Konzentration, sowie Polyethylenglykol. Bevorzugte Salze und Polyethylenglykole sowie deren Konzentration sind wie oben beschrieben.
Durch die Verwendung einer hydrophilen wasserhaltigen Polymermatrix als Festphasenmaterial anstelle von Silika oder Borsilikatglas, wie es üblicherweise verwendet wird, kann eine Bindung von Nukleinsäuren, welche reversibel und sequenzunspezifisch ist, erhalten werden. Die Polymermatrix enthält bevorzugt von 1 bis 90, mehr bevorzugt von 1 0 bis 50 Gew.-% Wasser.
Die hydrophile wasserhaltige Polymermatrix enthält bevorzugt ein hydrophi- les wasserlösliches Polymer, insbesondere ein hydrophiles wasserlösliches organisches Polymer. Besonders geeignet sind Polysaccharide, insbesondere
Polysaccharide mit endständigen Hydroxylgruppen, wie etwa Dextran oder Stärke. Besonders bevorzugt ist Dextran. Die hydrophile wasserhaltige Polymermatrix wird besonders vorteilhaft als Hüllpolymer um einen magnetischen Kern bereitgestellt, beispielsweise in Form von Dextran- Magnetitparikeln.
Die hydrophile wasserhaltige Polymermatrix kann auf ihrer Oberfläche hydrophile oder/und hydrophobe Gruppen enthalten. Bevorzugt ist eine Ausführungsform, in der eine Festphase verwendet wird, die sowohl hydrophobe als auch hydrophile Gruppen, wie oben beschrieben, auf der Oberfläche aufweist und gleichzeitig eine hydrophile wasserhaltige Polymermatrix umfaßt.
Eine Festphase mit einer hydrophilen wasserhaltigen Polymermatrix kann in gleicher Weise wie oben beschrieben in einem Verfahren zur Isolierung oder/und Aufreinigung von Nukleinsäuren oder in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe eingesetzt werden. Darüber hinaus kann sie zur Bestimmung der Nukleinsequenz einer Nukleinsäure oder zur Synthetisierung von Nukleinsäuren herangezogen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die beigefügten Figuren und folgenden Beispiele weiter erläutert.
Figur 1 (bestehend aus Fig.1 a und 1 b) zeigt ein Agarosegel von erfindungsgemäß aufgereinigten PCR-Produkten sowie von PCR-Produkten, die unter Verwendung von COOH-beschichte- ten Partikeln aufgereinigt wurden:
Figur 1 a zeigt einen Ausbeutevergleich unter Verwendung eines NH4CI-
Bindepuffers (links) sowie eines NaCI-Bindepuffers (rechts) für erfindungsgemäßaufgereinigte PCR-Produkte (C1 8/OH-Beads) sowie für PCR-Produkte, die unter Verwendung von COOH- beschichteten Partilen aufgereinigt wurden (COOH-Beads) .
Figur 1 b zeigt einen weiteren Ausbeutevergleich mit NH4CI-Bindepuffer. Figur 2 (bestehend aus Fig. 2a, 2b und 2c) zeigt die Isolierung und
Aufreinigung von ssDNA und dsDNA mit dem erfindungsgemäßen Verfahren für eine MALDI-MS-Analytik:
Figur 2a zeigt das MALDI-Flugzeitmassenspektrum von erfindungs- gemäß aufgereinigten PCR-Produkten mit 47 bzw. 48 Basenpaaren.
Figur 2b zeigt das MALDI-Flugzeitmassensepktrum eines erfindungsgemäß aufgereinigten PCR-Produktes mit 80 bp.
Figur 2c zeigt das MALDI-Flugzeitmassenspektrum eines erfindungs- gemäß aufgereinigten 24 Nukleotide langen DNA Einzelstrangs.
Bei MALDI werden bevorzugt einfach geladene Molekülionen der Spezies (M + H) + , und daneben mit verringerter Häufigkeit auch doppelt geladene Molekülionen der Spezies (M + 2H)2 + gebildet. PCR-Produkte werden bei der MALDI-Massenspektrometrie, sofern nicht besondere Maßnahmen ergriffen werden, aufgetrennt und in Form der Einzelstränge detektiert. Die Signale zueinander komplementärer Einzelstränge werden oft aufgrund geringer Massenunterschiede nur partiell aufgelöst. Die Größe der PCR-Produkte läßt sich dennoch durch Vergleich der gemessenen mittleren Massen mit abgeschätzten oder aufgrund von bekannten Sequenzen berechneten Werten bestimmen. Die (M + H) +-Signale nicht abgetrennter Primer würden in den Spektren an den mit den Pfeilen gekennzeichneten Positionen registriert werden.
