WO2001090721A1 - Method and device for controlling the exchange of substances between a sample and the surrounding atmosphere thereof - Google Patents

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WO2001090721A1
WO2001090721A1 PCT/EP2001/005903 EP0105903W WO0190721A1 WO 2001090721 A1 WO2001090721 A1 WO 2001090721A1 EP 0105903 W EP0105903 W EP 0105903W WO 0190721 A1 WO0190721 A1 WO 0190721A1
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sample
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atmosphere
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PCT/EP2001/005903
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Ralph Müller
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Basf-Lynx Bioscience Ag
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    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
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    • B01L3/50851—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates specially adapted for heating or cooling samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
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    • G—PHYSICS
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    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G01N35/028—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations having reaction cells in the form of microtitration plates

Definitions

  • So-called genome expression profile analyzes are carried out to elucidate the molecular effects of potential drugs. An attempt is made to determine the genes actually expressed in a cell, since the associated proteins influence the development of the cell. One way to determine the proteins actually present is to determine the mRNA synthesized in the cell, since the proteins are formed from them.
  • isolated cells are disrupted.
  • the mRNA is isolated from the cells by suitable purification steps. Then it is usually translated into cDNA using the reverse transcriptase. This is usually amplified using linear PCR.
  • the cDNA is usually labeled radioactively or with dyes.
  • the cDNA obtained in this way is then z.
  • the wells are small wells with a volume per well of, for example, 20 ⁇ l.
  • Each well contains a known, specially synthesized DNA fragment.
  • the construction of a complete DNA array takes a few hours to a few days and is usually carried out in a closed chamber.
  • the pipetted DNA fragments are then immobilized on the slide, be it by a covalent crosslinking reaction or by simple adsorption.
  • the sample to be examined is then placed on the slide or the DNA array.
  • the sample contains radioactive or DNA-labeled DNA or RNA molecules.
  • the hybridization is awaited in a special hybridization chamber at a suitable temperature. Unhybridized DNA or RNA from the sample to be examined ⁇ is removed by rinsing. Hybridized DNA or RNA molecules are detected in a reader. Difficulties are encountered in the rapid evaporation of the solvents from the small volumes of the wells, which leads to a shift in concentration and thus a change in reaction conditions. During the pipetting process, some of the solvent can evaporate completely. DNA arrays with well-defined properties cannot be built in this way.
  • evaporation can be counteracted by cooling the microplate or nanotiter plate.
  • a low temperature of the microplate or nanotiter plate leads to condensation on the microplate or nanotiter plate. This causes liquid to enter the wells and the concentration of the solutions in the wells changes.
  • the reaction conditions for the construction of the DNA arrays change in an uncontrolled manner. With stronger condensation, it can even overflow Wells come, which means that the solutions in the individual wells sometimes mix. A DNA array can no longer be reliably built under these conditions.
  • WO 99/39829 describes a method for solving these problems by cooling the sample to the dew point of the vapor of the solvent in the surrounding atmosphere. Then there is hardly any evaporation or condensation.
  • the object of the invention is to control the mass transfer between a sample and the atmosphere surrounding the sample.
  • the sample can be a solution, e.g. B. DNA molecules in an aqueous buffer solution. It can also be any other solution.
  • the sample can be a solid, e.g. B. ice or PVC, the substance can exchange with the environment via sublimation.
  • the sample can also be a solid with particles distributed therein. H. dissolved substances and with its associated vapor pressure.
  • the substance that is exchanged is usually a solvent, such as water, aqueous buffer solution, alcohol or the like, with the associated vapor pressure.
  • a solvent such as water, aqueous buffer solution, alcohol or the like
  • evaporation There is a continuous exchange between the sample and the substance or its vapor by means of evaporation and condensation.
  • the concentration of steam in the surrounding atmosphere i.e. the partial pressure of the steam can be at most equal to the saturated steam pressure at the respective temperature. If the partial pressure exceeds the saturation vapor pressure, the excess is removed by condensation. This can occur, for example, on the sample if the temperature of the sample is so low that the saturation vapor pressure associated with the low sample temperature is below the instantaneous partial pressure of the vapor in the warmer atmosphere surrounding the sample. In such a situation, condensation occurs on the sample.
  • the temperature of the sample and the partial pressure of the steam above the sample are decisive for the question of whether evaporation or condensation occurs on the sample.
  • the temperature of the sample must be based on the dew point of the steam in the atmosphere surrounding the sample.
  • the dew point of the steam is the temperature at which the partial pressure of the steam is equal to the saturation steam pressure. If the temperature of the sample is above the dew point, effective evaporation occurs; if it is below this, condensation occurs.
  • the dew point can e.g. B. can be determined with a dew point hygrometer.
  • the dew point of the steam can also be determined by measuring the temperature of the surrounding atmosphere and the vapor pressure of the substance in the surrounding atmosphere. The dew point can be calculated from these two variables.
  • the vapor pressure can also be measured as a relative vapor pressure, for example as a relative humidity, ie as a percentage of the saturation vapor pressure.
  • the relative humidity can be measured, for example, with a hygrometer or other relative or absolute humidity sensors.
  • the (absolute) saturation vapor pressure of the substance in the atmosphere results from the temperature.
  • the partial pressure of the vapor results from the saturation vapor pressure of the substance and the relative vapor pressure. From this in turn, the dew point is obtained via suitable reference values. This can, for. B. are at 8 ° C.
  • the solvent vapor is decisive for determining the vapor pressure in the surrounding atmosphere.
  • the volume of the sample and / or the concentration of the dissolved substance and / or the amount of the substance dissolved in the sample is determined directly or indirectly.
  • weight loss can be determined. If parts of the sample are not taken, this can usually only be attributed to evaporation. In such a case, the temperature of the sample is above the dew point. If weight gain is observed, usually only condensation can take place. The temperature of the sample is then below the dew point.
  • the determination of volume, weight or concentration thus offers a further possibility of determining the dew point, namely as the temperature at which the volume, weight or concentration does not change. In this way, regulation around the dew point and mass transfer control is easily possible.
  • the various options for determining the dew point can be combined.
  • z. B. the temperature of the sample can be regulated in such a way that z. B. does not change the volume or weight of the sample. This results alternately in a mini male evaporation and minimal condensation, which cancel each other out in total.
  • a small sample of e.g. B. 20 ⁇ l in a well of a microtiter plate or a sample of less than one microliter in a nanotiter plate can be kept in the open atmosphere for at least three to four days by means of the method according to the invention; the concentrations of the substances in the sample remain constant during this time. Constant and reproducible conditions of the solutions in the wells are obtained over a long period of time. This also results in precisely defined quantities, e.g. B. the DNA fragments on a DNA array. A large DNA array can therefore be built up over several days under precisely defined conditions. These advantages are achieved with the simplest technical means. Disturbances in the environmental conditions, e.g. B. can be quickly compensated by opening the reaction chamber or the entire automation system.
  • the chamber in which the microplate or nanotiter plate is located is ventilated by a fan.
  • a targeted, slight evaporation can be set to concentrate the sample. To do this, the temperature of the sample is set slightly above the dew point.
  • the partial pressure of the steam should be below the saturation pressure, otherwise there would be no evaporation. comes because the surrounding atmosphere could no longer absorb any more steam.
  • Targeted condensation can also be brought about by adjusting the temperature of the sample below the dew point.
  • the temperature of the atmosphere based on the dew point of the vapor of the substance or the vapor pressure of the substance in the surrounding atmosphere can be adjusted based on the saturation vapor pressure.
  • the vapor pressure over the sample can be easily adjusted using an evaporator. In the simplest case, this is a hot plate under an open solvent container.
  • the method according to the invention can also be used to bring about a precisely defined entry of different solvents by building up the associated vapor pressures over the sample.
  • the method according to the invention is thus also able to pump, for. B. micropumps or piezoelectric pipetting heads on the technical basis of inkjet heads to replace.
  • the latter can dose about 100 pl.
  • the condensation control according to the invention by setting low partial pressures, small surfaces and short interaction times, almost any small amounts of solvent can be introduced or deposited on solid surfaces.
  • Wells can be filled with small amounts of solvents, concentrations can be changed and mixtures can be created.
  • mixed vapors with defined partial pressures can be produced.
  • various solvents such. B. can be provided in different wells of a micro- or nanotiter plate, or different solvents are evaporated in succession.
  • Reliable temporary storage of samples, in particular liquid samples or solutions, in open vessels, for example after completion of a reaction or a reaction sequence such as the PCR reaction can also be achieved with the method according to the invention.
  • the method according to the invention can also be used for coating substrates.
  • An alternative way of introducing liquid into the sample is to apply a mist of liquid to the sample.
  • the mist consists of small droplets, which are deposited on the surface of the sample and thereby introduce the liquid from the mist into the sample., - Furthermore, a mist increases the vapor pressure, since the vapor pressure is increased over the strongly curved surfaces of small droplets , In this way, for example, the mass, the volume or the concentration of the sample can be controlled and kept approximately constant.
