WO2001078749A1 - Novel calcium antagonists - Google Patents

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Toshio Tanaka
Junko Sugatani
Yuichiro Kishi
Akira Matsukawa
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Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
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    • C07H19/10Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids

Definitions

  • the present invention relates to a new use of a nucleoside 5′-alkyl phosphate compound, particularly to a use of a pyridine 5′-alkyl phosphate compound or an adenosine 5′-alkyl phosphate compound as a calcium antagonist.
  • cardiovascular diseases are being overcome by antibiotics and other drugs, while cardiovascular diseases are combined with a rapid increase in fat intake due to the westernization of the diet and the high sodium chloride diet from ancient times in Japan.
  • the number of cases is increasing, and it is feared that it will become a serious problem in the future of aging.
  • various cardiovascular drugs have been developed. Among them, cardiovascular drugs having a mechanism of antagonism of calcium have high expectations for their excellent efficacy.
  • Calcium antagonists relax both the thick and narrow coronary arteries by suppressing the influx of calcium ions into vascular smooth muscle cells, thereby increasing coronary blood flow and increasing oxygen supply to the heart muscle Let it.
  • Conventional calcium antagonists are mainly divided into three types, difludipine, verapamil and diltiazem.
  • difludipine type dihydropyridine type
  • verapamil verapamil
  • diltiazem the power of the difludipine type (dihydropyridine type) is not only a blood vessel, but also a cardiomyocyte. It also has the effect of inhibiting the influx of calcium ions in, and is understood to have a relatively weak cardiac inhibitory effect compared to verapamil or diltiazem.
  • a main object of the present invention is to provide such a novel calcium antagonist.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of UMPC16 on PAF that induces platelet aggregation in the test examples described below.
  • A shows the effect of UMPC 16 at different concentrations on PAF that induces aggregation
  • B shows the dose-dependent effect of UMPC 16 and palmitate on PAF that induces platelet aggregation
  • C shows the effect of various concentrations.
  • 3 shows the inhibitory activity of UMPC 16 on platelet aggregation by PAF.
  • FIG. 2 is a graph showing the inhibitory effect of UMPC 16 on an aggregation-inducing substance that induces platelet aggregation.
  • FIG. 3 shows the effect of UMPC 16 on platelet aggregation induced by various agonists.
  • a indicates the time when UMPC 16 was added
  • b indicates the time when saponin was added (GTP ys experiments only)
  • c indicates the time when each agonist was added.
  • FIG. 4 is a view showing the inhibitory effect of nucleozide 5′-alkyl phosphates on a platelet aggregation inducer.
  • A is when the inducer is PAF
  • B is when the inducer is thrombin.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of extracellular calcium on the UMP C16 inhibitory activity of PAF that induces platelet aggregation.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of adding UMPC 16 at various times to PAF that induces platelet aggregation.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of UMPC 16 pre-incubation on PAF-induced platelet aggregation.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of UMPC 16 on PAF, thrombin, ADP, and ionomycin, which changes platelet calcium concentration. Summary of the Invention
  • nucleoside 5'-alkyl phosphate compounds especially ⁇ lysine 5'-alkyl phosphate compounds or adenosine 5'-alkyl phosphite compounds have remarkable calcium antagonism, was confirmed. Thus, the present invention has been completed.
  • R represents a linear or branched alkyl group
  • B represents a base constituting a nucleoside.
  • the alkyl group represented by R may be either linear or branched.
  • the carbon number does not usually exceed 30 and is preferably 4 to 24, more preferably 16 to 20.
  • Specific examples of such alkyl groups include butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, desinole, Examples thereof include linear alkyl such as pendecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, and eicosyl, or branched alkyl such as geranyl and fuarnesyl.
  • Examples of the base constituting the nucleoside represented by B include adenosine, guanosine, cytidine and peridine. Currently considered most preferred are those where R is an n_hexadecyl group of 16 carbons and B represents adenosine or peridine, ie, adenosine 5′-xadecyl phosphate (AMPC 16) or peridine 5 ′. Xadecyl phosphate (UMP C 16).
  • the compound (I) of the present invention as an active ingredient is not limited to a free form, but may be any form capable of providing a free form in a living body, such as a hydrate, a salt or an ester, as long as it is pharmaceutically acceptable. May be used. Therefore, in the following description, compound (I) is intended to include not only the free form but also any such pharmaceutically acceptable forms.
  • the compound (I) of the present invention that is, the nucleoside 5′-alkyl phosphate,
  • it can be prepared by dissolving nucleoside 5'-monophosphate and various linear or branched alkyl alkals in t-butyl alcohol and reacting in the presence of dicyclohexylcarbodiimide. I can do it.
  • the reaction temperature varies depending on the type of the solvent, but is usually 60100, preferably 70-90 ° C.
  • the reaction time varies depending on the reaction temperature, but is usually 220 hours, preferably 68 hours.
  • compound (I) had an inhibitory effect was confirmed in an agglutination test using egret platelets. It was also confirmed that compound (I) has an inhibitory action on intracellular calcium ion influx. Therefore, the compound (I) is useful as a calcium antagonist, and is also useful as a platelet aggregation inhibitor.
  • Compound (I) can be administered, for example, by oral, parenteral, buccal, rectal or transdermal administration, ie, in a manner convenient to apply the drug.
  • Oral administration Can be formulated as liquids or solids, for example, syrups, suspensions, emulsions, tablets, capsules or lozenges.
  • Liquid formulations generally comprise compound (I) together with any additives such as suspending agents, preservatives, flavoring agents, coloring agents and the like, in a suitable liquid carrier (eg, ethanol, glycerin, polyethylene glycol, oil, Water) to prepare a suspension or solution.
  • a suitable liquid carrier eg, ethanol, glycerin, polyethylene glycol, oil, Water
  • a composition in the form of a tablet can be prepared using any suitable pharmaceutical carrier (s) customary for the manufacture of solid formulations.
  • suitable pharmaceutical carrier include magnesium stearate, starch, lactose, sucrose and cellulose.
  • compositions that are in capsule form can be prepared using conventional encapsulation procedures.
  • active ingredient-containing pellets can be prepared by using a standard carrier and then filled into hard gelatin capsules.
  • a dispersion or suspension may be prepared using any suitable pharmaceutical carrier, for example, aqueous gums, celluloses, silicates or oils, and then filled into the soft gelatin capsule. it can.
  • Compound (I) may also be administered parenterally by bolus injection or infusion.
  • a typical parenteral composition comprises a solution or suspension of the compound in a sterile aqueous carrier or parenterally acceptable oil, such as polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, lecithin, peanut oil or sesame oil. .
  • the solution may be lyophilized and then reconstituted with a suitable solvent just prior to administration.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention are in unit dosage form, such as a tablet, capsule or ampoule.
  • Each dosage unit for oral administration preferably contains l-250 mg (preferably 0.1-6 Omg for parenteral administration) of compound (I) (converted as free base).
  • daily dosages are, for example, oral doses of Compound (I) (converted as the free base), lmg to 500mg, preferably 1mg to 250mg (eg, 5 to 20Omg)
  • the dose is an intravenous, subcutaneous or intramuscular dose of 0.1 mg to 100 mg, preferably 0.1 mg to 60 mg (eg, 1 to 40 mg), which is administered 1 to 4 times a day.
  • Compound (I) is preferably administered per day It may be administered by continuous intravenous infusion at doses up to 400 mg.
  • the total daily dose by oral administration is in the range of 1200 Omg
  • the total daily dose by parenteral administration is in the range of 0.140 Omg.
  • the compounds will be administered for the duration of continuous therapy, for example for a week or more.
  • specific examples of the buffer include citrate, phosphate and sodium hydroxide ZHCl
  • specific examples of the solvent include water
  • specific examples of the co-solvent include propylene glycol, Polyethylene dalicol and alcohol may be mentioned.
  • diluent Z filler examples include microcrystalline cellulose, lactose and starch
  • binder examples include polyvinylpyrrolidone and hydroxypropylmethylcellulose
  • disintegrant examples thereof include sodium starch daricolate and crospovidone
  • lubricant examples include magnesium stearate and sodium stearyl fumarate.
  • specific examples of the suspending agent include oxalate: microcrystalline cellulose
  • specific examples of the diluent include sorbitol solution, typically water
  • specific examples of the preservative include sodium benzoate.
  • Specific examples of the buffer include citrate
  • specific examples of the co-solvent include alcohol, propylene glycol, and polystyrene. Mention may be made of ethylene glycol and cyclodextrin.
  • 1-xadecyl-2-acetyl-sn-glycerol-1-phosphocholine (PAF) as a platelet aggregation inducer was purchased from Bachem Feinchemikalien AG (Bubendorf, Switzerland).
  • CMC Critical micelle concentration as a function of nucleoside 5'-alkylphosphate compounds
  • the degree (CMC) was determined by measuring the visible absorption spectrum (595 nm) of the pinassanol chloride dye (Nunn, CC et al., J. Phys. Chem., 86, 3271-3272 (1982)).
  • the buffers are as follows: (1) Basic Tyrode solution: NaCl 8.01 g / L, KC1 0.195 g / L, MgCl 2 6 H 2 0 0.21
  • HE PE S—buffered saline containing EDTA HE PES 1.0 Og / L, NaCl 8.01 g / L, KC1 0.195 g / L, dextrose 1.01 g / L, Na 2 EDTA 0.37 g / L, pH 7.4.
  • the platelet layer was mixed gently with 4 OmL of HEPES-buffered saline (pH 7.2) containing ImM EDTA, overlaid with 0.2 mL of Ficoll-Hyperk solution, and dried at 750 g. And centrifuged for 10 minutes. Again, the platelet layer was suspended in 40 mL of HEPS-buffered saline (pH 7.2) containing 0.1 mM EDTA and centrifuged at 750 g for 10 minutes. Blood cells are 0.1 mM
  • the cells were suspended in Tyrode / gelatin (pH 6.5) containing EDTA at a concentration of 1.0 ⁇ 10 9 cells / mL.
  • Platelets (1 ⁇ 10 8 cells, 400 cells) are stimulated and activated in Tyrode Z gelatin buffer containing 1 mM Ca 2 +. Aggregation activity is measured as a change in light transmission using an aggregometer (Nikko Hematracer, PAT-2A). Verizin 5'-alkylphosphate dissolved in physiological saline containing 0.05% ethanol-0.005% dimethylsulfoxide Verapamil dissolved in physiological saline is a stimulant such as PAF unless otherwise indicated. One minute before adding, it is added to the reaction system. However, guanosine 5'-0- (3-thiotriphosphate)
  • Platelets ( 2.5 ⁇ 10 8 cells / mL) were plated with UMP C16 (1 ⁇ 1) in Tyrode-1 gelatin buffer (pH 7.2) containing 0.1% BSA and ImM Ca 2+. after incubation 0- 5 M) and 1 min before the addition of [3H] acetyl- PA F (1 X 1 0- 9 M) at 37 ° C. Binding tests were performed in polypropylene tubes. After incubation for 3 minutes, remove 400 platelets, layer 50 / xL dibutyl phthalate / dioctyl phthalate mixture (3: 1, V / V), and centrifuge (10,000 Xg, 60 seconds) From the suspension medium.
  • the cells were washed with 400 ⁇ L of 0.1% BS saline solution.
  • the platelet pellet was resuspended in 300% iL of 1% (w / v) Triton X-100 solution, and the platelet-bound radioactivity was measured using a liquid scintillation counter. Specific binding was determined by the presence of [3H] acetyl- in the presence or absence of a 100-fold excess of unlabeled PAF.
  • the intracellular Ca 2+ concentration [C a 2+ ] i can be calculated from the following equation (G. Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem., 260, 3440, 1985).
  • FIG. 1 shows the effect of UMPC 16 on PAF which induces platelet aggregation
  • A shows the effect of UMPC 16 on different concentrations of UMPC 16 on PAF which induces aggregation
  • B shows the effect of platelet aggregation
  • FIG. 4 shows a comparison of the dose-dependent effects of UMPC 16 and palmitic acid on PAF
  • C shows the inhibitory activity of UMPC 16 on platelet aggregation by various concentrations of PAF.
  • a to f in A of Fig. 1 indicate the following experimental conditions. Briefly, washed rabbits (1 X 10 8 cells, 0.38 mL) in tie-mouthed Z-gelatin buffer (pH 7.2) containing lm CaCl 2 were replaced with 2.0% ethanol-2.0% dimethyl sulfoxide. Pre-incubate with UMP C16 (10 ⁇ L) (10 ⁇ L) dissolved in saline containing saline for 1 minute (a), and then add it to saline containing 0.1% BSA. Exposure to dissolved PAF (10 ⁇ L) (final concentration 8 x 10 HM) for 2 minutes (time to maximize response with PAF stimulation) (b).
  • the inhibition rate of platelet aggregation was calculated by the above method, and the results were shown as multiple average values (range of soil average values).
  • c is the mediator only, d is 6 X 10- 6 M, e is 8 X 10- 6 M, f represents the case of IX 10- 5 M.
  • UMPC 16 did not inhibit platelet morphology and changes caused by 8 ⁇ 10 M PAF, but inhibited platelet aggregation. Aggregation inhibition by UMPC 16 was dependent on UMPC 16 and PAF concentrations (see Figure 1, B and C). On the other hand, palmitic acid (consisting of a part of the alkyl of UMP C16) at a concentration of 1 to 10 ⁇ did not inhibit platelet aggregation by PAF ((in Fig. 1).
  • thrombin, arachidonic acid, and ADP which induce platelet aggregation
  • PAF which caused platelet aggregation
  • the strength of the inhibition was dependent on the concentrations of the agglutinogen and UMPC16.
  • PAF to induce aggregation 8 X 10- "M), thrombin (0.02UZmL), the IC 50 value for Araki Dong acid (2 X 1 0- 5 M) and ADP (2.5 X 10- 5 M) , respectively 2.4 X 10 one 6 M, 5.4 X 1_ ⁇ - 6 M, 2. (data not shown) was 1 X 10 _6 M and 2. 2 X 10- 6 M.
  • FIG. 3 shows the concentration-dependent effect of UMPC16.
  • UMPC 16 was found to inhibit platelet aggregation induced by PAF, thrombin, arachidonic acid, ADP and GTP ⁇ S in a concentration-dependent manner.
  • the platelet aggregation induced by GTPy S (final concentration 2 X 10- 5 M) In against test, for delivery into the effective platelet cyclic Tozoru the GTP gamma S is a membrane-impermeant, after being Pureinkyu Pies with UMPC 16 (final concentration 1 X 10- 5 M), saponin (3 3 ⁇ g / mL) for 1 minute to increase platelet membrane permeability in advance.
