WO2002016606A2 - Procede de mutagenese dirigee massive - Google Patents

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WO2002016606A2
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gene
mutagenesis
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Marc Delcourt
Stéphane BLESA
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Biomethodes
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    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms

Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular biology and more particularly that of mutagenesis. It relates to a process of directed mutagenesis at high flow rate, that is to say the constitution of numerous mutants directed in a time and a number of reduced steps. This process will therefore be called "massive mutagenesis”. Mutagenesis is a technique aimed at artificially modifying the nucleotide sequence of a DNA fragment with the aim of modifying the biological activity which results therefrom. Mutagenesis has taken an important place in many molecular biology works over the past decade.
  • mutagenesis can be associated with three distinct modifications of a DNA fragment: deletion, which consists in removing nucleotides from the DNA fragment of interest, - insertion, which consists in adding more, and
  • Mutagenesis techniques can be separated into two main groups: random mutagenesis on the one hand, and site-directed mutagenesis on the other.
  • Random mutagenesis aims to introduce substitutions of random nature and position in a DNA fragment.
  • random mutagenesis has been carried out using chemical processes that alter the structure of DNA. More recently, amplification of a molecule using a polymerase under specific conditions has often replaced chemical processes. These particular conditions are characterized in that they alter the capacity of the enzyme to 'faithfully replicate DNA. This introduces over the cycles of mutations, that is to say differences from the sequence initial. At the end of the reaction, a large number of copies of the original molecule are obtained, each of these molecules having different mutations. These molecules are present in the form of a library, that is to say a mixture of molecules of different nature (differing in the nature and the position of their mutations).
  • Site-directed mutagenesis aims to introduce one or a few mutations (substitutions, but also deletions or insertions) of known nature and position in a DNA fragment.
  • An oligonucleotide is used 'to introduce this mutation.
  • This oligonucleotide conventionally consists of around twenty bases. The sequence of this oligonucleotide is homologous at all points with the sequence targeted on the DNA fragment except for one or a few positions located in its middle part.
  • This oligonucleotide is then used to initiate a replication (or amplification, i.e. multiple replication) reaction using the DNA fragment as a template.
  • the newly synthesized sequence contains the modification sought.
  • the first techniques of site-directed mutagenesis were based on the amplification of the only DNA fragment of interest (in the form of a linear DNA fragment), which then had to be introduced into a plasmid. These techniques were tedious and had to be adapted to each study system.
  • mutant oligonucleotide has been used to directly replicate the plasmid containing the DNA fragment of interest. The number of manipulations to be performed is thus minimized.
  • Mutagenesis can be aimed at gaining or losing activity.
  • the gain of an activity, or more frequently its simple improvement, is particularly interesting in the fields of enzymology or of the ligand / receptor association.
  • having an enzyme with improved activity can make it possible to reduce the costs of industrial processes using these enzymes.
  • the affinity of the binding between a ligand and its receptor can be improved by means of a few localized mutations at the level of the recognition site of each other.
  • the present invention is an intermediate technique between site-directed mutagenesis and random mutagenesis. Indeed, its object is not as in the case of simple site-directed mutagenesis to obtain a single product in end of reaction containing the desired mutation (s), but to obtain a mixture of molecules each containing one or more of the desired mutations.
  • the object of the process which is the subject of the present invention is not either to introduce any substitution at the level of a given position, as in the case of random mutagenesis, but on the contrary to introduce a type ' of particular and predefined substitution.
  • This method thus combines the advantages of site-directed mutagenesis (control of the nature of the modifications obtained at a given position), and of random mutagenesis (obtaining a large number of different mutations distributed over many positions of the DNA fragment to mutate). It allows a large number of directed mutations to be carried out in a very short time.
  • the method of the invention is remarkable in that the constraint linked to the position of the mutation and that linked to its nature are dissociated; it is for example possible to carry out mutations of a particular type (for example any codon to Alanine) over an entire coding sequence.
  • each of the mutants obtained at the end of the reaction contains one or more mutations of known nature (codon alanine), but of unknown position.
  • the process of the invention makes it possible to incorporate at a few particular positions oligonucleotides containing degenerate bases. In this example, the positions are relatively known (the number of positions is limited), and the nature of the mutations introduced is unknown.
  • the method of the invention is also remarkable by the fact that at the end of the mutagenesis reaction, a large number of different DNA molecules are available, thus constituting a library. These molecules correspond to all the DNA molecules which have incorporated at least one mutation at the sites previously pointed out. The number of different mutant molecules is very important because all combinations of mutations are possible.
  • the mutagenesis method according to the invention can also be applied to a mutated gene bank.
  • This library is then used as a template in place of the target gene.
  • a series of N oligonucleotides of sequence substantially complementary to at least one region of the target mutated genes is prepared, then said series of oligonucleotides is reacted with said target mutated genes under conditions allowing the production of copies of the target mutated genes carrying to minus a mutation.
  • the target mutated genes are carried, by circular double-stranded plasmids, and each oligonucleotide has a sequence complementary to a region different from the target mutated genes and at least one mutation placed at the center of the sequence, of the oligonucleotide, the set N of said oligonucleotides of the series, with N greater than 5, covers all or part of the sequence said mutated target genes.
  • the said series of oligonucleotides is then reacted with the target mutated genes in the presence of a polymerase so as to generate a library of mutated genes where each mutation originating from a different oligonucleotide is present on average in less than 1/5 of the genes form the bank.
  • Another application of the method according to the invention consists in that the target mutated gene bank used as a template has previously been obtained by the massive mutagenesis method. The average number of mutations per molecule increases with the number of rounds of massive mutagenesis performed.
  • N is between approximately 5 and 10 6 and preferably between 50 and 500, and each mutation originating from a different oligonucleotide is present on average in between 1/5 and 1 / 10 6 and preferably between 1/50 and 1/500 of the bank's genes.
  • the method of the invention particularly contemplates the case where the series of oligonucleotides comprises N different oligonucleotides and where each mutation originating from a different oligonucleotide is present in an average of approximately 1 / N of the genes of the library, with N having the value above.
  • This characteristic distinguishes the method of the invention from the prior art, where the examples of multiple mutagenesis using simultaneously several oligonucleotides are on the contrary based. on 'incorporation rate of each oligonucleotide ' greater than 75%. Indeed, these approaches aim to isolate only the mutant that has incorporated all the oligonucleotides, and the high incorporation rates allow easily achieve this goal.
  • the frequency of mutation at the level of each of the mutations to be introduced is controlled so as not to obtain DNA molecules containing too many mutations.
  • the objective is to have mutants each containing a mutation or a combination of a few different mutations.
  • the ratio between the quantity of each mutant oligonucleotide and the quantity of matrix to be mutated must be controlled. This ratio is between 0.01 and 100, and preferably between 0.1 and 10 depending on the case.
  • a first embodiment consists in using a polymerase having a strand displacement activity such as Taq polymerase, an exonuclease activity or 3 '->5' as the Pfu polymerase.
  • the reaction may include the presence of a ligase .
  • a second embodiment consists in using a polymerase having no activity of strand displacement or exonuclease 3. '->5' as T4 polymerase, and in this case the reaction is carried out in the absence of ligase.
  • the oligonucleotides of the series have a size of between 10 and 100 and preferably between 15 and 25 nucleotides. Each of them is homologous to a part of the DNA sequence to be mutated, to the exclusion of one or a few positions located in its internal part, which constitute the mutation or mutations to be introduced. These oligonucleotides can be overlapping, that is to say comprise common sequences of two adjacent different regions. The oligonucleotides are preferably all of. same orientation, so that only one strand of the target gene is replicated, which makes it possible to obtain a low mutagenesis rate. In a particular embodiment, the oligonucleotides are reconstructed from two oligonucleotides, according to the method described in patent US 5,858,731.
  • each oligonucleotide comprises
  • Said mutations of each oligonucleotide can be chosen from deletions and / or insertions of one or more nucleotide (s).
  • a particular form of mutations is the use of degenerate oligonucleotides. That is to say that each oligonucleotide of the series is present in several copies, each copy having a different nucleotide at the level of said mutation (s).
  • each mutation is of the type allowing the introduction of an identical codon in each oligonucleotide or a codon corresponding to the same amino acid, in substitution for the original codon of the target gene.
  • said codon corresponds to an amino acid • selected from the group comprising Ala, Val, Gly, Leu, Ile.
  • the template is prepared, preferably a plasmid containing the DNA fragment (s) to be mutated.
