WO2002035222A1 - Biocapteur - Google Patents

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WO2002035222A1
WO2002035222A1 PCT/JP2001/009367 JP0109367W WO0235222A1 WO 2002035222 A1 WO2002035222 A1 WO 2002035222A1 JP 0109367 W JP0109367 W JP 0109367W WO 0235222 A1 WO0235222 A1 WO 0235222A1
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WO
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biosensor
reagent
electrode
biosensor according
layer
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PCT/JP2001/009367
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yuji Yagi
Original Assignee
Arkray, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP01978899A priority patent/EP1336839B1/en
Priority to US10/399,874 priority patent/US6982027B2/en
Priority to JP2002538156A priority patent/JP3713522B2/ja
Priority to AT01978899T priority patent/ATE543092T1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes

Definitions

  • the present invention relates to a biosensor. Background art
  • biosensors that can easily and rapidly quantify a sample containing a specific measurement target without diluting or stirring the sample have been widely used.
  • a biosensor is usually provided with a working electrode (measurement method) on an electrically insulating substrate by a method such as screen printing, as disclosed in, for example, Japanese Patent No. 2517153.
  • a counter electrode, and a reaction layer containing an oxidoreductase, an electron acceptor, and the like that reacts with the object to be measured is formed thereon.
  • the object to be measured When the sample containing the object to be measured is brought into contact with the reaction layer, the object to be measured is oxidized by the catalytic action of the oxidoreductase, and at the same time, the electron acceptor is reduced.
  • the reduced electron acceptor is reoxidized by an electrochemical method, and the concentration of the measurement target in the sample can be calculated from the oxidation current value obtained thereby.
  • such a biosensor may cause a measurement error due to the physical properties of the sample.
  • solid components such as blood cells contained in blood, soluble components such as lipids, proteins, and carbohydrates and insoluble components are adsorbed on the electrode surface of the biosensor. It was difficult to measure.
  • the hematocrit (H et) value which is the volume ratio of red blood cells to whole blood, varies greatly depending on the sample. There was also a difference in the effects described above. The influence of such impurities can be mitigated, for example, by diluting the sample and then subjecting the sample to a biosensor, but this requires time and effort and complicates the operation.
  • a method of forming a water-absorbing polymer layer on an electrode Japanese Patent Publication No. 6-53404
  • a method of forming a layer containing a water-insoluble polymer and a water-soluble polymer on a reaction layer Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-218358
  • a method of forming a polymer film comprising a mixture of a fat-soluble polymer and an amphiphilic polymer on an electrode Japanese Patent Application Laid-Open No. No.
  • the method using an anionic filter is effective only for solid components, and has a problem in that it has no effect on soluble components in a sample such as a protein. Further, in the other methods described above, water-soluble polymers and the like are used, so that there are problems such as high water absorption, susceptibility to humidity, and a slow enzyme reaction.
  • an object of the present invention is to provide a biosensor capable of measuring an object to be measured in a sample with high accuracy without being affected by impurities or humidity in the sample.
  • a biosensor of the present invention includes a substrate, a reagent layer containing a reagent, and an electrode system including a working electrode and a counter electrode, wherein the electrode system is disposed on the substrate, A bag on which the reagent layer is formed A biosensor, wherein the reagent layer further contains fine particles.
  • the reagent layer formed on the electrode system contains the fine particles, impurities in the sample can be prevented from adhering to the electrode surface. Further, since there is no need to use the above-mentioned water-soluble polymer or the like, it is not affected by humidity. For this reason, regardless of the physical properties of the sample as described above, a decrease in sensitivity is prevented, and the object to be measured can be measured with high accuracy. The reason why the fine particles can prevent the adhesion of impurities to the electrode surface is unknown, but it is considered that the impurities are physically adsorbed to the fine particles.
  • the reagent layer may be a single layer or a laminate including a reagent-containing layer containing the reagent and a fine-particle-containing layer containing the fine particles.
  • the reagent-containing layer may be formed on the electrode via the fine-particle-containing layer.
  • the fine particle-containing layer be formed on the electrode via the reagent-containing layer because the measurement target in the sample easily reacts with the reagent.
  • the average particle size of the fine particles is, for example, in the range of 0.5 to 0.5 m, preferably in the range of 0.5 to 30 m, and more preferably in the range of 1 to 20 m. And particularly preferably in the range of 3 to 15.