  • Figures 3a-c show preincubate with indicated concentrations of UMP C16 (a), incubation with saponin (b) (GTPy S experiments only), and exposure to various agonists (c), respectively. Is shown. The numbers in parentheses indicate the relative concentration of UMPC16. That is, (0) represents data only for vehicles.
  • nucleoside 5'-alkyl phosphate compounds (1) namely, UMP C8, UMPC 12, UMP C 16 s UMP C 20, UMPC24 and AMP C 16, on platelet aggregation was examined. That is, UMP C8, UMPC12, UMPC16, UMPC20, UMPC24 or AMPC16 (1) of a predetermined concentration dissolved in a physiological saline containing 2.0% ethanol-2.0% dimethyl sulfoxide.
  • nucleoside 5′-alkylphosphate compounds (I) affect platelet aggregation by PAF and thrombin.
  • Nucleoside 5 alkyl phosphates containing C16 and C20, which have a longer methylene chain in the pole group, have been reported to inhibit platelet aggregation-induced PAF from PAF stimulation (KD Newman et al., J. Clin. Invest., 61, 395, 1978; TC Lee et al., Arch. Biochem. Biophys., 223, 33, 1983; FH Valone et al., Thromb. Res., 40, P.
  • AMPC 16 has impaired inhibitory platelet aggregation induced by 8 X 10- UM of PAF (IC 50 values: 8. 7 X 10- 6 M) .
  • UMPC 16 addition time was tested to determine if UMPC 16 was effective after addition of PAF. That is, UMPC16 or a solvent for control test was added to platelets at specified times before and after the addition of 8 ⁇ 10-8 M PAF, the platelet aggregation inhibition rate was calculated by the above method, and the results were plotted.
  • Figure 6 shows multiple averages (range of soil averages). 8 X 10- well were incubated with 1 minute 1 X 10- 5 M UMP C 16 of prior to the addition of PAF of, 8 X 10- 1 of P AF simultaneously 1 X 10- 5 M of UMP C 16 With When added, aggregation by PAF was inhibited 100%.
  • Nonspecific binding of AF were respectively 9. 4 ⁇ 1. 4 and 8. 3 ⁇ 0. 3fmol / 10 8 cells in the absence and presence of 1 X 1 0- 5 M of UMPC 16.
  • UMPC 16 and a solvent were directly incubated with platelets in warm water at 37 ° C for 1 minute. Maximal response was determined by PAF stimulation in the presence of solvent. Was instructed added, the solvent (a), PAF (b, 8 X 10 HM), UMP C 16 (c, 1 X 10 - 5 M), 0. 05U / mL thrombin, 2 ⁇ 5 X 10- 5 AD of AD ⁇ and ionomycin (d, 4 ⁇ 1-8 M) were added. The results are shown in FIG. 8, representative of at least four experiments.
  • A shows data of vehicle alone
  • B shows data of UMPC 16 addition.
  • a to indicate preincubate with the vehicle (a), preincubate with the indicated concentration of UMPC 16 (b), and exposure to various agonists ( c ), respectively.
  • UMPC 16 inhibited [ Ca2 + ] i by PAF, thrombin, and ADP.
  • UMP C 16 is, PAF to induce [Ca 2+] i, but attenuate the action of thrombin and ADP, it can be seen that not attenuate the effects of Ionomaishin to induce [Ca 2 +] i ( Figure 8, Table 1).
  • Receptor-mediated inhibition of [Ca 2+ ] i by UMPC 16 was not 100% ( Figure 8, Table 1), but platelet aggregation was inhibited by 100%. This is due to UMPC 16 [Ca 2+] i inhibition of the response have shown that happened by inhibiting C a 2 + influx through the receptor.
  • Arakidon acid is metabolized by cyclo O key Shige kinase Ya thromboxane A 2 synthetase via the E command peroxide O sulfoxide Ya thromboxane A 2, which is thought to induce the activity of phospholipase C pathway.
  • PAF thrombin stimulation by thromboxane A 2 and ADP is transmitted through the receptor to elicit a protein phosphorylation 40- kD a, activation of phospholipase C associated with protein kinase C system Trigger.
  • UMPC 16 inhibited the action of PAF, which induces platelet aggregation and [Ca 2 —] i changes induced by stimulation through these receptors ( Figures 2 and 8 and Table 1).
  • UMPC 16 did not inhibit the action of ionomycin, which alters 3187 and [Ca 2 + ] i ( Figures 2 and 8). Furthermore, UMPC 16 did not inhibit PMA, which causes platelet aggregation ( Figure 2). On the other hand, UMPC 16 inhibited GTPyS, which induces platelet aggregation (Fig. 3). Guanine nucleotide binding proteins (G proteins) are thought to link receptors and related reactions, including the activity of membrane ion channels. Therefore, it was revealed that UMPC 16 antagonizes Ca 2+ channel linked to G protein receptor. PMA directly activates protein kinase C in platelets, which phosphorylates the 40 kDa protein, and does not require extracellular Ca 2 ⁇ .
  • G proteins Guanine nucleotide binding proteins
  • UMPC 16 concentration of 1 X 10- 5 M can inhibit aggregation. That is, it causes disaggregation. Verapamil has been reported to reverse phosphorylation of 40-kDa and 20-kDa proteins, causing disaggregation of PAF-aggregated platelets (G. Bonadonna et al., Thromb. Heamos. , 56 volumes, 308 pages, 1 986). In a study of the dynamics of PAF binding to egret platelets, platelets completely agglutinated by PAF showed disaggregation at the same time as the amount of PAF for the receptor decreased, meaning that platelet aggregation was observed. It is elucidated that this indicates that PAF binding is required for the receptor to be maintained.
  • the mode of activity of UMPC 16 inhibits calcium influx through an aggregation-inducing substance that specifically binds to a receptor, and inhibits the binding of an aggregation-inducing substance, like the calcium channel inhibitor verapaminole. It can be thought that this is due to the fact. In addition, it is considered that inhibition of the reaction dependent on intracellular calcium may affect the inhibitory activity of UMPC 16 on the platelet response. In conclusion, it can be said that UMPC 16 more effectively inhibits receptors through the platelet response than veravamil.
  • Nucleoside 5'-alkyl phosphate compounds did not inhibit the binding of agonists (PAF, thrombin, arachidonic acid, ADP, GTP ⁇ S) to platelet receptors. Thus, it can be seen that UMPC 16 does not antagonize the receptor. In addition, increasing the calcium concentration in the medium did not restore the PAF inhibitory effect of the nucleoside 5'-alkyl phosphate compound. Therefore, the nucleoside 5′-alkyl phosphate compound has no calcium chelating action. Nucleoside 5'-alkyl phosphate compounds did not inhibit the receptor-mediated increase in intracellular activity by 100%, but did inhibit platelet aggregation by 100%. It was found to be blocking body-operated calcium channels.
  • nucleoside 5'-alkyl phosphate compounds did not inhibit ionomycin and ⁇ 23187, but inhibited the increase in intracellular calcium concentration by PAF, thrombin, arachidonic acid, ADP, and GTP ⁇ S. Therefore, it was found to be a calcium channel inhibitor.
  • the inhibition of PAF, thrombin, and GTPyS indicated that the nucleoside 5'-alkylphosphate compound antagonized the G-protein-coupled receptor-operating potentiocyte channel.
  • the strength of the PAF inhibitory effect of nucleoside 5'-alkylphosphate compounds depends on the addition time, and it is better to add UMPC 16 before adding PAF The effect was strong.
  • platelet aggregation inhibition Since the platelet aggregation inhibition is not reversed by the addition of BSA, the mechanism of action seems to be different from that of econazole. In addition, platelet aggregation inhibition is not reversed by an increase in the calcium concentration in the medium, suggesting that the mechanism of action is different from that of verapaminole.
  • the nucleoside 5′-alkylphosphate compound (I) of the present invention has a calcium antagonism, and particularly has a calcium antagonism based on the inhibition of extracellular fluid calcium from flowing into cells. It is effective in preventing cardiomyopathy and arrhythmia, and has an excellent inhibitory effect on platelet aggregation. Therefore, it is useful as a preventive or therapeutic agent for thrombosis, embolism or arteriosclerosis.

Abstract

Novel calcium antagonists containing as the active ingredient nucleoside 5'-alkylphosphate compounds represented by the following general formula: wherein R represents a liner or branched alkyl; and B represents a base constituting a nucleoside.

Description

明 細 書 新規カルシウム拮抗剤 技術分野  Description New calcium antagonist Technical field
本発明は、 ヌクレオシド 5 ' —アルキルホスフェート化合物の新しい用途、 特 にゥリジン 5 ' —アルキルホスフェート化合物またはアデノシン 5 ' —アルキル ホスフヱ一ト化合物のカルシウム拮抗剤としての用途に関する。 背景技術  The present invention relates to a new use of a nucleoside 5′-alkyl phosphate compound, particularly to a use of a pyridine 5′-alkyl phosphate compound or an adenosine 5′-alkyl phosphate compound as a calcium antagonist. Background art
感染症は、 抗生物質などの薬剤によって克服されつつあるが、 他方、 循環器系 疾患は、 食生活の西洋化に伴う摂取脂肪量の急激な増加と日本古来からの高塩化 ナトリウム食とが相まって、 症例の拡大を見つつあり、 高齢化が進む将来におい てはゆゆしい問題になることが懸念されている。 このような状況を反映して、 種々の循環器用薬剤が開発されてきているが、 中でもカルシゥム拮抗作用を機序 とする循環器用薬にはその優れた薬効から大きな期待が寄せられている。  Infectious diseases are being overcome by antibiotics and other drugs, while cardiovascular diseases are combined with a rapid increase in fat intake due to the westernization of the diet and the high sodium chloride diet from ancient times in Japan. However, the number of cases is increasing, and it is feared that it will become a serious problem in the future of aging. In view of this situation, various cardiovascular drugs have been developed. Among them, cardiovascular drugs having a mechanism of antagonism of calcium have high expectations for their excellent efficacy.
カルシゥム拮抗剤は、 血管平滑筋細胞へのカルシウムイオンの流入を抑制する ことにより、 冠動脈の太い部分および細い部分の両方を弛緩させ、 これにより冠 動脈血流量を増加させ、 心筋への酸素供給を増大させる。 従来のカルシウム拮抗 剤は、 主に二フエジピン、 ベラパミルおよびジルチアゼムの三つのタイプに分け られるが、 これらのうち、 二フエジピンタイプ (ジヒドロピリジンタイプ) の力 ノレシゥム拮抗剤は、 血管のみならず、 心筋細胞におけるカルシウムイオンの流入 も抑制する作用を有しており、 ベラパミルやジルチアゼムに比較して、 相対的に 心臓抑制作用が弱いと理解されている。 発明の目的  Calcium antagonists relax both the thick and narrow coronary arteries by suppressing the influx of calcium ions into vascular smooth muscle cells, thereby increasing coronary blood flow and increasing oxygen supply to the heart muscle Let it. Conventional calcium antagonists are mainly divided into three types, difludipine, verapamil and diltiazem. Of these, the power of the difludipine type (dihydropyridine type) is not only a blood vessel, but also a cardiomyocyte. It also has the effect of inhibiting the influx of calcium ions in, and is understood to have a relatively weak cardiac inhibitory effect compared to verapamil or diltiazem. Purpose of the invention
カルシウム拮抗剤は、 現在、 狭心症や心筋梗塞のような虚血性心疾患の治療薬 として注目を浴びるに至っており、 より強力かつ安全な効力を有するカルシウム 拮抗剤の提供が、 常時、 要望されている。 本発明の主な目的は、 このような新規カルシゥム拮抗剤を提供することである。 以下、 添付の図面を参照し、 本発明のこの目的および他の目的ならびに効果に ついて、 さらに説明する。 図面の簡単な説明 Calcium antagonists are currently receiving attention as therapeutic agents for ischemic heart diseases such as angina pectoris and myocardial infarction, and there is a constant demand for calcium antagonists that have more potent and safe efficacy. ing. A main object of the present invention is to provide such a novel calcium antagonist. Hereinafter, this and other objects and effects of the present invention will be further described with reference to the accompanying drawings. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 後に記載する試験例における血小板凝集を惹起する PAFに対する U MPC 16の効果を示す図である。 Aは凝集を誘発する PAFに対する UMPC 16の異なった濃度における効果を示し、 Bは血小板凝集を惹起する PAFに対 する UMPC 16とパルミチン酸の投与量依存的効果を示し、 Cは種々の濃度の PAFによる血小板凝集に対する UMPC 16の阻害活性を示す。  FIG. 1 is a graph showing the effect of UMPC16 on PAF that induces platelet aggregation in the test examples described below. A shows the effect of UMPC 16 at different concentrations on PAF that induces aggregation, B shows the dose-dependent effect of UMPC 16 and palmitate on PAF that induces platelet aggregation, and C shows the effect of various concentrations. 3 shows the inhibitory activity of UMPC 16 on platelet aggregation by PAF.
図 2は、 血小板凝集を惹起する凝集惹起物質に対する UMPC 16の阻害効果 を示す図である。  FIG. 2 is a graph showing the inhibitory effect of UMPC 16 on an aggregation-inducing substance that induces platelet aggregation.
図 3は、 種々のァゴニストに誘導された血小板凝集に対する UMPC 16の効 果を示す図である。 aは UMPC 16の添加時、 bはサポニン添加時 (GTP y s実験のみ) 、 cは各ァゴニストの添加時を示す。  FIG. 3 shows the effect of UMPC 16 on platelet aggregation induced by various agonists. a indicates the time when UMPC 16 was added, b indicates the time when saponin was added (GTP ys experiments only), and c indicates the time when each agonist was added.
図 4は、 血小板凝集惹起剤に対するヌクレオジド 5'—アルキルホスフエ一ト 類の阻害効果を示す図である。 Aは惹起剤が PAFの場合のもの、 Bは惹起剤が トロンビンの場合のものである。  FIG. 4 is a view showing the inhibitory effect of nucleozide 5′-alkyl phosphates on a platelet aggregation inducer. A is when the inducer is PAF, B is when the inducer is thrombin.
図 5は、 血小板凝集を惹起する P A Fの UMP C 16による阻害活性に対する 細胞外カルシウムの効果を示す図である。  FIG. 5 is a graph showing the effect of extracellular calcium on the UMP C16 inhibitory activity of PAF that induces platelet aggregation.
図 6は、 血小板凝集を惹起する PAFに対し、 様々な時間に UMPC 16を添 加したときの効果を示す図である。  FIG. 6 is a graph showing the effect of adding UMPC 16 at various times to PAF that induces platelet aggregation.
