WO2002000230A1 - Künstliche sauerstoffträger aus vernetztem modifizierten human- oder schweinehämoglobin, verfahren zu ihrer herstellung aus gereinigtem material, sowie deren verwendung - Google Patents

Künstliche sauerstoffträger aus vernetztem modifizierten human- oder schweinehämoglobin, verfahren zu ihrer herstellung aus gereinigtem material, sowie deren verwendung Download PDF

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WO2002000230A1
WO2002000230A1 PCT/EP2001/006613 EP0106613W WO0200230A1 WO 2002000230 A1 WO2002000230 A1 WO 2002000230A1 EP 0106613 W EP0106613 W EP 0106613W WO 0200230 A1 WO0200230 A1 WO 0200230A1
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hemoglobin
oxygen
mol
blood
molecular weight
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PCT/EP2001/006613
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Wolfgang Barnikol
Oswald Burkhard
Harald Pötzschke
Ulrike Domack
Stephanie Dinkelmann
Bernd Fiedler
Birgit Manz
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Sanguibiotech Ag
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins

Definitions

  • the present invention comprises the production of chemically modified, crosslinked hemoglobins with improved functional properties, the crosslinked hemoglobins produced by this process, and their use as artificial oxygen carriers.
  • the manufacturing process is characterized by both technical simplicity and high yields.
  • Highly pure deoxygenated hemoglobin is covalently conjugated under the protection of an antioxidant with an oxygen binding effector, in particular pyridoxal-5-phosphate, after which the hemoglobin is polymerized with glutardialdehyde with a very large increase in the volume of the reaction mixture and thus a very strong dilution of the reactants during the Add the crosslinker. Then, after dilution with water, a polyethylene oxide derivative is chemically attached to the crosslinked hemoglobins.
  • the result is polymers that are compatible with blood plasma and have optimized oxygen binding characteristics, which can be used as artificial oxygen carriers, in particular divided into a low and a high molecular weight fraction as a blood substitute or as a blood additive, for example in the treatment of oxygen deficiency states.
  • volume deficiency shock can be broken through sooner than with a blood preserve, because the erythrocytes are stiffened in the preserve and thereby have a reduced capillary patency.
  • animal experiments have shown that volume deficiency shock can be combated more effectively with oxygen-transporting blood substitutes than with simple plasma expanders (Pabst R. ( 1977): "Oxygen transfer with stroma-free hemoglobin solutions and fluorocarbons", Med. Klin.
  • Organs intended for transplantation are much easier to preserve, if they are perfused with (artificial) Sauerstott carriers.
  • a liver transplant alone requires up to 100 transfusion units of 450 mL each. Similar large amounts are required in cases of polytraumatic damage (e.g. due to a car accident).
  • the concept benefits very much from the fact that it is a functional oxygen therapy: it is not the substrate (the oxygen) that is applied, but the function of the carrier system that brings the oxygen to the tissues is improved. This makes the therapy effective multiplicative, therefore very effective, and gives it a catalytic character.
  • an oxygen carrier dissolved in plasma is much more effective than one "packaged" in erythrocytes.
  • such an artificial blood substitute can be produced free of known pathogens; infection problems such as hepatitis and acquired immune deficiency (AIDS) are on these Way avoidable.
  • a further application of such artificial oxygen carriers would be to increase the radiation sensitivity of tumors, especially since it is increasingly being indicated that molecular oxygen carriers dissolved in plasma release much more effective oxygen to the tissue than whole blood:
  • Such artificial carriers bring about a synergy with the native ( intraerythrocytes) carrier.
  • the molecularly disperse artificial carrier in the blood plasma not only releases oxygen from the capillary per se, but also enhances the oxygen release of the existing native system through the mechanism of facilitated diffusion. That means that for this purpose only a minor one Concentration of the artificial Traget 0 in ⁇ asrna required. Nevertheless, this functional therapy (see above) remains extremely effective.
  • an iso-oncotic, oxygen-transporting volume substitute (artificial oxygen carrier of the first generation) is required for compensation
  • an oxygen-transporting blood additive artificial oxygen carrier of a second and new generation.
  • a corresponding blood additive in combination with a so-called plasma expander, also enables the therapy of acute blood loss with the great advantage that the doctor has the option of adapting both the administration of oxygen carriers and the volume of fluid to the needs of the individual patient.
  • the organism is also able to change both (amount of oxygen carrier and blood volume) independently of one another, namely erythrocyte formation via erythropoietin and the plasma volume via its own regulation system. Both sizes are decoupled by the fact that the carrier has a much lower colloid osmotic pressure in the blood than the plasma.
  • Another strategy is the microencapsulation of highly concentrated solutions of natural and also chemically modified hemoglobin in phospholipid vesicles with the addition of suitable effectors of hemoglobin binding (“artificial erythrocytes or hemosomes”) (Ogata Y. (1994): “Characteristics of Neo Red Cells, Their Function and Safety: In-Vivo Studies ", Artificial Cells, Blood Substitutes, and Immobilization Biotechnologies 22: 875-881).
  • the first animal experiments have also been successful in this field (Hunt CA, et al. (1985): "Synthesis and Evaluation of a Protypal Artificial Red Cell", Science 230: 1165-1168).
  • the vesicles had a diameter of less than 0.05
  • the third strategy consists in the production of infusible hemoglobin solutions.
  • the artificial oxygen carrier is then present in the blood extracellularly. While the first two problem solutions can be seen as the production of artificial blood So that the difficulty of colloid-osmotic interference cannot occur, this problem solution started with a plasma expander, whose macromolecules can also transport oxygen (so-called artificial oxygen carriers based on first-generation hemoglobin).
  • the hemoglobin cannot be used for this, since it is excreted too quickly via the kidney, for example. A chemical modification is therefore essential.
  • the hemoglobin has been covalently bound to dextrans via its amino groups or polymerized itself up to a molecular weight of approximately 700,000 g / mol.
  • the former was for example from Fresenius (r-resenius E. (1976): "Blood and Plasma Substitute - Comprising a Colloidal Solution of Hydroxyethyl Starch Coupled to Haemoglobin Free Stroma", patent DE-P 2616-086) and the latter from Biotest ( Bonhard K., et al.
  • hemoglobins as artificial oxygen carriers - compared to fluorocarbons - is that the favorable properties of natural oxygen binding can be used. These include the optimally adjusted mean oxygen affinity, the homotropic cooperativity, i.e. the S-shape of the oxygen binding curve, and the (alkaline) drilling effect, which forms the basis of a natural self-regulatory mechanism for targeted oxygen release to deficient tissues.
  • HILL index so-called n50 value decreases as an expression of reduced homotropic cooperativity (weakened S-shape of the oxygen-hemoglobin binding curve), which also makes it difficult to supply the tissues with oxygen.
  • This S-shape of the oxygen-hemoglobin binding curve also facilitates the absorption of oxygen in the lungs and its release to the cells.
  • Fluorocarbons on the other hand, have a linear "oxygen binding curve" and therefore do not have this functional advantage.
  • the artificial oxygen carrier often has a short residence time in the organism, the dissolved hemoglobins are excreted via the kidney.
  • the residence time of the extracellular hemoglobins remains shorter than desired.
  • Hemosomes are removed from the plasma by the reticuloendothelial system of the organism. examples for example, the half-life of artificial erythrocytes (see above) was only 5.8 hours.
  • a 2 value This characterizes the interaction of the (always macromolecular) oxygen carrier with the solvent (water). The synthesis should be set up so that this value is close to zero.
  • Too high viscosity of the carrier solution This is usually accompanied by an excessively large A 2 value, and it occurs preferentially when a carrier consists of chain molecules. According to EINSTEIN's viscosity law, excessive viscosity does not occur if the polymeric carrier molecules are spherical and compact.
  • RES reticuloendothelial system
  • Kidney and liver damage Kidney shock occurs especially when current-containing hemoglobin solution has been used. No kidney damage has been observed since the solutions were ultrafiltered. Liver damage was indicated with the help of the plasma transaminase level, it is presumably based on cellular membrane interactions: the liver has an open current pathway (fenestrated capillaries). • The biuisiming must also be checked; disturbances in the sense of promotion and inhibition are conceivable, particular attention must be paid to platelet aggregation.
  • Toxic effects can be differentiated as pyrogenic, vasoconstrictive - for example on the coronary vessels - and endotoxic.
  • the vasoconstrictor effect is presumably based on the capture of the nitrogen monoxide radicals, which are known to be endogenous vasodilatory control substances; however, the vasoconstrictive effect can also be explained by the high effectiveness of the artificial carriers in that the smooth muscles are supplied with oxygen "too well".
  • an artificial oxygen carrier has not been available for routine clinical use. From the mention of the manifold problems, it can be seen that there is still a large catalog of requirements for a usable artificial oxygen carrier. In nature, oxygen is always transported in giant muscupic aggregates. Two fundamentally different "problem solutions" have developed here. In higher animals (and also in humans), the molecular oxygen carrier is packaged in cells (in the erythrocytes). Second, giant oxygen-binding molecules that do not develop intracellularly, but extracellularly in one develop Finding hemolymph dissolved, this variant is mainly found in lower animals in various forms.
  • Annelids for example, have high molecular weight hemoglobins with an average molecular weight of around 3,000,000 g / mol as oxygen carriers. There are also so-called hemythrins, in which the iron, as Oxygen binder itself is directly molecularly linked to the protein. Finally, one finds the hemocyanins with a molecular weight around 8,000,000 g / mol, in which copper is the oxygen-binding heavy metal ion, see also Barnikol WKR, et al. (1996) : "Hyperpolymeric hemoglobins as artificial oxygen carriers. An in innovative approach to medical development ", therapy week 46: 811 - 815.
  • the earthworm has giant molecules (erythrocruorin) in its blood as oxygen carriers with a molecular weight of about 3400000 g / mol with around 200 binding sites for oxygen.
  • the molecule is very compact and its quaternary structure is highly ordered. The molecule is so large that it can be made directly visible using the electron microscope. Its concentration in the hemolymph is at least 6 g / dL.
  • Measuring the oxygen binding curve under simulated in vivo conditions gives a semi-saturation pressure (P50) of 9.1 torr (Barnikol WKR, Burkhard O.
  • the oncotic pressure of the erythrocyte is only 10 -7 Torr - the two functions of colloid osmolarity and oxygen binding decoupled, and both can be varied as manipulated variables from the organism-free.
  • the hemoglobin molecule must be modified so that it can support the normal oxygen transport of the erythrocytes at least temporarily as an extracellular giant molecule with negligible oncotic pressure.
  • Such artificial oxygen carriers are then highly polymerized hemoglobin, which must take into account all of the problems mentioned above.
  • Earthworm hemoglobin which fulfills the requirements for oncotic pressure, cannot be used for this purpose for humans, because it is presumably too great in nature; in addition, the semi-saturation pressure of 9 Torr is too low (Barnikol WKR, Burkhard O. (1987): "Highly Polymerized Human Hemoglobin as an Oxygen Carrying Blood Substitute", Advances in Experimental Medicine and Biology, Volume 215: 129-134; Barnikol WKR (1986): "The Influence of Glutardialdehyde on the Oxygen Cooperativity of Human Hemoglobin ", Pflügers Archiv 406: R 61). In addition, it is probably not obtainable in the required quantities.
  • the present invention was based on the task of producing hypo-oncotic artificial oxygen carriers from cross-linked hemoglobin, which have optimized good functional properties, in particular the characteristic of oxygen binding, and which are suitable for use as pharmaceuticals in humans, in a technically simple process in high yield to be able to manufacture.
  • the object is achieved according to the invention as described below.
  • the fundamental problem of the development of a percolation distribution of the degrees of multimerization and molecular weights due to the crosslinking of the polyfunctional hemoglobins with the bifunctional crosslinking agent glutardialdehyde was surprisingly eliminated by increasing the volume of the reaction mixture very strongly (2 to 10 times in total) during the crosslinking is, namely that the crosslinker is first added in dilute solution and then additionally diluted with water.
  • the production according to the invention thus comprises the following steps:
  • hemoglobin i) is first deoxygenated, in particular by overflowing with nitrogen; ii) subsequently implemented covalently with a chemically reactive effector of oxygen binding; iii) then the solution is mixed with a chemically non-reactive effector and then iv) the hemoglobin is stable with glutardialdehyde, with very strong dilution (2 to 5 times) of the volume of the reaction mixture, with simultaneous addition of the crosslinking agent (in solution)) covalently cross-linked and then the reaction volume further increased with water (total dilution of the solution to 2-10, in particular 2-7, especially 5-6 times the volume) and then v) a polyethylene oxide covalently attached.
  • the product obtained can be worked up in a known manner.
  • the starting hemoglobin preferably comes from pigs or from humans, very particularly preferably from pigs, especially from domestic pigs.
  • step iii) glutardialdehyde is added in a very dilute solution in a time-controlled manner. A further dilution and an increase in the reaction volume with water then preferably take place, so that the above-mentioned total dilution is achieved.
  • step iv) glutardialdehyde in a molar amount of 6-10, in particular 7-9 mol / mol, based on monomeric hemoglobin, dissolved in 1-4, preferably 1-2, in particular 1, 5-2, very particularly preferably 1, 7- 1, 9 L water, per liter of original reaction solution is added.
  • This addition is time-controlled between about 3 and 15, preferably 3-10, in particular 4-6 minutes.
  • step ii) pyridoxal-5'-phosphate in a molar ratio, based on monomeric hemoglobin, of 0.5 to 3, preferably 1 to 2.5 mol / mol, covalently over a period of 0.5- 20, especially 1-7 hours connected ..
  • step ii) in an amount of 1-9, preferably 1-5, in particular 1-2.5 mol / mol e.g. for 30 to 90 min., and in step iv) in an amount of 5-20, in particular 6, -12 mol / mol, in each case based on monomeric hemoglobin, for 15 to 100 min. added.