  • the sample can also be diluted with a mist.
  • the temperature of the sample can be adjusted to the dew point of the solvent in the surrounding atmosphere.
  • Such a mist can be generated with an ultrasonic or piezo nebulizer, for example.
  • the mist can also be formed from a solvent with a substance dissolved in it. This means that a substance can also be added to the sample.
  • the substance can be, for example, a mononucleotide that is required for the synthesis of DNA. It is also possible with this method to introduce chemical components into the sample volume for example, a next reaction step can be triggered.
  • control variable is the volume of the sample and / or the concentration of the dissolved substance and / or the amount of the substance dissolved in the sample.
  • Controlled variables can be determined directly or indirectly in various ways.
  • any indirect measurement variable for the above-mentioned control variables volume, concentration and quantity is sufficient as a control variable. In principle, it is sufficient, e.g. B. only observe the weight of the sample.
  • the volume of the sample can be determined in different ways, e.g. B. by an optical measurement or by a capacitive or inductive measurement and by a vibration measurement.
  • the concentration of the dissolved substance can also. be determined by an optical measurement - for example an absorption or fluorescence measurement.
  • An electrical measurement for example a measurement of the impedance or the dielectric constant of the sample, is also conceivable for determining the concentration of the dissolved substance or the amount of the substance dissolved in the sample.
  • the device for carrying out the method according to the invention has a negative shape with depressions for the wells of the microplate or nanotiter plate for fast and precise control of the temperature of a microplate or nanotiter plate.
  • This form can e.g. B. made of aluminum or copper.
  • the mold itself is tempered by a temperature control device. It can be flushed with tempered, double-distilled water from a cryostat, or it can be cooled by a Peltier element or a combination of the two. Due to the close contact between the wells and the negative mold, the temperature of the sample can be controlled quickly and precisely. Further advantageous developments of the invention are characterized in the subclaims.
  • Fig. 1 is a schematic representation of a device for controlling the mass transfer between a sample and the atmosphere surrounding the sample.
  • FIG. 1 shows a microtiter plate 10 with wells 12, which is arranged on a copper negative mold 14 with depressions 15 for the wells 12. Above the microtiter plate 10 there is a pipetting robot 16, which applies solutions from the wells 12 of the microtiter plate 10 to a slide,... 18. In this way, a DNA array is built up on the slide 18.
  • a humidity and temperature sensor 20 In the atmosphere above the microtiter plate 10 there is a humidity and temperature sensor 20, which is connected to a microcontroller 22.
  • the microcontroller 22 calculates the dew point from the humidity and temperature data.
  • the microcontroller 22 also regulates the temperature of the microtiter plate 10 via a cryostat 24, with which it communicates via a line 26.
  • the cryostat 24 tempers the negative mold 14 with chilled water. The water is transported via an inlet 28 and a reflux 30 between the cryostat 24 and the negative mold 14.
  • the temperature of the microtiter plate 10 is also measured by a sensor 32.
  • the measurement signal is fed to the microcontroller 22 via a line 34.
  • the weight of the microtiter plate - together with the negative mold 14 - is monitored with a balance 36.
  • the Signals of the scale are also routed to the microcontroller 22 via a line (not shown).
  • the microcontroller 22 uses the balance 36 to observe whether changes in the weight of the microtiter plate 10 occur. If the weight decreases for no apparent reason (for example, removal of solution from the wells 12 of the microtiter plate 10), evaporation occurs. The microtiter plate is therefore too warm. Accordingly, the microcontroller 22 sends a signal to the cryostat 24 to lower the temperature of the microtiter plate.
  • the microcontroller 22 checks whether the temperature of the microtiter plate 10 is above the dew point. If this is the case, the microcontroller 22 sends a suitable control signal via the line 26 to the cryostat 24, which then lowers the temperature of the water accordingly in order to bring the microtiter plate 10 to the dew point.
  • the volume of the sample can in principle be determined by a relative measurement.
  • the wells 12 are filled in a spotting or pipetting step, which specifies a volume that is known with sufficient accuracy. The aim is then to maintain this predetermined volume, possibly less a desired discharge.
  • the volume of the liquid in a well 12 is preferably determined by an optical reflection measurement.
  • the deflection of a laser beam which is dependent on the fill heights of the respective well 12, is measured via a position-sensitive 4-quadrant diode.
  • a height resolution of approximately 10 nm can thus be achieved.
  • the volume can also be determined optically via the imaging properties of a lenticular, transparent liquid drop if this is used to image a plurality of lines. In the event of a change in the lumen of the drop there is an offset of the lines, from which the volume can be determined if the refractive index is known.
  • the volume can also be determined by various electrical measurements.
  • a capacitive measurement of the volume - with a known dielectric constant - the sample volume is brought into the electrical field of a capacitor.
  • the capacitance of the capacitor is then determined.
  • the volume can be used to infer the volume of the sample. For this purpose, for example, a spot can be placed on an electrically conductive surface as the sample volume.
  • a counter electrode is then aligned parallel to the conductive surface and brought up to it.
  • the weight of the sample or microtiter plate 10 can be measured with a precision balance with an accuracy of less than
  • Weight measurement can also be used to control the amount of a discharge by determining the difference between the weight before and after the discharge.
  • a mass determination by means of a vibration measurement is also possible. To do this, the sample is positioned on the surface of a body. The mass of the sample can then be determined by shifting the surface oscillation frequency.
  • the concentration of charged species in the solution can e.g. B. determine by an impedance measurement.
  • the impedance can be determined ion-selectively by varying the frequency of an applied AC voltage. The concentration of the individual ions results from the ion-selective impedance.
  • chromophores are present, their concentration can be determined by an absorption measurement. If fluorophores are also present, the concentration can be determined via a fluorescence measurement, preferably via a laser-induced fluorescence (LIF) measurement. Fluorophores can also be used to determine the volume. For this purpose, a fluorophore is artificially added to the volume. The sample as a whole is excited to fluoresce. Your brightness is determined. The volume can be inferred from the brightness using a calibration curve.
  • LIF laser-induced fluorescence
  • a nebulizer is used to refill the wells 12 when weight loss is detected.
  • a nebulizer alternatively also in an inkjet or piezo dispenser - droplets with volumes from a few picoliters to several nanoliters are generated.
  • the fog can be generated by excitation of a piezo actuator with low or high frequencies.
  • Liquid jets are broken down into quantifiable droplets in a highly reproducible manner.
  • the number of droplets can be precisely determined in the so-called single-shot mode, in which individual droplets are dispensed in a well-defined manner.
  • droplets can be generated thermally using the so-called bubble jet process.
  • the nebuliser is preferably set up in the immediate vicinity of the substance to be controlled, in particular when other areas are to be separated from the mist, which can be achieved by suitable barriers.
  • the nebulizer can also be placed further away from the microtiter plate 10 if the mist is to be distributed homogeneously over different samples.
  • the mist droplets can perform different tasks:
  • the droplets from the mist can be introduced into wells 12 or onto existing liquid droplets or particles. These can be present in various media, for example in solid or gel-like matrices or bound to surfaces or in the gas phase. In any case, the existing droplets are mixed with the droplets from the mist.
  • the droplets present can contain solutions, such as DNA in an aqueous buffer solution.
  • the fog can introduce new reaction partners to the existing solution. These can be, for example, nucleotides or DNA, RNA or PNA fragments of different lengths. It can also be amino acids, peptides and the whole variety of proteins, such as enzymes, etc. Accordingly, the solvents that make up the mist droplets must be varied accordingly: from water to aqueous solutions to polar or amphiphilic solvents.
  • the method according to the invention is not restricted to use on microplates or nanotiter plates. It can be used for samples of any shape. reference numeral
  • Microtiter plate corrugated copper negative form wells pipetting robot microscope slide humidity and temperature sensor microcontroller cryostat communication line inlet return flow temperature sensor communication line scale

Abstract

The inventive method can be used with all open samples or reaction chambers. It is particularly useful in the synthesis of DNA arrays for the conditioning of micro or nano titerplates with a number of small wells. The atmosphere surrounding the micro or nano titerplates contains water vapour and the wells contain aqueous solutions. Water is continuously transferred between the atmosphere and the solutions in the form of condensation and evaporation. In order to avoid either of these processes from impinging upon the other, the temperature of the sample is controlled in such a way that the weight of the sample, for example, remains constant. A micro or nano titerplate with solutions in the wells can thus be kept for several days in an open atmosphere, without any change occurring in the concentrations of the substances in the wells.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Steuern des Stoffaustausche zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden AtmosphäreMethod and device for controlling the mass exchange between a sample and the atmosphere surrounding the sample
BesehreibungBesehreibung
Zur Aufklärung der molekularen Wirkung von potentiellen Medikamenten werden sogenannte Genomexpressionsprofilanalysen durchgeführt. Dabei wird versucht, die tatsächlich in einer Zelle exprimierten Gene zu bestimmen, da die zugehörigen Pro- teine Einfluss auf die Entwicklung der Zelle nehmen. Eine Möglichkeit, die tatsächlich vorhandenen Proteine zu bestimmen, besteht darin, die in der Zelle synthetisierten mRNA zu bestimmen, da aus ihnen die Proteine gebildet werden.So-called genome expression profile analyzes are carried out to elucidate the molecular effects of potential drugs. An attempt is made to determine the genes actually expressed in a cell, since the associated proteins influence the development of the cell. One way to determine the proteins actually present is to determine the mRNA synthesized in the cell, since the proteins are formed from them.