図 7は、 PAFに誘導される血小板凝集に対する UMPC 16のプレインキュ ベーシヨンが及ぼす影響を示す図である。  FIG. 7 is a graph showing the effect of UMPC 16 pre-incubation on PAF-induced platelet aggregation.
図 8は、 血小板内カルシウム濃度を変化させる PAF、 トロンビン、 ADPお よびィオノマイシンに対する UMPC 16の効果を示す図である。 発明の概要  FIG. 8 is a graph showing the effect of UMPC 16 on PAF, thrombin, ADP, and ionomycin, which changes platelet calcium concentration. Summary of the Invention
本発明者らも、 このような要望に応えるべく、 種々のヌクレオシド化合物につ いて種々研究を重ねるうち、 ヌクレオシド 5' —アルキルホスフェート化合物、 とりわけゥリジン 5' —アルキルホスフェート化合物またはアデノシン 5 ' —ァ ルキルホスフエ一ト化合物が顕著なカルシウム拮抗作用を有する事実を確認し、 この知見に基づいて本発明を完成するに至った。 The present inventors have also developed various nucleoside compounds in order to respond to such a demand. Through various studies and studies, the fact that nucleoside 5'-alkyl phosphate compounds, especially ゥ lysine 5'-alkyl phosphate compounds or adenosine 5'-alkyl phosphite compounds have remarkable calcium antagonism, was confirmed. Thus, the present invention has been completed.
ゥリジン類化合物については、 本発明に先立って、 ゥリジン 5' —モノホス フェート (UMP) の血小板凝集作用の有無を検討した事実が存在するが、 陰性 の結果が得られた旨、 報告されている (薬学雑誌、 1 1 1 (9) 504- 509 (1991) ) 。  Prior to the present invention, there is a fact that the presence or absence of platelet aggregation of peridine 5'-monophosphate (UMP) has been examined for peridine compounds, but it has been reported that a negative result was obtained ( Pharmaceutical Journal, 1 1 1 (9) 504-509 (1991)).
また、 ゥリジン 5' —アルキルホスフェート類は、 酵母菌のひおよび αハプロ イド (1倍体) 細胞間の有性凝集を阻害するが、 細胞の成長には影響しないこと が報告されている (F EMS Mi c r o b i o l . Le t t. , 147, 1 7 -22 (1997) ) 。 この凝集阻害は、 ゥリジン 5' —アルキルホスフェート 類の酵母菌細胞壁への直接の作用によるものではないことが明らかになつている c 本発明の要旨は、 式 I : It has also been reported that peridine 5'-alkyl phosphates inhibit sexual aggregation between yeast and α-haploid (haploid) cells but do not affect cell growth (F EMS Microbiol. Lett., 147, 17-22 (1997)). The aggregation inhibition Urijin 5 '- Abstract of c present invention that it is not by direct action on yeast cell walls alkyl phosphates are obviously summer, the formula I:
(式中、 Rは直鎖または分岐鎖状アルキ ル基を示し、 Bはヌクレオシドを構成する塩基を示す。 ) (In the formula, R represents a linear or branched alkyl group, and B represents a base constituting a nucleoside.)
で表されるヌクレオシド 5 ' —アルキルホスフェート化合物 (以下、 単に化合物 (I) と称する) を有効成分とするカルシウム拮抗剤、 特に、 血小板凝集抑制剤 にある。 発明の詳細な説明 Calcium antagonists containing a nucleoside 5'-alkyl phosphate compound represented by the following formula (hereinafter simply referred to as compound (I)) as an active ingredient, in particular, a platelet aggregation inhibitor. Detailed description of the invention
上記式 Iにおいて、 Rで示されるアルキル基は、 直鎖状または分岐鎖状のいず れであってもよい。 その炭素数は、 通常 30を超えることはなく、 好ましくは 4 〜24、 さらに好ましくは 16〜20である。 このようなアルキル基の具体例と しては、 ブチル、 ペンチル、 へキシル、 ヘプチル、 ォクチル、 ノニル、 デシノレ、 ゥンデシル、 ドデシル、 トリデシル、 テトラデシル、 ペンタデシル、 へキサデシ ル、 ヘプタデシル、 ォクタデシル、 ノナデシル、 エイコシルなどの直鎖状アルキ ルまたはゲラニル、 フアルネシルなどの分岐鎖状アルキルを挙げることが出来る。 また、 Bで示される、 ヌクレオシドを構成する塩基としては、 アデノシン、 グァ ノシン、 シチジンまたはゥリジンを挙げることができる。 現時点で最も好ましい と考えられるものは、 Rが炭素数 16の n_へキサデシル基であり、 かつ Bがァ デノシンまたはゥリジンを表す場合、 すなわち、 アデノシン 5' キサデシル ホスフェート (AMPC 16) またはゥリジン 5' キサデシルホスフェート (UMP C 16) である。 In the above formula I, the alkyl group represented by R may be either linear or branched. The carbon number does not usually exceed 30 and is preferably 4 to 24, more preferably 16 to 20. Specific examples of such alkyl groups include butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, desinole, Examples thereof include linear alkyl such as pendecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, and eicosyl, or branched alkyl such as geranyl and fuarnesyl. Examples of the base constituting the nucleoside represented by B include adenosine, guanosine, cytidine and peridine. Currently considered most preferred are those where R is an n_hexadecyl group of 16 carbons and B represents adenosine or peridine, ie, adenosine 5′-xadecyl phosphate (AMPC 16) or peridine 5 ′. Xadecyl phosphate (UMP C 16).
有効成分としての本発明の化合物 (I) は、 遊離形のみならず、 医薬的に許容 される限り、 水和物、 塩、 エステルなど、 生体内で遊離形を与えることの出来る 任意の形で使用されてよい。 したがって、 以下の記載において、 化合物 (I) は、 遊離形のみならず、 そのような医薬的に許容される任意形をも包括して意味する ものとする。  The compound (I) of the present invention as an active ingredient is not limited to a free form, but may be any form capable of providing a free form in a living body, such as a hydrate, a salt or an ester, as long as it is pharmaceutically acceptable. May be used. Therefore, in the following description, compound (I) is intended to include not only the free form but also any such pharmaceutically acceptable forms.
本発明の化合物 (I) 、 すなわちヌクレオシド 5' -アルキルホスフェートは、 The compound (I) of the present invention, that is, the nucleoside 5′-alkyl phosphate,
—般にヌクレオシド 5' —モノホスフェート (式 Iにおいて、 R = Hに相当する 化合物) から自体常套の方法により合成することができる。 例えば、 ヌクレオシ ド 5 ' —モノホスフュートおよび種々の直鎖状または分岐鎖状アルキルアル を t一ブチルアルコールに溶解し、 ジシク口へキシルカルボジィミ ドの存在下 で反応させることにより、 製造することが出来る。 反応温度は、 溶媒の種類によ り異なるが、 通常60 100で、 好ましくは 70 90°Cであり、 反応時間は、 反応温度により異なるが、 通常 2 20時間、 好ましくは 6 8時間である。 化合物 (I) は、 後に記載するように、 ゥサギの血小板を使用する凝集試験に おいて、 阻害効果を有する事実が確認された。 また、 化合物 (I) について、 細 胞内カルシウムイオン流入抑制作用を有する事実も確認された。 したがって、 ィ匕 合物 (I) は、 カルシウム拮抗剤として有用なものであり、 さらに血小板凝集抑 制剤として有用なものである。 In general, it can be synthesized from nucleoside 5'-monophosphate (a compound corresponding to R = H in the formula I) by a conventional method. For example, it can be prepared by dissolving nucleoside 5'-monophosphate and various linear or branched alkyl alkals in t-butyl alcohol and reacting in the presence of dicyclohexylcarbodiimide. I can do it. The reaction temperature varies depending on the type of the solvent, but is usually 60100, preferably 70-90 ° C. The reaction time varies depending on the reaction temperature, but is usually 220 hours, preferably 68 hours. As described later, the fact that compound (I) had an inhibitory effect was confirmed in an agglutination test using egret platelets. It was also confirmed that compound (I) has an inhibitory action on intracellular calcium ion influx. Therefore, the compound (I) is useful as a calcium antagonist, and is also useful as a platelet aggregation inhibitor.
化合物 (I) は、 例えば、 経口、 非経口、 口腔、 経直腸または経皮投与により、 すなわち薬剤を適用するのに都合のよい方法で投与することが出来る。 経口投与 のためには、 液体または固体、 たとえば、 シロップ、 懸濁液、 ェマルジヨン、 錠 剤、 カプセルまたはロゼンジとして処方できる。 Compound (I) can be administered, for example, by oral, parenteral, buccal, rectal or transdermal administration, ie, in a manner convenient to apply the drug. Oral administration Can be formulated as liquids or solids, for example, syrups, suspensions, emulsions, tablets, capsules or lozenges.
液体処方は、 一般に、 化合物 (I) を、 沈殿防止剤、 保存剤、 フレーバー剤、 着色剤などのような任意の添加剤と共に、 適当な液体担体 (例えば、 エタノール、 グリセリン、 ポリエチレングリコール、 油、 水) 中へ、 懸濁または溶解させて調 製する。  Liquid formulations generally comprise compound (I) together with any additives such as suspending agents, preservatives, flavoring agents, coloring agents and the like, in a suitable liquid carrier (eg, ethanol, glycerin, polyethylene glycol, oil, Water) to prepare a suspension or solution.
錠剤形である組成物は、 固体処方の製造に慣用的な適宜の医薬担体を用いて製 造することが出来る。 このような担体の例は、 ステアリン酸マグネシウム、 デン プン、 ラクトース、 シユークロースおよびセルロースを包含する。  A composition in the form of a tablet can be prepared using any suitable pharmaceutical carrier (s) customary for the manufacture of solid formulations. Examples of such carriers include magnesium stearate, starch, lactose, sucrose and cellulose.
カプセル形である組成物は、 慣用的カプセル化操作を用いて製造できる。 たと えば、 活性成分含有のペレットを標準担体の使用により調製し、 ついで、 硬ゼラ チンカプセルに充填することができる。 別法として、 いずれか適当な医薬担体、 たとえば水性ガム、 セルロース、 シリケートまたは油を用いて分散液または懸濁 液を調製し、 ついで該分散液または懸濁液を軟ゼラチンカプセルに充填すること ができる。  Compositions that are in capsule form can be prepared using conventional encapsulation procedures. For example, active ingredient-containing pellets can be prepared by using a standard carrier and then filled into hard gelatin capsules. Alternatively, a dispersion or suspension may be prepared using any suitable pharmaceutical carrier, for example, aqueous gums, celluloses, silicates or oils, and then filled into the soft gelatin capsule. it can.
化合物 (I ) は、 また、 ボーラス注射または点滴により非経口投与してもよレ、。 典型的な非経口用組成物は、 該化合物の滅菌水性担体または非経口的に許容され る油中、 例えば、 ポリエチレングリコール、 ポリビニルピロリ ドン、 レシチン、 落花生油またはゴマ油中溶液または懸濁液からなる。 別法として、 該溶液を凍結 乾燥し、 ついで、 投与直前に適当な溶媒で復元してもよい。  Compound (I) may also be administered parenterally by bolus injection or infusion. A typical parenteral composition comprises a solution or suspension of the compound in a sterile aqueous carrier or parenterally acceptable oil, such as polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, lecithin, peanut oil or sesame oil. . Alternatively, the solution may be lyophilized and then reconstituted with a suitable solvent just prior to administration.
本発明の医薬組成物は、 錠剤、 カプセルまたはアンプルのような単位投与形で あるのが好ましい。 経口投与用の各投与単位は、 l〜250mg (非経口投与で は、 好ましくは 0. 1〜6 Omg) の化合物 (I ) (遊離塩基として換算) を含 有するのが好ましい。  Preferably, the pharmaceutical compositions of the present invention are in unit dosage form, such as a tablet, capsule or ampoule. Each dosage unit for oral administration preferably contains l-250 mg (preferably 0.1-6 Omg for parenteral administration) of compound (I) (converted as free base).
成人患者の場合、 一日の投与量は、 たとえば化合物 ( I ) (遊離塩基として換 算) 、 lmg〜500mg、 好ましくは 1 m g〜 250 m g (例えば、 5〜2 0 Omg) の経口用量、 あるレヽは 0. lmg〜l 00mg、 好ましくは 0. 1 mg 〜60mg (例えば、 l〜40mg) の静脈内、 皮下または筋肉内用量であり、 それを一日に 1〜4回投与する。 また、 化合物 (I ) を、 好ましくは一日当たり 400m gまでの用量で、 連続的静脈内注入により投与してもよい。 かくして、 経口投与による一日の全用量は、 1 200 Omgの範囲にあり、 非経口投与に よる一日の全用量は 0. 1 40 Omgの範囲にある。 適当には、 該化合物を連 続的治療の期間中、 たとえば 1週間またはそれ以上の期間投与する。 For adult patients, daily dosages are, for example, oral doses of Compound (I) (converted as the free base), lmg to 500mg, preferably 1mg to 250mg (eg, 5 to 20Omg) The dose is an intravenous, subcutaneous or intramuscular dose of 0.1 mg to 100 mg, preferably 0.1 mg to 60 mg (eg, 1 to 40 mg), which is administered 1 to 4 times a day. Compound (I) is preferably administered per day It may be administered by continuous intravenous infusion at doses up to 400 mg. Thus, the total daily dose by oral administration is in the range of 1200 Omg, and the total daily dose by parenteral administration is in the range of 0.140 Omg. Suitably, the compounds will be administered for the duration of continuous therapy, for example for a week or more.
以下、 本発明の化合物 (I) の製造例、 製剤例および試験例を示して本発明を さらに詳しく説明する力 本発明はこれらに限定されるものではない。  Hereinafter, the ability to explain the present invention in more detail by showing Production Examples, Formulation Examples and Test Examples of the compound (I) of the present invention The present invention is not limited to these.
製造例  Manufacturing example
ヌクレオシド 5' —アルキルホスフェート化合物は、 Machida K. らの方法 (FEMS Microbiol. Lett. 147, 1 7— 22 (1997) ) により合成し た。 例えば、 ゥリジン 5' キサデシルホスフェート (I : R = C 16H33 The nucleoside 5'-alkyl phosphate compound was synthesized by the method of Machida K. et al. (FEMS Microbiol. Lett. 147, 17-22 (1997)). For example, lysine 5'xadecyl phosphate (I: R = C16H33
B = リジン) (UMPC 16) の場合、 以下のごとく合成される。 (B = lysine) (UMPC 16), it is synthesized as follows.