  • step iii) it is particularly preferred to add 2,3-bisphosphoglycerate as a chemically non-reactive effector in an amount of 0.5-6, in particular 1-4 mol / mol, based on monomeric hemoglobin, and about 5-50 minutes, in particular 10 - 20 and especially 15 minutes afterwards, glutardialdehyde added.
  • the polyethylene oxide used is preferably a polyethylene glycol ether, for example with a C1-C5-alkyl radical such as methyl, ethyl butyl, having a molecular weight of 500 to 3000 g / mol, in particular a methoxy polyethylene glycol derivative having a molecular weight of 1500-2500 g / Mol, in particular 2000 g / mol, such as special methoxy polyethylene glycol succinimidyl propionate, in amounts of 2-12, especially 3-8 mol / mol hemoglobin.
  • Other derivatization products are methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinamide and methoxy polyethylene glycol succinimidyl oxyacetate.
  • the reaction is preferably carried out over 1-4, especially 2-3 hours.
  • the product obtained can be worked up in a conventional manner, as described below.
  • it has a molecular weight distribution of from 50,000 to 5,000,000, optionally up to 10,000,000 g / mol or more.
  • the product obtained can preferably be obtained by a preparative substance-separating method, such as, for example, preparative volume exclusion chromatography, ultrafiltration, fractional precipitation, for example using polyalkylene oxides or salts such as ammonium sulfate as the precipitant, or a field-flow fractionation method (cf. Curling JM (Ed.) Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press, London et al. 1980, and the patents EP-A 0 854 151 and EP-A 95 107 280) are separated into a fraction with a large and a fraction with a low average molecular mass, the separation limit is preferably 700,000 g / mol.
  • a preparative substance-separating method such as, for example, preparative volume exclusion chromatography, ultrafiltration, fractional precipitation, for example using polyalkylene oxides or salts such as ammonium sulfate as the precipitant, or a field-flow fractionation method (cf. Curling JM (Ed.
  • a pharmaceutical preparation can be produced from the product with high molecular weight and from the product with low molecular weight, a parenteral blood substitute being obtained from the low molecular weight fraction of the polymers and a parenteral blood additive being obtained from the higher molecular weight fraction of the polymers.
  • the pH value adjustment before (and after) the individual reaction steps is preferably carried out with lactic acid or sodium hydroxide solution to values between 6 and 10, depending on the reaction step, e.g. 6.5-7.5 before step ii), then on 7.5-8.5 and then again on 6.5-7.5 before step iii), then on 7.5 to 9, and before step v) on 7.5-10.
  • the concentration of hemoglobin is preferably 200-380 g / L, in particular 240-360 g / L, the solution further contains 10 to 150 mmol / L NaHC0 3 and 10 to 150 mmol / L NaCl.
  • the temperature during the "one-pot reaction” is 2-42 ° C, especially 3-25 ° C, preferably 4-22 ° C.
  • the artificial oxygen carrier produced according to the invention preferably has an n50 value (cooperativity) of 1.6 to 2.5 and a p50 value (semi-saturation pressure) of 16 to 24 torr.
  • the product obtained according to the invention with the above-mentioned characteristics can be used to produce an agent for intravascular or biomedical use as an artificial oxygen carrier, or in the form of a pharmaceutical preparation as a substitute for the blood (blood substitute) or as an additive to the blood to increase the oxygen transport capacity (Blood additive) or to a nutrient solution, in the human and animal organism, in individual organs or in biotechnical applications, in particular for the treatment of chronic oxygen deficiency in humans.
  • the hemoglobin derivatives according to the invention are used in suitable media, such as infusion solutions, for example in aqueous saline or glucose solution, preferably in isotonic concentrations in the blood plasma.
  • Very pure hemoglobin is used as the starting material. This can be obtained using known methods from fresh blood from slaughter animals or, for example, from aged blood. Methods for obtaining purified hemoglobin are described in: Antonini E. et al. (Ed.): Hemoglobin (Colowick S.P., Kaplan N.O. (ed.): Methods in Enzymology, Volume 76), Academic Press, New York and others. 1,981th
  • deoxygenate the hemoglobin ie from its physiological ligand Oxygen liberates
  • only polymers made from deoxygenated hemoglobin during crosslinking have oxygen binding properties that enable their use as artificial oxygen carriers in the desired indications.
  • it can preferably be removed by chemical reaction with ascorbate ions.
  • pyridoxal-5'-phosphate in an amount optimized for the functional properties of the end product, is covalently bound to the pig or human hemoglobin as an effector of oxygen binding.
  • This connection of pyridoxal-5'-phosphate to hemoglobin is known in principle, for example the patent EP-P 0 528 841 describes a process for the preparation of pyridoxilated hemoglobin. The pyridoxylation leads to the desired half-saturation pressure values if the procedure is as described according to the invention.
  • a homotropic cooperativity of the oxygen binding sites with one another which is usually clearly lost through the crosslinking of the hemoglobin with the crosslinking agent glutardialdehyde, 2,3-bisphosphoglycerate, a (heterotropic) chemically non-reactive effector, is used before the crosslinking Oxygen binding of hemoglobin added.
  • Glutardialdehyde is used as the bifunctional crosslinker under the conditions according to the invention specified above.
  • the crosslinking produces crosslinked hemoglobins with a molecular weight distribution between approximately 50,000 and 5,000,000 g / mol (and larger, e.g. 10-15,000,000 g / mol).
  • a crosslinked hemoglobin is linked to a polyethylene oxide (MW) derivative, in particular the monofunctionally activated (methoxy) polyethylene glycol with a molecular weight of 1500-2500 g / mol mentioned above.
  • MW polyethylene oxide
  • the connection of polyethylene glycol (PEG), the so-called pegylation to and the crosslinking of hemoglolbins is known per se (see also E. Tsucheda (Hfsg): Blood Substituts: Present and Future Perspectives, Elsevier Science, Amsterdam 1998).
  • the result of the reaction sequence and conditions for this can on the one hand prevent the formation of a percolation distribution (by the dilution according to the invention), and on the other hand the formation of crosslinking and covalent bonds to hemoglobin e.g. undesirable changes in oxygen affinity and cooperativity caused by glutardialdehyde, pyridoxal phosphate and polyethylene oxide can be avoided and, in particular, high plasma compatibility can be achieved.
  • insoluble constituents can be removed by centrifugation (for example for 20 minutes with a relative centrifugal acceleration of 20,000 g).
  • the crosslinked hemoglobins are separated into a low and a higher molecular fraction by a (known) preparative process step, for example by volume exclusion chromatography or ultrafiltration, a fractional precipitation or a field-flow fractionation. If suitable methods are selected (for example, the nominal molecular weight cut-off limit of the ultrafiltration membrane or the molecular weight cut-off range of the gel used) are particularly important, all unused reactants and undesired reaction products are removed at the same time.
  • the temperature is from 2 to 42 ° C, preferably between 3 and 25 ° C.
  • This hemoglobin solution is stirred, by overflowing pure nitrogen, the hemoglobin is deoxygenated.
  • Hemoglobin added and allowed to react between 0.5 and 20, preferably between 1 and 7 h.
  • the pH is adjusted with sodium hydroxide solution or lactic acid (a concentration between
  • 0.1 and 1 preferably between 0.4 and 0.6 mol / L) to a value between 7.5 and 8.5, preferably between 7.7 and 8.2.
  • the pH of the solution is adjusted with lactic acid or sodium hydroxide solution (one
  • Hemoglobin added and between 5 and 50, preferably between 10 and
  • Crosslinker there are between 6 and 10, preferably between 7 and 9 mol
  • Glutardialdehyde per mole of hemoglobin dissolved in 1-4, preferably in 1.5 to 2 liters of water per liter of hemoglobin solution, is added within 3 to 10, preferably within 4 to 6 minutes and reacts between 1 and 6, preferably between 2 and 3 h to let.
  • the pH is adjusted to between 7.5 and 9.0, preferably between 7.6 and 0.1, with sodium hydroxide solution or alpha acid (a concentration between 0.1 and 1, preferably between 0.4 and 0.6 mol / L) 8.8.
  • mols of sodium borohydride (as a 1 molar solution in 0.01 molar sodium hydroxide solution) are added per mol of hemoglobin and allowed to react between 15 and 100, preferably between 30 and 80 minutes. Then 0 to 4, preferably between 0.5 and 3, liters of water are added per liter of the original hemoglobin solution.
  • the pH is adjusted to between 7.5 and 10, preferably between 8 and, using sodium hydroxide solution or lactic acid (a concentration between 0.1 and 1, preferably between 0.4 and 0.6 mol / L) 9, set.
  • sodium hydroxide solution or lactic acid a concentration between 0.1 and 1, preferably between 0.4 and 0.6 mol / L
  • an activated polyethylene oxide derivative preferably methoxy-succinimidylpropionate-polyethylene glycol, with a molecular weight between 500 and 3000, preferably 1000 and 2500 g / mol, in particular 2000 g / mol, are used per mol of monomeric hemoglobin. Mol added.
  • the reaction sequence according to the invention in particular the increase in the reaction volume in step iv) of the process, gives a product which can be used completely for the production of artificial oxygen carriers, in each case approximately half as a blood additive (the fraction with the crosslinked hemoglobins of higher degrees of polymerization: fraction I) and as a blood volume substitute (fraction II, with the low molecular weight proportions).
  • fraction I fraction with the crosslinked hemoglobins of higher degrees of polymerization
  • fraction II fraction II, with the low molecular weight proportions
  • the polymers of fraction I are thus sufficiently molecular uniform that they have a sufficiently low colloid osmotic pressure in the desirable therapeutic plasma concentration. Due to this molecular uniformity, both a small virial coefficient and a low viscosity are achieved.
  • the compatibility with the proteins of the blood plasma, sufficiently large immune tolerance and intravascular residence time, as well as a sufficiently low vasoconstrictive side effects, ie a low level of extravasation, of the polymers of the molecular fraction I is achieved by covalently linking polyalkylene oxides.
  • the manufacturing process enables modified and cross-linked hemoglobins to be prepared in just a few steps.
  • the selected process parameters lead to a defined distribution of modified hemoglobin polymers, which, as an artificial oxygen carrier, also takes into account the physiological conditions in the blood serum.
  • the cooperativity of the uncrosslinked hemoglobin in the crosslinked product is largely preserved and the semi-saturation pressure can be suitably adjusted.
  • the artificial oxygen carriers made from crosslinked hemoglobin produced according to the invention are compatible with plasma when used parenterally and can be used clinically as described.
  • Figures 1-3 show the following:
  • Figure 1 A mass-weighted distribution of the molecular sizes and molecular weights (M) of the pig hemoglobin polymer from Example 1, shown as Volume exclusion chromatogram (obtained with Sephacryl S-400 HR - Gel, Pharmacia, Freiburg, D). E 4 25 ⁇ m is the extinction in the chromatography eluate at 425 nm. The abscissa values 700,000 and 5,000,000 g / mol are shown.
  • Hemoqlobin contents were measured photometrically using the modified cyanhemiglobin method according to Drabkin ("Hemoglobin color test MRP 3", Boehimgerger Mannheim, D),
  • pH values were measured potentiometrically (pH glass electrode) with a blood gas analyzer ("ABL 5", Radiometer, Willich, D).
  • the molecular weight distribution of the crosslinked hemoglobins was determined by volume exclusion chromatography (according to: Pötzschke H. et al. (1996): "Crosslinked globular proteins - a new class of semisynthetic polymeric molecules: characterization of their structure in solution using the example of hyperpolymeric hemoglobin and myoglobin Volume exclusion chromatography, viscometry, osmometry and light scattering ", Macromolecular Chemistry and Physics 197, 1419 - 1437, and Pötzschke H. et al.
  • the electrolyte was then changed by volume exclusion chromatography (Sephadex G-25 - Gel, Pharmacia, D) to an aqueous electrolyte solution with the composition 125 mM NaCl, 4.5 mM KCI and 20 mM NaHCO 3 .
  • the yield was 77%; the yield for molecular weights greater than 700,000 g / mol is 28%.
  • 1 shows a representation of the distribution of the molar masses of the hemoglobin polymers obtained in the form of a volume exclusion chromatogram. Measurements of the characteristic of oxygen binding under physiological conditions (a temperature of 37 ° C., a carbon dioxide partial pressure of 40 Torr and a pH value of 7.4) gave the product a p50 value of 22 Torr and an n50 value of 1, 95.
  • a pH of 7.8 was set with 0.5 molar sodium hydroxide solution, 1.5 mol of sodium borohydride (as a 1 molar solution in 0.01 molar sodium hydroxide solution) was added and the mixture was left to react for one hour.
  • a pH of 7.3 was set with 0.5 molar lactic acid, initially 1.5 mol of 2,3-bisphosphoglycerate per mol of hemoglobin and after a reaction time of 15 minutes, 9 mol of glutardialdehyde per mol of hemoglobin, dissolved in 1.8 L of pure water per liter of hemoglobin solution to crosslink the hemoglobin within 5 minutes and react for 1 hour.
  • the electrolyte was then changed by volume exclusion chromatography (Sephadex G-25 - Gel, Pharmacia, D) to an aqueous electrolyte solution of the composition 125 mM NaCl, 4.5 mM KCI and 20 mM NaHC0 3 .
  • the yield was 79%; the yield for molecular weights greater than 700,000 g / mol was 28%.
  • the cross-linked pig hemoglobin showed no interactions with human plasma in the physiologically and pathophysiologically interesting pH range from 7.4 to 6.8, in particular no detectable precipitations, neither of the hemoglobin nor of plasma proteins.
  • a pH of 7.8 was set with 0.5 molar sodium hydroxide solution, 1.5 mol of sodium borohydride (as a 1 molar solution in 0.01 molar sodium hydroxide solution) was added and the mixture was left to react for one hour.