  • the average particle diameter is 0.1 m or more, the sample easily penetrates into the reagent layer easily, and the sensitivity of the biosensor can be improved.
  • the average particle diameter is 45 m or less, the influence of impurities in the sample can be sufficiently eliminated.
  • the average particle diameter is determined by, for example, directly observing the fine particles using an electron microscope. However, it can be obtained by measuring the particle size and calculating the average value. At this time, the measured number of the fine particles is not particularly limited, but is, for example, 100 or more, preferably 100 to 300.
  • the particle size distribution of the fine particles is not particularly limited, but is preferably in the range of 0.01 to 100 m, more preferably in the range of 0.05 to 60 m, and particularly preferably.
  • the average particle size is in the range of 0.1 to 40 / xm.
  • the form of the fine particles may be, for example, a spherical shape, a flat spherical shape, or a shape in which the fine particles are solidified into a spherical shape.However, since the layer containing the fine particles can maintain uniform and appropriate density, it is preferable that the fine particles are spherical. Further, the fine particles are preferably formed of a polymer compound, and more preferably are a polymer compound that does not contain impurities that cause electrolysis and is electrochemically inert. Further, the polymer compound is preferably water-insoluble.
  • the polymer compound include, for example, a polymer containing at least one of acrylic acid, methacrylic acid, maleic acid, acrylate, methacrylate, maleate and styrene derivative monomer. And copolymers.
  • the styrene derivative polymer include styrene and alkylstyrene.
  • urethane compounds such as polyurethane and polyurea
  • polyolefin polymer compounds such as polyethylene and polypropylene
  • polyolefin derivatives such as polyvinyl chloride
  • polyamide compounds can also be used.
  • polymer compound for example, it may be formed of an inorganic compound such as silica gel, alumina, zeolite, apatite, glass and ceramics represented by alite.
  • acrylic acid is more preferable because it is electrochemically inert.
  • PMMA polymethacrylate
  • PS polystyrene
  • PA polyamide
  • Such fine particles include commercially available trade name Techpolymer b mx-5 (manufactured by Sekisui Plastics Co., Ltd., PMMA, spherical, particle size 5 m), trade name Gantz Pearl GM-0600 (Gantz Chemical Co., Ltd.) Gantz Pearl GS-0805 (manufactured by Ganz Kasei Co., Ltd., crosslinked PS, spherical, particle size 8 ⁇ m), trade name Gantz Pearl PS-8F (trade name) Ganz Kasei Co., Ltd., PMMA, spherical, particle size 0.4 mm), trade name Augazol 200 EXD NAT COS Type S (Elfatchem, nylon, oblong, size 10 im), trade name Trefill E_ 500 C (Toray Dow Corning Silicone Co., Ltd., cross-linked silicone powder, spherical, particle size: 10 im), trade name: Saramix Powder SN—E—02 (Ube Industries, Ltd., gay nitride
  • the fine particles are electrically inactive, and it is preferable that the particle size is changed according to impurities to be removed from the sample, and the characteristics of the surface of the fine particles are changed.
  • the surface properties of the fine particles are preferable, and if it is desired to be set to be more hydrophilic than PS, fine particles formed of PMMA or PA are preferable.
  • fine particles formed from PS or the like into which a lipoxyl group is introduced are preferable, and when it is desired to be set to be positively charged, a PS into which an amino group is introduced is used. Formed from etc Fine particles are preferred.
  • red blood cells which make up the majority of blood cell components, have an average diameter of about 7 / im.
  • Erythrocyte separation can be carried out efficiently by selecting microparticles of size.
  • unspecified multiplicity can be obtained by appropriately mixing PS, PS into which a lipoxyl group has been introduced, and PS having an amino group. A number of proteins can be adsorbed and removed. Note that these methods are not limited.
  • the reagent layer preferably further contains an inorganic gel.
  • the inorganic gel By including the inorganic gel, the adsorption of impurities to the electrode can be further prevented, and the diffusion of the sample can be prevented.Therefore, an enzymatic reaction occurs in a narrow range, so that the reagent and the analyte can react quickly. it can.
  • an inorganic gel-containing layer containing an inorganic gel may be separately formed between the electrode and the reagent layer.
  • a clay mineral is preferable, and examples thereof include a swellable layered silicate.
  • swellable layered silicate for example, smectite and swellable mica are preferable.
  • smectite for example, hectorite, savonite, montmorillonite and the like are preferable
  • swellable mica for example, sodium tetrafluoride mica, teniolite and the like are preferable. Any of these may be used alone or in combination of two or more.