  • the mutant oligonucleotides different are synthesized preferably between 5 and 10 6 , and more preferably between 50 and 500, then all of the mutant oligonucleotides are mixed.
  • the final concentration of each of the oligonucleotides in the mixture is thus divided during this step by the number of oligonucleotides.
  • They are added to the matrix, that is to say to the plasmid containing the. DNA fragments to mutate, at a concentration such as the ratio between the number of matrix molecules and the number of molecules of each of the mutant oligonucleotides is between 0.01 and 100, and preferably between 0.1 and 10.
  • the matrix is denatured by heat (approximately 95 ° C), so as to temporarily have single-stranded DNA.
  • oligonucleotides we add all the elements necessary to achieve replication of the matrix from the mutant oligonucleotides, and in particular a polymerase, the buffer allowing its activity, nucleotide triphosphates in sufficient quantity, any necessary cofactors.
  • the replication reaction then takes place under the temperature conditions corresponding to the maximum activity of the polymerase.
  • a ligase can be added during the replication step, so that the strands of neosynthesized DNA join at the 5 end. ' of another oligonucleotide, linked on the matrix 3 ′ of the first. In this case, the oligonucleotides are previously phosphorylated.
  • the denaturation and replication steps are repeated several times.
  • the polymerase is thermostable, in order to avoid the need to add enzyme at each cycle.
  • the DNA molecules present in the mixture are of several types:
  • Competent bacteria are transformed by the above mixture, these bacteria are then spread on a medium containing a selective agent so as to select the bacteria which have integrated a plasmid.
  • the DNA molecules which were cleaved in the preceding step are eliminated because the presence of a complete circular plasmid is essential for the survival of the bacteria in selective medium.
  • the bacterial colonies obtained are taken individually and used to seed a selective nutritive medium.
  • a plasmid DNA preparation of these cultures is then carried out in order to isolate a large quantity of potentially mutant plasmid DNA.
  • An examination of the different plasmid DNA molecules at this stage makes it possible to calculate the average rate of incorporation of each oligonucleotide, and to verify that it is close to the value sought.
  • the biological activity corresponding to the different batches of mutant plasmid preparations is tested.
  • the activity measured can be greater than that of the non-mutated fragment, equal, or less.
  • the corresponding plasmid is sequenced so as to be able to locate the position of the introduced mutation.
  • the biological activity corresponding to the mutant molecules is tested, and this measurement is compared with that of the biological activity corresponding to the non-mutated plasmid DNA molecule. When the observation of these measurements reveals a significant difference, the mutant molecules are sequenced in order to highlight the position of the mutation at the origin of this modification of activity.
  • an embodiment of the mutagenesis method comprises the following steps: a) a matrix is prepared consisting of a plasmid containing the target gene or the target mutated gene bank and a resistance gene, b) prepares an equimolecular series of oligonucleotides having a sequence complementary to a region different from the target gene or the target mutated gene bank and at least one mutation placed at the center of the oligonucleotide sequence, all of the oligonucleotides of the series covering all or part of the sequence of said target gene, c) mixing the series of oligonucleotides prepared in step (b) with the plasmid of step (a) according to a molar ratio of each oligonucleotide relative to the plasmid included between 0.01 and 100 and preferably between
  • the oligonucleotides can be phosphorylated at their 5 ′ end when, in step (f), a ligase, advantageously a thermostable ligase, is added.
  • the mutagenesis method according to the invention is particularly useful for measuring the biological activity of the mutated proteins encoded by the mutated target genes. Consequently, the target gene is a nucleic acid molecule encoding a protein of interest with or without its own regulatory sequences. If the target gene does not include regulatory sequences, such as a promoter, these are present at the plasmid level.
  • the invention therefore also relates to a method of mutagenesis of a target protein or of a bank of target mutated proteins, characterized in that it comprises the preparation of a library of expression of mutated genes from a gene target coding for said protein according to the mutagenesis method described above, then the expression of said mutated genes to produce a library of mutated proteins, and . optionally screening said mutated proteins for a desired function, advantageously with respect to the target protein.
  • the invention therefore makes it possible to carry out a process for selecting mutated proteins having a modified activity compared to the same non-mutated protein, or the mutated gene corresponding to said mutated protein, comprising a mutagenesis process above, then after the screening of said mutated proteins for a desired function, advantageously in relation to the target protein, the selection of the mutated protein exhibiting the function desired, and optionally the sequencing of the mutated gene corresponding to said mutated protein.
  • k) seeds of individual bacteria are seeded from the colonies of step (j), 1) plasmid DNA preparations of the cultures of step (k) are made, m) biological activity associated with each plasmid DNA preparation of step (1) and the result obtained is compared with that measured using the plasmid DNA. not transferred. n) optionally, sequencing of the plasmid DNA preparations which made it possible to observe significant modifications of the biological activity.
  • the invention also relates to a series of oligonucleotides mutated with respect to a target gene or to the target mutated gene bank as defined above.
  • the subject of the invention is also a bank of mutated genes capable of being obtained by a process described above, characterized in that each different mutation is present on average in less than 1/5 of the genes from the bank and preferably on average in approximately 1 / N of the library genes, with N greater than 5, preferably with N between approximately 5 and 10 6 and most preferably with N between 50 and 500.
  • this library is obtained, in accordance with process of the invention, thanks to the use of N oligonucleotides with N greater than 5, preferably with N between approximately 5 and 10 6 and most preferably with N between 50 and 500.
  • FIG. 1 represents a distribution of the mutant oligonucleotides over the sequence of the CD4 molecule.
  • Each of the oligonucleotides contains a maximum of three mutations, represented here by the broken line of the arrow, located in its center, intended to change the codon aimed at Alanine.
  • the oligonucleotides overlap each other, and are shown here on three levels for clarity. In the example of Figure 1, only 24 mutant oligonucleotides are shown. In Example 1 below, 95 oligonucleotides were used simultaneously. In this example, the oligonucleotides carrying the mutations are all of the same orientation.
  • FIG. 2 is a schematic summary of the steps of the mutagenesis method according to the invention from the mutant oligonucleotides of Figure 1. Mutations in DNA molecules are represented by a vertical bar. The letters mean:
  • FIG. 3 represents an example of construction of mutant oligonucleotides from half-oligonucleotides comprising a ligation by T4 ligase.
  • FIG. 4 gives examples of a schematic representation of the oligonucleotides containing degenerate bases at the level of the mutation points.
  • the letter N means that any of the 4 bases can be present at this location.
  • the oligonucleotide concerned is actually made up of a mixture of 4 molecular species.
  • a gene encoding the CD4 molecule has been introduced into the vector SK +.
  • the first 95 codons of this gene were the target of a massive mutagenesis reaction according to the technique of the invention.
  • oligonucleotides of 21 bases were synthesized. Each of these oligonucleotides was complementary to a sequence of the CD4 gene centered on a codon. Thus, the first oligonucleotide was homologous to a sequence centered on the codon. 1. It was perfectly homologous to 9 bases on each side of said codon, and contained 3 mutations, intended to transform the first codon into Alanine codon ( Figure 1).
  • the second oligonucleotide was centered on the second codon and contained three adjacent mutations in its middle.
  • the 95 oligonucleotides overlapping with one another and all with the same orientation, were then mixed equimolar and phosphorylated using T4 kinase under standard conditions of use.
  • the mixture was subjected to a reaction of 12 temperature cycles [(94 ° C, l ');; (35 ° C, l'); (68 ° C, 20 ')].
  • reaction mixture was then subjected to digestion with 5 units of. the enzyme Dpnl under suitable buffer conditions, for 30 'at 37 ° C.
  • Competent bacteria were transformed by this mixture using a thermal shock protocol, and spread on a petri dish containing the selective agent. The next day, a thousand bacteria were obtained.
  • FIG. 2 A diagram summarizing the stages of the technique is proposed in FIG. 2.
  • mutant molecules were then amplified by bacterial culture and preparation of plasmid DNA.
  • Example 2 Valine scanninq using the reconstruction of the oligonucleotides reconstructed from half-oligonucleotides. A series of 11 oligonucleotides were each reconstructed from two double-stranded half-oligonucleotides. The ligation of the two half-oligonucleotides was carried out by a reaction using T4 ligase. Only one of the two half-oligonucleotides being phosphorylated at one of its 5 'ends, this reaction had the effect of making it possible to obtain a single complete oligonucleotide, composed of 18 bases (8 on each side perfectly homologous, and two in the middle invariably consist of GT nucleotides ( Figure 3).
  • valine codons can be written in the form GTN, where N represents any of the four bases.