ゥリジン 5' —モノホスフェート (600 πιο 1) およびへキサデシルアル コール (6mmo l ) を 20 m Lの t一ブチルアルコールに溶解した後、 3 mm o 1のジシクロへキシルカルボジイミ ドを加え、 80°Cで 20時間加熱する。 反 応終了後、 生成した沈殿を濾別し、 t一ブチルアルコールを減圧下に除去する。 残渣をへキサンおよびアセトンの混液 (1 : 1) で数回洗浄し、 乾燥した後、 ク ロロホルムおよびメタノールの混液 (95 : 5) に溶解する。 これを同溶液にて 作成したシリカゲル力ラムに負荷し、 カラムを同液で充分洗浄してジシクロカル ポジイミ ドを流出させる。 以後、 メタノールの濃度を順次、 上昇させることに よって、 ゥリジン 5' キサデシルホスフェートを溶出する。 溶出液から溶媒 を減圧下に除去することにより、 白色の沈殿を得た。 対ゥリジン 5' —モノホス フェートあたりの収率は、 32. 4%であった。  Peridine 5 '— monophosphate (600 πιο 1) and hexadecyl alcohol (6 mmol) are dissolved in 20 mL of t-butyl alcohol, and 3 mmol of dicyclohexylcarbodiimide is added, and the mixture is heated to 80 °. Heat at C for 20 hours. After the reaction is completed, the formed precipitate is filtered off, and t-butyl alcohol is removed under reduced pressure. The residue is washed several times with a mixture of hexane and acetone (1: 1), dried, and dissolved in a mixture of chloroform and methanol (95: 5). This is loaded onto a silica gel ram made of the same solution, and the column is thoroughly washed with the same solution to dilute the dicyclocarboimide. Thereafter, the lysine 5'-xadecyl phosphate is eluted by sequentially increasing the concentration of methanol. The solvent was removed from the eluate under reduced pressure to obtain a white precipitate. The yield per 5′-monophosphate relative to peridine was 32.4%.
製剤例 1 (静脈内注射)  Formulation Example 1 (Intravenous injection)
化合物 ( I ) 1一 40 m g  Compound (I) 1 40 mg
バッファー pH約 7まで  Buffer pH up to about 7
溶媒 100m lまで  Solvent up to 100ml
製剤例 2 (ボーラス注射)  Formulation Example 2 (bolus injection)
化合物 ( I ) 1一 40 m g  Compound (I) 1 40 mg
バッファー pH約 7まで 共溶媒 5m lまで Buffer pH up to about 7 Cosolvent up to 5 ml
上記製剤例 1および 2において、 バッファ一の具体例としてはクェン酸塩、 リ ン酸塩および水酸化ナトリウム Z塩酸を、 溶媒の具体例としては水を、 共溶媒の 具体例としてはプロピレングリコール、 ポリエチレンダリコールおよびアルコー ルを挙げることができる。  In Formulation Examples 1 and 2 above, specific examples of the buffer include citrate, phosphate and sodium hydroxide ZHCl, specific examples of the solvent include water, specific examples of the co-solvent include propylene glycol, Polyethylene dalicol and alcohol may be mentioned.
製剤例 3 (錠剤)  Formulation Example 3 (tablet)
化合物 ( I ) 1—40 m g  Compound (I) 1-40 mg
希釈剤 Z充填剤 50-25 Omg  Diluent Z filler 50-25 Omg
結合剤 5— 25 m g  Binder 5—25 mg
崩崩壊壊剤剤 5 _ 50 m g  Disintegration disintegrant 5 _ 50 mg
滑沢剤 1— 5 m g  Lubricant 1—5 mg
上記製剤例 3において、 希釈剤 Z充填剤の具体例としては微結晶セルロース、 ラクト一スおよび澱粉を、 結合剤の具体例としてはポリビニルピロリ ドンおよび ヒ ドロキシプロピルメチルセルロースを、 崩壊剤の具体例としてはナトリウム澱 粉ダリコレ一トおよびクロスポビドンを、 滑沢剤の具体例としてはステアリン酸 マグネシウムおよびステアリルフマル酸ナトリゥムを挙げることができる。  In Formulation Example 3 above, specific examples of the diluent Z filler include microcrystalline cellulose, lactose and starch, specific examples of the binder include polyvinylpyrrolidone and hydroxypropylmethylcellulose, and specific examples of the disintegrant Examples thereof include sodium starch daricolate and crospovidone, and specific examples of the lubricant include magnesium stearate and sodium stearyl fumarate.
製剤例 4 (経口用懸濁液)  Formulation Example 4 (Oral suspension)
化合物 ( I ) 1—4 Omg  Compound (I) 1-4 Omg
沈殿防止剤 0. 1 - 1 Omg  Precipitating agent 0.1-1 Omg
希釈剤 20 - 6 Om g  Diluent 20-6 Om g
保存剤 0. 0 1 - 1. Omg  Preservatives 0.0 1-1.Omg
ノくッファー pH約 5— 8まで  Knuffer pH up to 5-8
共溶媒 0-4 Omg  Cosolvent 0-4 Omg
フレーバー 0. 0 1 - 1. Omg  Flavor 0.0 1-1. Omg
着着色色剤剤 0. 00 1— O. l mg  Coloring agent 0.000 1— O. l mg
上記製剤例 4において、 沈殿防止剤の具体例としてはキサ: 微 結晶セルロースを、 希釈剤の具体例としてはソルビトール溶液、 典型的には水を、 保存剤の具体例としては安息香酸ナトリウムを、 バッファーの具体例としてはク ェン酸塩を、 共溶媒の具体例としてはアルコール、 プロピレングリコール、 ポリ エチレングリコールおよびシクロデキストリンを挙げることができる。 In Formulation Example 4 above, specific examples of the suspending agent include oxalate: microcrystalline cellulose, specific examples of the diluent include sorbitol solution, typically water, and specific examples of the preservative include sodium benzoate. Specific examples of the buffer include citrate, and specific examples of the co-solvent include alcohol, propylene glycol, and polystyrene. Mention may be made of ethylene glycol and cyclodextrin.
試験例  Test example
1. 試験材料と試験方法  1. Test materials and test methods
1 -1. 試験材料  1 -1. Test materials
試験化合物としてのゥリジン 5'—ォクチルホスフェート ( I : R CgHi Peridine 5'-octyl phosphate (I: R CgHi
7) (UMPC8) 、 ゥリジン 5'—ドデシルホスフェート (I : R = C12H2 5) (UMPC 12) 、 ゥリジン 5'—エイコシルホスフェート (I : R = C2 。H41 (UMPC20) 、 ゥリジン 5'—テトラコシルホスフェート (I : R = C24H49) (UMPC 24) およびアデノシン 5' キサデシルホス フェート (AMPC 16) は、 それぞれ、 製造例の方法に準じて合成した。 7) (UMPC8), Urijin 5'-dodecyl phosphate (I: R = C 12 H 2 5) (UMPC 12), Urijin 5'eicosyl phosphate (I: R = C 2 .H 41 (UMPC20), Urijin 5′-Tetracosyl phosphate (I: R = C 24 H 49 ) (UMPC 24) and adenosine 5′-xadecyl phosphate (AMPC 16) were respectively synthesized according to the method of Production Example.
血小板凝集誘導剤としての 1 キサデシル— 2—ァセチル— s n—グリセ口 一 3—ホスホコリン (PAF) は、 Bachem F einchemikalien AG (B ubendorf, S witzerland)力 ら購入したものを使用した。  1-xadecyl-2-acetyl-sn-glycerol-1-phosphocholine (PAF) as a platelet aggregation inducer was purchased from Bachem Feinchemikalien AG (Bubendorf, Switzerland).
カルシウム一イオン透過担体 「A23187」 、 ゥシ血漿由来トロンビン、 ァ ラキドン酸、 ノ ノレミチン酸、 へキサデシルアルコール、 アデノシン 5'—ジホス フェート (ADP) 、 ィオノマイシンカルシウム塩およびゥシ血清アルブミン (BSA fraction V, 必須脂肪酸を含まない) は、 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) の製品を用いた。 ヌクレオシド 5' —アルキルホ スフ ト化合物および脂質は、 クロロホルム一メタノール一水の展開溶媒系で シリカゲル 60Hプレートを用いた薄層クロマトグラフィ一により単一スポット を示すか、 あるいは、 メタノール一水ーァセトニトリルの溶媒系で ODSカラム を用いた高速液体クロマトグラフィーにより単一ピークを示すものを用いた。 フ ラ 2 AMとフラ 2は、 同仁 (熊本、 日本) の製品を用いた。 塩酸べラパミル、 1 2—ミ リスチン酸 13—酢酸ホルボール (PMA) 、 フイコール-ハイパーク液、 および塩化ピアシナノールは、 それぞれ和光純薬 (東京、 日本) 、 Research B iochemicals International (Natick, MA, USA) 、 アマシャム - ファノレ マシア ·バイオテク (東京、 日本) およびナカライテスタ (京都、 日本) から入 手した。 溶媒は全ての試薬が特級である。  Calcium ion-permeable carrier “A23187”, blood plasma-derived thrombin, arachidonic acid, nonoremitic acid, hexadecyl alcohol, adenosine 5′-diphosphate (ADP), ionomycin calcium salt, and blood serum albumin (BSA) (fraction V, free of essential fatty acids) used a product of Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Nucleoside 5'-alkylphospho compounds and lipids show single spots by thin-layer chromatography on silica gel 60H plate in a developing solvent system of chloroform / methanol / water, or a solvent system of methanol / water / acetonitrile. The one showing a single peak by high performance liquid chromatography using an ODS column was used. For Fura 2 AM and Fura 2, products from Dojin (Kumamoto, Japan) were used. Verapamil hydrochloride, 12-myristate 13-phorbol acetate (PMA), Ficoll-Hypaque solution, and piacinanol chloride are respectively available from Wako Pure Chemicals (Tokyo, Japan) and Research Biochemicals International (Natick, MA, USA) , Amersham-Fanore Macia Biotech (Tokyo, Japan) and Nakarai Testa (Kyoto, Japan). Solvents are of all grades.
ヌクレオシド 5 ' —アルキルホスフエ一ト化合物の機能としての臨界ミセル濃 度 (CMC) は、 塩化ピナシァノール色素の可視吸収スペクトル (595nm) を 測定することにより決定した (Nunn, CCら、 J. Phys. Chem. , 86, 3271 - 3272 (1982) ) 。 Critical micelle concentration as a function of nucleoside 5'-alkylphosphate compounds The degree (CMC) was determined by measuring the visible absorption spectrum (595 nm) of the pinassanol chloride dye (Nunn, CC et al., J. Phys. Chem., 86, 3271-3272 (1982)).
バッファ一糸且成は、 次のとおりである : (1) 基本タイロード (Tyrode) 液: NaCl 8.01 g/L、 KC1 0. 195 g/L、 Mg Cl2 6 H20 0. 21The buffers are as follows: (1) Basic Tyrode solution: NaCl 8.01 g / L, KC1 0.195 g / L, MgCl 2 6 H 2 0 0.21
5g/L、 NaHC03 1.02 g/L, グルコース 1.◦ 1 g/L、 pH 7.2 ; (2) Ca2+を含まず EDTAを含んだタイロード /ゼラチン:バッファー (1) と同じであるが、 ゼラチン (2.5g/L) と Na2 EDTA (0.373 g/L) を含む、 pH6. 5 ; (3) C a 2 +を含んだタイロード Zゼラチン:バッ ファー (1) と同じであるが、 CaCl2 2H20 (0. 143 g/L) を含む、 pH 5g / L, NaHC0 3 1.02 g / L, glucose 1.◦ 1 g / L, pH 7.2 ; (2) Tyrode containing EDTA free of Ca 2+ / gelatin: Same as buffer (1) PH 6.5 containing gelatin (2.5 g / L) and Na 2 EDTA (0.373 g / L); (3) Tyrode Z gelatin containing Ca 2+ : same as buffer (1), Containing CaCl 2 2H 20 (0.143 g / L), pH
7.2; (4) HE PE S— EDTAを含む緩衝性生理食塩水: HE PES 1. 0 Og/L, NaCl 8.01 g/L, KC1 0. 195 g/L, デキストロース 1. 01 g/L, Na2 EDTA 0. 373 g/L, pH7.4。 7.2; (4) HE PE S—buffered saline containing EDTA: HE PES 1.0 Og / L, NaCl 8.01 g / L, KC1 0.195 g / L, dextrose 1.01 g / L, Na 2 EDTA 0.37 g / L, pH 7.4.
ゥサギ血小板の調製:プラスチック容器やシリコン処理したガラス製容器が全 ての血小板の調製と刺激実験に用いられた。 洗浄されたゥサギの血小板は、 スガ タ二らの方法 (J.Biol. Chem., 262卷、 5740頁、 1987年) を一部修正 して調製した。 それぞれ 45mL分のゥサギ血液を、 5mLの 4 ImM クェン酸一 8 5mM クェン酸三ナトリゥム— 2%グルコース溶液中で加え、 170 gで 10分 間遠心分離した。 血小板が豊富な血漿である上清多血小板血漿 (platelet-rich plasma: PRP) は、 1 OmLのフイコール一ハイパーク液で下層にし、 750 g で 20分間遠心分離した。 血小板層は、 0. ImMの EDTAを含んだ 4 OmLの H E P E S—緩衝性生理食塩水 (pH7.2) と穏やかに混合し、 0. 2mLのフィ コール一ハイパーク液に重層し、 750 gで、 10分間遠心分離した。 再び、 血 小板層を 0. 1 mMの EDTAを含んだ 40 mLの H E P E S—緩衝性生理食塩水 (pH7. 2) で懸濁し、 750 gで 10分間遠心分離した。 血球は、 0. 1 mM ゥ Preparation of heron platelets: Plastic containers and siliconized glass containers were used for all platelet preparation and stimulation experiments. The washed egret platelets were prepared by partially modifying the method of Sugata et al. (J. Biol. Chem., 262, 5740, 1987). Forty-five milliliters of each rabbit's blood was added in 5 mL of 4 ImM citrate-185 mM trisodium citrate—2% glucose solution, and centrifuged at 170 g for 10 minutes. Platelet-rich plasma (PRP), a platelet-rich plasma, was sublayered with 1 OmL of Ficoll-Hyperk solution and centrifuged at 750 g for 20 minutes. The platelet layer was mixed gently with 4 OmL of HEPES-buffered saline (pH 7.2) containing ImM EDTA, overlaid with 0.2 mL of Ficoll-Hyperk solution, and dried at 750 g. And centrifuged for 10 minutes. Again, the platelet layer was suspended in 40 mL of HEPS-buffered saline (pH 7.2) containing 0.1 mM EDTA and centrifuged at 750 g for 10 minutes. Blood cells are 0.1 mM
EDTAを含んだタイロード/ゼラチン (pH6.5) で、 1.0 X 109 cells/mLとなるように懸濁した。 The cells were suspended in Tyrode / gelatin (pH 6.5) containing EDTA at a concentration of 1.0 × 10 9 cells / mL.