  • a pH of 7.3 was set with 0.5 molar lactic acid, initially 1.5 mol of 2,3-bisphosphoglycerate per mol of hemoglobin and, after a reaction time of 15 minutes, 9 mol Glutardialdehyde per mole of hemogloum, dissolved in 1.8 L of pure water per liter of hemoglobin solution for crosslinking the hemoglobin, is added uniformly within 5 minutes and allowed to react for 2.5 hours.
  • the electrolyte was then changed by volume exclusion chromatography (Sephadex G-25 - Gel, Pharmacia, D) to an aqueous electrolyte solution with the composition 125 mM NaCl, 4.5 mM KCI and 20 mM NaHCO 3 .
  • FIG. 3 shows a representation of the distribution of the molar masses of the hemoglobin polymers obtained in the form of a volume exclusion chromatogram.
  • the overall yield was 75%; the yield of polymer with a molecular weight greater than 700,000 g / mol was 17%.

Abstract

Die vorliegende Erfindung umfasst gemäss den Ansprüchen die Herstellung chemisch modifizierter, vernetzter Hämoglobine mit verbesserten funktionellen Eigenschaften, die nach diesem Verfahren hergestellten vernetzten Hämoglobine, sowie ihre Verwendung als künstliche Sauerstoffträger. Das Herstellungsverfahren ist gekennzeichnet sowohl durch technische Einfachheit, als auch hohe Ausbeuten. Hochreines desoxygeniertes Hämoglobin wird unter dem Schutz eines Antioxidationsmittels mit einem Effektor der Sauerstoffbindung, insbesondere Pyridoxal-5-phosphat, kovalent konjugiert, danach erfolgt die Polymerisierung des Hämoglobins mit Glutardialdehyd als bifunktionellem Vernetzer bei gleichzeitig starker Zunahme des Volumens des Reaktionsgemisches und abnehmender Konzentration des Hämoglobins während der Zugabe des Vernetzers. Anschliessend wird, nach weiterer Verdünnung mit Wasser, an die vernetzten Hämoglobine ein Polyethylenoxid-Derivat chemisch angeknüpft. Erhalten werden mit Blutplasma verträgliche Polymere mit optimierten Kooperativitäts- und Halbsättigungsdruckwerten, die als künstliche Sauerstoffträger, und insbesondere aufgeteilt in einen nieder- und einen hochmolekularen Anteil als Blutsubstitut bzw. als Blutadditiv, beispielsweise bei der Behandlung von Sauerstoffmangelzuständen Verwendung finden können.

Description

Künstliche Sauerstoffträger aus vernetzten! modifizierten Human- oder Schweinehämoglobin mit verbesserten Eigenschaften, Verfahren zu ihrer technisch einfachen Herstellung aus gereinigtem Material in hohen Ausbeuten, sowie deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung umfaßt gemäss den Ansprüchen die Herstellung chemisch modifizierter, vernetzter Hamoglobine mit verbesserten funktioneilen Eigenschaften, die nach diesem Verfahren hergestellten vernetzten Hamoglobine, sowie ihre Verwendung als künstliche Sauerstoffträger. Das Herstellungsverfahren ist gekennzeichnet sowohl durch technisch Einfachheit als auch hohe Ausbeuten.
Hochreines desoxygeniertes Hämoglobin wird unter dem Schutz eines Antioxidationsmittels mit einem Effektor der Sauerstoffbindung, insbesondere Pyridoxal-5-phopshat, kovalent konjugiert, danach erfolgt die Polymerisierung des Hämoglobins mit Glutardialdehyd bei sehr starker Zunahme des Volumens des Reaktionsgemisches und somit sehr starker Verdünnung der Reaktanden während der Zugabe des Vernetzers. Anschließend wird nach Verdünnung mit Wasser an die vernetzten Hamoglobine ein Polyethylenoxid-Derivat chemisch angeknüpft. Erhalten werden mit Blutplasma vertägliche Polymere mit optimierter Sauerstoffbindungs-Charakteristik, die als künstliche Sauerstoffträger, insbesondere aufgeteilt in einen nieder- und einen hochmolekularen Anteil als Blutsubstitut bzw. als Blutadditiv, beispielsweise bei der Behandlung von Sauerstoffmangelzuständen, Verwendung finden können.
In der Medizin ist es aus verschiedenen klinischen Indikationen wünschenswert, ein künstliches Unterstützungssystem für den Sauerstofftranspo t verfügbar zu haben. Im Falle eines akuten Blutverlustes erscheint es nämlich nicht nur sinnvoll, das Flüssigkeitsvolumen isoton und isonkotisch zu ersetzen, sondern auch eine weitere wesentliche Funktion des Blutes, nämlich die des Sauerstofftransports zu restituieren. Bei sinkender Bereitschaft zur Blutspende stehen immer seltener im akuten Katastrophenfall (u. a. auch im Kriegsfall) passende Blutkonserven zur Verfügung, um insbesondere einen unvorhersehbaren Bedarf decken zu können. Die momentane Verfügbarkeit geeigneter Blutkonserven bringt zudem erhebliche logistische Probleme mit sich. Femer lassen sich Blutkonserven in der Regel nur etwa 35 Tage lagern und müssen deshalb ständig erneuert werden - was erhebliche Kosten bereitet - während künstliche Lösungen wesentlich länger aufzubewahren sind, da sie gegebenenfalls eingefroren werden können. Abhängig von der Lagerzeit säuern sich Blutkonserven intrazellulär an, dadurch ist ihre Sauerstoffbindungscharakteristik akut keineswegs optimal, vielmehr muß diese im Organismus zunächst wieder regeneriert werden. Dagegen funktioniert ein künstlicher Sauerstoffträger vom ersten Moment an optimal. Der zunehmend mangelnden Bereitschaft zur Blutspende steht auf der anderen Seite die steigende Überalterung der Bevölkerung bedarfserhöhend gegenüber. Zugleich vermindert sich wegen der Überalterung auch die Zahl der potentiellen Blutspender. Ebenso ist wegen unübersehbarer Infektionsrisiken (Immunschwäche, Hepatitis) die Bevölkerung der Vorstädte („slums") als Blutspender ausgefallen. Ein künstlicher Sauerstoff-transportierender Blutersatz wäre auch, unabhängig von der Blutgruppe, universal. Es ist zudem möglich, daß mit einem solchen Blutersatz ein Volumenmangelschock eher durchbrochen werden kann als mit einer Blutkonserve, da die Erythrozyten in der Konserve versteift sind und dadurch eine verringerte Kapillardurchgängigkeit aufweisen. Jedenfalls haben Tierversuche ergeben, daß ein Volumenmangelschock mit sauerstofftransportierendem Blutersatz wirksamer bekämpft werden kann, als mit einfachen Plasmaexpandern (Pabst R. (1977): „Sauerstofftranspprt mit stromafreien Hämoglobinlösungen und Fluorocarbonen", Med. Klin. 72: 1555 - 1562, Keipert P. E., Chang T. M. S. (1985): „Pyπ'doxylated Polyhemoglobin as a Red Cell Substitute for Resuscitation of Lethal Hemorrhagic Shock in Conscious Rats", Biomater., Med. Dev., Artif. Organs J_3: 1 - 15). Weitere Anwendungen eines künstlichen Sauerstoffträgers kommen hinzu: Komplizierte operative Eingriffe, welche notwendig mit hohen Blutverlusten einhergehen, lassen sich zunehmend weniger durchführen, weil die entsprechenden Blutkonserven fehlen. Demgegenüber erarbeitet man immer größere und invasivere operative Eingriffe - wozu insbesondere auch Transplantationen zählen -, deren Ausführung im Einzelfall entscheidend von der Verfügbarkeit ausreichend vieler geeigneter Blutkonserven abhängt. Weiterhin sind für eine Transplantation vorgesehene Organe weit besser zu konservieren, wenn sie mit (künstlichen) Sauerstottträgern perfundiert werden. Allein eine Lebertransplantation benötigt bis zu 100 Transfusionseinheiten zu je 450 mL. In Fällen polytraumatischer Schädigungen (beispielsweise durch einen Autounfall) werden ähnliche große Mengen benötigt.
Aber nicht nur im Falle eines akuten Blutverlustes, sondern auch im Falle chronischer Durchblutungsstörungen (insbesondere cerebrale, koronare, renale und periphere - beispielsweise beim Hörsturz - oder einer anämischen Krise etwa im Falle chronischer Osteomyelitis oder nach Tumor-Chemotherapie) besteht ein Bedarf für einen künstlichen Sauerstoff-transportiereπden Blutzusatz. Auch um im Falle eines fetalen Sauerstoffmangels durch eine Plazenta-Insuffizienz einen drohenden Abort zu verhindern oder zur Verhinderung von Sauerstoffmangelschäden unter der Geburt, bietet sich die Anwendung des Additivs an oder aber zur Entwöhnung von der Beatmung. Ein Bedarf solcher Art ist sogar wesentlich größer als für den vorher genannten Fall eines akuten Blutverlustes: Jährlich sind für etwa 750 000 Menschen in Deutschland solche chronischen Durchblutungsstörungen die Todesursache. Hinzu kommen noch die Krankheitsfälle aus dieser Ursache. An Krebs dagegen sterben jährlich lediglich etwa die Hälfte Menschen. Man versucht bekanntermaßen chronische Sauerstoffgewebsmängel durch hyperbare Sauerstoffzufuhr zu therapieren. Abgesehen davon, daß diese Therapie nur solange wirkt, wie der Sauerstoffüberdruck herrscht und abgesehen davon, daß das Vorgehen nicht ungefährlich ist, besteht hierbei die Gefahr oxidativer Gewebeschädigung durch radikalische Sauerstoffreaktionen, die über entsprechende Reaktionsprodukte nachweisbar sind. Ein künstlicher Sauerstoffträger wirkt, solange er vorhanden ist, und er offeriert dem Gewebe sogenannten Niederdruck-Sauerstoff, so dass die genannten Schäden nicht aufträten. Die Anwendung eines sauerstofftransportierenden Blutadditivs als vorübergehende Unterstützung des endogenen Sauerstofftransportsystems stellt eine weitere Möglichkeit und Alternative zur Bekämpfung des chronischen geweblichen Sauerstoffmangels dar, den man bisher mit durchblutungsfördernden Mitteln(z.B. Gefäßdilatoren) zu therapieren versucht.
Für die Art der Anwendung kommt dem Konzept sehr zu gute, daß es sich um eine funktioneile Sauerstoff-Therapie handelt: Nicht das Substrat (der Sauerstoff) wird appliziert, sondern die Funktion des Trägersystems wird verbessert, das den Sauerstoff zu den Geweben bringt. Dies macht die Therapie in ihrer Wirkung multiplikativ, somit sehr effektiv, und gibt ihr gleichsam einen katalytischen Charakter. Hinzu kommen noch deutliche Hinweise, daß ein im Plasma gelöster Sauerstofftrager viel wirksamer ist, als ein in Erythrozyten „abgepackter". Weiterhin kann ein solcher künstlicher Blutersatz frei von bekannten Erregern hergestellt werden; Infektionsprobleme, wie Hepatitis und erworbener Immundefekt (AIDS) sind auf diese Weise vermeidbar.
Eine zusätzliche potentielle Empfängergruppe für künstliche sauerstofftranspor- tierende Lösungen sind Patienten, welche eine allergische Reaktion, beispielsweise auf HLA-Antigene, erwarten lassen. Bisher versucht man die Leukozyten durch eine Filtration über Baumwolle aus Blutkonserven zu entfernen. Künstliche Blutersatzlösungen wären dagegen völlig frei von Leukozyten. In neuerer Zeit hat man an Schweinen beobachtet, dass nach Verbesserung der Sauerstoffversorgung (Herabsetzung der Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins) das Schlagvolumen des Herzens verringert wird und die Herzfrequenz unbeeinflusst bleibt (Villereal M. C, et al. (1987): „Engineered Red Blood Cells with Modified Oxygen Transport Properties: A New Oxygen Carrier", Biomater., Med. Dev., Artif. Organs 15: 397). In einer anderen Arbeit (Bosman R. J., et al. (1992): „Free Polymerized Hemoglobin Versus Hyroxyethyl Starch in Resuscitatioπ of hypovolemic Dogs", Anesth. Anaig. 75: 811 - 817) wurde gezeigt, daß die Applikation sauerstofftransportierender Lösungen nach einem Volumenmangelschock beim Hund die Zunahme des Herzzeitvolumens verhindert und somit das Herz schont. Hier eröffnet sich die Möglichkeit, durch Verbesserung der Sauerstoffversorgung eine funktionelle kardiale Protektion zu . erreichen, was beispielsweise im Falle eines Infarkts hilfreich ist. Das wäre ein völlig neuer Aspekt für die Anwendung sauerstofftransportierender Lösungen.
Eine weitere Anwendung solcher künstlicher Sauerstoffträger wäre die Erhöhung der Strahlungsempfindlichkeit von Tumoren, zumal sich mehr und mehr andeutet, daß molekulare, im Plasma gelöste Sauerstoffträger sehr viel effektiver Sauerstoff an das Gewebe abgeben, als Vollblut: Solche künstlichen Träger bewirken eine Synergie mit dem nativen (intraerythrozyteren) Träger. D. h., dass der molekular-disperse künstliche Träger im Blutplasma nicht nur per se am besten Sauerstoff aus der Kapillare abgibt, sondern zudem die Sauerstoffabgabe des vorhandenen nativen Systems verstärkt, und zwar über den Mechanismus der erleichterten Diffusion. Das bedeutet, daß man für diesen Zweck nur eine geringe Konzentration des künstlichen Traget 0 im πasrna benötigt. Trotzdem bleibt diese funktioneile Therapie (siehe oben) äußerst effektiv.
Alles Gesagte verdeutlicht den Bedarf eines künstlichen Sauerstofftransporteurs. Unerläßlich für die Nutzung eines künstlichen Sauerstoffträgers ist, dass sein Ausgangsmaterial in ausreichender Menge zur Verfügung steht. Verfallene Blutkonserven lösen das Problem somit nicht. Deshalb ist es notwendig, Tier- hämoglobine zu verwenden, vorzugsweise von den wichtigsten Schlachttieren: Rind und/oder Schwein.