Dazu werden isolierte Zellen aufgeschlossen. Durch geeigne- te Aufreinigungsschritte wird die mRNA aus den Zellen isoliert. Danach wird sie i. d. R. mittels der Reversen Transkriptase in cDNA übersetzt. Diese wird mit i. d. R. linearer PCR amplifiziert . Dabei wird die cDNA i. d. R. radioaktiv oder mit Farbstoffen markiert . Die so gewonnene cDNA wird an- schließend z. B. mit Hilfe von geeigneten DNA-Arrays qualitativ bzw. quantitativ analysiert. Bei der Analyse wird die Bindung bzw. Hybridisierung der gewonnenen DNA-Moleküle an geeignete, auf dem Array immobilisierte DNA-Fragmente detektiert. Hierzu bedarf es der Herstellung geeigneter DNA-Arrays . Diese werden i. d. R. ausgehend von Mikro- oder Nanotiterplatten hergestellt, die Lösungen mit geeigneten DNA-Fragmenten in den Wells enthalten. Die Wells sind kleine Vertiefungen mit einem Volumen pro Well von beispielsweise 20 μl . Jedes Well enthält ein bekanntes, speziell synthetisiertes DNA-Fragment . Zum Aufbau eines DNA-Arrays werden jeweils z. B. 220 pl Lösung aus einem Well auf eine genau definierte Position auf z. B. einem Objektträger (Slide) pipettiert. Dies wird von Robotern durchgeführt, sog. Spotting-Robotern. Der Aufbau eines kompletten DNA-Arrays dauert einige Stunden bis einige Tage und wird i. d. R. in einer abgeschlossenen Kammer durchgeführt.For this, isolated cells are disrupted. The mRNA is isolated from the cells by suitable purification steps. Then it is usually translated into cDNA using the reverse transcriptase. This is usually amplified using linear PCR. The cDNA is usually labeled radioactively or with dyes. The cDNA obtained in this way is then z. B. qualitatively or quantitatively analyzed with the aid of suitable DNA arrays. In the analysis, the binding or hybridization of the DNA molecules obtained to suitable DNA fragments immobilized on the array is detected. This requires the production of suitable DNA arrays. These are usually produced on the basis of micro- or nanotiter plates, which contain solutions with suitable DNA fragments in the wells. The wells are small wells with a volume per well of, for example, 20 μl. Each well contains a known, specially synthesized DNA fragment. To build a DNA array z. B. 220 pl solution from a well to a precisely defined position on z. B. pipetted a slide. This is done by robots, so-called spotting robots. The construction of a complete DNA array takes a few hours to a few days and is usually carried out in a closed chamber.
Die pipettierten DNA-Fragmente werden anschließend auf dem Slide immobilisiert, sei es durch eine kovalente Crosslinking- Reaktion oder durch einfache Adsorption.The pipetted DNA fragments are then immobilized on the slide, be it by a covalent crosslinking reaction or by simple adsorption.
Anschließend wird die zu untersuchende Probe auf das Slide bzw. das DNA-Array gegeben. Die Probe enthält - wie oben ausgeführt - radioaktiv oder mit Farbstoffen markierte DNA- oder RNA-Moleküle . In einer speziellen Hybridisierungskammer wird bei geeigneter Temperatur die Hybridisierung abgewartet. Nicht hybridisierte DNA oder RNA aus der zu untersuchenden Probe ~ wird durch Spülen entfernt. Hybridisierte DNA- oder RNA- Moleküle werden in einem Reader detektiert. Schwierigkeiten bereitet dabei die schnelle Verdunstung der Lösungsmittel aus den kleinen Volumina der Wells, wodurch es zu einer Konzentrationsverschiebung und damit zur Änderung von Reaktionsbedingungen kommt. Es kann während der Dauer des Pi- pettierens teilweise zu einer vollständigen Verdunstung des Lösungsmittels kommen. DNA-Arrays mit wohldefinierten Eigenschaften können so nicht aufgebaut werden.The sample to be examined is then placed on the slide or the DNA array. As stated above, the sample contains radioactive or DNA-labeled DNA or RNA molecules. The hybridization is awaited in a special hybridization chamber at a suitable temperature. Unhybridized DNA or RNA from the sample to be examined ~ is removed by rinsing. Hybridized DNA or RNA molecules are detected in a reader. Difficulties are encountered in the rapid evaporation of the solvents from the small volumes of the wells, which leads to a shift in concentration and thus a change in reaction conditions. During the pipetting process, some of the solvent can evaporate completely. DNA arrays with well-defined properties cannot be built in this way.
Der Verdunstung kann prinzipiell durch Kühlen der Mikro- oder Nanotiterplatte entgegengewirkt werden. Bei hoher Luftfeuchtigkeit führt eine niedrige Temperatur der Mikro- oder Nanotiterplatte jedoch zu Kondensation auf der Mikro- oder Nanotiterplatte. Dadurch kommt es zu einem Flüssigkeitseintrag in die Wells, und die Konzentration der Lösungen in den Wells ändert sich. Die Reaktionsbedingungen für den Aufbau der DNA- Arrays ändern sich dadurch in unkontrollierter Weise. Bei stärkerer Kondensation kann es sogar zu einem Überlaufen der Wells kommen, wodurch sich die Lösungen in den einzelnen Wells teilweise mischen. Ein DNA-Array kann unter diesen Bedingungen nicht mehr zuverlässig aufgebaut werden.In principle, evaporation can be counteracted by cooling the microplate or nanotiter plate. At high air humidity, however, a low temperature of the microplate or nanotiter plate leads to condensation on the microplate or nanotiter plate. This causes liquid to enter the wells and the concentration of the solutions in the wells changes. As a result, the reaction conditions for the construction of the DNA arrays change in an uncontrolled manner. With stronger condensation, it can even overflow Wells come, which means that the solutions in the individual wells sometimes mix. A DNA array can no longer be reliably built under these conditions.
WO 99/39829 beschreibt ein Verfahren zur Lösung dieser Probleme, indem die Probe auf den Taupunkt des Dampfs des Lösungsmittels in der umgebenden Atmosphäre gekühlt wird. Dann kommt es effektiv kaum noch zu einer Verdunstung oder Kondensation.WO 99/39829 describes a method for solving these problems by cooling the sample to the dew point of the vapor of the solvent in the surrounding atmosphere. Then there is hardly any evaporation or condensation.
Ähnliche Probleme stellen sich allgemein im Bereich minia- turisierter Reaktions-, Mischungs- und Lageraufgaben, die sich durch den verstärkten Einsatz von Mikro- und Nanotechnologie, etwa bei Nanotiterplatten etc., in der Bio- und Gentechnologie ergeben.Similar problems generally arise in the area of miniaturized reaction, mixing and storage tasks, which result from the increased use of micro and nanotechnology, for example in the case of nanotiter plates, etc., in biotechnology and genetic engineering.
Aufgabe der Erfindung ist es, den Stoffaustausch zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre zu steu- * ern.The object of the invention is to control the mass transfer between a sample and the atmosphere surrounding the sample.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Die Probe kann eine Lösung sein, z. B. DNA-Moleküle in einer wässrigen Pufferlösung. Es kann auch jede andere Lösung sein. Ferner kann die Probe ein Festkörper sein, z. B. Eis o- der PVC, der Stoff mit der Umgebung über Sublimation austauschen kann. Die Probe kann aber auch ein Festkörper mit darin verteilten, d. h. gelösten Substanzen und mit seinem zugehörigen Dampfdruck sein.This object is achieved by the inventions according to the independent claims. Advantageous developments of the inventions are characterized in the subclaims. The sample can be a solution, e.g. B. DNA molecules in an aqueous buffer solution. It can also be any other solution. Furthermore, the sample can be a solid, e.g. B. ice or PVC, the substance can exchange with the environment via sublimation. However, the sample can also be a solid with particles distributed therein. H. dissolved substances and with its associated vapor pressure.