1-2. 試験方法  1-2. Test method
(血小板凝集試験) 血小板 (1 X 108 cells, 400 し) は、 1 mM Ca2 + を含んだタイロード Zゼラチン緩衝液中で刺激を受け、 活性化される。 凝集活性は、 凝集測定器 (N ikko Hematracer, PAT- 2 A) を使って、 光透過の変化として測定される。 0.05 %ェタノール一 0.005 %ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に 溶解させたゥリジン 5'—アルキルホスフエ一トゃ生理食塩水に溶解させたベラ パミルは、 特に示さない場合は、 P A F等の刺激剤を添加する 1分前に、 反応系 に添加される。 ただし、 グアノシン 5' -0- (3—チォトリホスフェート)(Platelet aggregation test) Platelets (1 × 10 8 cells, 400 cells) are stimulated and activated in Tyrode Z gelatin buffer containing 1 mM Ca 2 +. Aggregation activity is measured as a change in light transmission using an aggregometer (Nikko Hematracer, PAT-2A). Verizin 5'-alkylphosphate dissolved in physiological saline containing 0.05% ethanol-0.005% dimethylsulfoxide Verapamil dissolved in physiological saline is a stimulant such as PAF unless otherwise indicated. One minute before adding, it is added to the reaction system. However, guanosine 5'-0- (3-thiotriphosphate)
(GTP γ S) により誘発される血小板凝集に対する試験では、 膜非透過性であ る GTP γ Sを効果的に血小板サイトゾルの中へ送達させるために、 血小板をサ ポニン (3. 3 μ g/mL) と 1分間インキュベートし、 予め血小板の膜透過性を高 めておいた。 血小板凝集阻害の割合は、 [ (コントロール反応一阻害反応) Zコ ントロール反応] X 100で計算する。 I C5。は、 添加量—反応量曲線の回帰 分析によって得られる。 In a test for platelet aggregation induced by (GTPγS), platelets were converted to saponin (3.3 μg) to effectively deliver the membrane-impermeable GTPγS into the platelet cytosol. / mL) for 1 minute to increase platelet membrane permeability in advance. The ratio of platelet aggregation inhibition is calculated by [(control reaction-inhibition reaction) Z control reaction] × 100. IC 5. Is obtained by regression analysis of the addition amount-reaction amount curve.
( [3H] acetyl— PAFとの結合性)  ([3H] acetyl— binding to PAF)
0. 1 %の B S Aおよび ImMの C a 2 +を含有するタイロード一ゼラチン緩衝 液 (pH7. 2) 中で、 血小板 (2. 5 X 108cells/mL) を UMP C 16 (1 X 1 0— 5M) と 1分間インキュベートした後、 37°Cで [3H] acetyl— PA F ( 1 X 1 0— 9M) を添加した。 結合試験は、 ポリプロピレンチューブ中で 行った。 3分間インキュベーションした後、 400 の血小板を取り出し、 5 0 /xLのジブチルフタレート/ジォクチルフタレート混液 (3 : 1、 V/V) を 積層し、 遠心分離 (10, 000 X g、 60秒) により懸濁培地から分離した。 続いて、 400 μ Lの 0. 1 %B S ΑΖ生理食塩液で洗浄した。 血小板ペレツト は、 300 |iLの 1 % (w/v) トリ トン X_ 100液に再懸濁し、 血小板結合放射 活性を液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。 特異的結合は、 1 00 0倍 量の過剰の非ラベル P A Fの存在下、 または非存在下における [3H] acetyl—Platelets ( 2.5 × 10 8 cells / mL) were plated with UMP C16 (1 × 1) in Tyrode-1 gelatin buffer (pH 7.2) containing 0.1% BSA and ImM Ca 2+. after incubation 0- 5 M) and 1 min before the addition of [3H] acetyl- PA F (1 X 1 0- 9 M) at 37 ° C. Binding tests were performed in polypropylene tubes. After incubation for 3 minutes, remove 400 platelets, layer 50 / xL dibutyl phthalate / dioctyl phthalate mixture (3: 1, V / V), and centrifuge (10,000 Xg, 60 seconds) From the suspension medium. Subsequently, the cells were washed with 400 μL of 0.1% BS saline solution. The platelet pellet was resuspended in 300% iL of 1% (w / v) Triton X-100 solution, and the platelet-bound radioactivity was measured using a liquid scintillation counter. Specific binding was determined by the presence of [3H] acetyl- in the presence or absence of a 100-fold excess of unlabeled PAF.
PAF結合との差として計算した。 Calculated as difference from PAF binding.
(サイトゾル中の遊離カルシウム濃度の測定)  (Measurement of concentration of free calcium in cytosol)
0. 1 ra の E D T Aを含んだ H EPE S—緩衝性生理食塩水 ( p H 7.4 ) 中に 懸濁したゥサギ血小板 ( 1 X 109 cells/mL) は、 1 X 10— 6Mのフラ 2—ァ セトキシメチルエステルと、 37 C45分間ィンキュベートして細胞内に取り込 ませ、 細胞外色素を取り除くために 1度洗浄した。 0. ImM EDTAを含んだ タイロード/ゼラチン緩衝液 (pH6.5) で 1 X 109 cells/mL濃度となるよ うに再懸濁した。 この血小板懸濁液 (0.48mL) を、 丸底試験管に分取し、 外 液中の Ca2+ ([C a 2+]。) 濃度が ImMとなるように CaCl2を添加した。 Containing EDTA for 0. 1 ra H EPE S- buffered saline (p H 7.4) Usagi platelets suspended in (1 X 10 9 cells / mL ) is the 1 X 10- 6 M Hula 2 —A The cells were incubated with ethoxymethylester at 37 C for 45 minutes to allow intracellular uptake, and washed once to remove extracellular dye. 0. The cells were resuspended in Tyrode / gelatin buffer (pH 6.5) containing ImM EDTA to a concentration of 1 × 10 9 cells / mL. This platelet suspension (0.48 mL) was collected in a round-bottom test tube, and CaCl 2 was added so that the Ca 2+ ([C a 2+ ]) concentration in the external solution became ImM.
その後、 これらのサンプルは、 特注のキュベットホルダーに移し、 記録計を備 えた日本分光 (東京、 日本) 蛍光分光光度計 CAF— 100中に設置し、 37°C に保温した。 試験管内の磁石を回転させ、 絶えず細胞を攪拌した。 少なくとも 5 分間 37 °Cに保った後、 細胞は、 0.0 ImMの前述した濃度のゥリジン 5'—アル キルホスフェートで 1分間、 次いで、 0.0 lmLの前述した濃度の凝集惹起物質 を添加することにより、 活性化した。 フラ 2蛍光は、 340nm (F 340) と 3 8 Onm (F 380) (それぞれ誤差 ± 5nm) の励起波長で連続的に測定した。  These samples were then transferred to a custom-made cuvette holder, placed in a JASCO (Tokyo, Japan) equipped with a recorder and fluorescence spectrophotometer CAF-100 and kept at 37 ° C. The magnet in the test tube was rotated to constantly agitate the cells. After holding at 37 ° C for at least 5 minutes, the cells are incubated with the above-mentioned concentration of lysine 5'-alkyl phosphate at 0.0 ImM for 1 minute and then with 0.0 lmL of the above-mentioned concentration of the aggregation-inducing substance. Activated. Hula 2 fluorescence was measured continuously at excitation wavelengths of 340 nm (F 340) and 38 Onm (F 380), each with an error of ± 5 nm.
[C a 2+] iの測定は、 相当する発光シグナル (500 ± 1 Onm) を、 R 340 /380と表す比シグナル (F 340ZF 380) と同様に計測した。 [ Ca2 + ] i was measured by measuring the corresponding luminescence signal (500 ± 1 Onm) in the same manner as the ratio signal (F340ZF380) represented as R340 / 380.
細胞内 C a 2+濃度 [C a 2+] iは、 次の式から算出できる (G. Grynkiewicz et al. , J. Biol. Chem. , 260卷、 3440頁、 1985年) 。 The intracellular Ca 2+ concentration [C a 2+ ] i can be calculated from the following equation (G. Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem., 260, 3440, 1985).
[C a 2 ] i = K d X B X [ (R-Rmin) / (Rmax-R) ] [C a 2 ] i = K d XBX [(R-Rmin) / (Rmax-R)]
ただし、 K d : C a 2 +に対するフラ 2の解離定数で、 in vivoでは 224nMと 仮定する式から算出できる (G. Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem., 2 60卷、 3440頁、 1985年) ; B : C a 2 +を含んだ溶液中での F 38However, it is the dissociation constant of Hula 2 with respect to K d: C a 2 + , and can be calculated from the formula assuming 224 nM in vivo (G. Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem., 260, 3440, 1985); B: F 38 in a solution containing Ca 2+
0に対する C a 2 +を含まない溶液中での F 380の割合; R: F 340/F 380で表される蛍光比; Rmax: 20% TritonX-100を 0.01 mL添カ卩し、 細 胞を溶解したときの細胞内フラ 2による最大発光シグナル値; Rrain: Rmaxの 測定後、 1 5 OmM Tris/450mM EGTAを0.0 lmL添カ卩し、 Ca 2 +を除去し たときの発光シグナル値。 Ratio of F380 in a solution containing no Ca2 + to 0; R: Fluorescence ratio expressed as F340 / F380; Rmax: Add 0.01 mL of 20% TritonX-100 to the mixture, and clarify the cells. The maximum luminescence signal value due to intracellular fura 2 when lysed; Rrain: the luminescence signal value when 15 lOmM Tris / 450mM EGTA was added with 0.0 lmL after Rmax measurement and Ca2 + was removed.
いずれの実験も、 それぞれの阻害剤について 3〜4回測定した。 また、 血小板 反応蛍光、 色素の漏れおよび蛍光標識の影響を最小限に止めるために、 実験を 1 時間以内に完了するように設定した。  In each experiment, three to four measurements were made for each inhibitor. The experiment was set to be completed within one hour to minimize the effects of platelet reaction fluorescence, dye leakage, and fluorescent labeling.
データ表示:表や図に示した結果は、 調整した血小板を分離して用い、 とも 2回行った実験を表し、 特別の場合を除き、 複数回の平均値 (士平均の範 囲) を提供している。 Data display: The results shown in the tables and figures are based on the use of Both represent two experiments, and provide the average of multiple experiments (the range of the average) unless otherwise specified.
2. 試験結果  2. Test results
2— 1. 血小板凝集を惹起する PAFに対する UMPC 16の効果  2— 1. Effect of UMPC 16 on PAF that induces platelet aggregation
PAFに対する血小板凝集に対する UMPC 16の投与量に依存的な効果を、 図 1に示す。 すなわち、 図 1は、 血小板凝集を惹起する PAFに対する UMPC 16の効果を示す図であって、 Aは凝集を惹起する PAFに対する UMPC 16 の異なった濃度における効果を示し、 Bは血小板凝集を惹起する P A Fに対する UMPC 16とパルミチン酸の投与量依存的効果の比較を示し、 Cは種々の濃度 の PAFによる血小板凝集に対する UMPC 16の阻害活性を示す。  The dose-dependent effect of UMPC 16 on platelet aggregation on PAF is shown in FIG. That is, FIG. 1 shows the effect of UMPC 16 on PAF which induces platelet aggregation, where A shows the effect of UMPC 16 on different concentrations of UMPC 16 on PAF which induces aggregation, and B shows the effect of platelet aggregation. FIG. 4 shows a comparison of the dose-dependent effects of UMPC 16 and palmitic acid on PAF, and C shows the inhibitory activity of UMPC 16 on platelet aggregation by various concentrations of PAF.
図 1の Aにおける a〜f は、 次の実験条件を示す。 すなわち、 lm CaCl2を 含んだタイ口一ド Zゼラチン緩衝液 ( p H 7. 2) 中の洗浄ゥサギ血小板 ( 1 X 108 cells, 0. 38mL) を、 2.0 %エタノール一 2.0 %ジメチルスルホキ シドを含んだ生理食塩水に溶解した UMP C 16 (指示された濃度) ( 10 μ L) と、 1分間プレインキュペートし (a) 、 その後 0. 1 %B S Aを含んだ生 理食塩水に溶解した PAF (10 ^ L) (最終濃度 8 X 10 HM) に、 2分間 (PAF刺激により最大反応が得られる時間) 、 暴露した (b) 。 血小板凝集の 阻害率を上記の方法により計算し、 結果を複数個の平均値で示した (土平均値 の範囲) 。 cは媒介物のみ、 dは 6 X 10— 6M、 eは 8 X 10-6M、 f は I X 10— 5Mの場合を示す。 A to f in A of Fig. 1 indicate the following experimental conditions. Briefly, washed rabbits (1 X 10 8 cells, 0.38 mL) in tie-mouthed Z-gelatin buffer (pH 7.2) containing lm CaCl 2 were replaced with 2.0% ethanol-2.0% dimethyl sulfoxide. Pre-incubate with UMP C16 (10 μL) (10 μL) dissolved in saline containing saline for 1 minute (a), and then add it to saline containing 0.1% BSA. Exposure to dissolved PAF (10 ^ L) (final concentration 8 x 10 HM) for 2 minutes (time to maximize response with PAF stimulation) (b). The inhibition rate of platelet aggregation was calculated by the above method, and the results were shown as multiple average values (range of soil average values). c is the mediator only, d is 6 X 10- 6 M, e is 8 X 10- 6 M, f represents the case of IX 10- 5 M.
図 1の Aに示すように、 UMPC 16は、 8 X 10 M PAFによる血小 板の形態、 変化を抑制しなかったが、 血小板凝集を阻害した。 UMPC 16によ る凝集阻害は、 UMPC 16と PAFの濃度に依存した (図 1の Bと C参照) 。 一方、 1〜 10 μΜ濃度のパルミチン酸 (UMP C 16のアルキルの一部から成 る) は、 PAFによる血小板凝集を抑制しなかった (図 1の Β) 。  As shown in FIG. 1A, UMPC 16 did not inhibit platelet morphology and changes caused by 8 × 10 M PAF, but inhibited platelet aggregation. Aggregation inhibition by UMPC 16 was dependent on UMPC 16 and PAF concentrations (see Figure 1, B and C). On the other hand, palmitic acid (consisting of a part of the alkyl of UMP C16) at a concentration of 1 to 10 μΜ did not inhibit platelet aggregation by PAF ((in Fig. 1).