Beispiele
Beispiel 1 dsDNA-lsolierung und Aufreinigung aus PCR (Polymeraseket- tenreaktion)
Magnetische Partikel, deren Oberfläche hydrophobe und hydrophile Gruppen aufweist, werden zunächst dreimal mit 1 50 μ\ EDTA-Lösung (0, 5 mol/l, pH 8) durch magnetische Separation der Partikel und Verwerfen des Überstandes gewaschen. Nach dem letzten Waschen werden die Partikel in EDTA- Lösung aufgenommen und vermischt. Die Massenkonzentration beträgt 20 mg/ml.
Die zu untersuchenden Proben werden in einer Mikrotiterplatte (z.B. 96 well) vorgelegt. Zu 40 μ\ Probevolumen werden 40 μ\ Bindungspuffer (2,5 mol/l NaCI, 20% (Gew. /Gew.) PEG6000) und 1 0 μ\ der Partikelsuspension zugegeben, vermischt und bei Raumtemperatur 1 0 min inkubiert.
Die Mikrotiterplatte mit den Proben wird anschließend für 2 min in eine Magnethalterung gestellt, der Überstand verworfen und die Partikel zweimal mit 1 50 μ\ Waschpuffer (40% Ethanol) gewaschen und anschließend an Luft 2 bis 5 min getrocknet.
Schließlich wird die Mikrotiterplatte aus dem Magnethalter entnommen und die Partikel in 20 ml Elutionspuffer ( 1 mmol/l Tris-HCL) resuspendiert und 5 min inkubiert. Die Mikrotiterplatte wird dann wiederum in die Magnethalterung gestellt und das Eluat nach 2 min abgenommen.
Die im Eluat enthaltene DNA konnte ohne weitere Aufreinigung für Konzentrationsbestimmungen, zu DNA-Sequenzierung usw. verwendet werden. Beispiel 2 dsDNA-lsoiierung und Aufreinigung aus Zellkultur
Zellen aus einer Übernachtkultur wurden pelletiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in 40 μ\ Resuspendierungspuffer ( 50 mmol/l Tris-HCI, pH 8, 1 0 mmol/l EDTA, 100 μg/ml RNAse A) aufgenommen und vermischt. Dann wurden 40 μ\ Lysepuffer (200 mmol/l NAOH, 1 % (Gew. /Gew.) SDS) zugegeben und vermischt. Nach Zugabe von 40 μ\ Neutralisierungspuffer (3 mol/l KOAc, pH 5,5) und Vermischen wurde 1 5 min bei 1 3.000 U/min zentrifugiert.
Der Überstand wurde in eine frische Mikrotiterplatte transferiert. Erfindungsgemäße magnetische Partikel wurden dreimal mit 1 50 μl EDTA-Lösung (0, 5 mol/l pH 8) durch magnetische Separation der Partikel und Verwerfen des Überstandes gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurden die Partikel in EDTA-Lösung aufgenommen und vermischt. Die Massekonzentration betrug 20 mg/ml.
Zu 1 20 μl Probevolumen wurden 1 20 //! Bindungspuffer (2,5 mol/l NaCI, 20% (Gew. /Gew.) PEG 6000) und 1 0 μl der Partikelsuspension zugegeben. Nach Mischen des Ansatzes wurde 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Mikrotiterplatte mit den Proben wurde anschließend für 1 0 min in eine Magnethalterung gestellt, der Überstand verworfen und die Partikel zweimal mit 1 20 μl Waschpuffer (70% Ethanol, 1 0 mmol/l Tris-HCI, pH 8, 1 mmol/l EDTA) gewaschen und anschließend an der Luft 5 min getrocknet.
Die Mikrotiterplatte wurde dann aus dem Magnethalter genommen und die Partikel in 50 μl Elutionspuffer ( 1 mmol/l Tris-HCL, pH 8) resuspendiert, 5 min inkubiert und die Platte dann wieder in den Magnethalter gestellt und das Eluat nach 2 min abgenommen. Die im Eluat enthaltene DNA konnte ohne weitere Aufreinigung für Konzentrationsbestimmungen, DNA-Sequenzierung usw. verwendet werden.