Aus der Darstellung des Bedarfs künstlichen Sauerstoffträger ergeben sich grob zwei Typen der Anwendung: einerseits im Falle eines starken Blutverlustes und andererseits im Falle eines chronischen Sauerstoffmangels. Im ersten Fall benötigt man zur Kompensation ein iso-onkotisches, Sauerstoff transportierendes Volumensubstitut (künstliche Sauerstofftrager der ersten Generation), im zweiten Fall dagegen ein Sauerstoff-transportierendes Blutadditiv (künstliche Sauerstoffträger einer zweiten und neuen Generation). Wie erwähnt, ist der letzte Fall der weitaus häufigere. Im übrigen erlaubt ein entsprechendes Blutadditiv, in Kombination mit einem sogenannte Plasmaexpander, auch die Therapie eines akuten Blutverlustes mit dem großen Vorteil, daß der Arzt die Möglichkeit hat, sowohl die Gabe von Sauerstoffträgern als auch des Flüssigkeitsvolumen, auf den Bedarf des einzelnen Patienten abzustimmen.
Auch der Organismus vermag beides (Menge des Sauerstoffträgers und Blutvolumen) unabhängig voneinander zu verändern, nämlich die Erythrozytenbildung über Erythropoetin und das Plasmayolumen über ein eigenes Regulationssystem. Beide Größen sind dadurch entkoppelt, daß der Träger im Blut einen sehr viel kleineren kolloidosmotischen Druck hat als das Plasma.
Bisher wurden von anderen drei grundsätzlich verschiedene Strategien zur Entwicklung eines künstlichen Sauerstoffträgers für das Blut verfolgt (Stand der Technik: Rudolph A. S. et al. (Hrsg.): Red Blood Cell Substitutes: Basic P nciples and Clinical Applications, Marcel Dekker, New York u. a. 1998; Tsuchida E. (Hrsg.): Blood Substitutes: Present and Future Perspectives, Elsevier Science, Amsterdam 1998; Chang T. M. S. (Autor bzw. Hrsg.): Blood Substitutes: Pnnciples, Methods, Products and Clinical Trials, Volume 1 und ~ Volume 2, Karger Landes, Basel u. a. 1997 und 1998) Verwendung von Emulsionen mit hluorkohlenwasserstoffen - neuerdings setzt man auch andere Halogene wie Brom ein -, in welchen Sauerstoff besonders gut löslich ist (Hirlinger W. K., et al. (1982): „Auswirkungen eines teilweisen Blutaustausches mit Fluosol DA 20% auf den intakten Organismus des Schweines", Anästhesist 3 . 660 - 666). Da die Fluokarbone lipophil sind, ist jedoch zu erwarten, daß Wechselwirkungen und Störungen in den Lipidschichten der Zellmembranen auftreten. Letztere sind integrierende funktionelle Bestandteile der Zelle. Zudem müssen die Fluokarbone mit Emulgatoren, wie Phospholipide dispergiert werden, welche zusätzlich mit den Membranen der Zellen interferieren können (so benannte künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Fluorkarbonen der ersten Generation).
Eine weitere Strategie stellt die Mikroverkapselung hochkonzentrierter Lösungen natürlichen und auch chemisch modifizierten Hämoglobins in Phospholipidvesikeln unter Zusatz geeigneter Effektoren der Hämoglobinbindung („künstliche Erythro- zyten oder Hämosomen") dar (Ogata Y. (1994): „Characteristics of Neo Red Cells, Their Function and Safety: In-Vivo Studies", Artificial Cells, Blood Substitutes, and Immobilization Biotechnologies 22: 875 - 881). Auf diesem Felde sind auch erste Tierversuche gelungen (Hunt C. A., et al. (1985): „Synthesis and Evaluation of a Protypal Artificial Red Cell", Science 230: 1165 - 1168). Die Vesikel hatten einen Durchmesser von weniger als 0,05 μm und waren damit vom Volumen her um gut zwei Zehnerpotenzen kleiner als natürliche rote Blutzellen. Die dritte Strategie besteht in der Herstellung infundierbarer Hämoglobinlösungen. Der künstliche Sauerstofftrager liegt dann im Blut extrazellulär vor. Während man die beiden ersten Problemlösungen als Herstellen eines künstlichen Blutes ansehen kann, so daß die Schwierigkeit einer kollσid-osmotischen Interferenz nicht auftreten kann, stand bei dieser Problemlösung ein Plasmaexpander am Anfang, dessen Makromoleküle auch Sauerstoff transportieren können (so benannte künstliche Sauerstoffträger auf der Basis von Hämoglobin der ersten Generation).
Natives Hämoglobin ist hierfür nicht brauchbar, da es beispielsweise zu schnell über die Niere ausgeschieden wird. Eine chemische Modifikation ist deshalb unerläßlich. Im Rahmen dieser Strategie hat man beispielsweise das Hämoglobin über seine Aminogruppen kovalent an Dextrane gebunden oder selbst bis zu einem Molekulargewicht von etwa 700 000 g/mol polymerisiert. Ersteres wurde beispielsweise von der Firma Fresenius (r-resenius E. (1976): „Blood and Plasma Substitute - Comprising a Colloidal Solution of Hydroxyethyl Starch Coupled to Haemoglobin Free Stroma", Patentschrift DE-P 2616-086 ) und letzteres von der Firma Biotest (Bonhard K., et al. (1983): „Verfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, sterilen, pyrogenfreien und stromafreien Hämoglobinlösungen", Patentschrift DE-0 31 30 770 ) und der Firma Alza (Bonsen P. (1976): „Water-soluble Polymerized Hemoglobin", Patentschrift DE-0 26 07 706) verfolgt. Eine weitere Strategie bezüglich extrazellulärer Lösungen ist, das Hämoglobin zu stabilisieren, indem man es intratetramer vernetzt oder indem man Seitengruppen anhängt (Oligo-Ethylenglykol), ohne das (tetramere) Molekulargewicht wesentlich zu erhöhen (stabilisierte Hamoglobine (Matsushita M., et al. (1987): „In vivo Evaluation of Pyridoxylated Hemoglobin-Polyoxyethylene Conjugate", Biomat., Artif. Cells, Artif. Org. 15: 377). Wie weiter oben erwähnt, haben extrazelluläre Blutersatzlösungen in Tierversuchen bezüglich einer Schockbehandlung erfolgversprechende Ergebnisse gebracht.
Vorteil der Verwendung von Hämoglobinen als künstliche Sauerstoffträger - gegenüber Fluorkarbonen - ist, daß sich die günstigen Eigenschaften der natürlichen Sauerstoffbindung nutzen lassen. Dazu gehören die optimal angepaßte mittlere Sauerstoffaffinität, die homotrope Kooperativität, also die S-Form der Sauerstoffbindungskurve, sowie der (alkalische) Bohreffekt, der die Basis eines natürlichen selbstregulatorischen Mechanismus zur gezielten Sauerstoffabgabe an mangelversorgte Gewebe bildet.
Aus der diesbezüglichen Literatur geht klar hervor, daß eine intra-tetramere kovalente Verknüpfung der Hämoglobinuntereinheiten (Keipert P.E., et al. (1989): „Metabolism, Distribution, and Excretion of HbXL: A Nondissociation Interdime- rically Crosslinked Hemoglobin with Exceptional Oxygen Offloading Capability", - in: Chang T. M. S., Geyer R. P. (Eds.): Blood Substitutes, Marcel Dekker, New York 1989) und/oder eine Polymerisation des Hämoglobins zu einer starken Erhöhung der Verweildauer im Blut führt (Chang T. M. S.(1987): „Modified Hemoglobin as Red Cell Blood Substitutes", Biomater., Med. Devices Artif. Organs 14: 323 - 328; Friedman H. J., et al. (1984): „In Vivo Evaluation of Pyridoxylated- Polymerized Hemoglobin Solution", Surg., Gynecol., Obstet. 159: 429 - 435). Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die klinische Brauchbarkeit solcher Lösungen. Im Fall der extrazellulären molekuiσi-uioμeiöeii künstlichen Sauerstofftrager hat man jedoch bisher an einem sehr großen Bedarfsfeld - dem chronischen Sauerstoffmangel - vorbeientwickelt, indem isonkotische Lösungen angestrebt wurden. Die, wie bereits erwähnt, wesentlich häufiger auftretenden Folgen chronischer Durchblutungsstörungen lassen sich jedoch nur durch sauerstofftransportierende Lösungen bessern, deren kolloidosmotischer Druck gegen den normalen (35 mbar) zu vernachlässigen ist, also nur mit Hilfe eines sauerstofftransportierenden Blutadditivs, gewissermaßen eines „molekularen Erythrozytenkonzentrats". Dies sind künstliche Sauerstoffträger auf der Basis von Hämoglobin einer zweiten Generation.
Bei den verschiedenen Ansätzen, einen künstlichen Sauerstofftransporteur zu entwickeln, traten nachfolgend genannte Probleme auf:
• Erhöhung der Sauerstoff-Hämoglobin-Affinität: der Halbsättigungsdruck (P50) nimmt durch die chemische Modifikation am Hämoglobinmolekül ab. Dadurch wird die Abgabe des Sauerstoffs an das Gewebe erschwert. Dies tritt ausgeprägt bei der Bindung des Hämoglobins an Dextran auf. Um die Erhöhung der Sauerstoffaffinität zu vermeiden, hat man geeignete Effektoren (beispielsweise Pyridoxalphosphat) an die prosthetische Gruppe des Hämoglobins gebunden.
• Oftmals verkleinert sich zugleich der sogenannte n50-Wert (HILL-Index) als Ausdruck verringerter homotroper Kooperativität (abgeschwächte S-Förmigkeit der Sauerstoff-Hämoglobin-Bindungskurve), was ebenfalls die Versorgung der Gewebe mit Sauerstoff erschwert. Diese S-Förmigkeit der Sauerstoff- Hämoglobin-Bindungskurve erleichtert zugleich die Aufnahme des Sauerstoffs in der Lunge und dessen Abgabe an die Zellen. Fluorkarbone besitzen dagegen eine lineare "Sauerstoffbindungskurve" und haben daher nicht diesen funktionellen Vorteil.
• Der künstliche Sauerstoffträger hat oftmals eine zu geringe Verweildauer im Organismus, die Ausscheidung der gelösten Hamoglobine erfolgt über die Niere. Im Falle extrazellulärer Hämoglobinlösungen als künstliche Sauerstoff- träger hat man versucht, die Ausscheidung durch intermolekulare Vernetzung zu verhindern; jedoch bleibt trotzdem die Verweildauer der extrazellulären Hamoglobine kleiner als gewünscht. Hämosomen werden dagegen durch das Retikuloendotheliale System des Organismus aus dem Plasma entfernt. Bei- spielsweise betrug die Halbweπszen αer Kunstlichen Erythrozyten (siehe oben) nur 5,8 Stunden.
• Zu großer kolloidosmotischer Druck: Dadurch kann es zum Volumenverlust kommen (Volumenmangelschock). Dieser Effekt tritt auf, wenn das Molekulargewicht des künstlichen Sauerstoffträgers mit dem der Plasmaproteine vergleichbar ist. Auch ist man hierdurch mit der Dosierung des künstlichen Sauerstoffträgers nicht frei, sondern muß auf die onkotischen Verhältnisse Rücksicht nehmen.
• Das onkotische Milieu des Plasmas wird weiterhin entscheidend durch den sogenannte zweiten Virialkoeffizienten (A2-Wert) bestimmt: Dieser charakterisiert die Wechselwirkung des (stets makromolekularen) Sauerstoffträgers mit dem Lösungsmittel (Wasser). Die Synthese ist so einzurichten, daß dieser Wert nahe null ist.
• Zu hohe Viskosität der Trägerlösung: Diese geht in der Regel mit einem zu großen A2-Wert einher, und sie tritt bevorzugt auf, wenn ein Träger aus Kettenmolekülen besteht. Eine zu große Viskosität tritt dem EINSTEINschen Viskositätsgesetz gemäß nicht auf, wenn die polymeren Trägermoleküle kugelig und kompakt sind.
» In vitro - Stabilität der Trägermoleküle. Diese bezieht sich einerseits auf den Zerfall der Moleküle und andererseits auf die oxidative Bildung von Met- Hämoglobin, welches keinen Sauerstoff mehr zu binden vermag und schließlich auf die Viskosität durch sich langsam ändernde Wechselwirkungen zwischen dem Träger und dem Albumin des Plasmas.
• Übermäßige Reaktion des retikuloendothelialen Systems (RES): Hauptsächlicher Einflußfaktor ist die molekulare Größe des künstlichen Trägers. Es gibt dafür eine kritische Grenze bei rund 0,3 μm: Größere Teilchen aktivieren das RES.
• Nieren- und Leberschädigung: Ein Nierenschock tritt vor allem dann auf, wenn stromahaltige Hämoglobinlösung verwendet wurde. Seit man die Lösungen ultrafiltriert, wurde eine Nierenschädigung nicht mehr beobachtet. Leberschädigungen wurden mit Hilfe des Plasmatransaminase-Spiegels indiziert, sie beruhen vermutlich auf zellulären Membran-Wechselwirkungen: die Leber besitzt eine offene Strombahn (fenestrierte Kapillaren). • Zu überprüfen ist auch die Biuisimung; es sind Störungen im Sinne einer Förderung und einer Hemmung denkbar, zu achten ist insbesondere auf die Thrombozytenaggregation.