  • smectite examples include commercially available synthetic hectorite, trade name Rabonight XLG and trade name Rabonight XLS (each manufactured by Laboratoy Industries), trade name Lucentite SWN and trade name Luo Knight SLS.
  • synthetic savonites such as Sengyuit SWF (Corp Chemical Co., Ltd.) and Chikisopie W (Kyowa Chemical Co., Ltd.) Kunipia F (manufactured by Kunimine Industry Co., Ltd.) can be used.
  • swellable mica examples include commercially available sodium tetrafluoride mica, trade name Na-TS (manufactured by Topi Industries), and commercially available teniolite, trade name Li-TN (manufactured by Topy Industries). And the like.
  • a surfactant-containing layer containing a surfactant is formed on the reagent layer.
  • a hydrophilic film is formed on the surface of the reagent layer, so that the sample and the reagent are quickly and uniformly mixed. Therefore, the reaction proceeds quickly, and the reproducibility is improved.
  • a surfactant-containing layer containing a surfactant is formed on the fine particle-containing layer.
  • the surfactant examples include a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, a nonionic surfactant, and a natural surfactant. Is a cationic surfactant, a nonionic surfactant, or a natural surfactant, and more preferably a nonionic surfactant or a natural surfactant.
  • the natural surfactant include phospholipids, and preferably, lecithin such as egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated lecithin, and high-purity lecithin can be used.
  • nonionic surfactant examples include, for example, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as Tween 20 (trade name), polyoxyethylene alkyl ethers such as riro nX—'100 (trade name), and Triton nX (trade name). And polyoxyethylene phenyl alkyl ether such as —405. Of these, phospholipids are particularly preferred. Most preferably, it is lecithin such as high-purity lecithin.
  • the electrode may be any electrode that can be used to electrochemically detect the reaction between the object to be measured and the sample, and examples thereof include a gold electrode, a carbon electrode, and a silver electrode.
  • a gold electrode and a carbon electrode are preferred because of their excellent electrical conductivity and chemical stability, and a carbon electrode is more preferred.
  • the reagent is not particularly limited as long as it reacts with an object to be measured and the reaction can be detected electrochemically.
  • the reagent preferably contains an enzyme. Examples of the enzyme include oxidoreductase and the like.
  • the oxidoreductase can be appropriately determined, for example, depending on the type of the measurement target. Specifically, glucose oxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase, lactate dehydrogenase, fructose dehydrogenase, galactose Oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, pyriluvate oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, formate dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, acyl-CoA oxidase Choline oxidase, 4-hydroxybenzoate hydroxylase, maleate dehydrogenase, sarcosine oxidase, pericase, etc. .
  • the enzyme when the enzyme is an oxidoreductase, the enzyme preferably further contains an electron acceptor in the reaction of the enzyme.
  • Examples of the electron acceptor include potassium ferricyanide, P-benzoquinone, phenazine methosulfate, indophenol and derivatives thereof, potassium 3- / 3-naphthoquinone-4-sulfonate, methylene blue 1. Hue mouth and its derivatives, osmium complexes, ruthenium complexes,
  • NAD + , NADP +, quinoline quinoline quinone (PQQ) and the like can be used.
  • the measurement sample is not particularly limited, but is useful for a sample containing impurities such as the soluble component, the insoluble component, and the solid component.
  • impurities include proteins, fats, carbohydrates, and blood cells.
  • Specific measurement samples include, for example, biological samples such as whole blood, plasma, serum, saliva, urine, and cerebrospinal fluid, drinking water such as juice, foods such as soy sauce, sauces, etc., drainage water, rainwater, and pool water. And the like. Among them, preferred are whole blood, plasma, serum, saliva, cerebrospinal fluid and the like, and more preferred is whole blood.
  • FIG. 1 is a view showing an example of the biosensor of the present invention, (A) is a plan view thereof, and (B) and (C) are cross-sectional views thereof.
  • FIG. 2 is a view showing another example of the biosensor of the present invention, (A) is a plan view thereof, and (B) and (C) are sectional views thereof.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view showing still another example of the biosensor of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing a correlation between a current value and an open circuit time in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 shows an example of the biosensor of the present invention.
  • 2A is a plan view of the biosensor
  • FIG. 2B is a cross-sectional view taken along the line I-I of FIG. 1A
  • FIG. 1C is a sectional view of FIG.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view in the II-II direction.