Beispiel 3 Ausbeutevergleich
Figur 1 zeigt das Agarosegel von aufgereinigten 1 00 bp PCR-Produkten. Die Aufreinigung wurde zum einen gemäß der Erfindung und zum anderen unter Verwendung von COOH-beschichteten Partikeln (vgl. US-Patent 5,705,628) durchgeführt. Den PCR-Produkten wurden vor der Aufreinigung 1 00 pmol einer 32 Nukleotide großen ssDNA zugegeben. Wie man aus der Abbildung des Agarose-Gels sehen kann, wurde die gewünschte Nukleinsäure in gereinigter Form erhalten und unerwünschte Substanzen inklusive der 32 Nukleotide ssDNA abgetrennt. Weiterhin ist die Ausbeute beim erfindungsgemäßen Verfahren deutlich höher als den COOH-beschichteten Partikeln.
Beispiel 4 Aufreinigungsprotokolle
Zur Aufreinigung von Doppelstrang DNA (vgl. Figur 2a und 2b) wurden PCR-Reaktionen jeweils in 40 μl Reaktionsvolumina in 96iger Titerplatten durchgeführt. Magnetische Partikel wurden vor Gebrauch magnetisch separiert, wobei überstehende Lösung abpipetiert und die Partikel in einem Aliquot des Bindungspuffers resuspendiert wurden. Nach Abschluß der Am- plifikationsreaktion wurden zu jedem Reaktionsgefäß 5 μl der Suspension der magnetischen Partikel zugegeben, gefolgt von 50μl Bindungspuffer und zwar für die PCR-Produkte mit 47/48 bp (vgl. Figur 2a) : 1 , 5 M NH4CI/40 mM MgCI2 in 40 % (Gew. /Gew.) PEG 6000/60% (Gew. /Gew.) H20 und für das PCR Produkt mit 80 bp: 2, 5 M NH4CI in 30 % (Gew./- Gew.) PEG 6000/70% (Gew. /Gew.) H20.
Die resultierende Suspension wurde gut durchmischt und 1 0 min stehengelassen. Danach wurden die Partikel magnetisch separiert, der Überstand abpipetiert und durch 1 05 μl 65 % (vol/vol) Ethanol/35 % (vol/vol) H20 (Waschlösung 1 ) ersetzt. Durch Umsetzen der Gefäße wurden die magnetischen Partikel zweimal durch die Waschlösung bewegt. Anschließend wurde der Überstand nacheinander durch 1 1 5, 1 25 und 1 35 μl 1 , 5 M Ammoniumacetat in 30 % (vol/vol) H20, 70 % (vol/vol) Ethanol ersetzt, wobei die Partikel jeweils fünfmal durch die neue Waschlösung 2 bewegt wurden. Die Überstände wurden jeweils verworfen. Schließlich wurden die Partikel zweimal mit 1 45 μl 80 % (vol/vol) Ethanol/20 % (vol/vol) H20 (Waschlösung 3) gewaschen, wobei die Partikel jeweils zweimal durch die Lösung bewegt wurden. Nach Abpipettieren des letzten Überstandes wurden die Partikel zum Abdampfen des verbliebenen Ethanols 1 0 min an Luft stehen gelassen. Anschließend wurden die Partikel in 5 μl 1 mM Tris-HCI, pH 7,5 (Elutionslösung) resuspendiert. Nach 1 0 min wurden die Partikel magnetisch abgetrennt und 0,5 μl des Überstandes auf einen frischgereinigten MALDI- Probenträger überführt und dort mit 0,5 μl Matrixlösung (200 mM 3- Hydroxypicolinsäure in 30 % (vol/vol) Acetonitril/70 % H20 (vol/vol)) vermischt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde die Probe in einen Bruker Reflex II MALDI-Flugzeitmassenspektrometer analysiert.