2-2. 血小板凝集を惹起する PAF、 トロンビン、 ァラキドン酸、 ADP、 A23187および PMAに対する UMPC 16の効果  2-2. Effects of UMPC 16 on PAF, thrombin, arachidonic acid, ADP, A23187 and PMA that induce platelet aggregation
UMPC 16による血小板凝集阻害は、 PAFに対してのみ惹起されるのか検 討するために、 種々の凝集惹起物質に対する UMPC 16の効果を試験した。 す なわち、 2— 1 (図 1) の場合と同様に、 血小板 (1 X 108 cells, 0. 38 mL) を 1分間 UMPC 16とプレインキュペートし、 その後凝集惹起物質 (10 μ L) 、 すなわち 0. 1%B SAを含んだ生理食塩水に溶解した PAF (最終濃 度 8 X 10— ΗΜ) 、 生理食塩水に溶解したトロンビン (最終濃度 0.02 U/mL) 、 4%エタノールを含んだ生理食塩水に溶解したァラキドン酸 (最終濃度To examine whether the inhibition of platelet aggregation by UMPC 16 is induced only on PAF, the effect of UMPC 16 on various aggregation-inducing substances was examined. You That is, as in the case of 2-1 (Fig. 1), platelets (1 x 10 8 cells, 0.38 mL) were pre-incubated with UMPC 16 for 1 minute, followed by an aggregation-inducing substance (10 μL), That is, it contained PAF (final concentration 8 × 10-ΗΜ) dissolved in physiological saline containing 0.1% BSA, thrombin (final concentration 0.02 U / mL) dissolved in physiological saline, and 4% ethanol. Arachidonic acid dissolved in saline (final concentration
2 X 1 0- 5M) 、 生理食塩水に溶解した ADP (最終濃度 2.5 X 1 0- 5M) 、 4 %ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解した A 23187 (最終濃 度 2 X 10"7M) および 4%エタノールを含んだ生理食塩水に溶解した PMA (最終濃度 2 X 10- 8M) に、 それぞれ 2分、 4分、 2分、 2分、 4分および 30分間 (媒介物の存在下、 凝集惹起物質で刺激することにより最大反応が得ら れる時間) 、 暴露した。 血小板凝集の阻害率は、 上記方法で計算し、 結果を複数 個の平均値で、 図 2に示した (土平均値の範囲) 。 2 X 1 0- 5 M), ADP ( final concentration dissolved in saline 2.5 X 1 0- 5 M), A 23187 ( final concentration of 2 X 10 dissolved in inclusive saline 4% dimethyl sulfoxide "to 7 M) and 4% ethanol and dissolved in physiological saline containing PMA (final concentration 2 X 10- 8 M), 2 min each, 4 minutes, 2 minutes, 2 minutes, 4 minutes and 30 minutes (mediated The maximum response was obtained by stimulating with an aggregating substance in the presence of a substance.) The inhibition rate of platelet aggregation was calculated by the above method, and the results were averaged for multiple samples. Indicated (range of soil average).
図 2から明らかなように、 血小板凝集を惹起するトロンビン、 ァラキドン酸、 ADPは、 血小板凝集を惹起する PAFと同様に UMPC 16により明らかに抑 制された。 阻害の強さは、 凝集惹起物質と UMPC 16の濃度に依存した。 凝集 を惹起する PAF (8 X 10— "M) 、 トロンビン (0.02UZmL) 、 ァラキ ドン酸 (2 X 1 0— 5M) および ADP (2.5 X 10— 5M) に対する I C50値は、 それぞれ 2.4 X 10一6 M、 5.4 X 1〇- 6M、 2. 1 X 10_6Mおよび 2. 2 X 10— 6Mであった (データを示さず) 。 反対に、 2 X 10— SMから 2 X 10— 7 Mの濃度の A23187による血小板凝集と、 2 X 10— 9Mから 2 X 10— 7M の濃度の PMAによる血小板凝集は、 1 X 10— 5Mの UMPC 16により阻害 されなかった。 これらの結果は、 UMP C 16が P AFの刺激のみならず、 受容 体を介した刺激を阻害するが、 A23187により惹起される細胞外カルシウム の流入や、 プロテインキナーゼ C経路の活性化には影響を及ぼさなかったことを 示している。 As is evident from FIG. 2, thrombin, arachidonic acid, and ADP, which induce platelet aggregation, were clearly suppressed by UMPC 16, as was PAF, which caused platelet aggregation. The strength of the inhibition was dependent on the concentrations of the agglutinogen and UMPC16. PAF to induce aggregation (8 X 10- "M), thrombin (0.02UZmL), the IC 50 value for Araki Dong acid (2 X 1 0- 5 M) and ADP (2.5 X 10- 5 M) , respectively 2.4 X 10 one 6 M, 5.4 X 1_〇- 6 M, 2. (data not shown) was 1 X 10 _6 M and 2. 2 X 10- 6 M. Conversely, from 2 X 10- S M and platelet aggregation by A23187 concentration of 2 X 10- 7 M, platelet aggregation by PMA concentration of 2 X 10- 7 M from 2 X 10- 9 M is not inhibited by UMPC 16 of 1 X 10- 5 M These results indicate that UMP C16 inhibits not only PAF stimulation but also receptor-mediated stimulation, but that A23187-induced extracellular calcium influx and protein kinase C pathway activation. Indicates that it had no effect.
また、 UMPC 16の濃度依存効果を図 3に示す。 実験の結果、 UMPC 16 は、 PAF、 トロンビン、 ァラキドン酸、 ADPおよび GTP γ Sにより誘導さ れる血小板凝集を濃度依存的に阻害することが明らかとなった。  FIG. 3 shows the concentration-dependent effect of UMPC16. As a result, UMPC 16 was found to inhibit platelet aggregation induced by PAF, thrombin, arachidonic acid, ADP and GTPγS in a concentration-dependent manner.
なお、 GTPy S (最終濃度 2 X 10— 5M) により誘発される血小板凝集に 対する試験では、 膜非透過性である GTP γ Sを効果的に血小板サイ トゾルの中 へ送達させるために、 UMPC 16 (最終濃度 1 X 10— 5M) でプレインキュ ペートされた後、 サポニン (3. 3 μ g/mL) と 1分間インキュベートされ、 予め 血小板の膜透過性を高めた。 Incidentally, the platelet aggregation induced by GTPy S (final concentration 2 X 10- 5 M) In against test, for delivery into the effective platelet cyclic Tozoru the GTP gamma S is a membrane-impermeant, after being Pureinkyu Pies with UMPC 16 (final concentration 1 X 10- 5 M), saponin (3 3 μg / mL) for 1 minute to increase platelet membrane permeability in advance.
図 3の a〜cは、 それぞれ、 指示された濃度の UMP C 16とのプレインキュ ペート (a) 、 サポニンとのインキュベート (b) (GTPy S実験のみ) 、 お よび各種ァゴニス トの曝露 (c) を示す。 また、 ( ) 内の数字は、 UMPC 1 6の相対濃度を示す。 すなわち、 (0) は、 媒介物のみのデータを表している。  Figures 3a-c show preincubate with indicated concentrations of UMP C16 (a), incubation with saponin (b) (GTPy S experiments only), and exposure to various agonists (c), respectively. Is shown. The numbers in parentheses indicate the relative concentration of UMPC16. That is, (0) represents data only for vehicles.
2-3. 血小板凝集を誘発する PAFとトロンビンに対するヌクレオシド 5' - アルキルホスフェート化合物 ( I )の阻害効果  2-3. Inhibitory effect of nucleoside 5'-alkylphosphate compound (I) on platelet aggregation-induced PAF and thrombin
各種ヌクレオシド 5' —アルキルホスフェート化合物 (1)、 すなわち UMP C8、 UMPC 12、 UMP C 16 s UMP C 20 , UMPC24および AMP C 16の血小板凝集阻害作用を調べた。 すなわち、 2.0%エタノール一 2. 0% ジメチルスルホキシドを含む生理食塩水に溶解した所定濃度の UMP C 8、 UM PC 12、 UMP C 16 , UMP C 20、 UMP C 24または AMP C 16 ( 1The inhibitory effect of various nucleoside 5'-alkyl phosphate compounds (1), namely, UMP C8, UMPC 12, UMP C 16 s UMP C 20, UMPC24 and AMP C 16, on platelet aggregation was examined. That is, UMP C8, UMPC12, UMPC16, UMPC20, UMPC24 or AMPC16 (1) of a predetermined concentration dissolved in a physiological saline containing 2.0% ethanol-2.0% dimethyl sulfoxide.
0 /i L) を、 ImM CaCl2含有タイロード Zゼラチン緩衝液 (pH7.2) 中の 血小板 (1 X 108 cells, 0. 38 mL) に 1分間暴露し、 その後 0. 1%BSA を含む生理食塩水に溶解した PAF (最終濃度 8 X 10- UM) (A) または生 理食塩水に溶解したトロンビン (最終濃度 0 · 02 U/mL) (B) に、 それぞれ 2 分または 4分間暴露する。 血小板凝集の阻害率を、 上記した方法により計算し、 結果を図 4に複数個の平均値で示した (土平均値の範囲) 。 0 / i L) was exposed to platelets (1 X 10 8 cells, 0.38 mL) in Tyrode Z gelatin buffer (pH 7.2) containing ImM CaCl 2 for 1 minute, and then 0.1% BSA was added. PAF (final concentration 8 x 10-UM) dissolved in saline (A) or thrombin (final concentration 0.02 U / mL) dissolved in saline (B) for 2 or 4 minutes, respectively. Expose. The inhibition rate of platelet aggregation was calculated by the method described above, and the results are shown in FIG. 4 as a plurality of average values (range of soil average values).
図 4の Aや Bから明らかなように、 これらのヌクレオシド 5' —アルキルホス フエ一ト化合物 ( I)は P A Fやトロンビンによる血小板凝集に影響を及ぼす。 極頭基のメチレン鎖の長さを引き延ばした C 16や C 20を含むヌクレオシド 5 アルキルホスフェート類は、 血小板凝集を惹起する PAFを PAF刺激に対 する阻害が報告 (K. D. Newman et al. , J. Clin. Invest. , 61巻、 395頁、 1978年; T. C. Lee et al. , Arch. Biochem. Biophys. , 223卷、 33頁、 1983年; F. H. Valone et al., Thromb. Res. , 40卷、 385頁、 198 5年) されているカルシウムチャネル阻害剤であるべラパミルより強く阻害した c つまり、 1 X 10— 5Mの UMP C 16と 1 X 10_5Mのベラノ、。ミルは、 それぞ れ対照試験に対し、 8 X 10— HM PAFによる凝集を 0%および 19 %抑制 した。 8 X 1 0— HM P AFに対する UMPC 16の凝集阻害の I C5。値 (2. 4X 10— 6M) は、 UMPC 20の I C50値 (2.2 X 10一6 M) と同程度で あった。 さらに、 UMPC 16と UMPC 20は、 PAFだけでなく、 トロンビ ンの凝集も同様に抑制した。 As is clear from FIGS. 4A and 4B, these nucleoside 5′-alkylphosphate compounds (I) affect platelet aggregation by PAF and thrombin. Nucleoside 5 alkyl phosphates containing C16 and C20, which have a longer methylene chain in the pole group, have been reported to inhibit platelet aggregation-induced PAF from PAF stimulation (KD Newman et al., J. Clin. Invest., 61, 395, 1978; TC Lee et al., Arch. Biochem. Biophys., 223, 33, 1983; FH Valone et al., Thromb. Res., 40, P. 385, 198 5) c , which inhibited calcium channel inhibitor verapamil more strongly That, 1 X 10- 5 M of UMP C 16 and 1 X 10_ 5 M of Berano. The mill inhibited the aggregation by 8 × 10-HM PAF by 0% and 19%, respectively, compared to the control test. 8 X 1 0- HM P IC 5 aggregation inhibition UMPC 16 for AF. Value (2. 4X 10- 6 M) was comparable with an IC 50 value of UMPC 20 (2.2 X 10 one 6 M). In addition, UMPC 16 and UMPC 20 inhibited not only PAF but also thrombin aggregation.
また、 AMPC 16は、 8 X 10— UMの PAFで誘発される血小板凝集を阻 害した (I C50値: 8. 7 X 10— 6M) 。 Further, AMPC 16 has impaired inhibitory platelet aggregation induced by 8 X 10- UM of PAF (IC 50 values: 8. 7 X 10- 6 M) .
2—4. 凝集を惹起する PAFに対する UMPC 16の阻害作用の特徴 次に、 UMPC 16により惹起された血小板凝集阻害が、 ベラパミルで見られ たのと同様に、 補足のカルシウムにより元に戻るかどうかを調べた。 すなわち、 ImM又は 1 OmMの CaCl2を含んだタイロード Zゼラチン緩衝液 (pH7. 2) 中 の血小板 (1 X 1 08 cells, 0.38 mL) を、 2. 0 %エタノール一 2. 0 %ジ メチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解した UMP C 16 (最終濃度 1 X 1 0— 5M) ( 1 0 μ L) と 1分間プレインキュベーションした後、 0. 1 %Β2-4. Characteristics of the inhibitory effect of UMPC 16 on PAF that induces aggregation Next, whether platelet aggregation inhibition induced by UMPC 16 is restored by supplemental calcium, similar to that seen with verapamil Was examined. Specifically, platelets (1 × 10 8 cells, 0.38 mL) in Tyrode Z gelatin buffer (pH 7.2) containing ImM or 1 OmM CaCl 2 were mixed with 2.0% ethanol / 2.0% after preincubation UMP C 16 dissolved in physiological saline and (final concentration 1 X 1 0- 5 M) ( 1 0 μ L) 1 minute containing methyl sulfoxide, 0. 1% beta
S Αを含む生理食塩水に溶解した P A F (最終濃度 8 X 10— 1 に 2分間暴 露した。 血小板凝集の阻害率は、 上記した方法により計算し、 結果を図 5に複数 個の平均値として示した (士平均値の範囲) 。 And violence dew 2 minutes PAF (final concentration 8 X 10- 1 was dissolved in physiological saline containing S Alpha. Inhibition of platelet aggregation was calculated by the aforementioned method, the results plurality pieces of average values in FIG. 5 (Range of average value).
図 5から理解できるように、 血小板の懸濁液中で、 ImMから 1 OmMの範囲で力 ルシゥム濃度を増加させたところ、 P AFの凝集惹起に対する UMP C 16によ る阻害は元に戻らなかった。 逆に、 補足 CaCl2濃度を 1 OmMにすると PAFに よる血小板凝集誘発の程度は、 72 %に減少した。 As can be seen from Fig. 5, when the concentration of calcium in the platelet suspension was increased from ImM to 1 OmM, the inhibition of PAF aggregation by UMP C16 was not reversed. Was. Conversely, at a supplemental CaCl 2 concentration of 1 OmM, the extent of PAF-induced platelet aggregation was reduced to 72%.