  • Example 3 Improvement of an active site by massive saturation mutagenesis.
  • plasmid DNA molecules were intended to be screened to measure an increase in the activity of the enzyme.
  • Example 4 Optimization of the codons of a gene.
  • Genes generally contain codons that are unfavorable for the expression of the proteins for which they code. These unfavorable codons can be seen as a mechanism for regulating the expression of a gene. These unfavorable codons are relatively well identified, and it may be necessary to change into a more favorable codon in protein expression but does not induce amino acid change.
  • a library of mutations relating to these unfavorable codons can be produced using the technique of the invention, and the mutant molecules exhibiting the best levels of expression are then selected.
  • a mutant oligonucleotide must be synthesized for each unfavorable codon, the mutations carried by these oligonucleotides being defined by the fact that they change a codon unfavorable for expression into a codon favorable to it, without changing the primary sequence of the corresponding protein.
  • the average frequency of incorporation of the mutant oligonucleotides can be sought within a relatively wide range, for example between 1 and 20%. Indeed, the number of simultaneous mutations making it possible to obtain the best level of expression is not known. In this context, several banks corresponding to different incorporation frequencies can be produced.
  • To carry out these libraries having different mutation rates it is possible either to carry out the process described using variable concentrations of oligonucleotides, or to carry out the process of massive mutagenesis several times in succession, ie to use the mutant library produced during a first stage of massive mutagenesis as a template for a second stage of massive mutagenesis. The process is similar to that presented in Example 1.
  • the mutant molecules are then screened on the criterion of their level of expression: the molecules having the best levels of expression are selected. '

Abstract

La présente invention concerne le domaine de la biologie moléculaire et plus particulièrement celui de la mutagenèse. Elle a pour objet un procédé de mutagenèse dirigée à haut débit, c'est-à-dire la constitution de nombreux mutants dirigés en un temps et un nombre d'étapes réduits. Ce procédé sera donc qualifié mutagenèse massive.

Description

PROCÉDÉ DE MUTAGENÈSE DIRIGÉE MASSIVE.
La présente invention concerne le domaine de la biologie moléculaire et plus particulièrement celui de la mutagenèse. Elle a pour objet un procédé de mutagenèse dirigée à haut débit, c'est-à-dire la constitution de nombreux mutants dirigés en un temps et un nombre d'étapes réduits. Ce procédé sera donc qualifié de « mutagenèse massive ». La mutagenèse est une technique visant à modifier artificiellement la séquence nucleotidique d'un fragment d'ADN dans le but de modifier l'activité biologique qui- en découle. La mutagenèse a pris cette dernière décennie une place importante dans de nombreux travaux de biologie moléculaire.
Le terme dé mutagenèse peut être associé à trois modifications distinctes d'un fragment d'ADN : la délétion, qui consiste à éliminer des nucléotides du fragment d'ADN d'intérêt, - l'insertion, qui consiste à en rajouter, et
- la substitution, qui consiste à remplacer une ou plusieurs bases par un même nombre de bases de nature différente.
Les techniques de mutagenèse peuvent être séparées en deux grands groupes : la mutagenèse aléatoire d'une part, et la mutagenèse dirigée d'autre part.
La mutagenèse aléatoire vise à introduire des substitutions de nature et de position aléatoires dans un fragment d'ADN. Historiquement, la mutagenèse aléatoire était réalisée au moyen de procédés chimiques altérant la structure de l'ADN. Plus récemment, l'amplification d'une molécule en utilisant une polymérase dans des conditions particulières a souvent remplacé les procédés chimiques . Ces conditions particulières sont caractérisées en ce qu'elles altèrent les capacités dé l'enzyme à 'répliquer fidèlement l'ADN. Celle-ci introduit au fil des cycles des mutations, c'est-à-dire des différences par rapport à la séquence initiale. À la fin de la réaction, un grand nombre de copies de la molécule initiale sont obtenues, chacune de ces molécules comportant des mutations différentes. Ces molécules sont présentes sous forme d'une banque, c'est-à- dire d'un mélange de molécules de nature différente (différant par la nature et la position de leurs mutations) .
La mutagenèse dirigée vise à introduire une ou quelques mutations (substitutions, mais aussi délétions ou insertions) de nature et de position connues dans un fragment d'ADN. Un oligonucléotide est utilisé ' pour introduire cette mutation. Cet oligonucléotide est classiquement constitué d'une vingtaine de bases. La séquence de cet oligonucléotide est homologue en tout point à la séquence ciblée sur le fragment d'ADN à l'exception d'une ou de quelques positions localisées dans sa partie médiane. •
Cet oligonucléotide est ensuite utilisé pour amorcer une réaction de réplication (ou d'amplification, c'est-à-dire de multiples réplications) en utilisant le fragment d'ADN comme matrice. La séquence nouvellement synthétisée contient la modification recherchée.
Les premières techniques de mutagenèse dirigée étaient basées sur l'amplification du seul fragment d'ADN d'intérêt (sous la forme d'un fragment d'ADN linéaire), qui devait ensuite être introduit dans un plasmide. Ces techniques étaient fastidieuses et devaient être adaptées à chaque système d'étude.
Plus récemment, l' oligonucléotide mutant a été utilisé pour répliquer directement le plasmide contenant le fragment d'ADN d'intérêt. Le nombre de manipulations à réaliser est ainsi minimisé.
La réalisation pratique de la mutagenèse dirigée est cependant loin d'être simple. Se pose notamment le problème de l'isolement des molécules ayant incorporé la mutation par rapport aux molécules ne l'ayant pas incorporée. La seule réplication d'un fragment d'ADN circulaire (correspondant au cas classique d'un gène clone dans un plasmide) au moyen d'un oligonucléotide mutant ne permet pas, en l'absence de système de sélection, d'observer un taux de mutagenèse détectable. L'ADN synthétisé in vitro pouvant être distingué de l'ADN synthétisé dans des bactéries sur le critère de son contenu en bases méthylées, un système de criblage basé sur ce critère a été mis au point et généralisé. Il s'agit d'utiliser l'enzyme Dpnl, spécifique de sites présents sur l'ADN méthylé mais pas sur l'ADN non méthylé (Lacks et al., 1980, Methods in Enzymology, 65 :138). Les molécules n'ayant pas subi de réplication in vitro sont ainsi éliminées. Mais même en utilisant ce système de criblage de mutants, l'efficacité de la réaction de- mutagenèse reste faible et voisine de 5% seulement de molécules mutantes . Ce faible taux de mutants est notamment dû au fait qu'à l'issue de la réaction de mutagenèse dirigée, les molécules circulaires sont introduites dans, des bactéries contenant un système de réparation de l'ADN qui élimine une grande partie des mutations si celles-ci ne sont portées que par l'un des brins d'ADN.
De nombreux systèmes ont été proposés pour tenter d'améliorer l'efficacité de ces techniques de mutagenèse. Ces techniques nécessitent le plus souvent un second oligonucléotide permettant d'améliorer la fréquence des molécules mutantes avant criblage (Brevet EP 96942905' ; Brevet WO 9935281) . D'autres systèmes utilisent également un second oligonucléotide permettant un système de criblage particulier et parfois plus efficace (Brevet EP 0938552, Catalogue Clontech 2000, page 45) . Enfin d'autres systèmes utilisent des souches bactériennes particulières, ces systèmes ayant pour objet de minimiser la déperdition de rendement due à l'activité réparatrice des bactéries (Brevet US 4,873,192 ; Brevet EP 0938552).
Enfin, la plupart des techniques existantes permettent d'intégrer simultanément ' plusieurs oligonucléotides dans une séquence d'ADN. En règle générale, jusqu'à trois oligonucléotides ont pu être introduits simultanément en différents lieux du fragment à muter (Brevet WO 9935281 ; Brevet EP 0938552) . Un article fait même référence à l'obtention de molécules ayant simultanément intégré jusqu'à sept oligonucléotides en une seule étape (Perlak et al., 1990, Nucleic Acid Research, 18 :7457) .
La notion de banque n'est pas, dans la technique selon l'art antérieur, adaptée pour caractériser les produits obtenus à l'issue d'une réaction de mutagenèse dirigée. En effet, dans la grande majorité des cas, un seul produit est obtenu à l'issue de la réaction, contenant une seule mutation. Dans les cas où plusieurs mutations sont introduites simultanément au moyen de plusieurs oligonucléotides (Brevet WO 9935281 ; Perlak et al., 1990, Nucleic Acid Research, 18 :7457), les seuls produits recherchés sont ceux ayant incorporé la totalité des mutations, et la technique tend à être optimisée dans l'objectif de maximiser la fréquence de ces produits. Les produits n'ayant incorporé qu'une petite fraction des mutations sont minimisés et sont dans ces rapports considérés comme des produits secondaires .