• Antigene Wirkung: Dazu wurde neuerdings in Homologversuchen an Ratten gezeigt, daß natives Hämoglobin nicht antigen wirksam ist und daß die Polymerisation mit Glutardialdehyd die Antigenität nicht erhöht (Hertzman C. M., et al. (1986): „Serum Antibody Titers in Rats Receiving Repeated Small Subcutaneous Injection of Hemoglobin or Polyhemoglobin: A Preliminary Report", Int. J. Artif. Organs 9: 179 - 182). In der gleichen Arbeit wird gezeigt, daß natives und polymerisiertes Human-Hämoglobin bei Ratten wenig antigen wirkt und daß der Effekt durch die Polymerisation höchstens geringgradig verstärkt wird.
• Toxische Wirkungen lassen sich als pyrogen, vasokonstriktorisch - beispielsweise an den Koronargefäßen - und endotoxisch differenzieren. Die vasokon- striktorische Wirkung beruht vermutlich auf dem Einfangen der Stickstoffmonoxid-Radikale, welche bekanntlich endogene vasodilatorische Steuersubstanzen sind; die vasokonstriktorische Wirkung lässt sich jedoch auch durch die hohe Wirksamkeit der künstlichenTräger erklären, indem die glatte Muskulatur „zu gut" mit Sauerstoff versorgt wird.
• in vivo - Stabilität: Zu denken ist an einen endogenen enzymatischen Abbau, beispielsweise durch Proteasen.
• Überlastung des Organismus mit Lipoiden (Emulgatoren): Diese Komplikation tritt bei der Anwendung mikroverkapselter Hämoglobinlösungen und Fluokarbonen auf; hierbei wurde an Ratten eine Komplementaktivierung über den alternativen Weg sowie eine Antikörperbildung festgestellt.
• Verträglichkeit der künstlichen Träger mit frischem menschlichen Blutplasma, abhängig vom pH-Wert kann es zu Fällungen kommen.
Vermutlich wegen der hier angeführten Probleme steht bislang ein künstlicher Sauerstofftrager für die klinische Routineanwendung nicht zur Verfügung. Aus der Nennung der manigfachen Probleme geht hervor, dass es nach wie vor einen großen Anforderungskatalog an einen brauchbaren künstlichen Sauerstofftrager gibt. In der Natur wird Sauerstoff stets m miMusκupischen Riesenaggregaten transportiert. Es haben sich hier zwei grundsätzlich verschiedene „Problemlösungen" entwickelt. Bei höheren Tieren (und auch beim Menschen) ist der molekulare Sauerstoffträger in Zellen (in den Erythrozyten) abgepackt. Zweitens entwickelten sich Sauerstoff bindende Riesenmoleküle, die sich nicht intrazellulär, sondern extrazellulär in einer Hämolymphe gelöst finden, diese Variante trifft man vorwiegend bei niederen Tieren in verschiedener Ausprägung an. Anneliden besitzen beispielsweise hochmolekulare Hamoglobine mit einem mittleren Molekulargewicht um 3 000 000 g/Mol als Sauerstoffträger. Femer gibt es sogenannte Häm- erythrine, bei welchen das Eisen, als Sauerstoffbinder, selbst direkt mit dem Protein molekular verknüpft ist. Schließlich findet man die Hämocyanine mit einem Molekulargewicht um 8 000 000 g/Mol, bei welchen Kupfer das Sauerstoff bindende Schwermetall-Ion ist, vgl. auch Barnikol W. K. R., et al. (1996): „Hyperpolymere Hamoglobine als künstliche Sauerstoffträger. Ein innovativer Ansatz der medizinischen Entwicklung", Therapiewoche 46: 811 - 815. Der entwicklungsgeschichtliche Übergang vom extrazellulär gelösten Sauerstoffträger zum Erythrozyten hat dazu geführt, daß sich der Sauerstoffgehalt der Blutflüssigkeit um den Faktor drei erhöht: Während 1 mL „Blut" des Regenwurms nur 3,6 μmol Sauerstoff maximal zu binden vermag, werden in dem gleichen Volumen des Menschenbluts bis zu 9,0 μmol Sauerstoff gebunden.
Der Regenwurm besitzt in seinem Blut Riesenmoleküle (Erythrocruorin) als Sauerstofftrager mit einem Molekulargewicht von etwa 3400000 g/mol mit rund 200 Bindungsstellen für Sauerstoff. Zudem ist das Molekül sehr kompakt und seine Quartärstruktur hochgeordnet. Das Molekül ist so groß, daß man es mit Hilfe des Elektronenmikroskops direkt sichtbar machen kann. Seine Konzentration in der Hämolymphe beträgt mindestens 6 g/dL. Vermessen der Sauerstoffbindungskurve unter simulierten In-vivo-Bedingungen ergibt einen Halbsättigungsdruck (P50) von 9,1 Torr (Barnikol W. K. R., Burkhard O. (1987): „Highly Polymerized Human Haemoglobin as an Oxygen Carrying Blood Substitute", Advances in Experimental Mediane and Biology Volume 215: 129 - 134; Barnikol W.K.R. (1986): „The Influence of Glutardialdehyde on the Oxygen Cooperativity of Human Hemoglobin", Pflügers Archiv 406: R 61). Dieses System versorgt also die Zellen des Regenwurms ausreichend mit Sauerstoff. Durch das extrem hohe Molekulargewicht hat das Hämogiuuiπ αes egenwurms praktisch keine kolloid- osmotische Wirkung mehr (nur etwa 0,4 mbar). Damit sind, wie im Blut des Säugers - der onkotische Druck der Erythrozyten beträgt nur 10'7 Torr - die beiden Funktionen Kolloidosmolarität und Sauerstoffbindung entkoppelt, und beide können als Stellgrößen vom Organismus frei variiert werden. Will man das Prinzip desRegenwurm-Systems auf künstliche Sauerstofftrager, die auf menschlichem oder tierischem Hämoglobin beruhen, übertragen, so muß das Hämoglobin-Molekül so verändert werden, daß es als extrazelluläres Riesenmolekül mit vernachlässigbarem onkotischen Druck den normalen Sauerstofftransport der Erythrozyten zumindest zeitweilig unterstützen kann. Solche künstlichen Sauerstoffträger sind dann hochpolymerisiertes Hämoglobin, welches allen oben erwähnten Problematiken Rechnung tragen muß. Regenwurm-.Hämoglobin", welches zwar die Anforderungen an onkotischen Druck erfüllt, wird sich zu diesem Zweck für den Menschen nicht verwenden lassen, weil es eine vermutlich zu große Aπtigenität besitzt; zudem ist der Halbsättigungsdruck mit 9 Torr zu niedrig (Barnikol W. K. R., Burkhard O. (1987): „Highly Polymerized Human Haemoglobin as an Oxygen Carrying Blood Substitute", Advances in Experimental Medicine and Biology, Volume 215: 129 - 134; Barnikol W.K.R. (1986): „The Influence of Glutardialdehyde on the Oxygen Cooperativity of Human Hemoglobin", Pflügers Archiv 406: R 61). Zudem ist es vermutlich nicht in den erforderlichen Mengen gewinnbar.
Bisher wurde bei der Entwicklung künnstlicher Sauerstoffträger deren Halbsättigungdruck genau auf den für den Menschen normalen Wert von etwa 26 Torr einzustellen versucht. Tierversuche zeigen allerdings, daß ein molekulardisperser künstlicher Sauerstoffträger mit einem Haibsättigungsdruck von etwa 15 Torr Organe am besten oxygeniert (Conover et al. (1999), Art. Cells, Blood Subst, and Immobil. Biotech. 27 93 - 107). Andererseits zeigen aber Tierversuche auch, daß für eine ausreichende Sauerstoffversorgung mindestens ebenso wichtig eine genügend große Sauerstoffkapazität des Blutes ist (Moss G. S., et al. (1984): „Hemoglobin Solution - From Tetramer to Polymer", - in: The Red Cell: Sixth Aven Arbor Conference, Alan R. Riss, New York 1984: 191 - 210). Diese hängt wiederum von der möglichen Konzentration des Sauerstoffträgers im Plasma ab. Weiterhin zeigte sich hierbei, daß ein Halbsättigungsdruck von 26 Torr nicht unbedingt eingehalten werden muis. wesentlich ist vielmehr, daß ein bestimmter kritischer Wert nicht unterschritten werdem darf.
Zu den Forderungen bei der Entwicklung eines künstlichen Sauerstoffsträgers kommt hinzu, dass ein Herstellungsverfahren möglichst einfach und damit wirtschaftlich sein soll, vor allem, da ab initio steril gearbeitet werden muss . Das Produkt soll in möglichst großer Ausbeute erhalten werden können. Es sollte zugleich Material zur Verwendung als Blut-Additiv sowie solches zur Verwendung als Sauerstoff-transportierende Blutvolumen-Substitut während der Vernetzungsreaktion entstehen.
Insbesondere ist ferner bei der Herstellung der künstlichen Polymeren aus Hämoglobin durch Verknüpfung der Hämoglobin-Moleküle über ihre Aminogruppen mittels geeigneter bifunktioneller Verπetzer darauf zu achten, dass sich nicht molekulare Netzwerke bilden , die unlöslich sind und daher die Produktausbeute verringern. Daher ist das Entstehen der sogenannten sogenannte Perkolations-Verteilung des Molekulargewichts zu verhindern:
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, hypo-onkotische künstliche Sauerstoffträger aus vernetztem Hämoglobin, die optimierte gute funktioneile Eigenschaften, insbesondere der Charakteristik der Sauerstoffbindung, besitzen und die geeignet sind als Pharmazeutikum im Menschen angewendet zu werden, in einem technisch einfachen Prozess in großer Ausbeute herstellen zu können.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß, wie nachfolgend beschrieben, gelöst. Das fundamentale Problem der Entstehung einer Perkolationsverteilung der Multimerisationsgrade und Molekulargewichte durch die Vernetzung der polyfunk- tionellen Hamoglobine mit dem bifunktionellen Vernetzer Glutardialdehyd konnte überraschenderweise dadurch beseitigt werden, indem während der Vernetzung das Volumen des Reaktionsgemisches sehr stark (insgesamt 2- bis 10-fach) vergrößert wird, und zwar, indem zunächst zugleich der Vernetzer in verdünnter Lösung zugegeben und anschließend zusätzlich mit Wasser verdünnt wird. Dadurch entstehen vernetzte Hamoglobine mit hohem Verπetzungsgrad in großer Ausbeute, ohne dass eine Perkolationsverteilung der Molekulargewichte unter Bildung unlöslicher molekularer Netzwerke entsteht. Das Rohprodukt der Vernetzung zeichnet sich vielmehr αurcn eine oestimmte gewünschte (ungefähre) Obergrenze des Molekulargewichtsbereichs aus. Man erhält im Gel- Chromatogramm eine sogenannte Viereck-Verteilung des Molekulargewichtes (vgl. Fig. 1 , Fig. 2 und Fig. 3).
Die erfindungsgemäße Herstellung umfasst also folgende Schritte:
In einer Eintopf-Reaktion wird Hämoglobin i) zunächst desoxygeniert, insbesondere durch Überströmen mit Stickstoff; ii) anschließend kovalent mit einem chemisch reaktiven Effektor der Sauer- stoffbindung umgesetzt ; iii) dann die Lösung mit einem chemisch nicht reaktiven Effektor versetzt und sodann iv) das Hämoglobin mit Glutardialdehyd, unter sehr starker Verdünnung (2- bis 5-fach) des Volumens des Reaktionsgemisches, bei gleichzeitiger Zugabe des Vernetzters (in Lösung)), stabil kovalent miteinander vernetzt und anschließend das Reaktionsvolumen mit Wasser weiter erhöht (Gesamtverdünnung der Lösung auf das 2-10, insbesondere 2-7, besonders 5-6-fache an Volumen) und sodann v) ein Polyethylenoxid kovalent angeknüpft .
Das erhaltene Produkt kann in bekannter Weise aufgearbeitet werden.
Bevorzugt stammt das Ausgangshämoglobin vom Schwein oder vom Menschen, ganz besonders bevorzugt vom Schwein, besonders vom Hausschwein.
Insbesondere wird erfindungsgemäß in Schritt iii) Glutardialdehyd in einer sehr stark verdünnten Lösung zeitgesteuert zugegeben. Bevorzugt erfolgt anschließend eine weitere Verdünnung und Erhöhung des Reaktionsvolumens mit Wasser, so dass die obengenannte Gesamtverdünnung erzielt wird.
Dabei ist bevorzugt, dass in Schritt iv) Glutardialdehyd in einer molaren Menge von 6-10, insbesondere 7-9 mol/mol, bezogen auf monomeres Hämoglobin, gelöst in 1-4, bevorzugt 1-2, insbesondere 1 ,5-2, ganz besonders bevorzugt 1 ,7- 1 ,9 L Wasser, pro Liter ursprünglicher Reaktionslösung zugesetzt wird. Dieser Zusatz erfolgt zeitgesteuert zwischen etwa 3 und 15, bevorzugt 3-10, insbesondere 4-6 Minuten.
Anschließend reagiert die Lösung zwischen 1 und 6 Stunden.
Es ist ferner bevorzugt, dass der das Hämoglobin enthaltenden Lösung vor der Umsetzung gemäss dem Schritt ii) 2-8, insbesondere 3-6, ganz besonders bevorzugt 3-4 Mol Natriumascorbat pro Mol unvemetztes Hämoglobin, zugegeben wird. Diese Umsetzung erfolgt über 0,5-6 Stunden, insbesondere 70- 120 Minuten.
Ferner wird bevorzugt in Schritt ii) als Effektor Pyridoxal-5'-phosphat in einem molaren Verhältnis, bezogen auf monomeres Hämoglobin, von 0,5 bis 3, bevorzugt 1 bis 2,5 mol/mol kovalent über einen Zeitraum von 0,5-20, insbesondere 1-7 Stunden angebunden..
Erfindungsgemäß weiterhin vorteilhaft und bevorzugt ist es, dass in Schritt ii) sowie in Schritt iv) nach der kovalenten Anbindung von Pyhdoxal-5'-phosphat sowie von Glutardialdehyd jeweils reduktives Natriumborhydrid hinzugesetzt wird.