さらに、 UMPC 16は、 PAFの添加後でも効果があるのか調べるために、 血小板凝集に対する UMPC 16の添加時間の影響を試験した。 すなわち、 UM PC 16または対照試験用の溶媒を、 8 X 10— 8Mの PAF添加前後の指定さ れた時間に血小板に添加し、 血小板凝集の阻害率を上記方法により計算し、 結果 を図 6に複数個の平均値として示した (土平均値の範囲) 。 8 X 10— の P A Fを添加する前に 1分間 1 X 10— 5Mの UMP C 16とインキュベートした だけでなく、 8 X 10— 1 の P AFと同時に 1 X 10— 5Mの UMP C 16を添 加した場合も、 PAFによる凝集が 100%阻害された。 一方、 UMPC 16を PAFの添加後 10秒、 30秒および 1分経過した後の血小板に添加すると、 血 小板凝集は、 それぞれ、 対照試験に対し 29%、 42%および 75%程度となつ た (図 6) 。 これらの所見は、 UMPC 16がべラパミル同様に脱凝集を引き起 こし、 PAFより後に添加した場合でさえ、 PAF刺激に対する阻害効果があつ たことを示している。 In addition, the effect of UMPC 16 addition time on platelet aggregation was tested to determine if UMPC 16 was effective after addition of PAF. That is, UMPC16 or a solvent for control test was added to platelets at specified times before and after the addition of 8 × 10-8 M PAF, the platelet aggregation inhibition rate was calculated by the above method, and the results were plotted. Figure 6 shows multiple averages (range of soil averages). 8 X 10- well were incubated with 1 minute 1 X 10- 5 M UMP C 16 of prior to the addition of PAF of, 8 X 10- 1 of P AF simultaneously 1 X 10- 5 M of UMP C 16 With When added, aggregation by PAF was inhibited 100%. On the other hand, when UMPC 16 was added to platelets 10 seconds, 30 seconds and 1 minute after PAF addition, platelet aggregation was approximately 29%, 42% and 75%, respectively, compared to the control test. (Figure 6). These findings indicate that UMPC 16 caused disaggregation like verapamil and had an inhibitory effect on PAF stimulation even when added after PAF.
2-5. 受容体を介した血小板凝集に対する UMP C 16の阻害活性の特徴 カルシウム拮抗剤であるェコナゾールによるカルシウム流入阻害は、 0. 3% (w/v) の B S Aを添加することにより復元することが知られている。 そこで、 血小板凝集を誘発する PAFに対する UMPC 16の阻害活性に対する B S Aの 作用について検討した。  2-5. Characteristics of inhibitory activity of UMP C16 on receptor-mediated platelet aggregation The inhibition of calcium influx by econazole, a calcium antagonist, is restored by the addition of 0.3% (w / v) BSA It is known. Therefore, the effect of BSA on the inhibitory activity of UMPC 16 on PAF, which induces platelet aggregation, was examined.
ImMの塩化カルシウムを含有するタイロード—ゼラチン緩衝液 (pH7. 2) 中のゥサギ血小板 (2. 5 X 108cells/mL) を UMPC 16 ( 1 X 1 0— 5M) と 1分間プレインキュペートした後、 PAF (1 X 1 0—9M) を加えて 2分間 インキュベートし、 生理食塩液に溶解させた B S A (最終濃度 0. 3% (w/Tyrode containing calcium chloride ImM - gelatin buffer (. PH 7 2) Usagi platelets in (2. 5 X 10 8 cells / mL) a UMPC 16 (1 X 1 0- 5 M) and 1 minute Pureinkyu after Pies, PAF was incubated (1 X 1 0- 9 M) were added for 2 minutes, BSA (final concentration 0.3% dissolved in saline (w /
V ) ) または生理食塩液を血小板に添加した。 3分後、 UMPC 16を添加しな 力つたものと添加したものとの血小板凝集の程度は、 それぞれ 58. 3 ±6. 5%、 12. 5 ±6. 5%であった。 この結果は、 UMPC 16による P A F の阻害は、 0. 3%B SAの添加により復元しないということを示している。 また、 血小板懸濁液中の C a 2+濃度を 1から 1 OmMにまで上昇させても、 UV))) or saline was added to the platelets. Three minutes later, the degree of platelet aggregation in the case where UMPC 16 was added and the case where UMPC 16 was added were 58.3 ± 6.5% and 12.5 ± 6.5%, respectively. This result indicates that the inhibition of PAF by UMPC 16 is not restored by the addition of 0.3% BSA. Also, increasing the Ca 2+ concentration in the platelet suspension from 1 to 1 OmM
MPC 16による血小板凝集を誘発する PAFの阻害は復元しなかった。 このこ とは、 UMPC 16がカルシウムキレート作用を有しないことを示している。 一方、 血小板 (2. 5 X 108cells/mL) を 1 X 10— 5Mの UMP C 16と 1 0秒、 30秒、 1分および 2分間プレインキュペートした後 1 X 10— 9Mの P AFを添加すると、 血小板凝集はコントロールに比較して、 それぞれ 85. 7The inhibition of PAF, which induces platelet aggregation by MPC 16, was not restored. This indicates that UMPC 16 has no calcium chelating action. On the other hand, platelets (2. 5 X 10 8 cells / mL) of 1 X 10- 5 M UMP C 16 and 1 0 seconds, 30 seconds, 1 X 10- 9 M after pre incubator adipate 1 minute and 2 minutes When PAF was added, platelet aggregation was 85.7
± 14. 3%、 56. 0± 15. 5% 47. 6±4. 7 %及び 17. 9 ±2. 1%であった (図 7) 。 これらの所見は、 UMPC 16による阻害活性の強さは 血小板との反応時間に依存することを示している。 They were ± 14.3%, 56.0 ± 15.5%, 47.6 ± 4.7% and 17.9 ± 2.1% (Fig. 7). These findings indicate that the strength of the inhibitory activity by UMPC 16 depends on the reaction time with platelets.
UMPC 16がァゴニストと受容体の結合を阻害しているかどうかを調查する ために、 血小板に結合する [3H] acetyl— PAFに対する UMPC 16の作用 を検査した。 PAFは、 ゥサギ血小板と特異的あるいは非特異的に結合する。 P A Fの特異的結合は、 UMPC 16により有意に阻害されなレ、。 1 X 1 0— 9M の PAFの特異的結合は、 1 X 1 0— 5Mの UMPC 16の非存在下および存在 下でそれぞれ 1. 9±0. 9および 1. 5±0. 2fmol/l 08cellsであり、 PDetermine if UMPC 16 inhibits agonist-receptor binding To this end, the effect of UMPC 16 on [3H] acetyl-PAF binding to platelets was examined. PAF specifically or nonspecifically binds to egret platelets. PAF specific binding was not significantly inhibited by UMPC16. 1 X 1 0- 9 specific binding of PAF of M is, 1 X 1 0- 5 M, respectively in the absence and presence of UMPC 16 of 1. 9 ± 0. 9 and 1. 5 ± 0. 2fmol / l 0 8 cells, P
A Fの非特異的結合は、 1 X 1 0— 5Mの UMPC 16の非存在下および存在下 でそれぞれ 9. 4± 1. 4及び 8. 3±0. 3fmol/ 108cellsであった。 Nonspecific binding of AF were respectively 9. 4 ± 1. 4 and 8. 3 ± 0. 3fmol / 10 8 cells in the absence and presence of 1 X 1 0- 5 M of UMPC 16.
2-6. [Ca2+] i反応を誘発する PAF、 トロンビン、 AD Pおよびィォ ノマイシンに対する UMP C 16の作用 2-6. Effects of UMP C16 on PAF, thrombin, ADP and ionomycin that induce [Ca 2+ ] i response
[Ca2+] i反応を誘発するァゴニストに対する UMPC 16の作用を調べる ため、 UMPC 16や溶媒を 37 °Cの温水中で、 直接血小板と 1分間、 プレイン キュベーシヨンした。 最大反応は、 溶媒の存在下で、 PAFの刺激により測定し た。 添加を指示したのは、 溶媒 (a) 、 PAF (b、 8 X 10 HM) 、 UMP C 16 (c、 1 X 10 - 5M) 、 0. 05U/mLのトロンビン、 2· 5 X 10— 5Μ の AD Ρおよびィオノマイシン (d、 4X 1— 8M) を添加した。 結果は、 少な くとも 4回行った実験の代表例を、 図 8に示す。 To examine the effect of UMPC 16 on the agonist inducing the [Ca 2+ ] i response, UMPC 16 and a solvent were directly incubated with platelets in warm water at 37 ° C for 1 minute. Maximal response was determined by PAF stimulation in the presence of solvent. Was instructed added, the solvent (a), PAF (b, 8 X 10 HM), UMP C 16 (c, 1 X 10 - 5 M), 0. 05U / mL thrombin, 2 · 5 X 10- 5 AD of AD Ρ and ionomycin (d, 4 × 1-8 M) were added. The results are shown in FIG. 8, representative of at least four experiments.
各図において、 Aは媒介物のみ、 Bは UMPC 16添加のデータを示す。 また、 a〜(:は、 それぞれ、 媒介物とのプレインキュペート (a) 、 指示された濃度の UMPC 16とのプレインキュベ一ト (b) 、 および各種ァゴニストの曝露 (c) を示す。 その結果、 UMPC 16は、 PAF、 トロンビン、 および ADP による [C a 2+] iを阻害した。 In each figure, A shows data of vehicle alone, and B shows data of UMPC 16 addition. In addition, a to (: indicate preincubate with the vehicle (a), preincubate with the indicated concentration of UMPC 16 (b), and exposure to various agonists ( c ), respectively. As a result, UMPC 16 inhibited [ Ca2 + ] i by PAF, thrombin, and ADP.
血小板内カルシウム濃度を変化させる P A Fやトロンビン、 ADP、 ィオノマ イシンに対するベラパミルと UMPC類の効果を比較した。 すなわち、 血小板 (109 cells/mL) を、 溶媒、 ベラパミル (最終濃度 1 X 10— または U MPC類 (最終濃度 1 X 10- 5M) と、 上記 2. 4 (図 6) に記載したように、We compared the effects of verapamil and UMPCs on PAF, thrombin, ADP, and ionicomasin, which alter platelet calcium concentration. That is, as a platelet (10 9 cells / mL), the solvent, and verapamil (final concentration 1 X 10- or U MPC compound (final concentration 1 X 10- 5 M), as described above 2.4 (Fig. 6) To
1分間、 インキュベート、 処理した後、 PAF (最終濃度 4 X 10 ゃト ロンビン (最終濃度 0. 05U/mL) 、 ADP (最終濃度 2. 5 X 10— 5M) 、 ィオノマイシン (最終濃度 4 X 10— 8Mまたは 1. 6 X 10 7M) に暴露した。 最大 [C a 2+] i レベルは、 上記したように、 フラー 2蛍光で測定した。 結果は、 4-6回行つた測定結果の平均値土 S Dとして表 1に示す。 1 minute, incubated, after treatment, PAF (final concentration 4 X 10 Yato thrombin (final concentration 0. 05U / mL), ADP (final concentration 2. 5 X 10- 5 M), Ionomaishin (final concentration 4 X 10 — 8 M or 1.6 X 10 7 M) The maximum [C a 2+ ] i levels were measured with Fuller 2 fluorescence as described above. Table 1 shows the average value of the measurement results for 4-6 times.
その結果、 PAF、 トロンビンおよび ADPにより誘発される [C a 2つ i 増加は、 1 X 10— 5Mの UMPC 16により阻害 (コントロールに比較してそ れぞれ 65%、 34%、 78%) された。 As a result, PAF, i increase [C a 2 one induced by thrombin and ADP are compared to their respective 65% in inhibition (Control by UMPC 16 of 1 X 10- 5 M, 34% , 78% ) Was done.
上昇 [Ca 2+] i ァゴニスト 食塩水 ベラパミル UMPC16 阻害率 n %Elevated [Ca 2+ ] i agonist saline verapamil UMPC16 inhibition n%
PAF (8X10— 474.7±30.3 199·8±67.3 167.4± 17.9*** 65 トロンビン(0.05U/mL) 182.1± 18.6 N. D. 120.4± 13.6** 34 ADP (2.5X10— 5M) 118.1± 12.4 N. D. 26.4±3.2*** 78 PAF (8X10- 474.7 ± 30.3 199 · 8 ± 67.3 167.4 ± 17.9 *** 65 thrombin (0.05U / mL) 182.1 ± 18.6 ND 120.4 ± 13.6 ** 34 ADP (2.5X10- 5 M) 118.1 ± 12.4 ND 26.4 ± 3.2 *** 78
8M) 204.9± 14.4 N.D. 230.1 ±9.5 0 8M) 204.9 ± 14.4 N.D. 230.1 ± 9.5 0
(1.6X10— 7M) 756.0± 94.4 N.D. 789.5 ±149.0 0 **、 ***は、 コントロール群 (媒介物のみ) との有意差 pく 0.01、 pく 0.001を示す。 (1.6X10- 7 M) 756.0 ± 94.4 ND 789.5 ± 149.0 0 **, *** indicates a significant difference p rather 0.01, p rather 0.001 with the control group (vehicle only).
N. D. :実施せず N. D .: Not implemented
この結果から、 UMP C 16は、 [Ca2+] iを誘発する PAF、 トロンビン および ADPの作用を減弱させるが、 [Ca2 + ] iを誘発するィオノマイシンの 作用を減弱させないことが理解できる (図 8、 表 1) 。 UMPC 16による受容 体を介する [Ca 2+] iの阻害は 100%ではなかったが (図 8、 表 1) 、 血小 板凝集の阻害は 100%であった。 このことは UMPC 16による [Ca 2+] i 応答の阻害が、 受容体を介する C a 2 +流入を阻害することにより起こったこと を示している。 ImMの細胞外カルシウムの存在下において、 未刺激血小板の平均 [Ca2+] i力;52.0± 18.4ηΜ (η=15) であり、 UMP C 16はこの値 を変化させなかった。 8 X 10 1 の P AFを添カ卩すると、 血小板 [Ca2+] i は 474. 7±74. 2 nMに上昇するが、 UMPC 16は、 この PAFによ る [Ca2+] iの上昇を減弱させた。 UMPC 16による [Ca2+] i反応の阻害 の程度は、 ベラパミルによるものより高かったが (表 1) 、 血小板凝集阻害の様 式は、 よく似ていた。 This result, UMP C 16 is, PAF to induce [Ca 2+] i, but attenuate the action of thrombin and ADP, it can be seen that not attenuate the effects of Ionomaishin to induce [Ca 2 +] i ( Figure 8, Table 1). Receptor-mediated inhibition of [Ca 2+ ] i by UMPC 16 was not 100% (Figure 8, Table 1), but platelet aggregation was inhibited by 100%. This is due to UMPC 16 [Ca 2+] i inhibition of the response have shown that happened by inhibiting C a 2 + influx through the receptor. In the presence of ImM extracellular calcium, the mean [Ca 2+ ] i force of unstimulated platelets; 52.0 ± 18.4ηΜ (η = 15), and UMP C16 did not change this value. Platelet [Ca 2+ ] i increases to 477.7 ± 74.2 nM when 8 × 10 1 P AF is added, but UMPC 16 shows that [PA 2+ ] i The rise was attenuated. Although the degree of inhibition of the [Ca 2+ ] i response by UMPC 16 was higher than by verapamil (Table 1), the manner of platelet aggregation inhibition was very similar.