La mutagenèse peut avoir pour but le gain ou la perte d'une activité. Le gain d'une activité, ou plus fréquemment sa simple amélioration, est particulièrement intéressante dans les domaines de l'enzymologie ou de l'association ligand/ récepteur. Ainsi, pouvoir disposer d'une enzyme d'activité améliorée peut permettre de réduire les coûts de procédés industriels utilisant ces enzymes. De même, l'affinité de la liaison entre un ligand et son récepteur peut être améliorée grâce à quelques mutations localisées au niveau du site de reconnaissance de l'un par l'autre.
La recherche de ces améliorations d'activité est souvent désignée de façon générique • par « évolution moléculaire ». Il s'agit de simuler l'évolution lors de réactions in vi tro, en introduisant des mutations dans un fragment d'ADN et en sélectionnant ceux ayant des activités améliorées. Plusieurs tours de mutagenèse/sélection miment ainsi l'évolution d'une molécule en présence d'une pression sélective. Le type de mutagenèse utilisé le plus fréquemment dans ce contexte est la mutagenèse aléatoire. En effet, aucun élément ne permettant généralement de définir à priori la nature et la position des changements susceptibles d'apporter une amélioration de l'activité étudiée, il est nécessaire dans ce contexte de produire un grand nombre de molécules ayant chacune des mutations de position et de nature différentes, afin de maximiser les chances que parmi elles se trouve une molécule correspondant à une activité améliorée . La perte de l'activité biologique associée à un fragment d'ADN ayant été soumis à mutagenèse apporte des informations particulières sur les acides aminés supportant son activité. Ainsi, si la modification d'un acide aminé entraîne la perte de l'activité biologique, il est probable que cet acide aminé intervienne dans la constitution du site actif supportant cette activité biologique. Ces résultats doivent cependant être considérés avec beaucoup de nuances : il est par exemple possible que cet acide aminé n'intervienne pas directement dans le site actif de l'activité biologique, mais qu'il prenne part à des activités annexes, comme l'adressage intracellulaire de la protéine par exemple. D'autre part, il est possible que. la modification introduite déstabilise l'ensemble de la protéine, l'effet de la substitution introduite étant alors indirect et non direct. Pour ces deux raisons, il est important de savoir reconnaître sur un gène codant pour une protéine les motifs supportant les activités d'adressage, de localisation membranaire, de liaison de cofacteurs... D'autre part, il est essentiel que les modifications introduites induisent le moins de déstabilisation possible de la protéine. Le plus souvent, ce sont de petits acides aminés hydrophobes, l'Alanine ou la Valine, qui sont introduits en substitution des acides aminés d'origine. Ces petits acides aminés sont connus pour conserver la majorité des structures secondaires protéiques (Hélice ou feuillet β) , et donc pour minimiser les déstabilisations globales des protéines. Les travaux menés dans ce domaine impliquent la création d'un grand nombre de mutants ponctuels portant chacun une substitution différente d'un acide aminé de la protéine par une alanine. Ces travaux nécessitent une somme de travail très importante, chaque mutant devant être réalisé indépendamment.
Il existe des exceptions aux cas généraux présentés ci-dessus. La mutagenèse dirigée a été utilisée dans le contexte de la recherche d'un gain d'activité. Dans le cas où la région du site actif est bien connue, on peut en effet espérer que la modification dirigée des acides aminés le constituant est susceptible d'entraîner une amélioration de l'activité. Ainsi, il est proposé dans le brevet européen No. 527 809 de remplacer séquentiellement les acides aminés . d'une région active par un acide aminé fréquemment impliqué dans les sites actifs (la serine par exemple) en utilisant une technique apparentée à la mutagenèse dirigée. Cette technique présuppose cependant de disposer d'informations précises concernant le site actif de la molécule étudiée, et utilise une technologie ne permettant pas d'introduire un grand nombre de modifications sur un fragment d'ADN.
A l'inverse, des expériences de mutagenèse aléatoire ont été menées dans un contexte de recherche de perte d'activité (Loeb et, al., 1989, Nature, 340 :397). Dans ce cas, de très nombreux clones doivent être analysés pour obtenir des résultats concordants et ainsi s'affranchir des limites posées par le remplacement aléatoire.
La présente invention est une technigue intermédiaire entre la mutagenèse dirigée et la mutagenèse aléatoire. En effet, son objet n'est pas comme dans le cas de la mutagenèse dirigée simple d'obtenir un seul produit en fin de réaction contenant la ou les mutations souhaitées, mais d'obtenir un mélange de molécules contenant chacune une ou plusieurs des mutations désirées. L'objet du procédé objet de la présente invention n'est pas non plus d'introduire au niveau d'une position donnée n'importe quelle substitution, comme dans le cas de la mutagenèse aléatoire, mais au contraire d'y introduire un type ' de substitution particulier et prédéfini .
Ce procédé combine ainsi les avantages de la mutagenèse dirigée (contrôle de la nature des modifications obtenues en une position donnée) , et de la mutagenèse aléatoire (obtention d'un grand nombre de mutations différentes réparties sur de nombreuses positions du fragment d'ADN à muter) . Il permet de réaliser en un temps très court un grand nombre de mutations dirigées.
Ces buts sont atteints selon 1 ' invention grâce à un procédé de mutagenèse d'un gène cible consistant à préparer une série , de N oligonucléotides de séquence substantiellement complémentaire d'au moins une région du gène cible, puis . à faire réagir ladite série •dOligonucléotide avec ledit gène cible dans des conditions permettant la production de copies du gène cible portant au moins une mutation. Le gène cible est porté par un plasmide circulaire double-brin.. Chaque oligonucléotide présente une séquence complémentaire d'une région différente du gène cible et au moins une mutation placée au centre de la séquence de l' oligonucléotide. l'ensemble N desdits oligonucléotides de la série, avec N supérieur à 5, couvre tout ou partie de la séquence dudit gène cible. On fait ensuite réagir ladite série d' oligonucléotides avec le gène cible en présence d'une polymérase de façon à générer une
• banque de gènes mutés où chaque mutation provenant d'un oligonucléotide différent est présente en moyenne dans moins de 1/5 des gènes de la banque.
Le procédé de l'invention est remarquable en ce que la contrainte liée à la position de la mutation et celle liée à sa nature sont dissociées ; il est par exemple possible de réaliser des mutations d'un type particulier (par exemple n'importe quel codon vers Alanine) sur toute une séquence codante. Dans cet exemple, chacun des mutants obtenus en fin de réaction contient une ou plusieurs mutations de nature connue (codon alanine) , mais de position non connue. A l'inverse, le procédé de l'invention permet d'incorporer sur quelques positions particulières des oligonucléotides contenant des bases dégénérées . Dans cet exemple, les positions sont relativement connues (le nombre de positions est limité) , et la nature des mutations introduites est inconnue.
Ces caractéristiques contrastent par rapport aux techniques de mutagenèse aléatoire, où ni la nature ni la position des mutations ne sont connues, et la mutagenèse dirigée classique, où la nature et la position de la mutation introduite sont, connues .
Le procédé de 1 ' invention est également remarquable par le fait qu'à l'issue de la réaction de mutagenèse, on dispose d'un grand nombre de molécules d'ADN différentes, constituant donc une banque. Ces molécules correspondent à toutes les molécules d'ADN ayant incorporé au moins une mutation au niveau des sites préalablement pointés. Le nombre de molécules mutantes différentes est très important car toutes les combinaisons de mutations sont possibles .
Le procédé de mutagenèse selon 1 ' invention peut également s ' appliquer à une banque de gènes mutés . Cette banque est alors utilisée comme matrice à la place du gène cible. On prépare une série de N oligonucléotides de séquence substantiellement complémentaire d'au moins une région des gènes mutés cibles, puis on fait réagir ladite série d' oligonucléotides avec lesdits gènes mutés cibles dans des conditions permettant la production de copies des gènes mutés cibles portant au moins une mutation. Les gènes mutés cibles sont portés, par des plasmides circulaires double brin, et chaque oligonucléotide présente une séquence complémentaire d'une région différente des gènes mutés cibles et au moins une mutation placée au centre de la séquence, de l' oligonucléotide, l'ensemble N desdits oligonucléotides de la série, avec N supérieur à 5, couvre tout ou partie de la séquence desdits gènes mutés cibles. On fait ensuite réagir ladite série d'oligonucléotides avec les gènes mutés cibles en présence d'une polymérase de façon à générer une banque de gènes mutés où chaque mutation provenant d'un oligonucléotide différent est présente en moyenne dans moins de 1/5 des gènes de la banque.