Dies wird insbesondere in Schritt ii) in einer Menge von 1-9, bevorzugt 1-5, insbesondere 1-2,5 mol/mol z.B. für 30 bis 90 min., und in Schritt iv) in einer Menge von 5-20, insbesondere 6,-12 mol/mol, jeweils bezogen auf monomeres Hämoglobin, für 15 bis 100 min. zugesetzt.
Besonders bevorzugt wird in Schritt iii) als chemisch nicht reaktiver Effektor 2,3- Bisphosphoglyzerat in einer Menge von 0,5-6, insbesondere 1-4 mol/mol, bezogen auf monomeres Hämoglobin, zugesetzt und etwa 5-50 Minuten, insbesondere 10- 20 und ganz besonders 15 Minuten danach Glutardialdehyd zugesetzt.
Als Polyethylenoxid wird bevorzugt ein Polyethylenglykol-Ether z.B. mit einem C1- C5-Alkylrest wie Methyl, Ethyl Butyl, mit einem Molekulargewicht von 500 bis 3000 g/Mol angeknüpft, insbesondere ein Methoxy-Polyethylenglykol-Derivat mit einem Molekulargewicht von 1500-2500 g/Mol, insbesondere 2000 g/mol, wie insbe- sondere Methoxy-Polyethylenglykol-Succinimidyl-propionat-, in Mengen von 2-12, insbesondere 3-8 mol/mol Hämoglobin. Andere Derivatisierungsprodukte sind Methoxy-Polyethylenglykol-Succinimidyl-Succinamid und Methoxy-Polyethylen- glykol-Succinimidyl-Oxyacetat.
Die Anknüpfung von Polyalkylenoxid an nicht vernetzte Hamoglobine ist beschrieben in US A-4 179 337, US 5 478 805, US 5 386 014, EP-A 0 206 448, EP-A 0 067 029, DE-OS 3 026 398.
Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise über 1-4, insbesondere 2-3Stunden.
Es ist ferner vorteilhaft, dass alle Herstellungsreaktionen in insbesondere durch Tonometrie mit sauerstofffreien Gasen vom Sauerstoff befreiten Lösungen erfolgen. Das verwendete Verfahren ist beschrieben in: Pötzschke H.: Hyperpoly- mere des menschlichen Hämoglobins: Entwicklung präparativer Verfahren zu ihrer Synthese, Validierung analytischer Methoden und Geräte zu ihrer Charakterisierung, Dissertation, Medizinische Fakultät, Universität Wien, 1997.
Das erhaltene Produkt kann auf übliche Weise, wie nachfolgend geschildert, aufgearbeitet werden. Es weist insbesondere eine Verteilung der Molekulargewichte von 50 000 bis zu 5 000 000 auf, gegebenenfalls bis zu 10 000 000 g/Mol oder mehr.
Bevorzugt kann das erhaltene Produkt durch eine präparative stofftrennende Methode, wie beispielsweise eine präparative Volumenausschluss- Chromatographie, eine Ultrafiltration, eine fraktionierte Fällung, z.B. mit Polyalkylenoxiden oder Salzen wie Ammoniumsulfat als Fällmittel, oder eine Feld- Fluss-Fraktionier-Methode (vgl. Curling J.M. (Hrsg.) Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press, London u.a. 1980, sowie die Patentschriften EP-A 0 854 151 und EP-A 95 107 280) in eine Fraktion mit großer und eine Fraktion mit niederer mittlerer molekularer Masse getrennt werden, wobei bevorzugt die Trenngrenze bei 700 000 g/mol liegt. Aus dem Produkt mit hochmolekuldiei ividbb und aus dem Produkt mit niedermolekularer Masse kann je eine pharmazeutische Zubereitung hergestellt werden, wobei aus dem niedermolekularen Anteil der Polymeren ein parenterales Blutsubstitut und aus dem höhermolekularen Anteil der Polymeren ein parenterales Blutadditiv erhalten wird.
Die pH-Wert-Einstellung vor (und nach) den einzelnen Reaktionsschritent erfolgt vorzugsweise mit Milchsäure oder Natronlauge auf Werte zwischen 6 und 10, je nach Reaktionsschritt, z.B. 6,5-7,5 vor Schritt ii), anschließend auf 7,5-8,5 und nachfolgend wieder auf 6,5-7,5 vor Schritt iii), danach auf 7,5 bis 9, sowie vor Schritt v) auf 7,5-10.
Die Konzentration an Hämoglobin beträgt vorzugsweise 200-380 g/L, insbesondere 240-360 g/L, die Lösung enthält weiterhin 10 bis 150 mmol/L NaHC03 sowie 10 bis 150 mmol/L NaCI.
Die Temperatur während der "Eintopf-Reaktion" beträgt 2-42°C, insbesondere 3- 25°C, bevorzugt 4-22°C.
Der erfindungsgemäß hergestellte künstliche Sauerstoffträger weist vorzugsweise einen n50-Wert (Kooperativität) von 1 ,6 bis 2,5 und einen p50-Wert (Halbsättigungsdruck) von 16 bis 24 Torr auf.
Das erfindungsgemäß erhaltene Produkt mit den genannten Charakteristiken kann verwendet werden zur Herstellung eines Mittels zur intravasalen oder biomedizinischen Anwendung als künstlicher Sauerstoffträger, oder in Form einer pharmazeutischen Zubereitung als ein Ersatz des Blutes (Blutsubstitut) oder als ein Zusatz zum Blut zur Erhöhung der Sauerstofftransport-Kapazität (Blutadditiv) oder zu einer Nährlösung, im menschlichen und tierischen Organismus, in einzelnen Organen oder in biotechnischen Anwendungen, insbesondere zur Behandlung eines chronischen Sauerstoffmangels beim Menschen.
Zur Herstellung der zu verabreichenden Produkte werden die erfindungsgemäßen Hämoglobin-Derivate in geeigneten Medien, wie Infusionslösungen, beispielsweise in wässriger Kochsalz- oder Glukoselösung, vorzugsweise in dem Blutplasma isotonischen Konzentrationen, gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht somit auf einzelnen aufeinander abgestimmten Reaktionsschritten, deren Bedeutung und Auswirkung nachfolgend erläutert wird.
Als Ausgangsmaterial dient sehr reines Hämoglobin. Dieses kann nach bekannten Verfahren aus frischem Blut von Schlachttieren oder beispielsweise aus überalterten Blutkonserven gewonnen werden. Verfahren zur Gewinnung gereinigten Hämoglobins sind beschrieben in: Antonini E. et al. (Hrsg.): Hemoglobin (Colowick S.P., Kaplan N.O. (Hrsg.): Methods in Enzymology, Volume 76), Academic Press, New York u.a. 1981.
Wie erwähnt, ist erfindungsgemäß während der Vernetzung mit Glutardialdehyd, welche an sich bekannt ist, vgl. DE 24 99 885, US 4 857 636, US-A 4 001 200, US-A 4 001 401 , DE 4 49 885, US 5 439 882, EP-A 0 201 618, das Hämoglobin desoxygeniert (d. h. von seinem physiologischen Liganden Sauerstoff befreit), denn nur aus während der Vernetzung desoxygeniertem Hämoglobin hergestellte Polymere besitzen Sauerstoffbindungseigenschaften, die einen Einsatz als künstlicher Sauerstoffträger in den gewünschten Indikationen ermöglichen. Vorzugsweise kann zum weiteren Schutz vor Oxidation des Hämoglobins durch Spuren von verbliebenem Sauerstoff dieser durch chemische Reaktion mit Ascorbat-Ionen entfernt werden.
Als Effektor der Sauerstoffbindung wird insbesondere Pyridoxal-5'-phosphat, in einer an den funktioneilen Eigenschaften des Endproduktes optimierten Menge, kovalent an das Schweine- oder Humanhämoglobin angebunden. Diese Anbindung von Pyridoxal-5'-phosphat an Hämoglobin ist prinzipiell bekannt, beispielsweise beschreibt die Patentschrift EP-P 0 528 841 ein Verfahren zur Herstellung pyridoxilierten Hämoglobins. Die Pyridoxilierung führt zu dem gewünschten Halbsättigungsdruck-Werten, wenn so wie erfinduπgsgemäß beschrieben, vorgegangen wird.
Die Verknüpfungsstellen (Aldimine = Schiffsche Basen) der nicht stabilen kovalenten Anknüpfung von Pyridoxal-5'-phosphat können bekanntlich (s.o.) durch Reduktion mit Natriumborhydrid bwuino.cn ιcs entstehen Amine) werden, wobei erfindungsgemäß die genannten besonderen Bedingungen eingehalten werden. Zum Schutz der Fähigkeit der Hämoglobinmoleküle zu einer homotropen Kooperativität der Sauerstoffbindungsstellen mit einander, die durch die Vernetzung des Hämoglobins mit dem Vernetzer Glutardialdehyd meist deutlich verloren geht, wird erfindungsgemäß vor der Vernetzung 2,3-Bisphosphoglyzerat, ein (heterotroper) chemisch nicht reaktiver Effektor der Sauerstoffbindung des Hämoglobins, zugegeben. Dieser kann somit während der Vernetzung reversibel an seine Bindungsstelle im Hämoglobinmolekül angelagert sein. Nach der Synthese wird 2,3-Bisphosphoglyzerat zusammen mit unverbrauchten Reaktanden sowie überflüssigen Reaktionsprodukten vollständig entfernt (siehe weiter unten). Als bifunktioneller Vernetzer wird Glutardialdehyd unter den erfindungsgemäßen oben angegebenen Bedingungen eingesetzt.
Die Verknüpfungsstellen (Aldimine = Schiffsche Basen) der vernetzenden molekularen Glutardialdehyd-Brücken werden wie beschrieben durch Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert (es entstehen Amine), wobei die erfindungsgemäßen Bedingungen einzuhalten sind.
Durch die Vernetzung entstehen vernetzte Hamoglobine mit einer Verteilung der Molekulargewichte zwischen etwa 50 000 und 5 000 000 g/mol (und größer, z.B. 10-15 000 000 g/mol).
Zur Verbesserung der Verträglichkeit mit Plasmaproteinen wird an das vernetzte Hämoglobin ein Polyethylenoxid (MW)-Derivat, insbesondere dasoben erwähnte monofunktionell aktivierte (Methoxy-) Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1500-2500 g/mol angeknüpft. Die Anknüpfung von Polyethylenglykol (PEG), die sogenannte Pegylierung an als auch die Vernetzung von Hämoglolbinen ist an sich bekannt (vgl. auch E. Tsucheda (Hfsg): Blood Substituts: Present and Future Perspectives, Elsevier Science, Amsterdam 1998).
Neu sind jedoch sowohl Pegylierung als auch Vernetzung von Hämoglobinen zusammen, sowie die Anwendung des chemisch nicht wirksamen Effektors vor der Vernetzung, was insbesondere zum Erhalt der Kooperativität beiträgt, als auch insbesondere die geschilderten Vernetzungsbedingungen. Durch die hier vorgenommene Pegylierung wird nunmehr die ohnehin schwache Reaktion des RES und auch der enzymatische Abbau durch Proteasen verhindert. Die pH-Wert-Einstellung erfolgt wie oDeπ gescnndert.
Durch die erhaltene Reaktionsabfolge und Bedingungen hierfür kann so zum einen die Entstehung einer Perkolationsverteilung verhindert werden (durch die erfindungsgemäße Verdünnung), andererseits können auch die durch Vernetzung und kovalente Anbindungen an Hämoglobin z.B. von Glutardialdehyd, Pyridoxalphosphat und Polyethylenoxid bedingten unerwünschten Änderungen der Sauerstoffaffinität und Kooperativität vermieden werden und insbesondere auch eine hohe Plasmaverträglichkeit erzielt werden.
Alle Reaktionsschritte tragen zusammen zu diesen besonderen Eigenschaften des erfindungsgemäß hergestellten Produktes bei.
Die weitere Aufarbeitung liegt im Rahmen der Kenntnis des Fachmannes: Unlösliche Bestandteile können durch Zeπtrifugation (beispielsweise für 20 Minuten mit einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 20000 g) abgetrennt werden.
Die vernetzten Hamoglobine werden durch einen (bekannten) präparativen Verfahrensschritt, beispielsweise durch eine Volumenausschluss-Chromato- graphie oder eine Ultrafiltration, eine fraktionierte Fällung oder eine Feld-Fluss- Fraktionierung, in einen nieder- und einen höher molekularen Anteil aufgetrennt. Bei Wahl geeigneter Methoden (besonders wichtig sind beispielsweise die Nominelle Molekulargewichts-Trenngrenze der Ultrafiltrationsmembrane oder der Molekulargewichts-Trennbereich des verwendeten Gels) werden dabei zugleich alle unverbrauchten Reaktanden sowie unerwünschte Reaktionsprodukte entfernt.
Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung ist anhand des nachfolgenden Herstellungsbeispiels näher erläutert:
Gereinigtes Schweine- oder Humanhämoglobin mit einer Konzentration zwischen 200 und 380 g/L, bevorzugt zwischen 240 und 360 g/L, ist in einem wässrigen Elektrolyten gelöst. Dieser enthält Natriumhydrogenkarbonat mit einer Konzentration zwischen 10 und 150 mmol/L, bevorzugt zwischen 40 und 60 mmol/L, sowie Natriumchlorid mit einer Konzentration zwischen 10 und 150 mmol/L, bevorzugt zwischen 50 und 100 mmol/L.
Die Temperatur beträgt von 2 bis 42 °C, bevorzugt zwischen 3 und 25 °C.
Diese Hämoglobinlösung wird gerührt, durch Überströmen reinen Stickstoffs erfolgt eine Desoxygenierung des Hämoglobins.
Zu dieser Lösung werden 2 bis 8, bevorzugt 3 bis 4 mol Natrium-Ascorbat (als 1- molare Lösung in Wasser) pro Mol Hämoglobin zugegeben und zwischen 0,5 und
6 h, bevorzugt zwischen 70 und 120 Minuten, reagieren lassen.