Der Stoff, der ausgetauscht wird, ist üblicherweise ein Lösungsmittel, wie Wasser, wässrige Pufferlösung, Alkohol oder ähnliches, mit dem zugehörigen Dampfdruck. Zwischen der Probe und dem Stoff bzw. seinem Dampf findet ein kontinuierlicher Austausch mittels Verdampfen und Kondensation statt. Diese Prozesse sind von thermodynamischer, statistischer Natur. Auch bei höheren Temperaturen treten einzelne Moleküle aus dem Dampf in die Probe ein (Kondensation) ; al- lerdings überwiegt bei höheren Temperaturen der Austritt von Molekülen aus der Probe in die umgebende Atmosphäre (Verdunstung) .The substance that is exchanged is usually a solvent, such as water, aqueous buffer solution, alcohol or the like, with the associated vapor pressure. There is a continuous exchange between the sample and the substance or its vapor by means of evaporation and condensation. These processes are of a thermodynamic, statistical nature. Even at higher temperatures, individual molecules from the steam enter the sample (condensation); however, at higher temperatures, the outflow of Molecules from the sample into the surrounding atmosphere (evaporation).
Die Konzentration des Dampfs in der umgebenden Atmosphäre, d.h. der Partialdruck des Dampfs, kann maximal gleich dem Sät- tigungsdampfdruck bei der jeweiligen Temperatur sein. Übersteigt der Partialdruck den Sättigungsdampfdruck, so wird der Überschuss durch Kondensation abgeschieden. Dies kann beispielsweise an der Probe eintreten, wenn die Temperatur der Probe so niedrig ist, dass der zur niedrigen Probentemperatur gehörige Sättigungsdampfdruck unter dem momentanen Partialdruck des Dampfs in der die Probe umgebenden wärmeren Atmosphäre liegt . In einer solchen Situation kommt es zu Kondensation auf der Probe.The concentration of steam in the surrounding atmosphere, i.e. the partial pressure of the steam can be at most equal to the saturated steam pressure at the respective temperature. If the partial pressure exceeds the saturation vapor pressure, the excess is removed by condensation. This can occur, for example, on the sample if the temperature of the sample is so low that the saturation vapor pressure associated with the low sample temperature is below the instantaneous partial pressure of the vapor in the warmer atmosphere surrounding the sample. In such a situation, condensation occurs on the sample.
Im umgekehrten Fall, in dem die Probe hinreichend warm ist und der Partialdruck des Dampfs noch nicht den Sättigungsdruck erreicht hat, kommt es zu Verdunstung.In the opposite case, in which the sample is sufficiently warm and the partial pressure of the steam has not yet reached the saturation pressure, evaporation occurs.
Entscheidend für die Frage, ob es zu Verdunstung oder Kondensation auf der Probe kommt, sind somit die Temperatur der Probe und der Partialdruck des Dampfs über der Probe. Die Tem- peratur der Probe muss sich dabei am Taupunkt des Dampfs in der die Probe umgebenden Atmosphäre orientieren. Der Taupunkt des Dampfs ist diejenige Temperatur, bei der der Partialdruck des Dampfs gleich dem Sättigungsdampfdruck ist. Liegt die Temperatur der Probe über dem Taupunkt, kommt es zu einer effek- tiven Verdunstung; liegt sie darunter, kommt es zu Kondensation.The temperature of the sample and the partial pressure of the steam above the sample are decisive for the question of whether evaporation or condensation occurs on the sample. The temperature of the sample must be based on the dew point of the steam in the atmosphere surrounding the sample. The dew point of the steam is the temperature at which the partial pressure of the steam is equal to the saturation steam pressure. If the temperature of the sample is above the dew point, effective evaporation occurs; if it is below this, condensation occurs.
Der Taupunkt kann z. B. mit einem Taupunkt-Hygrometer bestimmt werden. Der Taupunkt des Dampfs kann auch durch Messen der Temperatur der umgebenden Atmosphäre und des Dampfdrucks des Stoffs in der umgebenden Atmosphäre bestimmt werden. Aus diesen beiden Größen lässt sich der Taupunkt berechnen. Der Dampfdruck kann dabei auch als relativer Dampfdruck, etwa als relative Luftfeuchtigkeit, gemessen werden, d.h. als prozentualer Anteil am Sättigungsdampfdrucks. Die relative Luftfeuch- tigkeit kann beispielsweise mit einem Hygrometer oder sonsti- gen relativen oder absoluten Feuchtesensoren bestimmt werden. Aus der Temperatur ergibt sich der (absolute) Sättigungsdampfdruck des Stoffs in der Atmosphäre. Aus dem Sättigungsdampfdruck des Stoffs und dem relativen Dampfdruck ergibt sich der Partialdruck des Stoffdampfs. Aus diesem wiederum erhält man über geeignete Referenzwerte den Taupunkt . Dieser kann unter gewöhnlichen Bedingungen z. B. bei 8°C liegen.The dew point can e.g. B. can be determined with a dew point hygrometer. The dew point of the steam can also be determined by measuring the temperature of the surrounding atmosphere and the vapor pressure of the substance in the surrounding atmosphere. The dew point can be calculated from these two variables. The vapor pressure can also be measured as a relative vapor pressure, for example as a relative humidity, ie as a percentage of the saturation vapor pressure. The relative humidity can be measured, for example, with a hygrometer or other relative or absolute humidity sensors. The (absolute) saturation vapor pressure of the substance in the atmosphere results from the temperature. The partial pressure of the vapor results from the saturation vapor pressure of the substance and the relative vapor pressure. From this in turn, the dew point is obtained via suitable reference values. This can, for. B. are at 8 ° C.
Wenn als Probe ein Lösungsmittel mit einer im Lösungsmittel gelöste Substanz gewählt wird, so ist der Lösungsmitteldampf für die Bestimmung des Dampfdrucks in der umgebenden Atmosphäre entscheidend.If a solvent with a substance dissolved in the solvent is selected as the sample, the solvent vapor is decisive for determining the vapor pressure in the surrounding atmosphere.
Zur Einstellung eines gezielten Stoffaustausche mit der Umgebung wird erfindungsgemäß das Volumen der Probe und/oder die Konzentration der gelösten Substanz und/oder die in der Probe gelöste Menge der Substanz direkt oder indirekt bestimmt .To set a targeted exchange of substances with the environment, the volume of the sample and / or the concentration of the dissolved substance and / or the amount of the substance dissolved in the sample is determined directly or indirectly.
•Werden diese Größen etwa über eine Waage beobachtet, so kann beispielsweise ein Gewichtsabnahme festgestellt werden. Diese kann - bei fehlender Entnahme von Teilen der Probe - in der Regel einzig auf Verdunstung zurückgeführt werden. In ei- nem solchen Fall liegt also die Temperatur der Probe oberhalb des Taupunkts. Wird eine Gewichtszunahme beobachtet, kann in der Regel lediglich Kondensation stattfinden. Die Temperatur der Probe liegt dann unterhalb des Taupunkts. Damit bietet die Bestimmung von Volumen, Gewicht oder Konzentration eine weite- re Möglichkeit, den Taupunkt zu ermitteln, und zwar als diejenige Temperatur, bei der sich Volumen, Gewicht oder Konzentration nicht ändern. Auf diese Weise ist eine Regelung um den Taupunkt und eine Stoffaustauschkontrolle einfach möglich. Die verschiedenen Möglichkeiten der Taupunkt-Bestimmung können kombiniert werden.• If these quantities are observed using a scale, for example, weight loss can be determined. If parts of the sample are not taken, this can usually only be attributed to evaporation. In such a case, the temperature of the sample is above the dew point. If weight gain is observed, usually only condensation can take place. The temperature of the sample is then below the dew point. The determination of volume, weight or concentration thus offers a further possibility of determining the dew point, namely as the temperature at which the volume, weight or concentration does not change. In this way, regulation around the dew point and mass transfer control is easily possible. The various options for determining the dew point can be combined.
Zur Einstellung eines minimalen Stoffaustauschs mit der Umgebung kann dann z. B. die Temperatur der Probe in der Weise geregelt werden, dass sich z. B. das Volumen oder Gewicht der Probe nicht ändert. Dadurch ergibt sich abwechselnd eine mini- male Verdunstung und eine minimale Kondensation, die sich in der Summe gegenseitig aufheben.To set a minimum mass exchange with the environment, z. B. the temperature of the sample can be regulated in such a way that z. B. does not change the volume or weight of the sample. This results alternately in a mini male evaporation and minimal condensation, which cancel each other out in total.
Selbst eine kleine Probe von z. B. 20 μl in einem Well einer Mikrotiterplatte oder eine Probe von unter einem Mikroli- ter in einer Nanotiterplatte kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens mindestens drei bis vier Tage an der offenen Atmosphäre gehalten werden; während dieser Zeit bleiben die Konzentrationen der Stoffe in der Probe konstant . Man erhält konstante und reproduzierbare Bedingungen der Lösungen in den Wells über einen langen Zeitraum. Daraus ergeben sich ebenso genau definierte Mengen z. B. der DNA-Fragmente auf einem DNA- Array. Es kann somit auch ein großes DNA-Array über mehrere Tage hinweg unter genau definierten Bedingungen aufgebaut werden. Diese Vorteile werden mit einfachsten technischen Mitteln erreicht. Auch können Störungen der Umgebungsbedingungen, z. B. durch Öffnen der Reaktionskammer oder des gesamten Automationssystems, schnell ausgeglichen werden.Even a small sample of e.g. B. 20 μl in a well of a microtiter plate or a sample of less than one microliter in a nanotiter plate can be kept in the open atmosphere for at least three to four days by means of the method according to the invention; the concentrations of the substances in the sample remain constant during this time. Constant and reproducible conditions of the solutions in the wells are obtained over a long period of time. This also results in precisely defined quantities, e.g. B. the DNA fragments on a DNA array. A large DNA array can therefore be built up over several days under precisely defined conditions. These advantages are achieved with the simplest technical means. Disturbances in the environmental conditions, e.g. B. can be quickly compensated by opening the reaction chamber or the entire automation system.