Une autre application du procédé selon l'invention consiste en ce que la banque de gènes mutés cibles utilisée comme matrice a préalablement été obtenue par le procédé de mutagenèse massive. Le nombre moyen de mutations par molécule augmente avec le nombre de tours de mutagenèse massive réalisés .
Selon une forme avantageuse de réalisation du procédé de l'invention, N est compris entre environ 5 et 106 et de préférence entre 50 et 500, et chaque mutation provenant d'un oligonucléotide différent est présente en moyenne dans entre 1/5 et 1/106 et de préférence entre 1/50 et 1/500 des gènes de la banque.
Le procédé de l'invention envisage tout particulièrement le cas où la série d'oligonucléotides comprend N oligonucléotides différents et où chaque mutation provenant d'un oligonucléotide différent est présente dans en moyenne environ 1/N des gènes de la banque, avec N ayant la valeur ci-dessus . Cette caractéristique distingue le procédé de l'invention de l'art antérieur, où les exemples de mutagenèse multiple utilisant simultanément plusieurs oligonucléotides sont au contraire basées . sur des ' taux d'incorporation de chaque oligonucléotide ' supérieur à 75%. En effet, ces approches ont pour but d'isoler uniquement le mutant ayant incorporé tous les oligonucléotides, et les taux d'incorporation élevés permettent facilement de parvenir à ce but. Au contraire, dans le procédé selon l'invention, la fréquence de mutation au niveau de chacune des mutations à introduire est contrôlée de façon à ne pas obtenir de molécules d'ADN contenant un trop grand nombre de mutations. L'objectif est de disposer de mutants contenant chacun une mutation ou une combinaison de quelques mutations différentes. Pour ce faire, le ratio entre la quantité de chaque oligonucléotide mutant et la quantité de matrice à muter doit être contrôlé. Ce ratio est compris entre 0,01 et 100, et preferentiellement entre 0,1 et 10 selon les cas.
La réaction entre la série d'oligonucléotides avec le gène cible ou avec la banque de gènes mutés cibles peut être réalisée avec différents types de polymérase, avantageusement thermostables. Un premier mode de réalisation consiste à ' utiliser une polymérase ayant une activité de déplacement de brin comme la Taq polymérase, ou une activité exonucléasique 3 ' -> 5' comme la Pfu polymérase. Dans ce mode de réalisation, la réaction peut comprendre la présence d'une 'ligase.. Un. second mode de réalisation consiste à utiliser une polymérase n'ayant pas d'activité de déplacement de brin ou exonucléasique 3 ' -> 5 ' comme la T4 polymérase, et dans ce cas la réaction est réalisée en l'absence de ligase.
Les oligonucléotides de la série ont une taille comprise entre 10 et 100 et de préférence entre 15 et 25 nucléotides . Chacun d'entre eux est homologue d'une partie de la séquence d'ADN à muter, à l'exclusion d'une ou de quelques positions localisées dans sa partie interne, qui constituent- la ou les mutations à introduire. Ces oligonucléotides peuvent être chevauchants, c'est-à-dire comprendre des séquences communes de deux régions différentes adjacentes. Les oligonucléotides sont preferentiellement tous de . même orientation, de façon à ce qu'un seul brin du gène cible soit répliqué, ce qui permet d'obtenir un taux de mutagenèse faible. Dans un mode • de réalisation particulier, les oligonucléotides sont reconstruits à partir de deux oligonucléotides, selon le procédé décrit dans le brevet US 5 858 731. Avantageusement, chaque oligonucléotide comprend
1 ou plus mutation (s) et de préférence de 1 à 3 mutation (s) placée (s) au centre de sa séquence.
Lesdites mutations de chaque oligonucléotide peuvent être choisies parmi des délétions et/ ou des insertions de un ou plusieurs nucléotide (s) .
Une forme particulière de mutations consiste à utiliser des oligonucléotides dégénérés. C'est-à-dire que chaque oligonucléotide de la série est présent en plusieurs exemplaires, chaque exemplaire possédant un nucléotide différent au niveau de la ou desdites mutation (s) .
Une autre forme particulière de mutation consiste en ce que chaque mutation est du type permettant d'introduire un codon identique dans chaque oligonucléotide ou un codon correspondant au même acide aminé, en substitution du codon original du gène cible. Avantageusement, ledit codon correspond à un acide • aminé choisi dans le groupe comprenant Ala, Val, Gly, Leu, Ile.
Le procédé de l'invention peut être décrit plus précisément à l'aide des étapes suivantes :
On prépare la matrice, de préférence un plasmide contenant le ou les fragments d'ADN à muter.
- On synthétise les oligonucléotides mutants différents de préférence entre 5 et 106, et plus preferentiellement entre 50 et 500, puis on mélange l'ensemble des oligonucléotides mutants. La concentration finale de chacun des oligonucléotides dans le mélange est ainsi divisée lors de cette étape par le nombre d'oligonucléotides. - On les ajoute à la matrice, c'est-à-dire au plasmide contenant le ou les . fragments d'ADN à muter, à une concentration telle que le rapport entre le nombre de molécules de matrice et le nombre de molécules de chacun des oligonucléotides mutants soit compris entre 0,01 et 100, et de préférence entre 0,1 et 10.
- On dénature la matrice par la chaleur (environ 95°C) , de façon à disposer temporairement d'ADN simple brin.
Lors du retour à une température plus basse, certains ou tous les oligonucléotides présents dans le mélange se fixent sur la matrice au niveau de leur site d'homologie.
- On ajoute tous les éléments nécessaires à réaliser une réplication de la matrice à partir des oligonucléotides mutants, et notamment une polymérase, le tampon permettant son activité, des nucléotides triphosphates en quantité suffisante, les éventuels cofacteurs nécessaires . La réaction de réplication a ensuite lieu dans les conditions de température correspondant à l'activité maximale de la polymérase. Éventuellement, une ligase peut être ajoutée lors de l'étape de réplication, de façon à ce que les brins d'ADN néosynthétisés se liguent au niveau de l'extrémité 5.' d'un autre oligonucléotide, lié sur la matrice en 3' du premier. Dans ce cas, les oligonucléotides sont préalablement phosphorylés .
Éventuellement, on répète les étapes de dénaturation et de réplication plusieurs fois. Dans ce cas, il est préférable que la polymérase soit thermostable, afin d'éviter la nécessité de rajouter de l'enzyme à chaque cycle. A l'issue dé cette réaction, les molécules d'ADN présentes dans le mélange sont de plusieurs types :
- d'une part, il reste de la matrice initiale double brin n'ayant pas été . efficacement répliquée, - d'autre part, une partie des molécules a été répliquée, c'est-à-dire qu'elles contiennent ' un brin d'origine et un brin néosynthétisé à partir d'une ou de plusieurs amorces que constituent les oligonucléotides mutants . - On soumet le mélange obtenu à la digestion par l'enzyme Dpnl, ou une autre enzyme de restriction permettant de supprimer les molécules d'ADN- méthylés sur les deux brins et de conserver celles qui ne sont pas méthylés ou hémi- méthylés .
- On transforme des bactéries compétentes par le mélange précédent, ces bactéries sont ensuite étalées sur un milieu contenant un agent sélectif de façon à sélectionner les bactéries ayant intégré un plasmide. Les molécules d'ADN qui ont été clivées à 1 ' étape précédente sont éliminées car la présence d'un plasmide circulaire complet est indispensable à la survie de la bactérie en milieu sélectif. - On prélève individuellement les colonies bactériennes obtenues et on les utilise pour ensemencer un milieu nutritif sélectif. Une préparation d'ADN plasmidique de ces cultures est ensuite réalisée afin d'isoler une grande quantité d'ADN plasmidique potentiellement mutant. Un examen des différentes molécules d'ADN plasmidiques à ce stade permet de calculer le taux moyen d'incorporation de chaque oligonucléotide, et de vérifier que celui-ci est voisin de la valeur recherchée.