Der pH-Wert der Lösung wird nun mit Milchsäure oder Natronlauge (einer
Konzentration zwischen 0,1 und 1 , bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 mol/L) auf einen Wert zwischen 6,5 und 7,5, bevorzugt zwischen 6,9 und 7,3 titriert.
Nun werden 0,5 bis 3,0, bevorzugt 1 ,0 bis 2,5 mol Pyridoxal-5'-Phosphat je Mol
Hämoglobin zugegeben und zwischen 0,5 und 20, bevorzugt zwischen 1 und 7 h, reagieren lassen.
Der pH-Wert wird mit Natronlauge oder Milchsäure (einer Konzentration zwischen
0,1 und 1 , bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 mol/L) auf einen Wert zwischen 7,5 und 8,5, bevorzugt zwischen 7,7 und 8,2, eingestellt.
Jetzt werden 1 ,0 bis 9,0, bevorzugt etwa 1 ,0 bis 2,5 Mol Natriumborhydrid (als 1- molare Lösung in 0,01 -molarer Natronlauge) zugegeben und zwischen 30 und 90, bevorzugt zwischen 50 und 70 Minuten, reagieren lassen.
Der pH-Wert der Lösung wird mit Milchsäure oder Natronlauge (einer
Konzentration zwischen 0,1 und 1 , bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 mol/L) auf einen Wert zwischen 6,5 und 7,5, bevorzugt zwischen 6,9 und 7,5 titriert.
Nun werden 0,5 bis 6,0, bevorzugt 1 ,0 bis 4,0 Mol 2,3-Bisphosphoglyzerat je Mol
Hämoglobin zugegeben und zwischen 5 und 50, vorzugsweise zwischen 10 und
20 Minuten, reagieren lassen.
Anschließend erfolgt die kontrollierte zeitgesteuerte Zugabe des bifunktionellen
Vernetzers, es werden zwischen 6 und 10, bevorzugt zwischen 7 und 9 Mol
Glutardialdehyd je Mol Hämoglobin, gelöst in 1-4, bevorzugt in 1 ,5 bis 2 L Wasser je Liter Hämoglobinlösung, innerhalb 3 bis 10, bevorzugt innerhalb 4 bis 6 Minuten zugegeben und zwischen 1 und 6, bevorzugt zwischen 2 und 3 h, reagieren lassen. Der pH-Wert wird mit Natronlauge oαer Miicnsaure (einer Konzentration zwischen 0,1 und 1 , bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 mol/L) auf einen Wert zwischen 7,5 und 9,0, bevorzugt zwischen 7,6 und 8,8, eingestellt.
Es werden 5 bis 20, bevorzugt 6 bis 12 Mol Natriumborhydrid (als 1 -molare Lösung in 0,01 -molarer Natronlauge) je Mol Hämoglobin zugegeben und zwischen 15 und 100, bevorzugt zwischen 30 und 80 Minuten, reagieren lassen. Dann erfolgt eine Zugabe von 0 bis 4, bevorzugt zwischen 0,5 und 3 L Wasser je Liter der ursprünglichen Hämoglobinlösung.
Der pH-Wert wird, falls erforderlich, mit Natronlauge oder Milchsäure (einer Konzentration zwischen 0,1 und 1 , bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 mol/L) auf einen Wert zwischen 7,5 und 10, bevorzugt zwischen 8 und 9, eingestellt. Nun werden je Mol monomeren Hämoglobins zwischen 2 und 12, bevorzugt zwischen 3 und 8 mol eines aktivierten Polyethylenoxid-Derivat, bevorzugt Methoxy-Succinimidylpropionat-Polyethylenglykol, mit einem Molekulargewicht zwischen 500 und 3000, bevorzugt 1000 und 2500 g/Mol, insbesondere 2000 g/Mol zugegeben.
Anschließend wird, bei weiterem Rühren der Hämoglobinlösung, die Stickstoffatmosphäre für 1 bis 3 Stunden durch reinen Sauerstoff ersetzt und das Hämoglobin so zügig oxygeniert. Die Aufarbeitung erfolgt wie oben geschildert.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich somit wie folgt zusammenfassen:
Durch die erfindungsgemäße Reaktionsabfolge, insbesondere die Reaktionsvolumenerhöhung in Schritt iv) des Verfahrens, wird ein Produkt erhalten, welches vollständig zur Herstellung künstlicher Sauerstoffträger verwendet werden kann , und zwar je etwa hälftig als Blut-Additiv (die Fraktion mit den vernetzten Hamoglobine höherer Polymerisationsgrade: Fraktion I) und als Blutvolumen- Substitut (Fraktion II, mit den nieder-molekularen Anteilen). Die Trennung kann in einfacher Weise mit bekanntem Verfahren erfolgen, einige mögliche Methoden sind beispielsweise in den Patentschriften EP-A 95 107 280 und EP-A 97 100 790 angeführt. Die Polymeren der Fraktion I, vorzugsweise bis zu einem Molekulargewicht von größer 700 000 g/Mol sind so hinreichend molekular einheitlich, dass sie in der wünschenswerten therapeutischen Plasmakonzentration einen ausreichend geringen kolloidosmotischen Druck besitzen. Durch diese Molekulareinheitlichkeit wird zugleich ein kleiner Virialkoeffizient, wie auch eine geringe Viskosität erreicht. Die Verträglichkeit mit den Proteinen des Blutplasmas, ausreichend große Immunverträglichkeit und intravasale Verweildauer, wie auch eine ausreichend geringe vasokonstriktorische Nebenwirkungen, d. h. eine geringe Extravasation, der Polymeren der Molekülfraktion I wird durch eine kovalente Anknüpfung von Polyalkylenoxiden erzielt. Darüberhinaus wird der Forderung nach Einfachheit und Wirtschaftlichkeit bei diesem neuen Verfahren in entscheidender Weise insofern Rechnung getragen, als die gesamte Herstellung in einem einzigem Gefäß stattfindet (sogenannte Eintopf-Herstellung) und hohe Ausbeuten von über 70% erzielt werden, wobei die Ausbeute an Polymeren mit einem Molekulargewicht von über 700 000 g/mol mehr als 15 % beträgt.
Das Herstellungsverfahren ermöglicht die Präparation modifizierter und vernetzter Hamoglobine in wenigen Verfahrensschritten. Die gewählten Verfahrensparameter führen dabei zu einer definierten Verteilung modifizierter Hämoglobin-Polymeren, die als künstliche Sauerstofftrager geeignet auch den physiologischen Gegebenheiten im Blutserum Rechnung trägt.
Weiterhin ist die Kooperativität des unvemetzten Hämoglobins im vernetzten Produkt weitgehend erhalten und der Halbsättigungsdruck geeignet justierbar.
Die erfindungsgemäß hergestellten künstlichen Sauerstoffträger aus vernetztem Hämoglobin sind bei parenteraler Applikation plasmaverträglich, und können klinisch wie geschildert angewendet werden .
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Dabei zeigen die Figuren 1-3 folgendes:
Figur 1 : Eine massen-gewichtete Verteilung der Molekülgrößen und Molekulargewichte (M) des Schweinehämoglobin-Polymeren aus Beispiel 1 , dargestellt als Volumenausschluss-Chromatogramm (erhalten mit Sephacryl S-400 HR - Gel, Pharmacia, Freiburg, D). E425πm ist die Extinktion im Chromatographie-Eluat bei 425 nm. Eingezeichnet sind die Abszisssenwerte 700 000 und 5 000 000 g/Mol.
Figur 2: Chromatogramm für Anwendungsbeispiel 2, Erläuterungen vgl. Fig. 1
Figur 3: Chromatogramm für Anwendungbeisiel 3, Erläuterungen vgl. Fig. 1
Ferner wurden folgende Bestimmungsmethoden angewendet:
1. Hämoqlobingehalte wurden fotometrisch mit der modifizierten Cyanhämiglobin-Methode nach Drabkin ( „Hämoglobin-Farbtest MRP 3", Boeh- rimger Mannheim, D),
2. pH-Werte wurden potentiometrisch (pH-Glaselektrode) mit einem Blutgas- analysator („ABL 5", Radiometer, Willich, D) gemessen.
3. Bestimmungen der Molekulargewichtsverteilunq der vernetzten Hamoglobine erfolgten durch Volumenausschluss-Chromatografie (gemäß: Pötzschke H. et al. (1996): „Vernetzte globuläre Proteine - eine neue Klasse halbsynthetischer polymerer Moleküle: Charakterisierung ihrer Struktur in Lösung am Beispiel hyperpolymeren Hämoglobins und Myoglobins mittels Volumenausschluss- Chromatographie, Viskosimetrie, Osmometrie und Lichtstreuung", Macromolecular Chemistry and Physics 197, 1419 - 1437, sowie Pötzschke H. et al. (1996): „Ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung Molarer Massen breit verteilter Polymerer mit Hilfe der Gel-Chromatographie und der Viskosimetrie am Beispiel Hämoglobin- Hyperpoiymerer", Macromolecular Chemistry and Physics 197, 3229 - 3250) am Gel „Sephacryl S-400 HR" (Pharmacia Biotech, Freiburg, D).
4. Bestimmungen der Charakteristik der Sauerstoffbindunq durch Hamoglobine erfolgte mittels einer eigenen Methode und Apparatur (wie beschrieben in: Barnikol W. K. R. et al. (1978): „Eine verbesserte Modifikation der Mikromethode nach Niesei und Thews zur Messung von O2-Hb-Bindungskurven in Vollblut und konzentrierten Hb-Lösungen", Respiration 36, 86 - 95).
5. Die Untersuchung der Plasmaverträglichkeit vernetzter Hamoglobine erfolgte mittels eines standardisierten in vitro - Fällungstests (Domack U. (1997), „Entwicklung und in vivo - Evaluation eines künstlichen Sauerstoffträgers auf Basis von Rinderhämoglobin", Dissertation, Fachbereich Chemie, Johannes Gutenberg- Universität, Mainz 1997): Hämoglobinlösungen (Hämoglobingehalte etwa 30 g/L, in einem wässrigen Elektrolyten (StLg) der Zusammensetzung 125 mM NaCI, 4,5 mM KCI und 3 mM NaN3) wurden mit gleichen Mengen frisch gewonnenen, steril filtrierten menschlichen Plasmas gemischt und anschließend zu jeweils 500 μL der Mischung bis zu 20 μL 0,5-molare Milchsäure zugesetzt und eingemischt, so dass sich für jedes zu untersuchende Hämoglobin-Derivat jeweils pH-Werte aus einem Bereich zwischen etwa 7,4 bis 6,8 ergaben. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur und Zentrifugation der Proben erfolgte die Bestimmung des Hämoglobingehaltes als Maß für das nicht ausgefällte Hämoglobin sowie des zugehörigen pH-Wertes im Überstand, sowie die subjektivoptische Kontrolle auf ungefärbte Ausfällungen von Plasmaproteinen.
Ausführunqsbeispiel 1 :
Herstellung eines erfindungsgemäßen vernetzten und molekular modifizierten Schweinehämoglobins bei 4 °C gemäss dem allgemeinen Herstellungsverfahren
Hochreines Schweinehämoglobin, in einer Konzentration von 330 g/L gelöst in einem wässrigen Elektrolyten der Zusammensetzung 50 mM NaHCO3 und 100 mM NaCI, wurde bei 4 °C durch Rühren der Lösung unter ständig erneuertem, reinen Stickstoff über der Lösung desoxygeniert. Anschließend wurden 4 mol Nat um-Ascorbat (als 1 -molare Lösung in Wasser) pro Mol (monomeren) Hämoglobins zugegeben und 6 h reagieren lassen. Die Lösung wurde mit 0,5- molarer Milchsäure auf einen pH-Wert von 7,1 titriert, 1 ,1 Mol Pyridoxal-5'- Phosphat je Mol Hämoglobin zugegeben und für 16 h reagieren lassen. Nun wurde mit 0,5-molarer Natronlauge ein pH-Wert von 7,8 eingestellt, 1 ,1 Mol Natriumborhydrid (als 1 -molare Lösung in 0,01 -molarer Natronlauge) zugegeben und für eine Stunde reagieren lassen. Jetzt wurde mit 0,5-molarer Milchsäure ein pH von .7,3 eingestellt, zunächst 1 ,1 Mol 2,3-Bisphosphoglyzerat pro Mol Hämoglobin und nach 15 min Reaktionszeit 8 Mol Glutardialdehyd je Mol Hämoglobin, gelöst in 1 ,8 L reinem Wasser je Liter Hämoglobinlösung zur Vernetzung des Hämoglobins innerhalb 5 Minuten zugegeben und 2,5 h reagieren lassen. Nach Titration mit 0,5-molarer Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,8 folgte eine Zugabe von 15 Mol Natriumborhydrid (als 1 -molare Lösung in 0,01- molarer Natronlauge) je Mol Hämoglobin für 1 h. Es erfolgte eine Zugabe von 2 Liter Wasser jeüter ursprünglicher Hämoglobinlösung. Der pH-Wert betrug dann 9,3, und es folgte direkt eine Zugabe von 4 Mol Methoxy-Succinimidylpropionat- Polyethylenglykol des Molekulargewichts 2000 g/Mol für 2 h. Die Stickstoffatmosphäre über der Lösung wurde durch reinen Sauerstoff ersetzt. Nach 1 h wurden unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation (20000 g für 15 min) abgetrennt. Anschließend erfolgte ein Wechsel des Elektrolyten durch eine Volumenausschluss-Chromatographie (Sephadex G-25 - Gel, Pharmacia, D) zu einer wässrigen Elektrolyt-Lösung der Zusammensetzung 125 mM NaCI, 4,5 mM KCI und 20 mM NaHCO3.
Die Ausbeute betrug 77 %; die Ausbeute für Molekulargewicht größer 700 000 g/Mol ist 28 %.