In der Regel wird die Kammer, in der sich die Mikro- oder Nanotiterplatte befindet durch einen Lüfter belüftet. Dieser stört das Gleichgewicht des Austausches zwischen Probe und Umgebung dahingehend, dass er aus der Probe verdunstetes Lösungsmittel wegträgt. Dies muss durch Kondensation wieder ausgeglichen werden. Daher wird die Temperatur der Probe i. d. R. nicht genau auf den Taupunkt eingestellt bzw. um den Taupunkt herum geregelt . Vielmehr wird die Temperatur der Probe leicht unter den Taupunkt eingestellt, so dass es zu einer leichten Kondensation kommt, die die Verdunstungsverluste aufgrund des Lüfters ausgleicht . In einer anderen Variante kann ein gezieltes leichtes Verdunsten zur Aufkonzentrierung der Probe eingestellt werden. Dazu wird die Temperatur der Probe leicht über dem Taupunkt eingestellt. Zusätzlich sollte der Partialdruck des Dampfs unter dem Sättigungsdruck sein, da es sonst zu keiner Verduns- tung kommt, da die umgebende Atmosphäre keinen weiteren Dampf mehr aufnehmen könnte .As a rule, the chamber in which the microplate or nanotiter plate is located is ventilated by a fan. This disturbs the balance of the exchange between the sample and the environment in that it carries away evaporated solvent from the sample. This must be compensated for by condensation. Therefore, the temperature of the sample is usually not set exactly to the dew point or regulated around the dew point. Rather, the temperature of the sample is set slightly below the dew point, so that there is a slight condensation, which compensates for the evaporation losses due to the fan. In another variant, a targeted, slight evaporation can be set to concentrate the sample. To do this, the temperature of the sample is set slightly above the dew point. In addition, the partial pressure of the steam should be below the saturation pressure, otherwise there would be no evaporation. comes because the surrounding atmosphere could no longer absorb any more steam.
Ebenso gut kann durch Einstellen der Temperatur der Probe unterhalb des Taupunkts ein gezieltes Kondensieren herbeige- führt werden.Targeted condensation can also be brought about by adjusting the temperature of the sample below the dew point.
Statt die Temperatur der Probe zu regeln, kann auch die Temperatur der Atmosphäre bezogen auf den Taupunkt des Dampfs des Stoffs oder der Dampfdruck des Stoffs in der umgebenden Atmosphäre bezogen auf den Sättigungsdampfdruck eingestellt werden. Der Dampfdruck über der Probe lässt sich auf einfache Weise über einen Verdampfer einstellen. Im einfachsten Fall ist dies eine Heizplatte unter einem offenen Lösungsmittelbehälter.Instead of regulating the temperature of the sample, the temperature of the atmosphere based on the dew point of the vapor of the substance or the vapor pressure of the substance in the surrounding atmosphere can be adjusted based on the saturation vapor pressure. The vapor pressure over the sample can be easily adjusted using an evaporator. In the simplest case, this is a hot plate under an open solvent container.
Es können auch sowohl die Atmosphäre als auch die Tempera- tur der Probe gleichzeitig in geeigneter Weise eingestellt • werden. ■ .■ •■,.■ It can be • the atmosphere also adjusted as well as the temperature of the sample simultaneously structure in a suitable manner. ■. ■ • ■,. ■
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch dazu verwendet werden, einen genau definierten Eintrag verschiedener Lösungsmitteln herbeizuführen, indem über der Probe die zugehörigen Dampfdrücke aufgebaut werden.The method according to the invention can also be used to bring about a precisely defined entry of different solvents by building up the associated vapor pressures over the sample.
Auf diese Weise können minimale Mengen von Stoffen in die Probe eintragen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist damit auch in der Lage, Pumpen, z. B. Mikropumpen oder piezoelektrischen Pipettierköpfen auf der technischen Basis von Tintenstrahlköpfen, zu ersetzen. Letztere können etwa 100 pl dosieren. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Kondensationskontrolle können über das Einstellen von geringen Partialdrücken, kleinen Oberflächen und kurzen Wechselwirkungszeiten nahezu beliebig kleine Mengen Lösungsmittel eingetragen bzw. auf fes- ten Oberflächen abgeschieden werden. Es können so Wells gezielt mit geringen Mengen an Lösungsmitteln gefüllt werden, Konzentrationen geändert werden und Mischungen erstellt werden.In this way, minimal amounts of substances can be added to the sample. The method according to the invention is thus also able to pump, for. B. micropumps or piezoelectric pipetting heads on the technical basis of inkjet heads to replace. The latter can dose about 100 pl. With the aid of the condensation control according to the invention, by setting low partial pressures, small surfaces and short interaction times, almost any small amounts of solvent can be introduced or deposited on solid surfaces. Wells can be filled with small amounts of solvents, concentrations can be changed and mixtures can be created.
Bei Einstellung der Temperatur der Probe leicht oberhalb des Taupunkts können auch gezielt Mischdämpfen mit jeweils de- finierten Partialdrücken hergestellt werden. Dazu können verschiedene Lösungsmittel z. B. in verschiedenen Wells einer Mikro- oder Nanotiterplatte vorgesehen werden, oder es werden zeitlich nacheinander verschiedene Lösungsmittel verdampft. Auch ein zuverlässiges vorübergehendes Aufbewahren von Proben, insbesondere Flüssigkeitsproben bzw. Lösungen, in offenen Gefäßen, etwa nach Abschluss einer Reaktion oder einer Reaktionsfolge wie der PCR-Reaktion, kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreicht werden. Schließlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zum Beschichten von Substraten verwendet werden.If the temperature of the sample is set slightly above the dew point, mixed vapors with defined partial pressures can be produced. For this purpose, various solvents such. B. can be provided in different wells of a micro- or nanotiter plate, or different solvents are evaporated in succession. Reliable temporary storage of samples, in particular liquid samples or solutions, in open vessels, for example after completion of a reaction or a reaction sequence such as the PCR reaction, can also be achieved with the method according to the invention. Finally, the method according to the invention can also be used for coating substrates.
Eine alternative Möglichkeit, Flüssigkeit , in die Probe einzutragen besteht darin, die Probe mit einem Nebel der Flüssigkeit zu beaufschlagen. Der Nebel besteht aus kleinen Tropf- chen, die sich auf der Oberfläche der Probe niederschlagen und dadurch die Flüssigkeit aus dem Nebel in die Probe eintragen., - Ferner erhöht ein Nebel den Dampfdruck, da der Dampfdruck über den stark gekrümmten Oberflächen kleiner Tröpfchen erhöht ist . Auf diese Weise lassen sich beispielsweise die Masse, das Volumen oder die Konzentration der Probe regeln, etwa konstant halten. Genauso gut kann die Probe mit Hilfe eines Nebels verdünnt werden.An alternative way of introducing liquid into the sample is to apply a mist of liquid to the sample. The mist consists of small droplets, which are deposited on the surface of the sample and thereby introduce the liquid from the mist into the sample., - Furthermore, a mist increases the vapor pressure, since the vapor pressure is increased over the strongly curved surfaces of small droplets , In this way, for example, the mass, the volume or the concentration of the sample can be controlled and kept approximately constant. The sample can also be diluted with a mist.
Um den Eintrag der Flüssigkeit durch den Nebel nicht im Wege der Verdunstung wieder zu verlieren, kann gleichzeitig die Temperatur der Probe auf den Taupunkt des Lösungsmittels in der umgebenden Atmosphäre eingestellt werden.In order not to lose the entry of the liquid through the mist again by evaporation, the temperature of the sample can be adjusted to the dew point of the solvent in the surrounding atmosphere.
Ein solcher Nebel kann beispielsweise mit einem Ultraschall- oder Piezovernebler erzeugt werden.Such a mist can be generated with an ultrasonic or piezo nebulizer, for example.
Der Nebel kann auch aus einem Lösungsmittel mit einer darin gelösten Substanz gebildet werden. Dadurch kann auch eine Substanz in die Probe eingetragen werden. Die Substanz kann beispielsweise ein Mononukleotid sein, das zur Synthese von DNA benötigt wird. Ebenso ist mit diesem Verfahren der Eintrag von chemischen Komponenten in das Probenvolumen möglich, wodurch beispielsweise ein nächster Reaktionsschritt ausgelöst werden kann.The mist can also be formed from a solvent with a substance dissolved in it. This means that a substance can also be added to the sample. The substance can be, for example, a mononucleotide that is required for the synthesis of DNA. It is also possible with this method to introduce chemical components into the sample volume for example, a next reaction step can be triggered.