- Éventuellement, on teste l'activité biologique correspondant aux • différents lots de préparations plasmidiques mutantes. L'activité mesurée peut être supérieure à celle du fragment non muté, égale, ou inférieure. Dans le cas où l'activité est modifiée, le plasmide correspondant est séquence de façon à pouvoir localiser la position de la mutation introduite. Dans un mode de réalisation préféré, on teste l'activité biologique correspondant aux molécules mutantes, et on compare cette mesure à celle de l'activité biologique correspondant à la molécule d'ADN plasmidique non mutée. Lorsque l'observation de ces mesures fait apparaître une différence significative, les molécules mutantes sont séquencées afin de mettre en évidence la position de la mutation à l'origine de cette modification d'activité. L'ordre de ces deux dernières étapes est inversé par rapport aux techniques habituelles de mutagenèse dirigée, qui impliquent généralement l'obtention et la vérification de la molécule mutante préalablement au test de son activité biologique. Ainsi, une forme de réalisation du procédé de mutagenèse selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) on prépare une matrice constituée d'un plasmide contenant le gène cible ou la banque de gènes mutés cibles et un gène de résistance, b) on prépare une série équimoléculaire d'oligonucléotides présentant une séquence complémentaire d'une région différente du gène cible ou la banque de gènes mutés cibles et au moins une mutation placée au centre de la séquence de l' oligonucléotide, l'ensemble des oligonucléotides de la série couvrant tout ou partie de la séquence dudit gène cible, c) on mélange la série d'oligonucléotides préparée à l'étape (b) avec le plasmide de l'étape (a) selon un rapport molaire de chaque oligonucléotide par rapport au plasmide compris entre 0,01 et 100 et de préférence entre 0,1 et 10, d) on dénature le mélange de l'étape (c) par la température de façon à obtenir une matrice simple brin, e) on soumet le mélange de l'étape (d) à une température permettant l'hybridation des ' oligonucléotides sur la matrice, f) on ajoute au mélange au moins une polymérase, son tampon et ses cofacteurs, et une quantité suffisante de chacun des nucléotides triphosphates, pour permettre la réplication des brins de la matrice à partir de n'importe lequel des oligonucléotides, g) éventuellement on répète les étapes (d) , (e) et (f), h) on sélectionne par tout moyen approprié les produits de l'étape (f) ou (g) ayant subi ia réplication, i) on transforme les produits sélectionnés à l'étape (h) dans' des bactéries compétentes, et l'on sélectionne les produits portant un plasmide sur un milieu sélectif correspondant à un gène de résistance porté par le plasmide de l'étape (a). Avantageusement, l'étape (h) ci-dessus consiste à soumettre les produits de l'étape (f) à l'action d'une enzyme de restriction sélectionnant les produits ayant subi la réplication, comme l'enzyme Dpnl.
Les oligonucléotides peuvent être phosphorylés à leur extrémité 5' lorsqu'à l'étape (f) on ajoute une ligase, avantageusement une ligase thermostable.
Le procédé de mutagenèse selon l'invention est particulièrement utile pour mesurer l'activité biologique des protéines mutées codées par les gènes cibles mutés . En conséquence, le gène cible est une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine d'intérêt avec ou sans ses propres séquences de régulation. Si le gène cible ne comprend pas les séquences de régulation, comme un promoteur, celles-ci sont présentes au niveau du plasmide.
L'invention concerne donc aussi un procédé de mutagenèse d'une protéine cible ou d'une banque de protéines mutées cibles, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation d'une banque d'expression de gènes mutés à partir d'un gène cible codant pour ladite protéine selon le procédé de mutagenèse décrit précédemment, puis l'expression desdits gènes mutés pour produire une banque de protéines mutées, et .éventuellement le criblage desdites protéines mutées pour une fonction désirée, avantageusement par rapport à la protéine cible.
L'invention permet donc la réalisation .d'un procédé de sélection de protéines mutées présentant une activité modifiée par rapport à la même protéine non mutée, ou du gène muté correspondant à ladite protéine mutée, comprenant un procédé de mutagenèse ci-dessus, puis après le criblage desdites protéines mutées pour une fonction désirée, avantageusement par rapport à là protéine cible, la sélection de la protéine mutée présentant la fonction désirée, et éventuellement le séquençage du gène muté correspondant à ladite protéine mutée.
Ces procédés de mutagenèse d'une protéine cible ou d'une banque de protéines mutées cibles ou de sélection d'une protéine mutée ou du gène Correspondant selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils comprennent la préparation d'une banque d'expression de gènes mutés à partir d'un gène cible codant pour ladite protéine, puis les étapes suivantes : j ) on incube le milieu sélectif à la température adéquate pendant le temps suffisant à la pousse de colonies
» bactériennes individuelles, k) on ensemence des cultures de bactéries individuelles à partir des colonies de l'étape (j), 1) on effectue des préparations d'ADN plasmidique des cultures de l'étape (k) , m) on mesure l'activité biologique associée à chaque préparation d'ADN plasmidique de l'étape (1) et on compare le résultat obtenu par rapport à celui mesuré en utilisant l'ADN plasmidique. non muté. n) éventuellement, on séquence les préparations d'ADN plasmidique ayant permis d'observer des modifications significatives de l'activité biologique.
L'invention a également pour objet une série d'oligonucléotides mutés par rapport à un gène cible ou à la banque de gènes mutés cibles comme défini précédemment.
L'invention a encore pour objet une banque de gènes mutés susceptibles d'être obtenue par un procédé décrit précédemment caractérisée en ce que chaque mutation différente est présente en moyenne dans moins de 1/5 des gènes de la banque et de préférence en moyenne dans environ 1/N des gènes de la banque, avec N supérieur à 5, de préférence avec N compris entre environ 5 et 106 et tout preferentiellement avec N compris entre 50. et 500. De préférence, cette banque est obtenue, conformément au procédé de l'invention, grâce à la mise en œuvre de N oligonucléotides avec N supérieur à 5, de préférence avec N compris entre environ 5 et 106 et tout preferentiellement avec N compris entre 50 et 500.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent donnés à titre non limitatif et des dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 représente une répartition des oligonucléotides mutants sur la séquence de la molécule CD4. Chacun des oligonucléotides contient trois mutations au maximum, représentées ici par la brisure de la ligne de la flèche, localisées en son centre, destinées à changer le codon visé en Alanine. Les oligonucléotides se chevauchent les uns les autres, et sont représentés ici sur trois niveaux par mesure de clarté. Dans l'exemple de la figure 1, 24 oligonucléotides mutants seulement sont représentés. Dans l'exemple 1 ci-après, 95 oligonucléotides ont été utilisés simultanément. Dans cet exemple, les oligonucléotides portant ies mutations sont tous de même orientation.
La figure 2 est un résumé schématique des étapes du procédé de mutagenèse selon l'invention à partir des oligonucléotides mutants de la figure 1. Les mutations dans les molécules d'ADN sont représentées par une barre verticale. Les lettres signifient :
(a) polymérisation (polymérase, dNTP, Tampon et cofacteurs) ;
(b) digestion par Dpnl pour ' éliminer les matrices initiales ; (c) transformation de bactéries . compétentes puis étalement sur milieu sélectif ;
(d) ensemencement de cultures • bactériennes - à partir des colonies isolées puis préparation d'ADN plasmidique . - (e) test phénotypique puis sélection et séquençage des mutants ayant le phénotype 'recherché. La figure 3 représente un exemple de construction d'oligonucléotides mutants à partir de demi- oligonucléotides comprenant une ligation par la T4 ligase.
La figure 4 donne des exemples de représentation schématique des oligonucléotides contenant des bases dégénérées au niveau des points de mutation. La lettre N signifie que n'importe laquelle des 4 bases peut être présente à ce endroit. Ainsi.1' oligonucléotide concerné est en réalité constitué d'un mélange de 4 espèces moléculaires.
Exemple 1 : Alanine Scanning.
Un gène codant pour la molécule CD4 a été introduit dans le vecteur SK+ . Les 95 premiers codons de ce gène ont été la cible d'une réaction de mutagenèse massive selon la technique de l'invention.
Pour ce faire, une série de 95 oligonucléotides de 21 bases ont été synthétisés. Chacun de ces oligonucléotides était complémentaire d'une séquence du gène CD4 centrée sur un codon. Ainsi, le premier oligonucléotide était homologue d'une séquence centrée sur le codon. 1. Il était parfaitement homologue à 9 bases de chaque côté dudit codon, et contenait 3 mutations, destinées à transformer le premier codon en codon Alanine (Figure 1) .
De même, le second oligonucléotide était centré sur le second codon et contenait trois mutations adjacentes en son milieu.
Les 95 oligonucléotides, chevauchants entre eux et tous de même orientation, étaient ensuite mélangés de façon équimolaire et phosphorylés en utilisant la kinase de T4 dans des conditions standards d'utilisation.