Fig. 1 zeigt eine Darstellung der Verteilung der Molaren Massen der erhaltenen Hämoglobin-Polymere in Form eines Volumenausschluss-Chromatogrammes. Messungen der Charakteristik der Sauerstoffbindung unter physiologischen Bedingungen (eine Temperatur von 37 °C, ein Kohlendioxid-Partialdruck von 40 Torr und ein pH-Wert von 7,4) ergaben für das Produkt einen p50-Wert von 22 Torr und einen n50-Wert von 1 ,95.
Im „Fällungstest" zeigte das vernetzte Schweinehämoglobin im pH-Bereich von 7,4 bis 6,8 keinerlei Wechselwirkungen mit menschlichem Plasma, insbesondere keine nachweisbaren Fällungen, weder des Hämoglobins, noch von Plasmaproteinen. Ausführungsbeispiel 2:
Herstellung eines erfindungsgemäßen vernetzten und molekular modifizierten Schweinehämoglobins bei Raumtemperatur gemäss dem allgemeinen Herstellungsverfahren
Hochreines Schweinehämoglobin, in einer Konzentration von 330 g/L gelöst in einem wässrigen Elektrolyten der Zusammensetzung 50 mM NaHC03 und 100 mM NaCI, wurde bei 22 °C durch Rühren der Lösung unter ständig erneuertem, reinen Stickstoff desoxygeniert. Anschließend wurden 4 mol Natrium-Ascorbat (als 1 -molare Lösung in Wasser) pro Mol (monomeren) Hämoglobins zugegeben und 90 min reagieren lassen. Die Lösung wurde mit 0,5-molarer Milchsäure auf einen pH-Wert von 7,1 titriert, 1 ,1 mol Pyridoxal-5'-Phosphat je Mol Hämoglobin zugegeben und für 2 h reagieren lassen. Nun wurde mit 0,5-molarer Natronlauge ein pH-Wert von 7,8 eingestellt, 1 ,5 Mol Natriumborhydrid (als 1 -molare Lösung in 0,01-molarer Natronlauge) zugegeben und für eine Stunde reagieren lassen. Jetzt wurde mit 0,5-molarer Milchsäure ein pH von 7,3 eingestellt, zunächst 1 ,5 mol 2,3- Bisphosphoglyzerat pro Mol Hämoglobin und nach 15 min Reaktionszeit 9 Mol Glutardialdehyd je Mol Hämoglobin, gelöst in 1 ,8 L reinem Wasser je Liter Hämoglobinlösung zur Vernetzung des Hämoglobins innerhalb 5 Minuten zugegeben und 1 h reagieren lassen. Nach Titration mit 0,5-molarer Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,8 folgte eine Zugabe von 10 Mol Natriumborhydrid (als 1- molare Lösung in 0,01 -molarer Natronlauge) je Mol Hämoglobin für 0,5 h. Der pH- Wert betrug 8,7 und es folgte direkt eine Zugabe von 8 Mol Methoxy- Succinimidylpropionat-Polyethylenglykol des Molekulargewichts 1000 g/Mol für 1 h. Die Stickstoffatmosphäre wurde durch reinen Sauerstoff ersetzt. Nach 1 h wurden unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation (10 min mit 20000 g) abgetrennt. Anschließend erfolgte ein Wechsel des Elektrolyten durch eine Volumenausschluss-Chromatographie (Sephadex G-25 - Gel, Pharmacia, D) zu einer wässrigen Elektrolyt-Lösung der Zusammensetzung 125 mM NaCI, 4,5 mM KCI und 20 mM NaHC03.
Die Ausbeute betrug 79 %; die Ausbeute für Molekulargewichte größer als 700 000 g/Mol betrug 28 %.
Fig. 2 zeigt eine Darstellung der Verteilung der Molaren Massen der erhaltenen Hämoglobin-Polymere in Form eines Volumenausschluss-Chromatogrammes. Messungen der Charakteristik der Sauerstoffbindung unter physiologischen Bedingungen (eine Temperatur von 37 °C, ein Kohlendioxid-Partialdruck von 40 Torr und ein pH-Wert von 7,4) ergaben für das Produkt einen p50-Wert von 22 Torr und einen n50-Wert von 1 ,6.
Im „Fällungstest" zeigte das vernetzte Schweinehämoglobin im physiologisch und pathophysiologisch interessanten pH-Bereich von 7,4 bis 6,8 keinerlei Wechselwirkungen mit menschlichem Plasma, insbesondere keine nachweisbaren Fällungen, weder des Hämoglobins, noch von Plasmaproteinen.
Anwendungsbeispiel 3:
Herstellung eines erfindungsgemäßen vernetzten und molekular modifizierten menschlichen Hämoglobins (bei 4°C) gemäss dem allgemeinen Herstellungsverfahren
Hochreines Humanhämoglobin, in einer Konzentration von 330 g/L gelöst in einem wässrigen Elektrolyten der Zusammensetzung 50 mM NaHCθ3 und 100 mM NaCI, wurde bei 4 °C durch Rühren der Lösung unter ständig erneuertem, reinen Stickstoff desoxygeniert. Anschließend wurden 4 mol Natrium-Ascorbat (als 1- molare Lösung in Wasser) pro Mol (monomeren) Hämoglobins zugegeben und 3 h reagieren lassen. Die Lösung wurde mit 0,5-molarer Milchsäure auf einen pH-Wert von 7,1 titriert, 1 ,1 mol Pyridoxal-5'-Phosphat je Mol Hämoglobin zugegeben und für 16 h reagieren lassen. Nun wurde mit 0,5-molarer Natronlauge ein pH-Wert von 7,8 eingestellt, 1 ,5 Mol Natriumborhydrid (als 1 -molare Lösung in 0,01 -molarer Natronlauge) zugegeben und für eine Stunde reagieren lassen. Jetzt wurde mit 0,5-molarer Milchsäure ein pH von 7,3 eingestellt, zunächst 1 ,5 mol 2,3- Bisphosphoglyzerat pro Mol Hämoglobin und nach 15 min Reaktionszeit 9 mol Glutardialdehyd je Mol Hämogloum, geiost in 1 ,8 L reinem Wasser je Liter Hämoglobiπlösung zur Vernetzung des Hämoglobins innerhalb 5 Minuten gleichmäßig zugegeben und 2,5 h reagieren lassen. Nach Titration mit 0,5-molarer Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,0 folgte eine Zugabe von 10 Mol Natriumborhydrid (als 1 -molare Lösung in 0,01 -molarer Natronlauge) je Mol Hämoglobin für 1 h.Dann erfolgt eine Zugabe von Wasser, 2 L pro Liter ursprüngliche Hämoglobinlösung. Der pH-Wert betrug dann 8,6 und es folgte direkt eine Zugabe von 4 Mol Methoxy-Succinimidylpropionat-Polyethylenglykol des Molekulargewichts 2000 g/mol für 2 h. Die Stickstoffatmosphäre wurde durch reinen Sauerstoff ersetzt. Nach 1 h wurden unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation (10 min mit 20000 g) abgetrennt. Anschließend erfolgte ein Wechsel des Elektrolyten durch eine Volumenausschluss-Chromatographie (Sephadex G-25 - Gel, Pharmacia, D) zu einer wässrigen Elektrolyt-Lösung der Zusammensetzung 125 mM NaCI, 4,5 mM KCI und 20 mM NaHCO3.
Fig. 3 zeigt eine Darstellung der Verteilung der Molaren Massen der erhaltenen Hämoglobin-Polymere in Form eines Volumenausschluss-Chromatogrammes. Die Gesamtausbeute betrug 75 %; die Ausbeute an Polymerem mit einem Molekulargewicht größer als 700 000 g/Mol betrug 17 %.
Messungen der Charakteristik der Sauerstoffbinduπg unter physiologischen Bedingungen (eine Temperatur von 37 °C, ein Kohlendioxid-Partialdruck von 40 Torr und ein pH-Wert von 7,4) ergaben für das Produkt einen p50-Wert (als Maß einer mittleren Sauerstoffaffinität) von 21 Torr und einen n50-Wert (eine mittlere scheinbare Kooperativität der Sauerstoffbindungsstellen) von 1 ,74. Im „Fällungstest" zeigte das vernetzte Schweinehämoglobin im physiologisch und pathophysiologisch interessanten pH-Bereich von 7,4 bis 6,8 keinerlei Wechselwirkungen mit den Proteinen menschlichen Plasmas, insbesondere keine nachweisbaren Fällungen, weder des Hämoglobins, noch von Plasmaproteinen.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur technisch einfachen Herstellung künstlicher Sauerstofftrager aus vernetztem Hämoglobin mit verbesserten funktionellen Eigenschaften in großer Ausbeute, dadurch gekennzeichnet, dass Hämoglobin i) zunächst desoxygeniert wird; ii) anschließend kovalent mit einem chemisch reaktiven Effektor der Sauer stoffbindung umgesetzt wird; iii) dann die Lösung mit einem chemisch nicht reaktiven Effektor versetzt wird; und sodann iv) das Hämoglobin mit Glutardialdehyd, unter sehr starker Verdünnung des Volumens des Reaktionsgemisches bei gleichzeitiger Zugabe des Vernetzers, stabil kovalent miteinander vernetzt wird und anschließend die Lösung erneut mit Wasser verdünnt wird, und sodann v) ein Polyethylenoxid kovalent angeknüpft wird vi) das erhaltene Produkt in bekannter Weise aufgearbeitet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Hämoglobin vom Schwein oder vom Menschen stammt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Schweinehämoglobin als Ausgangsmaterial dient.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt iv) Glutardialdehyd in einer sehr stark verdünnten Lösung zeitgesteuert zugegeben wird und so das Volumen des Reaktionsgemisches und die Hämoglobinkonzentration während der Polymerisationsreaktion gleichzeitig gegensinnig variiert werden, und anschließend die Lösung verdünnt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass während des Schrittes iv) das Volumen des Reaktionsgemisches insgesamt um einen Faktor 2 bis 10 zunimmt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt iv) Glutardialdehyd in einer Menge von 6-10 mol/mol, bezogen auf monomeres Hämoglobin, gelöst in 1-2 L Wasser je Liter ursprünglicher Reaktionslösung, innerhalb von 3-15 Minuten zugsetzt wird und weitere 1-6 Stunden reagiert.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der das Hämoglobin enthaltenden Lösung vor der Umsetzung gemäß dem Schritt ü) 2-8 Mol Natriumsascorbat pro Mol unvemetztes Hämoglobin für 0,5- 6 Stunden zugegeben wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt ii) als Effektor Pyridoxal-5'-phosphat in einem molaren Verhältnis, bezogen auf monomeres Hämoglobin, von 0,5 bis 3, bevorzugt 1 bis 2,5 mol/mol, innerhalb von 0,5 bis 20 Stunden kovalent angebunden wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt ii) sowie in Schritt iv) nach der kovalenten Anbindung von Pyridoxal-5'-phosphat an Hämoglobin sowie nach kovalenter Verknüpfung des Hämoglobins mit Glutardialdehyd jeweils reduktives Natriumborhydrid hinzugesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass reduktives Natriumborhydrid in Schritt ii) in einer relativen Menge von 1-9 mol/mol und in Schritt iv) von 5-20 mol/mol, jeweils bezogen auf monomeres Hämoglobin, für 30 bis 90 min. bzw. für 15 bis 100 min. zugesetzt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt iii) 2,3-Bisphosphoglyzerat in einer relativen Menge von 0,5-6 mol/mol, bezogen auf monomeres Hämoglobin, zugesetzt wird und 5-50 Minuten danach Schritt iv) eingeleitet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt v) ein Polyethylenglykol-Ether mit einem Molekulargewicht von 500 bis 3000 g/mol angeknüpft wird
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Polyethylenglykol-Ether ein Methoxy-Polyethylenglykol-Derivat mit einem Molekulargewicht von 1500-2500 g/mol angeknüpft wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellungsreaktionen in durch Tonometrie mit sauerstofffreien Gasen vom Sauerstoff befreiten Lösungen erfolgen
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass sämtliche Verfahrensschritte in einem einzigen Gefäß nacheinander durchführbar sind.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Produkt erhalten wird, das eine Verteilung der Molekulargewichte von 50 000 bis zu 5 000 000 g/Mol aufweist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtausbeute über 70 % und die Ausbeute an Polymeren mit einem Molekulargewicht über 700 000..g/mol mehr als 15 % beträgt.
18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Produkt durch ein präparatives Trennverfahren in eine Fraktion mit großer mittlerer molarer und eine Fraktion mit niederer mittlerer molekularer Masse getrennt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Produkt mit höhermolekularer Masse und aus dem Produkt mit niederer molekularer Masse je eine pharmazeutische Zubereitung hergestellt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem niedermolekularen Anteil der Polymeren ein parenterales Blutsubstitut hergestellt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem höhermolekularen Anteil der Polymeren ein parenterales Blutadditiv hergestellt wird.
22. Künstlicher Sauerstoffträger, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-21.
23. Künstlicher Sauerstoffträger gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger einen n50-Wert von 1 ,6 bis 2,5 und einen p50-Wert von 16 bis 24 Torr aufweist.
24. Verwendung von vernetztem Hämoglobin gemäss Anspruch 22 oder 23, oder, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 22 zur Herstellung eines Mittels zur intravasalen oder biomedizinischen Anwendung als künstlicher Sauerstofftrager.
25. Verwendung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel in Form einer pharmazeutischen Zubereitung als ein Ersatz des Blutes (Blutsubstitut) oder als ein Zusatz zum Blut zur Erhöhung der Sauerstofftransport-Kapazität (Blutadditiv) oder zu einer Nährlösung, im menschlichen und tierischen Organismus, in einzelnen Organen oder in biotechnischen Anwendungen .verwendet wird.
26. Verwendung gemäss Anspruch 23 oder 24 zur Behandlung eines chronischen Sauerstoffmangels beim Menschen.
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