Zur Aufreinigung der Einzelstrang-DNA (vgl. Figur 2c) wurden 1 0 pmol eines 24 Nukleotide langen Oligodeoxyribonukleotids in 40 μl PCR-Reaktions- lösung vorgelegt und hierzu 5 μl der Suspension der magnetischen Partikel (in Bindepuffer) gegeben, gefolgt von 50 μl Bindepuffer ( 1 , 5 M NH4CI/40 mM MgCI2 in 35 % (Gew. /Gew.) PEG 6000/30 % (vol/vol) Ethanol. Die Waschprozedur unterschied sich von der obigen darin, daß die erste Waschung ausgelassen wurde und die Waschlösung 2 durch 1 00 mM Ammoniumacetatin 30% (vol/vol) H2O/70% (vol/vol) Ethanol ersetzt wurde. Die Elution und anschließende Analyse des aufgereinigten Produkts wurden wie oben beschrieben durchgeführt.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäuren enthaltende Lösung mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist, in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykols in Kontakt gebracht wird, wobei die Nukleinsäuren reversibel und sequenzunspezifisch an die Oberfläche gebunden werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß besagte Oberfläche Alkyl- oder Arylgruppen als hydrophobe Gruppen aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkylgruppen ausgewählt werden aus C8-Alkyl, C18-Alkyl und Mischungen davon.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche Hydroxylgruppen als hydrophile Gruppen aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Festphase um Festpartikel handelt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet. daß die Festphase magnetisch ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Salz um ein Alkali-, Erdalkali- oder/und Ammoni- umhalogenid handelt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polyethylenglykol mit einer mittleren Molmasse von 1 000 bis
20000 g/mol zugegeben wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz in einer finalen Konzentration von 5 mmol/l bis 4 mol/l verwendet wird.
1 0. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Polyethylenglykol in einer finalen Konzentration von 5 Gew. % bis
40 Gew.-% verwendet wird.
1 1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Nukleinsäure um DNA handelt.
1 2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Nukleinsäure um Amplifikationsprodukte handelt.
1 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet. daß selektiv Einzelstrang- oder Doppelstrang-Nukleinsäuren gebunden werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem Bereich von > 5 Nukleotide bis < 1000 Nukleotide selektiv hinsichtlich der Größe gebunden wird.
5. Verfahren zur Isolierung oder/und Aufreinigung von Nukleinsäuren umfassend die Schritte
(a) Bereitstellen einer Nukleinsäure enthaltenden Lösung,
(b) Inkontaktbringen der Nukleinsäure enthaltenden Lösung mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist, in Gegenwart eines Salzes und Poly- ethylenglykol, wobei die Nukleinsäure reversibel und sequenzunspezifisch an die Oberfläche gebunden wird,
(c) Abtrennen der Festphase von der Lösung und
(d) gegebenenfalls Ablösen der Nukleinsäure von der Festphase.
6. Verfahren nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphase magnetisch ist und das Abtrennen der Festphase von der Lösung durch magnetische Mittel erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 5 oder 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt (c) abgetrennte Festphase mit einer Pufferlösung gewaschen wird, welche an die Festphase gebundene Verunreinigungen, nicht aber an die Festphase gebundene Nukleinsäuren löst.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 5 bis 1 7, dadurch gekennzeichnet. daß das Ablösen der Nukleinsäure in Schritt (d) mittels einer Elutionslösung durchgeführt wird.
1 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 5 bis 1 8, dadurch gekennzeichnet, daß von der Festphase abgelöste Nukleinsäure und die Festphase mit magnetischen Mitteln getrennt werden.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 5 bis 1 9, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene Nukleinsäure einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen wird.
21 . Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure umfassend die Schritte:
(a) Anbinden einer Nukleinsäure an eine Festphase gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 und
(b) Sequenzieren der Nukleinsäure nach bekannten Verfahren.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , weiterhin umfassend den Schritt
(c) Aufreinigung der Sequenzierungsprodukte.
23. Verfahren zur Synthetisierung von Nukleinsäuren umfassend die Schritte (a) Anbinden einer Nukleinsäure an eine Festphase gemäß dem
Verfahren nach Anspruch 1 und (b) Verlängern der Nukleinsäure um mindestens ein Nukleotid nach bekannten Verfahren.
24. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet. daß man eine Nukleinsäuren enthaltende Lösung mit einer Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist, in Gegenwart eines Salzes und Polyethylenglykols in Kontrakt bringt, wobei die Nukleinsäuren reversibel und sequenzunspezifisch an die Oberfläche gebunden werden, anschließend diese Festphase mit der
Probe in Kontakt bringt und den Analyten über die Bindung an die gebundenen Nukleinsäuren nachweist.
25. Reagenzienkit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 umfassend:
(a) einen Bindepuffer, der ein Salz und ein Polyethylenglykol enthält und
(b) eine Festphase, die hydrophobe und hydrophile Gruppen auf der Oberfläche aufweist.
26. Reagenzienkit nach Anspruch 25, weiterhin umfassend,
(c) einen Elutionspuffer, mit dem an diese Oberfläche gebundene Nukleinsäure abgelöst werden können, (d) einen Waschpuffer, mit dem an die Festphase gebundene
Verunreinigungen abgetrennt werden können.
27. Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäuren enthaltende Lösung mit einer Festphase, welche eine hydrophile wasserhaltige Poiymermatrix umfaßt, in Gegenwart eines wasserentziehenden Reagenz in Kontakt bringt, wobei die Nukleinsäuren reversibel und sequenzunspezifisch an die Festphase gebunden werden.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymermatrix ein hydrophiles wasserlösliches Polymer enthält.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymermatrix ein hydrophiles organisches Polymer enthält.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophile Polymermatrix ein Polysaccharid umfaßt.
31 . Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Polysaccharid mit endständigen Hydroxylgruppen handelt.
32. Verfahren nach Anspruch 30 oder 31 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Polysaccharid um Dextran handelt.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserentziehende Reagenz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Salzen und Polyethylenglykol oder Gemischen davon.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserentziehendes Reagenz ein chaotroper Salzpuffer zugegeben wird.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophile wasserhaltige Polymermatrix ein Hüllpolymer um einen magnetischen Kern bildet.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem magnetischen Kern um Magnetit handelt.
37. Verfahren zur Isolierung oder/und Aufreinigung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen einer Nukleinsäure enthaltenden Lösung,
(b) Inkontaktbringen der Nukleinsäure enthaltenden Lösung mit einer Festphase, welche eine hydrophile wasserhaltige Polymermatrix umfaßt, in Gegenwart eines wasserentziehenden Reagenz, wobei die Nukleinsäure reversibel und sequenz- unspezifisch an die Festphase gebunden wird,
(c) Abtrennen der Festphase von der Lösung und
(d) gegebenenfalls Ablösen der Nukleinsäure von der Festphase.
38. Verfahren nach Anspruch 37, weiterhin umfassend eines oder mehrere Merkmale der Ansprüche 1 6 bis 20.
39. Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure, umfassend die Schritte:
(a) Anbinden einer Nukleinsäure an eine Festphase gemäß dem Verfahren nach Anspruch 27 und
(b) Sequenzieren der Nukleinsäure nach bekannten Verfahren.
40. Verfahren nach Anspruch 39, weiterhin umfassend den Schritt:
(c) Aufreinigen der Sequenzierungsprodukte.
41 . Verfahren zur Synthetisierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte: (a) Anbinden einer Nukleinsäure an eine Festphase gemäß dem Verfahren nach Anspruch 27 und
(b) Verlängern der Nukleinsäure um mindestens ein Nukleotid nach bekannten Verfahren.
42. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäuren enthaltende Lösung mit einer Festphase, welche eine hydrophile wasserhaltige Polymermatrix umfaßt, in Gegenwart eines wasserentziehenden Reagenz in Kontakt bringt, wobei die Nukleinsäuren reversibel und sequenzunspezifisch an die Festphase gebunden werden, anschließend die Festphase mit der Probe in Kontakt bringt und den Analyten über die Bindung an die gebundenen Nukleinsäuren nachweist.
43. Reagenzienkit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 27 bis 42, umfassend:
(a) einen Bindepuffer, derein wasserentziehendes Reagenz enthält und (b) eine Festphase, welche eine hydrophile wasserhaltige Polymermatrix umfaßt.