La réaction suivante a ensuite été réalisée : Matrice SK-CD4 (250 μg/ μl) : 1 μl
MIX des 95 oligonucléotides 5'P (0,5 μM chacun) 2 μl dNTP Triphosphates (2,5 mM) 10 μl Tampon 10X de Pfu Polymérase 2,5 μl
ATP 10 mM 0,5 μl
Pfu Polymérase (2,5 U / μl) 1 μl Pfu Ligase (4 U / μl) 1 μl
H20 7 μl
Total 25 μl
Le mélange a été soumis à une réaction de 12 cycles de température [ (94°C, l').;(35°C, l') ; (68°C, 20')].
Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à une digestion par 5 unités de. l'enzyme Dpnl dans des conditions de tampon adaptées, pendant 30' à 37°C.
Des bactéries compétentes ont été transformées par ce mélange en utilisant un protocole de choc thermique, et étalées sur une boite de pétri contenant l'agent sélectif. Le lendemain, un millier de bactéries étaient obtenues .
Un schéma résumant les étapes de la technique est proposé en figure 2.
A ce stade, un test statistique de quelques molécules d'ADN de la- banque a été réalisé pour mesurer le taux d'intégration . des mutations, c'est-à-dire le remplacement d'un des 95 codons par un codon Alanine. Cet examen révélait que la fréquence d'incorporation de chaque oligonucléotide était voisine de 1%, ce qui était dans ce cas la valeur recherchée (1/N avec N=95) .
Les molécules mutantes ont ensuite été amplifiées par culture bactérienne et préparation d'ADN plasmidique. Chacun des lots d'ADN plasmidique, correspondant à un . type unique de molécule mutante, a été utilisé pour transfecter des cellules eucaryotes', et celles- ci ont été testées pour le maintien ou la perte des épitopes portés par la molécule CD4, cette activité étant mesurée par la liaison d'un anticorps anti-CD4.
Exemple 2 : Valine scanninq en utilisant la reconstruction des oligonucléotides reconstruits à partir de demi-oligonucléotides . Une série de 11 oligonucléotides ont été chacun reconstruits à partir de deux demi-oligonucléotides double brin. La ligation des deux demi-oligonucléotides a été effectuée par une réaction utilisant la T4 ligase. Seul un des deux demi-oligonucléotides étant phosphorylé au niveau d'une de ses extrémités 5', cette réaction avait pour effet de permettre l'obtention d'un seul oligonucléotide complet, composé de 18 bases (8 de chaque côté parfaitement homologues, et deux en son milieu invariablement constituées des nucleotides GT (figure 3) .
Ces mutations, destinées à remplacer les deux premiers nucleotides de n'importe quel codon, permettent de remplacer ce codon par un codon Valine. En effet, le code génétique étant dégénéré, les codons valine peuvent s'écrire sous la forme GTN, où N représente n'importe laquelle des quatre bases .
Une fois obtenus ces 11 oligonucléotides reconstruits, homologues de 11 régions distinctes de la molécule CD4, mais portant la même mutation (changement en Valine) , par ailleurs orientés dans le même sens, le protocole était identique à celui exposé dans l'exemple 1.
Il était recherché une fréquence moyenne d'incorporation des oligonucléotides mutants d'environ 9% (1/11) dans cet exemple.
Exemple 3 : Amélioration d'un site actif par mutagenèse massive à saturation.
Une fois connus les acides aminés prenant part directement au site actif d'une protéine, par exemple grâce à des données de mutagenèse massive telle que présentée dans les exemple précédents, ces acides aminés peuvent être soumis à une mutagenèse massive à saturation, c'est-à-dire visant à introduire un grand nombre de codons différents en remplacement d'un codon particulier. Ainsi, 6 codons du gène • codant pour la protéine agaB, enzyme impliquée dans la synthèse des sucres, étaient identifiés comme prenant part directement à l'activité de l'enzyme. Six oligonucléotides centrés sur ces codons étaient synthétisés. De chaque côté, ils étaient totalement homologues à 9 bases de la séquence . Au niveau des deux premiers nucleotides des codons à muter, la séquence sauvage était remplacée par la séquence N(firure 4) . De cette façon, chacun des 6 codons pouvait être remplacé par différents codons spécifiques d'autres acides aminés.
Une fois obtenus ces oligonucléotides, la réaction de mutagenèse massive était identique à celle décrite dans l'exemple 1.
Il était recherché une fréquence moyenne d'incorporation des oligonucléotides mutants d'environ 17% (1/6) dans cet exemple.
Ces molécules d'ADN plasmidique étaient destinées à être criblées de façon à mesurer une augmentation de l'activité de l'enzyme.
Cet exemple, bien que n'utilisant qu'un nombre réduit d'oligonucléotides mutants contenant des bases dégénérées, démontre la faisabilité de l'adaptation de la technique de l'invention à la mutagenèse de nature aléatoire
(changement d'un codon en un grand nombre d'autres codons) mais de positions déterminées.
Exemple 4 : Optimisation des codons d'un gène. Les gènes contiennent généralement des codons qui sont défavorables à l'expression des protéines pour lesquelles ils codent. Ces codons défavorables peuvent être vus comme un mécanisme de régulation de l'expression d'un gène. Ces codons défavorables sont relativement bien identifiés, et il peut être' nécessaire de les modifier en un codon plus favorable à l'expression de la protéine mais n'induisant pas de changement d'acide aminé.
En règle générale, environ 5 % des codons d'un gène sont défavorables, et limitent le niveau d'expression de la protéine correspondante. La modification de ces codons peut permettre d'obtenir de meilleurs niveaux d'expression du gène lors de la production in vitro de la protéine correspondante .
Pour autant, la modification simultanée de tous les codons ne permet pas d'obtenir cette amélioration de niveau d'expression, probablement a cause de la déstabilisation générale de la séquence par un trop grand nombre de modifications.
Les meilleurs niveaux d'expression sont le plus souvent obtenus lorsqu'une partie seulement des codons défavorables sont modifiés.
Dans ce cas, une banque de mutations portant sur ces codons défavorables peut être réalisée en utilisant la technique de l'invention, et les molécules mutantes présentant les meilleurs taux d'expression sont alors sélectionnées. Pour ce faire, un oligonucléotide mutant doit être synthétisé pour chaque codon défavorable, les mutations portées par ces oligonucléotides étant définies par le fait qu'elles changent un codon défavorable à l'expression en codon lui étant favorable, sans changer la séquence primaire de la protéine correspondante.
Dans ce contexte, la fréquence moyenne d'incorporation des oligonucléotides mutants peut être recherchée dans une fourchette relativement large, par exemple entre '1 et 20 %. En effet, le nombre de mutations simultanées permettant d'obtenir le meilleur niveau d'expression n'est pas connu. Dans ce contexte, plusieurs banques correspondant à des fréquences d'incorporation différentes peuvent être réalisées. Pour réaliser ces banques ayant des taux de mutations différents, il est possible soit de réaliser le procédé décrit en utilisant des concentrations variables d'oligonucléotides, soit de réaliser plusieurs fois de suite le procédé de mutagenèse massive, • c'est-à-dire d'utiliser la banque de mutants produite au cours d'une première étape de mutagenèse massive comme matrice d'une seconde étape de mutagenèse massive. Le procédé est similaire à celui présenté dans l'exemple 1. Les molécules mutantes sont ensuite criblées sur le critère de leur niveau d'expression : les molécules présentant les meilleurs niveaux d'expression sont sélectionnées . '

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de mutagenèse d'un gène cible, consistant à préparer une série de N oligonucléotides de séquence substantiellement complémentai±-e d'au moins une région du gène cible, puis à faire réagir ladite série d'oligonucléotides avec ledit gène cible dans des conditions permettant la production de copies du gène cible portant au moins une mutation, caractérisé en ce que le gène cible est porté par un plasmide circulaire double brin, en ce que chaque oligonucléotide présente une séquence complémentaire d'une région différente du gène cible et au moins une mutation placée au centre de la séquence de 1' oligonucléotide, l'ensemble N desdits oligonucléotides de la série, avec N supérieur à 5, couvrant tout ou partie de la séquence dudit gène cible, et en ce que l'on fait réagir ladite série d'oligonucléotides avec le gène cible en présence d'une polymérase de façon à générer une banque de gènes mutés où chaque mutation provenant d'un oligonucléotide différent est présente en moyenne dans moins de 1/5 des gènes de la banque.