3. 試験結果の解析  3. Analysis of test results
上記試験結果は、 UMPC 16力 PAFだけでなく、 血小板凝集を惹起する トロンビン、 ァラキドン酸および ADPをも投与量依存的に直接阻害し、 その阻 害は血小板活性化を惹起する PAFに限局したものでないことを示している (図 1および 2) 。 UMPC化合物のうち、 UMPC 16は、 血小板活性化に対する 阻害効果が UMPC 8や UMPC 12よりも強い。 また、 AMP C 16も血小板 凝集阻害活性を示した (図 3) 。 ァラキドン酸は、 ホスホリパーゼ C経路の活性 を誘発すると考えられているェンドペルォキシドゃトロンボキサン A2を経てシ クロォキシゲナーゼゃトロンボキサン A 2シンテターゼにより代謝される。 P A F、 トロンビン、 トロンボキサン A2および ADPによる刺激は、 受容体を介し て伝達され、 40— kD aのタンパク質リン酸化を惹起する、 プロテインキナー ゼ Cシステムと関連しているホスホリパーゼ Cの活性化を誘発する。 UMPC 1 6は、 これら受容体を介した刺激による血小板凝集や、 [Ca2— ] iの変化を誘 発する PAFの作用を阻害した (図 2と 8および表 1) 。 The above test results show that, in addition to UMPC 16-force PAF, thrombin, arachidonic acid and ADP, which induce platelet aggregation, are directly inhibited in a dose-dependent manner, and the inhibition is limited to PAF, which induces platelet activation (Figures 1 and 2). Of the UMPC compounds, UMPC 16 has a role in platelet activation The inhibitory effect is stronger than UMPC 8 or UMPC 12. AMP C16 also exhibited platelet aggregation inhibitory activity (Fig. 3). Arakidon acid is metabolized by cyclo O key Shige kinase Ya thromboxane A 2 synthetase via the E command peroxide O sulfoxide Ya thromboxane A 2, which is thought to induce the activity of phospholipase C pathway. PAF, thrombin stimulation by thromboxane A 2 and ADP is transmitted through the receptor to elicit a protein phosphorylation 40- kD a, activation of phospholipase C associated with protein kinase C system Trigger. UMPC 16 inhibited the action of PAF, which induces platelet aggregation and [Ca 2 —] i changes induced by stimulation through these receptors (Figures 2 and 8 and Table 1).
血小板懸濁液中のカルシウム濃度の増加は、 UMPC 16の PAFに対する凝 集誘発の阻害を回復させず (図 5) 、 これは、 ベラパミルの活性様式とは相違す る。 他の所見は、 好中球におけるベラパミルの阻害効果が、 単にカルシウムの流 入を阻害するためだけでなく、 ベラパミルにより活性化されたプロティンキナー ゼ C酵素に対する直接的な阻害活性もまたあるということを示している。 一方、 UMPC 16は、 カルシウムイオン透過担体であり、 血小板凝集を惹起する A 2 Increasing the calcium concentration in the platelet suspension did not reverse the inhibition of UMPC 16 from inducing aggregation on PAF (Figure 5), which differs from the mode of activity of verapamil. Another finding is that the inhibitory effect of verapamil on neutrophils is not only to inhibit calcium flux, but also to have a direct inhibitory activity on the protein kinase C enzyme activated by verapamil. Is shown. On the other hand, UMPC 16 is a calcium ion permeable carrier and induces platelet aggregation A 2
3187や [Ca2 + ] iを変化させるィオノマイシンの作用を阻害しなかった(図 2と 8)。 さらに、 UMPC 16は、 血小板凝集を惹起する PMAを阻害しな かった(図 2) 。 一方、 UMPC 16は、 血小板凝集を誘発する GTP y Sを阻 害した (図 3) 。 グァニンヌクレオチド結合タンパク質 (Gタンパク質) は、 受 容体と膜イオンチャネルの活性を含む関連反応をつなぐと考えられている。 した がって、 UMPC 16力 Gタンパク質受容体とつながつている C a 2 +チヤネ ノレに拮抗することが明らかになった。 PMAは、 血小板において、 40k D aのタ ンパク質をリン酸化するプロテインキナーゼ Cを直接活性化させ、 細胞外 Ca2^ を必要としない。 It did not inhibit the action of ionomycin, which alters 3187 and [Ca 2 + ] i (Figures 2 and 8). Furthermore, UMPC 16 did not inhibit PMA, which causes platelet aggregation (Figure 2). On the other hand, UMPC 16 inhibited GTPyS, which induces platelet aggregation (Fig. 3). Guanine nucleotide binding proteins (G proteins) are thought to link receptors and related reactions, including the activity of membrane ion channels. Therefore, it was revealed that UMPC 16 antagonizes Ca 2+ channel linked to G protein receptor. PMA directly activates protein kinase C in platelets, which phosphorylates the 40 kDa protein, and does not require extracellular Ca 2 ^.
図 6で示したように、 あらかじめ PAFで凝集された血小板に添加したとき、 As shown in Figure 6, when added to platelets previously aggregated with PAF,
1 X 10—5Mの濃度の UMPC 16は、 凝集を阻害できる。 すなわち、 脱凝集 を引き起こす。 ベラパミルは、 40 - kDaや 20— kDaのタンパク質のリン 酸化を元に戻すことにより、 P A Fで凝集した血小板に脱凝集を引き起こすと報 告されてきた (G. Bonadonna et al. , Thromb. Heamos. , 56卷、 308頁、 1 986年) 。 我々は、 ゥサギ血小板に結合する PAFの動態についての研究で、 P AFにより完全に凝集された血小板は、 受容体に対する PAFの量が減少する と同時に、 脱凝集が見られる、 つまり、 血小板凝集を維持するために、 受容体に P AFの結合が必要であるということを示していることを解明している。 UMPC 16 concentration of 1 X 10- 5 M can inhibit aggregation. That is, it causes disaggregation. Verapamil has been reported to reverse phosphorylation of 40-kDa and 20-kDa proteins, causing disaggregation of PAF-aggregated platelets (G. Bonadonna et al., Thromb. Heamos. , 56 volumes, 308 pages, 1 986). In a study of the dynamics of PAF binding to egret platelets, platelets completely agglutinated by PAF showed disaggregation at the same time as the amount of PAF for the receptor decreased, meaning that platelet aggregation was observed. It is elucidated that this indicates that PAF binding is required for the receptor to be maintained.
以上、 UMPC 16の活性様式は、 受容体に特異的に結合する凝集惹起物質を 介するカルシウム流入を阻害したり、 カルシウムチャンネル阻害剤であるべラパ ミノレと同様に、 凝集惹起物質の結合を阻害することによるものであると考えるこ とが出来る。 なお、 細胞内カルシウムに依存する反応の阻害は、 血小板反応に対 する UMPC 16の阻害活性に影響を与える可能性が考えられる。 結論として、 UMPC 16は、 血小板反応を介する受容体をべラバミルより効果的に阻害する ということができる。  As described above, the mode of activity of UMPC 16 inhibits calcium influx through an aggregation-inducing substance that specifically binds to a receptor, and inhibits the binding of an aggregation-inducing substance, like the calcium channel inhibitor verapaminole. It can be thought that this is due to the fact. In addition, it is considered that inhibition of the reaction dependent on intracellular calcium may affect the inhibitory activity of UMPC 16 on the platelet response. In conclusion, it can be said that UMPC 16 more effectively inhibits receptors through the platelet response than veravamil.
ヌクレオシド 5' —アルキルホスフェート化合物は、 ァゴニスト (PAF、 ト ロンビン、 ァラキドン酸、 ADP、 GTP γ S) の血小板受容体への結合を阻害 しなかった。 よって、 UMPC 16は、 受容体に拮抗しないことがわかる。 また、 培地中のカルシウム濃度を上昇させても、 ヌクレオシド 5' —アルキル ホスフエ一ト化合物の PAF阻害作用は復元しなかった。 よって、 ヌクレオシド 5 ' —アルキルホスフェート化合物は、 カルシウムキレート作用は有しない。 ヌクレオシド 5' —アルキルホスフェート化合物は、 受容体を介した細胞内力 ルシゥム濃度増加を 100%阻害しなかったが、 血小板凝集は 100%阻害した こと力ゝら、 ヌクレオシド 5' —アルキルホスフェート化合物は、 受容体作動性の カルシウムチャネルを阻害していることが明らかとなった。  Nucleoside 5'-alkyl phosphate compounds did not inhibit the binding of agonists (PAF, thrombin, arachidonic acid, ADP, GTPγS) to platelet receptors. Thus, it can be seen that UMPC 16 does not antagonize the receptor. In addition, increasing the calcium concentration in the medium did not restore the PAF inhibitory effect of the nucleoside 5'-alkyl phosphate compound. Therefore, the nucleoside 5′-alkyl phosphate compound has no calcium chelating action. Nucleoside 5'-alkyl phosphate compounds did not inhibit the receptor-mediated increase in intracellular activity by 100%, but did inhibit platelet aggregation by 100%. It was found to be blocking body-operated calcium channels.
さらに、 ヌクレオシド 5' —アルキルホスフェート化合物は、 ィオノマイシン および Α23187を阻害せず、 PAF、 トロンビン、 ァラキドン酸、 ADP、 GTP γ Sによる細胞内カルシウム濃度上昇を阻害した。 よって、 カルシウム チャネル阻害剤であることが判った。 また、 PAF、 トロンビン、 GTP y Sを 阻害することから、 ヌクレオシド 5' —アルキルホスフェート化合物は Gタンパ ク質共役型受容体作動性力ルシゥムチャネルに拮抗していることがわかった。 ヌクレオシド 5 ' —アルキルホスフエ一ト化合物の PAF阻害作用の強さは、 添加時間に依存しており、 P AF添加の前に UMPC 16を添加した方が、 阻害 作用は強かった。 In addition, nucleoside 5'-alkyl phosphate compounds did not inhibit ionomycin and Α23187, but inhibited the increase in intracellular calcium concentration by PAF, thrombin, arachidonic acid, ADP, and GTPγS. Therefore, it was found to be a calcium channel inhibitor. In addition, the inhibition of PAF, thrombin, and GTPyS indicated that the nucleoside 5'-alkylphosphate compound antagonized the G-protein-coupled receptor-operating potentiocyte channel. The strength of the PAF inhibitory effect of nucleoside 5'-alkylphosphate compounds depends on the addition time, and it is better to add UMPC 16 before adding PAF The effect was strong.
B S Aの添加により血小板凝集阻害が元に戻らないことより、 ェコナゾールと は作用機序が異なっていると思われる。 また、 培地中のカルシウム濃度上昇によ り血小板凝集阻害が元に戻らないことより、 ベラパミノレとは作用機序が異なつて いると思われる。  Since the platelet aggregation inhibition is not reversed by the addition of BSA, the mechanism of action seems to be different from that of econazole. In addition, platelet aggregation inhibition is not reversed by an increase in the calcium concentration in the medium, suggesting that the mechanism of action is different from that of verapaminole.
以上記載したごとく、 本発明のヌクレオシド 5 '—アルキルホスフエ一ト化合 物 (I ) は、 カルシウム拮抗作用を有し、 特に細胞外液カルシウムの細胞内流入 阻止に基づくカルシウム拮抗作用を有することから、 心筋障害や不整脈発生の防 止に有効であり、 また優れた血小板凝集抑制作用を有することから、 血栓症、 塞 栓症または動脈硬化症の予防薬または治療薬として有用である。  As described above, the nucleoside 5′-alkylphosphate compound (I) of the present invention has a calcium antagonism, and particularly has a calcium antagonism based on the inhibition of extracellular fluid calcium from flowing into cells. It is effective in preventing cardiomyopathy and arrhythmia, and has an excellent inhibitory effect on platelet aggregation. Therefore, it is useful as a preventive or therapeutic agent for thrombosis, embolism or arteriosclerosis.

Claims

請 求 の 範 囲 式 I Scope of Claim Formula I
(式中、 Rは直鎖または分岐鎖状アルキ ル基を示し、 Bはヌクレオシドを構成する塩基を示す。 ) で表されるヌクレオシ ド 5 ' —アルキルホスフエ一ト化合物を有効成分とするカルシウム拮抗剤。 (In the formula, R represents a linear or branched alkyl group, and B represents a base constituting a nucleoside.) Calcium containing as an active ingredient a nucleoside 5′-alkylphosphate compound represented by the following formula: Antagonist.
2 . Bがゥリジンである、 請求項 1記載のカルシウム拮抗剤。  2. The calcium antagonist according to claim 1, wherein B is peridine.
3 . Bがアデノシンである、 請求項 1記載のカルシウム拮抗剤。  3. The calcium antagonist according to claim 1, wherein B is adenosine.
4 . Rが炭素数 3 0を超えないアルキル基である、 請求項 1〜3いずれか 1項 記載のカルシウム拮抗剤。  4. The calcium antagonist according to any one of claims 1 to 3, wherein R is an alkyl group having no more than 30 carbon atoms.
5 . Rが炭素数 4〜 2 4のアルキル基である、 請求項 4記載のカルシウム拮抗 剤。  5. The calcium antagonist according to claim 4, wherein R is an alkyl group having 4 to 24 carbon atoms.
6 . ヌクレオシド 5 ' —アルキルホスフェート化合物が遊離形または生体内で 遊離形を与え得る医薬的に許容される任意形で使用される、 請求項 1〜5のいず れか 1項記載のカルシウム拮抗剤。  6. Calcium antagonist according to any one of claims 1 to 5, wherein the nucleoside 5'-alkyl phosphate compound is used in free form or in any pharmaceutically acceptable form capable of giving the free form in vivo. Agent.
7 . 血小板凝集抑制剤として使用される、 請求項 1〜 6のレ、ずれか 1項記載の 、拮抗剤。  7. The antagonist according to claim 1, which is used as a platelet aggregation inhibitor.
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