Wie weiter oben erwähnt, dient als Regelgröße das Volumen der Probe und/oder die Konzentration der gelösten Substanz und/oder die in der Probe gelöste Menge der Substanz . DieseAs mentioned above, the control variable is the volume of the sample and / or the concentration of the dissolved substance and / or the amount of the substance dissolved in the sample. This
Regelgrößen können auf verschiedene Weise direkt oder indirekt bestimmt werden.Controlled variables can be determined directly or indirectly in various ways.
Prinzipiell reicht als Regelgröße auch jede indirekte Messgröße für die genannten Regelgrößen Volumen, Konzentration und Menge. Es reicht also prinzipiell, z. B. lediglich das Gewicht der Probe zu beobachten.In principle, any indirect measurement variable for the above-mentioned control variables volume, concentration and quantity is sufficient as a control variable. In principle, it is sufficient, e.g. B. only observe the weight of the sample.
Das Volumen der Probe kann auf unterschiedliche Weise bestimmt werden, z. B. durch eine optische Messung oder durch eine kapazitive oder induktive Messung sowie durch eine Schwingungsmessung.The volume of the sample can be determined in different ways, e.g. B. by an optical measurement or by a capacitive or inductive measurement and by a vibration measurement.
Die Konzentration, der gelösten Substanz kann ebenfalls . durch eine optische Messung - beispielsweise eine Absorptionsoder Fluoreszenzmessung - bestimmt werden. Denkbar ist zur Bestimmung der Konzentration der gelösten Substanz oder der in der Probe gelöste Menge der Substanz auch eine elektrische Messung, beispielsweise eine Messung der Impedanz oder der Dielektrizitätskonstante der Probe.The concentration of the dissolved substance can also. be determined by an optical measurement - for example an absorption or fluorescence measurement. An electrical measurement, for example a measurement of the impedance or the dielectric constant of the sample, is also conceivable for determining the concentration of the dissolved substance or the amount of the substance dissolved in the sample.
Die Vorrichtung zum Ausführen der erfindungsgemäßen Verfahren weist zur schnellen und genauen Steuerung der Temperatur einer Mikro- oder Nanotiterplatte eine Negativform mit Vertiefungen für die Wells der Mikro- oder Nanotiterplatte auf. Diese Form kann z. B. aus Aluminium oder Kupfer gefertigt werden. Die Form selbst wird über eine Temperatur-Regeleinrichtung temperiert. Sie kann etwa von temperiertem, zweifach destil- liertem Wasser aus einem Kryostat durchspült werden, oder sie wird von einem Peltierelement oder einer Kombination aus bei- dem gekühlt . Durch den engen Kontakt zwischen den Wells und der Negativform kann die Temperatur der Probe schnell und genau geregelt werden. Weitere vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet .The device for carrying out the method according to the invention has a negative shape with depressions for the wells of the microplate or nanotiter plate for fast and precise control of the temperature of a microplate or nanotiter plate. This form can e.g. B. made of aluminum or copper. The mold itself is tempered by a temperature control device. It can be flushed with tempered, double-distilled water from a cryostat, or it can be cooled by a Peltier element or a combination of the two. Due to the close contact between the wells and the negative mold, the temperature of the sample can be controlled quickly and precisely. Further advantageous developments of the invention are characterized in the subclaims.
Im folgenden wird die Erfindung anhand eines Ausführungs- beispiels näher erläutert, das in der Figur schematisch dargestellt ist. Im einzelnen zeigt:The invention is explained in more detail below on the basis of an exemplary embodiment which is shown schematically in the figure. In detail shows:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Steuern des Stoffaustauschs zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre.Fig. 1 is a schematic representation of a device for controlling the mass transfer between a sample and the atmosphere surrounding the sample.
Fig. 1 zeigt eine Mikrotiterplatte 10 mit Wells 12, die auf, einer kupfernen Negativform 14 mit Vertiefungen 15 für die Wells 12 angeordnet ist. Über der Mikrotiterplatte 10 befindet sich ein Pipettier-Roboter 16, der Lösungen aus den Wells 12 der Mikrotiterplatte 10 auf einen Objektträger.,..18 aufträgt.. Auf dem Objektträger 18 wird auf diese Weise ein DNA-Array aufgebaut .1 shows a microtiter plate 10 with wells 12, which is arranged on a copper negative mold 14 with depressions 15 for the wells 12. Above the microtiter plate 10 there is a pipetting robot 16, which applies solutions from the wells 12 of the microtiter plate 10 to a slide,... 18. In this way, a DNA array is built up on the slide 18.
In der Atmosphäre über der Mikrotiterplatte 10 befindet sich ein Feuchte- und Temperatursensor 20, der mit einem Mik- rocontroller 22 verbunden ist. Der MikroController 22 berechnet aus den Feuchte- und Temperaturdaten den Taupunkt.In the atmosphere above the microtiter plate 10 there is a humidity and temperature sensor 20, which is connected to a microcontroller 22. The microcontroller 22 calculates the dew point from the humidity and temperature data.
Der Mikrocontroller 22 regelt auch die Temperatur der Mikrotiterplatte 10 über einen Kryostaten 24, mit dem er über eine Leitung 26 kommuniziert. Der Kryostat 24 temperiert die Negativform 14 mit gekühltem Wasser. Das Wasser wird über einen Zulauf 28 und einen Rückfluss 30 zwischen Kryostat 24 und Negativform 14 transportiert .The microcontroller 22 also regulates the temperature of the microtiter plate 10 via a cryostat 24, with which it communicates via a line 26. The cryostat 24 tempers the negative mold 14 with chilled water. The water is transported via an inlet 28 and a reflux 30 between the cryostat 24 and the negative mold 14.
Außer den Temperatur- und Feuchtewerten der Atmosphäre wird noch von einem Sensor 32 die Temperatur der Mikrotiterplatte 10 gemessen. Das Messsignal wird dem Mikrocontroller 22 über eine Leitung 34 zugeführt.In addition to the temperature and humidity values of the atmosphere, the temperature of the microtiter plate 10 is also measured by a sensor 32. The measurement signal is fed to the microcontroller 22 via a line 34.
Ferner wird mit einer Waage 36 das Gewicht der Mikrotiterplatte - zusammen mit der Negativform 14 - überwacht. Die Signale der Waage werden ebenfalls über eine (nicht gezeigte) Leitung zum Mikrocontroller 22 geführt.Furthermore, the weight of the microtiter plate - together with the negative mold 14 - is monitored with a balance 36. The Signals of the scale are also routed to the microcontroller 22 via a line (not shown).
Im bevorzugten Ausführungsbeispiel beobachtet der Mikrocontroller 22 mit Hilfe der Waage 36, ob Änderungen des Ge- wichts der Mikrotiterplatte 10 auftreten. Verringert sich das Gewicht ohne erkennbaren Grund (etwa Entnahme von Lösung aus den Wells 12 der Mikrotiterplatte 10) , so liegt Verdunstung vor. Die Mikrotiterplatte ist also zu warm. Entsprechend sendet der Mikrocontroller 22 ein Signal an den Kryostaten 24 zum Senken der Temperatur der Mikrotiterplatte.In the preferred exemplary embodiment, the microcontroller 22 uses the balance 36 to observe whether changes in the weight of the microtiter plate 10 occur. If the weight decreases for no apparent reason (for example, removal of solution from the wells 12 of the microtiter plate 10), evaporation occurs. The microtiter plate is therefore too warm. Accordingly, the microcontroller 22 sends a signal to the cryostat 24 to lower the temperature of the microtiter plate.
In einem weiterentwickelten Ausführungsbeispiel prüft der Mikrocontroller 22 ob die Temperatur der Mikrotiterplatte 10 über dem Taupunkt liegt. Ist dies der Fall, sendet der MikroController 22 ein geeignetes Regelsignal über die Leitung 26 an den Kryostaten 24, der daraufhin die Temperatur des Wassers entsprechend senkt, .um die Mikrotiterplatte 10. an den Taupunkt heran zu führen .In a further developed embodiment, the microcontroller 22 checks whether the temperature of the microtiter plate 10 is above the dew point. If this is the case, the microcontroller 22 sends a suitable control signal via the line 26 to the cryostat 24, which then lowers the temperature of the water accordingly in order to bring the microtiter plate 10 to the dew point.
Das Volumen der Probe, als Regelgröße, kann prinzipiell durch eine Relativmessung ermittelt werden. Die Wells 12 wer- den in einem Spotting- oder Pipettierschritt gefüllt, der ein hinreichend genau bekanntes Volumen vorgibt. Ziel ist es dann, dieses vorgegebene Volumen zu erhalten, evtl. abzüglich eines gewollten Austrags .The volume of the sample, as a controlled variable, can in principle be determined by a relative measurement. The wells 12 are filled in a spotting or pipetting step, which specifies a volume that is known with sufficient accuracy. The aim is then to maintain this predetermined volume, possibly less a desired discharge.