2) Procédé de mutagenèse d'une banque de gènes mutés cibles, consistant à préparer une série de N oligonucléotides de séquence substantiellement complémentaire d'au moins une région des gènes mutés cibles, puis à faire réagir ladite série d'oligonucléotides avec lesdits gènes mutés cibles dans des conditions permettant la production de copies des gènes mutés cibles portant au moins une mutation, caractérisé en ce que- les gènes mutés cibles sont portés par des plasmides circulaires double brin, en ce que chaque oligonucléotide présente une séquence complémentaire d'une région • différente des gènes mutés cibles et au moins une mutation placée au centre de la séquence de l' oligonucléotide, l'ensemble N desdits oligonucléotides de la série, avec N supérieur à 5, couvrant tout ou partie de la séquence desdits gènes mutés cibles, et en ce que l'on fait réagir ladite série d'oligonucléotides avec les gènes mutés cibles en présence d'une polymérase de façon à générer une banque de gènes mutés où chaque mutation provenant d'un oligonucléotide différent est présente en moyenne dans moins de 1/5 des gènes de la'banque.
.3) Procédé de mutagenèse selon la revendication 2 , dans lequel la banque de gènes mutés cibles a été obtenue selon le procédé de la revendication 1.
4) Procédé de mutagenèse selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que N est compris entre environ 5 et 106 et de préférence entre 50 et 500, et en ce que chaque mutation provenant d'un oligonucléotide différent est présente en moyenne dans entre 1/5 et 1/106 et de préférence entre 1/50 et 1/500 des gènes de la banque.
5) Procédé' de mutagenèse selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la série d'oligonucléotides comprend N oligonucléotides différents et en ce que chaque mutation provenant d'un oligonucléotide différent est présente dans en moyenne environ 1/N des gènes de la banque.
6) Procédé de mutagenèse selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ce que l'on fait réagir la série d'oligonucléotides avec le gène cible ou la banque de gènes mutés cibles selon un rapport molaire de chaque oligonucléotide par rapport au gène cible ou à la banque de gènes mutés cibles compris entre 0,01 et 100 et de préférence entre 0,1 et 10.
7) Procédé de mutagenèse selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ce que l'on fait réagir la série d'oligonucléotides avec le gène cible ou la banque de gènes' mutés cibles en présence d'une polymérase ayant une activité de déplacement de brin comme la Taq polymérase ou une activité exonucléasique 3 ' -> 5' comme la Pfu polymérase.
8) Procédé de mutagenèse selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ce que l'on fait réagir la série d'oligonucléotides avec le gène cible ou la banque de gènes mutés cibles en présence d'une polymérase ayant une activité de déplacement de brin ou une activité exonucléasique 3 ' -> 5 ' et une ligase .
9) Procédé de mutagenèse selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ce que l'on fait réagir la série d'oligonucléotides avec le gène cible ou la banque de gènes mutés cibles en présence d'une polymérase n'ayant pas d'activité de déplacement de brin ou d'activité exonucléasique 3 ' -> 5', comme la T4 polymérase, et en l'absence de ligase.
10) Procédé de mutagenèse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les oligonucléotides de la série sont chevauchants ou non et présentent une taille comprise entre 10 et 100 et de préférence entre 15 et 25 nucleotides .
11) Procédé de mutagenèse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque oligonucléotide comprend 1 ou plus mutation (s) et de préférence de 1 à 3 mutation (s) placée (s) au centre de sa séquence.
12) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en • ce que les mutations de chaque oligonucléotide sont choisies parmi des délétions et ou des insertions de un ou plusieurs nucléotide (s) . 13) Procédé de mutagenèse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque oligonucléotide - de la série est présent en plusieurs exemplaires chaque exemplaire possédant un nucléotide différent au niveau de la ou desdites mutation (s) .
14) Procédé de mutagenèse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque mutation est du type permettant d'introduire un codon identique dans chaque oligonucléotide ou un codon correspondant au même acide aminé, en substitution du codon original du gène cible.
15) Procédé de mutagenèse selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit codon correspond à un acide aminé choisi dans le groupe comprenant Ala, Val, Gly, Leu, Ile.
16) Procédé de mutagenèse selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on prépare une matrice constituée d'un plasmide contenant le gène cible ou la banque de gènes mutés cibles et un gène de résistance, b) on prépare une série équimoléculaire d'oligonucléotides présentant une séquence complémentaire d'une région différente du gène cible ou de la banque de gènes mutés cibles et au moins une mutation placée au centre de la séquence de l' oligonucléotide, l'ensemble des oligonucléotides de la série couvrant tout ou partie de la séquence dudit gène cible ou de ladite banque de gènes mutés cibles, c) on mélange la série d'oligonucléotides préparée à l'étape (b) avec le plasmide de l'étape (a) selon un rapport molaire de chaque oligonucléotide par rapport au plasmide compris entre 0,01 et 100 et de préférence entre
0,1 et 10, d) on dénature le mélange de l'étape (c) par la température de façon à obtenir une matrice simple brin, e) on soumet le mélange de l'étape (d) à une température permettant l'hybridation des oligonucléotides sur la matrice, f) on ajoute au mélange au moins une polymérase, son tampon et ses cofacteurs, et une quantité suffisante de chacun des nucleotides triphosphates, pour permettre la réplication des brins de la matrice à partir de n'importe lequel des oligonucléotides, g) éventuellement on répète les étapes (d) , (e) et (f), h) on sélectionne par tout moyen approprié les produits de l'étape (f) ou (g) ayant subi la réplication, i) on transforme les produits sélectionnés à l'étape (h) dans des bactéries compétentes, et l'on sélectionne les produits portant un gène muté sur un milieu sélectif correspondant à un gène de résistance porté par le plasmide de l'étape (a) .
17) Procédé de mutagenèse selon la revendication
16, caractérisé en ce que l'étape (h) consiste à soumettre les produits de l'étape (f) à l'action d'une enzyme de restriction sélectionnant les produits ayant subi" la réplication.
18) Procédé de mutagenèse selon la revendication
17, caractérisé en ce que l'enzyme de restriction sélectionnant les produits ayant subi la réplication est 1 ' enzyme ' Dpnl .
19) Procédé de mutagenèse selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que les oligonucléotides sont phosphorylés à leur extrémité 5' et en ce qu'à l'étape (f) on ajoute une ligase, avantageusement une ligase thermostable. 20) Procédé de mutagenèse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène cible est une molécule d'acide nucléique . codant pour une protéine d'intérêt avec ou sans ses propres séquences de régulation.
21) Procédé de mutagenèse d'une protéine cible ou d'une banque de protéines mutées cibles, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation d'une banque d'expression de gènes mutés à partir d'un gène cible codant pour ladite protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, puis en ce que l'on exprime lesdits gènes mutés pour produire une banque de protéines mutées, et éventuellement en ce que l'on crible lesdites protéines mutées pour une fonction désirée, avantageusement par rapport à la protéine cible.
22) Procédé de sélection de protéines mutées présentant une activité modifiée par rapport à la même protéine non mutée, ou du gène muté correspondant à ladite protéine mutée, caractérisé en ce qu'il comprend un procédé de mutagenèse selon la revendication 21, eh ce qu'après le criblage desdites protéines mutées pour une fonction désirée, avantageusement par rapport à la protéine cible, on sélectionne la protéine mutée présentant la fonction désirée, et éventuellement on séquence le gène muté correspondant à ladite protéine mutée.
23) Procédé de mutagenèse d'une protéine cible ou d'une banque de protéines mutées cibles selon la revendication 21 ou de sélection d'une protéine mutée ou du gène correspondant selon la revendication 22, caractérisé en •ce qu'il comprend la préparation d'une banque d'expression de- gènes mutés à partir d'un gène cible codant pour ladite protéine selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend après l'étape (i) , les étapes suivantes : j ) on incube le milieu sélectif à la température adéquate pendant le temps suffisant à la pousse de colonies bactériennes individuelles, k) on ensemence des cultures de bactéries individuelles à partir des colonies de l'étape (j),
1) on effectue des préparations d'ADN plasmidique des cultures de l'étape (k) , m) on mesure l'activité biologique associée à chaque préparation d'ADN plasmidique de l'étape (1) et on compare le résultat obtenu par rapport à celui mesuré en utilisant l'ADN plasmidique non muté. n) éventuellement, on séquence les' préparations d'ADN plasmidique ayant permis d'observer des modifications significatives de l'activité biologique.
24) Série d'oligonucléotides mutés par rapport à un gène cible ou à la banque de gènes mutés cibles comme définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 20.
25) Banque de gènes mutés susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20.
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