44. Reagenzienkit nach Anspruch 43, weiterhin umfassend:
(c) einen Elutionspuffer, mit dem an die Oberfläche gebundene Nukleinsäuren abgelöst werden können, und
(d) einen Waschpuffer, mit dem an die Festphase gebundene Verunreinigungen abgetrennt werden können.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004042058A2 (de) * 2002-11-08 2004-05-21 InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren
US7517969B2 (en) * 2002-04-05 2009-04-14 Qiagen Gmbh Process for isolating nucleic acid with chaotrope agents and ammonium compounds
WO2009070465A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 New England Biolabs, Inc. Selective purification of small rnas from mixtures

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20040121313A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in organs for transplantation
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US7718354B2 (en) 2001-03-02 2010-05-18 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
WO2004060278A2 (en) 2002-12-06 2004-07-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
DE10253351B4 (de) * 2002-11-08 2007-02-22 InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH Neuartige Pufferfomulierungen zur Isolierung, Reinigung und Rückgewinnung lang- und kurzkettiger Nukleinsäuren
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) * 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US20100035239A1 (en) * 2003-09-11 2010-02-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8097416B2 (en) * 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US20120122096A1 (en) 2003-09-11 2012-05-17 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of bacteria
US20060240412A1 (en) * 2003-09-11 2006-10-26 Hall Thomas A Compositions for use in identification of adenoviruses
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
EP2458619B1 (de) 2004-05-24 2017-08-02 Ibis Biosciences, Inc. Massenspektrometrie mit selektivem Ionfilter durch digitale Schwelle
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
WO2006094238A2 (en) 2005-03-03 2006-09-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for use in identification of adventitious viruses
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
CA2616281C (en) 2005-07-21 2014-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of mitochondrial dna variants
US20070190526A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-16 Nexgen Diagnostics Llc Methods of extracting nucleic acids
JP5635772B2 (ja) * 2006-08-01 2014-12-03 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド 核酸の非特異的標的の捕捉方法
AU2007353877B2 (en) 2006-09-14 2012-07-19 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
US8871471B2 (en) 2007-02-23 2014-10-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic DNA analysis
WO2008118809A1 (en) * 2007-03-23 2008-10-02 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of mixed populations of bioagents
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
US20090048439A1 (en) * 2007-08-06 2009-02-19 Weisburg William G Isolation of nucleic acids molecules using modified solid supports
GB2455780A (en) * 2007-12-21 2009-06-24 Zainulabedin Mohamedali Saiyed Nucleic acid separation
EP2344893B1 (de) 2008-09-16 2014-10-15 Ibis Biosciences, Inc. Mikroplatten-handhabungssysteme und verfahren
WO2010033599A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
US8148163B2 (en) 2008-09-16 2012-04-03 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
EP2396803A4 (de) 2009-02-12 2016-10-26 Ibis Biosciences Inc Ionisationssondenanordnungen
WO2011008971A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
US9194877B2 (en) 2009-07-17 2015-11-24 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent indentification
US20110091882A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-21 Ibis Biosciences, Inc. Determination of methylation status of polynucleotides
EP2957641B1 (de) 2009-10-15 2017-05-17 Ibis Biosciences, Inc. Multiple-displacement-amplifikation
TWI407994B (zh) 2009-10-22 2013-09-11 Ind Tech Res Inst 分離核酸的方法、試劑及套組
EP2954054B1 (de) 2013-02-08 2018-12-05 Qiagen GmbH Verfahren zum trennen von dna anhand der grösse
US9587263B2 (en) 2014-03-26 2017-03-07 General Electric Company Isothermal amplification under low salt condition
DE102014211221A1 (de) 2014-06-12 2015-12-17 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur Anreicherung und/oder Aufreinigung von Nukleinsäuren
US10143220B2 (en) 2014-08-15 2018-12-04 Corn Products Development, Inc. Pet food having modified waxy cassava starch
WO2016193490A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-08 Qiagen Gmbh Method for separating dna by size
CN112427027A (zh) * 2020-11-19 2021-03-02 南京瑞贝西生物科技有限公司 一种氨基化磁性微球的制备方法及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4579661A (en) * 1983-05-02 1986-04-01 Pharmacia Ab Process in the purification of biologically active substances
EP0389063A2 (de) * 1989-03-23 1990-09-26 Akzo Nobel N.V. Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren
EP0580305A2 (de) * 1992-07-02 1994-01-26 Advanced Genetic Technologies Corporation Verfahren und Material für Reinigung von Nukleinsäuren
US5705628A (en) * 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9212164D0 (en) * 1992-06-09 1992-07-22 Medical Res Council Preparation of nucleic acids
US5668268A (en) * 1995-11-27 1997-09-16 Hybridon, Inc. Passivated polymer supports for nucleic acid synthesis
WO1999058664A1 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4579661A (en) * 1983-05-02 1986-04-01 Pharmacia Ab Process in the purification of biologically active substances
EP0389063A2 (de) * 1989-03-23 1990-09-26 Akzo Nobel N.V. Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren
EP0580305A2 (de) * 1992-07-02 1994-01-26 Advanced Genetic Technologies Corporation Verfahren und Material für Reinigung von Nukleinsäuren
US5705628A (en) * 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7517969B2 (en) * 2002-04-05 2009-04-14 Qiagen Gmbh Process for isolating nucleic acid with chaotrope agents and ammonium compounds
WO2004042058A2 (de) * 2002-11-08 2004-05-21 InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren
WO2004042058A3 (de) * 2002-11-08 2004-08-19 Invitek Biotechnik & Biodesign Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren
EP1560926B2 (de) † 2002-11-08 2013-08-21 STRATEC Molecular GmbH Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren
WO2009070465A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 New England Biolabs, Inc. Selective purification of small rnas from mixtures

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