Das Volumen der Flüssigkeit in einem Well 12 wird vorzugs- weise durch eine optische Reflexionsmessung bestimmt. Dabei wird die von der Füllhöhen des jeweiligen Wells 12 abhängige Ablenkung vorzugsweise eines Laserstrahls über eine positionssensitive 4-Quadrantendiode gemessen. Es kann so eine Höhenauflösung von ca. 10 nm erreicht' werden. Bei einer Quer- schnittsfläche der Wells 12 von 100 μm ergibt sich eine Volumenauflösung von 1 Femtoliter.The volume of the liquid in a well 12 is preferably determined by an optical reflection measurement. The deflection of a laser beam, which is dependent on the fill heights of the respective well 12, is measured via a position-sensitive 4-quadrant diode. A height resolution of approximately 10 nm can thus be achieved. With a cross-sectional area of the wells 12 of 100 μm, a volume resolution of 1 femtoliter results.
Das Volumen kann aber auch optisch über die Abbildungseigenschaften eines linsenförmigen, transparenten Flüssigkeitstropfens bestimmt werden, wenn dieser zur Abbildung einer Mehrzahl von Linien verwendet wird. Bei einer Änderung des Vo- lumens des Tropfens kommt es zu einem Versatz der Linien, aus dem sich bei bekanntem Brechungsindex das Volumen bestimmen lässt.However, the volume can also be determined optically via the imaging properties of a lenticular, transparent liquid drop if this is used to image a plurality of lines. In the event of a change in the lumen of the drop there is an offset of the lines, from which the volume can be determined if the refractive index is known.
Das Volumen kann außerdem durch verschiedene elektrische Messungen bestimmt werden. Bei einer kapazitiven Messung des Volumens - bei bekannter Dielektrizitätskonstante - wird das Probenvolumen in das elektrische Feld eines Kondensators gebracht. Anschließend wird die Kapazität des Kondensators bestimmt . Aus der Kapazität kann auf das Volumen der Probe ge- schlössen werden. Dazu kann beispielsweise als Probenvolumen ein Spot auf eine elektrisch leitende Oberfläche gebracht werden. Anschließend wird eine Gegenelektrode parallel zu der leitenden Oberfläche ausgerichtet und an diese herangeführt .The volume can also be determined by various electrical measurements. In the case of a capacitive measurement of the volume - with a known dielectric constant - the sample volume is brought into the electrical field of a capacitor. The capacitance of the capacitor is then determined. The volume can be used to infer the volume of the sample. For this purpose, for example, a spot can be placed on an electrically conductive surface as the sample volume. A counter electrode is then aligned parallel to the conductive surface and brought up to it.
Das Gewicht der Probe bzw. der Mikrotiterplatte 10 kann mit einer Präzisionswaage mit einer Genauigkeit von weniger alsThe weight of the sample or microtiter plate 10 can be measured with a precision balance with an accuracy of less than
1.00, .μg, entsprechend weniger als 100 nl Wasser, bestimmt wer-,, den. Eine Gewichtsmessung kann auch dazu verwendet werden, die Menge eines Austrags zu kontrollieren, in dem die Differenz zwischen dem Gewicht vor und nach dem Austrag bestimmt wird. Möglich ist auch eine Massenbestimmung durch eine Schwingungsmessung. Dazu wird die Probe auf der Oberfläche eines Körpers positioniert . Die Masse der Probe kann dann über die Verschiebung der Oberflächen-Schwingungsfrequenz ermittelt werden. Die Konzentration geladener Spezies in der Lösung lässt sich z. B. durch eine Impedanzmessung bestimmen. Dabei kann die Impedanz durch Variation der Frequenz einer angelegten WechselSpannung Ionen-selektiv bestimmt werden. Aus der Ionenselektiven Impedanz ergibt sich die Konzentration der einzel- nen Ionen.1.00, .μg, corresponding to less than 100 nl of water. Weight measurement can also be used to control the amount of a discharge by determining the difference between the weight before and after the discharge. A mass determination by means of a vibration measurement is also possible. To do this, the sample is positioned on the surface of a body. The mass of the sample can then be determined by shifting the surface oscillation frequency. The concentration of charged species in the solution can e.g. B. determine by an impedance measurement. The impedance can be determined ion-selectively by varying the frequency of an applied AC voltage. The concentration of the individual ions results from the ion-selective impedance.
Bei Anwesenheit von Chromophoren lässt sich deren Konzentration durch eine Absorptionsmessung bestimmen. Bei zusätzlicher Anwesenheit von Fluorophoren lässt sich die Konzentration über eine Fluoreszenzmessung, vorzugsweise über eine Laser- induzierte-Fluoreszenz (LIF) -Messung, ermitteln. Fluorophore können auch zur Bestimmung des Volumens eingesetzt werden. Dazu wird dem Volumen ein Fluorophor künstlich zugegeben. Die Probe wird als Ganzes zur Fluoreszenz angeregt. Ihre Helligkeit wird bestimmt. Über eine Kalibrierkurve kann aus der Helligkeit auf das Volumen geschlossen werden.If chromophores are present, their concentration can be determined by an absorption measurement. If fluorophores are also present, the concentration can be determined via a fluorescence measurement, preferably via a laser-induced fluorescence (LIF) measurement. Fluorophores can also be used to determine the volume. For this purpose, a fluorophore is artificially added to the volume. The sample as a whole is excited to fluoresce. Your brightness is determined. The volume can be inferred from the brightness using a calibration curve.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird zum Wiederauffüllen der Wells 12 bei erkanntem Gewichtsverlust ein Ver- nebler eingesetzt. Im Vernebler - alternativ auch in einem InkJet- oder Piezodispenser - werden Tröpfchen mit Volumina von wenigen Picolitern bis mehreren Nanolitern erzeugt.In a further exemplary embodiment, a nebulizer is used to refill the wells 12 when weight loss is detected. In the nebulizer - alternatively also in an inkjet or piezo dispenser - droplets with volumes from a few picoliters to several nanoliters are generated.
Der Nebel kann durch Anregung eines Piezoaktuators mit niedrigen oder hohen Frequenzen erzeugt werden. Dabei werden Flüssigkeitsstrahlen hochreproduzierbar in quantifizierbare Tröpfchen zerlegt. Die Anzahl der Tröpfchen kann beim sog. Single-Shot-Betrieb, bei dem einzelne Tröpfchen wohldefiniert abgegeben werden, genau ermittelt werden. Analog lassen sich Tröpfchen im sog. Bubble-Jet Verfahren auf thermischem Wege erzeugen.The fog can be generated by excitation of a piezo actuator with low or high frequencies. Liquid jets are broken down into quantifiable droplets in a highly reproducible manner. The number of droplets can be precisely determined in the so-called single-shot mode, in which individual droplets are dispensed in a well-defined manner. Analogously, droplets can be generated thermally using the so-called bubble jet process.
Der Vernebler wird vorzugsweise in unmittelbarer Nähe zu der zu kontrollierenden Substanz aufgestellt, insbesondere dann, wenn andere Bereiche von dem Nebel abzugrenzen sind, was durch geeignete Barrieren erreicht werden kann. Der Vernebler kann aber auch weiter von der Mikrotiterplatte 10 entfernt aufgestellt sein, wenn der Nebel homogen auf verschiedene Pro- ben verteilt werden soll.The nebuliser is preferably set up in the immediate vicinity of the substance to be controlled, in particular when other areas are to be separated from the mist, which can be achieved by suitable barriers. The nebulizer can also be placed further away from the microtiter plate 10 if the mist is to be distributed homogeneously over different samples.
Die Nebel-Tröpfchen können unterschiedliche Aufgaben erfüllen:The mist droplets can perform different tasks:
1. Auffüllen der Wells 12 oder Spots mit reinem Lösungsmittel und somit ein Konstanthalten von Volumen und Gewicht . Zu diesem Zweck wird der Nebel aus dem reinen Lösungsmittel erzeugt .1. Filling the wells 12 or spots with pure solvent and thus keeping the volume and weight constant. For this purpose, the mist is created from the pure solvent.
2. Ein- oder Aufbringen von Reaktionspartnern mit Hilfe des Nebels .2. Introduction or application of reactants with the help of the fog.
2.1 Eingebracht werden können die Tröpfchen aus dem Nebel in Wells 12 oder auf bereits vorhandene Flüssigkeitströpfchen bzw. Partikel. Diese können in verschiedenen Medien vorliegen, etwa in festen bzw. Gel-artigen Matrizes oder an Oberflächen gebunden sein oder sich in der Gasphase befinden. In jedem Fall kommt es zu einer Mischung der vorhandenen Tröpfchen mit den Tröpfchen aus dem Nebel .2.1 The droplets from the mist can be introduced into wells 12 or onto existing liquid droplets or particles. These can be present in various media, for example in solid or gel-like matrices or bound to surfaces or in the gas phase. In any case, the existing droplets are mixed with the droplets from the mist.
2.2 Die vorhandenen Tröpfchen können dabei Lösungen enthalten, etwa DNA in einer wässrigen Pufferlösung.2.2 The droplets present can contain solutions, such as DNA in an aqueous buffer solution.
2.3 Der Nebel kann zu der vorhandenen Lösung neue Reaktionspartner einbringen. Diese können beispielsweise Nukleotide oder DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente unterschiedlicher Länge sein. Ebenso können es Aminosäuren, Peptide und die ganze Vielfalt der Proteine, wie Enzyme etc., sein. Dementsprechend müssen auch die Lösungsmittel variiert werden, aus denen die Nebeltröpfchen überwiegend bestehen: von Wasser über wässrige Lösungen zu polaren oder amphiphilen Lösungsmitteln.2.3 The fog can introduce new reaction partners to the existing solution. These can be, for example, nucleotides or DNA, RNA or PNA fragments of different lengths. It can also be amino acids, peptides and the whole variety of proteins, such as enzymes, etc. Accordingly, the solvents that make up the mist droplets must be varied accordingly: from water to aqueous solutions to polar or amphiphilic solvents.
Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Abwandlungen und Weiterbildungen der beschriebenen Ausführungsbeispiele verwirklichbar. So ist es beispielsweise möglich, ganze Stapel von Mikro- oder Nanotiterplatten gleichzeitig zu temperieren und damit diese im Stoffaustausch zu kontrollieren. Dazu kann jede einzelne Probe, hier also jede Mikro- oder Nanotiterplatte, auf einer Kälteplatte ruhen. Denkbar ist aber auch, dass der Raum, in dem die Proben lagern, insgesamt temperiert wird. Durch ein Kühlen des Raums werden auch die Proben gekühlt . Wird anschließend Dampf in den Raum eingeleitet, so kondensiert er u.a. auf der Probe.Numerous modifications and developments of the exemplary embodiments described can be implemented within the scope of the invention. For example, it is possible to temper entire stacks of micro- or nanotiter plates at the same time and thus control them in the mass transfer. For this purpose, every single sample, here every micro or nanotiter plate, can rest on a cold plate. It is also conceivable that the room in which the samples are stored is tempered overall. Cooling the room also cools the samples. If steam is subsequently introduced into the room, it condenses, among other things. on the test.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die Anwendung auf Mikro- oder Nanotiterplatten beschränkt. Es kann für beliebig geformte Proben eingesetzt werden. BezugszeichenThe method according to the invention is not restricted to use on microplates or nanotiter plates. It can be used for samples of any shape. reference numeral
Mikrotiterplatte Well kupferne Negativform Vertiefungen Pipettier-Roboter Objektträger Feuchte- und Temperatursensor Mikrocontroller Kryostat Kommunikationsleitung Zulauf Rückfluss Temperatursensor Kommunikationsleitung Waage Microtiter plate corrugated copper negative form wells pipetting robot microscope slide humidity and temperature sensor microcontroller cryostat communication line inlet return flow temperature sensor communication line scale

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum Steuern des Stoffaustausche zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre, wobei als Probe ein Lösungsmittel mit einer im Lösungsmittel gelöste Substanz gewählt wird; wobei das Volumen der Probe und/oder die Konzentration der gelösten Substanz und/oder die in der Probe gelöste Menge der Substanz bestimmt wird; und wobei die physikalischen Eigenschaften der Probe und/oder der umgebenden Atmosphäre derart eingestellt werden, dass sich eine gewünschte Kondensation des Lösungsmitteldampfs in oder auf die Probe bzw. eine gewünschte Verdunstung oder Sublimation des Lösungsmittels aus der Probe ergibt. . .1. A method for controlling the mass exchange between a sample and the atmosphere surrounding the sample, wherein a solvent with a substance dissolved in the solvent is selected as the sample; wherein the volume of the sample and / or the concentration of the dissolved substance and / or the amount of the substance dissolved in the sample is determined; and wherein the physical properties of the sample and / or the surrounding atmosphere are set such that a desired condensation of the solvent vapor in or onto the sample or a desired evaporation or sublimation of the solvent results from the sample. , ,
2. Verfahren zum Steuern des Stoffaustausche zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre, wobei als Probe ein Lösungsmittel mit einer im Lösungsmittel gelöste Substanz gewählt wird; wobei das Volumen der Probe und/oder die Konzentration der gelösten Substanz und/oder die in der Probe gelöste Menge der Substanz bestimmt wird; und wobei die Probe mit einem Nebel einer Flüssigkeit benebelt wird, um die Flüssigkeit in die Probe einzutragen.2. A method for controlling the mass exchange between a sample and the atmosphere surrounding the sample, a solvent with a substance dissolved in the solvent being selected as the sample; wherein the volume of the sample and / or the concentration of the dissolved substance and / or the amount of the substance dissolved in the sample is determined; and misting the sample with a mist of liquid to introduce the liquid into the sample.
3. Verfahren nach dem mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Taupunkt des Lösungsmitteldampfs in der umgebenden Atmosphäre bestimmt wird; und dass die Temperatur der Probe oberhalb des Taupunkts des Lösungsmittels in der umgebenden Atmosphäre eingestellt wird, um das Volumen der Probe durch Verdunstung oder Sublimation zu verringern. 3. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the dew point of the solvent vapor in the surrounding atmosphere is determined; and that the temperature of the sample is adjusted above the dew point of the solvent in the surrounding atmosphere to reduce the volume of the sample by evaporation or sublimation.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3 , dadurch gekennzeichnet, dass der Nebel durch einen Ultraschall- oder Piezovernebler erzeugt wird.4. The method according to claim 2 or 3, characterized in that the mist is generated by an ultrasonic or piezo nebulizer.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, dass ein Nebel aus einem Lösungsmittel mit einer darin ge- lösten Substanz gebildet wird.5. The method according to any one of claims 2 to 4, characterized in that a mist is formed from a solvent with a substance dissolved therein.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Probe durch Bestimmen des Gewichts der Probe bestimmt wird.6. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the volume of the sample is determined by determining the weight of the sample.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Probe durch eine optische Messung be- stimmt wird.7. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the volume of the sample is determined by an optical measurement.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Probe durch eine kapazitive oder in- duktive Messung bestimmt wird.8. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the volume of the sample is determined by a capacitive or inductive measurement.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Probe durch eine Schwingungsmessung bestimmt wird.9. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the volume of the sample is determined by a vibration measurement.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der gelösten Substanz durch eine optische Messung - beispielsweise eine Absorptions- oder Fluoreszenzmessung - bestimmt wird.10. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that that the concentration of the dissolved substance is determined by an optical measurement - for example an absorption or fluorescence measurement.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der gelösten Substanz oder die in der Probe gelöste Menge der Substanz durch eine elektrische Messung - beispielsweise eine Messung der Impedanz oder der Dielektrizitätskonstante der Probe - bestimmt wird.11. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the concentration of the dissolved substance or the amount of the substance dissolved in the sample is determined by an electrical measurement - for example a measurement of the impedance or the dielectric constant of the sample.
12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer Probe, die mit einer Atmosphäre in Kontakt ist, wobei die Atmosphäre einen Dampf eines Stoffs enthält und die Probe diesen Stoff enthält, oder ihn aufnehmen kann; mit Mitteln (20, 22) zum Bestimmen des Taupunkts des Dampfs des Stoffs in der Atmosphäre; und mit Mitteln (32, 24) zum Einstellen der physikalischen Eigenschaften der Probe und/oder der Atmosphäre bezogen auf den Taupunkt des Dampfs des Stoffs in der Atmosphäre derart, dass sich eine gewünschte Kondensation des Dampfs in oder auf die Probe bzw. Verdunstung bzw. Sublimation des Stoffs aus der Probe ergibt ; wobei die Probe eine Mikro- oder Nanotiterplatte (10) mit einer Vielzahl von Wells (12) ist; dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Einstellen der physikalischen Eigenschaften der Probe eine Temperatur-Regeleinrichtung (22, 24) für die Probe mit einer Negativform (14) der Mikro- oder Nanotiterplatte (10) mit Vertiefungen (15) für die Wells (12) enthalten. 12. An apparatus for carrying out the method according to one of the preceding claims with a sample which is in contact with an atmosphere, the atmosphere containing a vapor of a substance and the sample containing or being able to absorb this substance; means (20, 22) for determining the dew point of the vapor of the substance in the atmosphere; and with means (32, 24) for adjusting the physical properties of the sample and / or the atmosphere in relation to the dew point of the vapor of the substance in the atmosphere such that a desired condensation of the vapor in or on the sample or evaporation or Sublimation of the material from the sample results; the sample being a micro or nanotiter plate (10) having a plurality of wells (12); characterized in that the means for adjusting the physical properties of the sample include a temperature control device (22, 24) for the sample with a negative shape (14) of the microplate or nanotiter plate (10) with depressions (15) for the wells (12) contain.
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