  • an electrode system composed of a working electrode 12 and a counter electrode 13 is arranged on a substrate 11, and on one end thereof (right side in FIG. 1 (A)).
  • the two counter electrodes 13 are arranged at both ends in the width direction of the substrate 11 (in the direction of the arrow b), and the working electrode 12 is arranged at the center in the width direction of the substrate 11. 1 It extends along the long side direction (arrow a direction). Further, an insulating portion 14 is formed between the working electrode 12 and the counter electrode 13. On one end of the electrode system, spacers 15a and 15b are arranged so as to be perpendicular to the electrode system, and between the spacers 15a and 15b.
  • the reagent layer 16 is arranged at the bottom.
  • a cover 17 is disposed on the spacers 15a and 15b so as to cover the upper part of the reagent layer 16, and a hole penetrating in the width direction between the cover 17 and the reagent layer 16 is provided. Is formed, and this becomes the sample supply hole 18.
  • the size of the biosensor 1 is not particularly limited and can be appropriately set depending on the amount of the sample to be supplied and the like.
  • the overall length is 50 to 10 mm
  • the overall width is 20 to 2 mm
  • the maximum thickness is 1500 to 500 zm
  • minimum thickness 500 to 300 m preferably total length 30 to 10 mm
  • overall width 10 to 2 mm maximum thickness 1 000 to 500 m
  • the size of the reagent layer 16 is, for example, 10 to 0.2 mm in length, 20 to 2 mm in width, and 400 to 5 m in thickness, preferably 5 to 0.2 mm in length and 10 to 10 in width. 2 mm, thickness 200 ⁇ : L 0 m.
  • the size of the substrate 1 1 is For example, the length is 50 to 10 mm, the width is 20 to 2 mm, the thickness is 1000 to 50 m, and preferably, the length is 30 to: L 0 mm, the width is 10 to 2 mm, and the thickness is 500 to 50 m.
  • the size of the spacers 15a and 15b is, for example, length 20 to lmm, width 20 to 2mm, thickness 500 to: L0 ⁇ m, preferably length 10 to 2mm and width 10 to It is 2 mm and 300 to 20 m thick.
  • the size of the cover 17 is, for example, 50 to 10 mm in length, 20 to 2 mm in width, and 1000 to 50 m in thickness, preferably 30 to 10 mm in length, 10 to 2 mm in width, and 500 to 500 in thickness. 50 m.
  • the size of the hole 18 is, for example, a length of 10 to 0.211, a width of 20 to 0.2 mm, a height of 500 to 5 m, preferably a length of 5 to 0.2 mm and a width of 10 to It is 2 mm high and 300 to 10 zm high.
  • the “length” of each part refers to the length in the longitudinal direction of the biosensor, and the “width” refers to the length in the width direction.
  • the size of the reagent layer 16 is, for example, 2 to 0.2 mm in length, 20 to 2 mm in width, and 400 to 5 m in thickness, and preferably It has a thickness of 1 to 0.4 mm, a width of 10 to 2 mm, and a thickness of 200 to 10 m.
  • the size of the hole 18 is, for example, 2 to 0.2 mm in length, 20 to 2 mm in width, and 500 to 50 m in height, and is preferably a length; ⁇ 0.4mm, width 10 ⁇ 2mm, height 300 ⁇ : 100m.
  • the content of the fine particles in the reagent layer 16 can be appropriately determined depending on the type of the sample to be supplied, the amount thereof, and the like, and is, for example, in the range of 1 to 0.01 mg for about 2 L of the sample, Preferably, it is in the range of 0.5 to 0.05 mg.
  • the content of the reagent in the reagent layer 16 is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the type of the reagent, the type and the amount of the sample, and the like.
  • an enzyme when used as a reagent, its content is preferably 50 to 0.05 U, more preferably 20 to 0.1 U, for about 2 L of the sample.
  • an electron acceptor when used, its content is preferably 100 to 0.01 mol, more preferably 50 to 0.05 mol, per 2 L of the sample.
  • G ⁇ D is used as the enzyme and potassium ferricyanide is used as the electron acceptor
  • GOD 20-0.1 U and potassium ferricyanide 50-0.05 ⁇ 1 are used for about 2 L of the sample. More preferably, the GOD is 10 to 0.2 U, and the potassium phenylate is 10 to 0.1 mol.
  • Such a biosensor can be manufactured, for example, as described below.
  • a substrate 11 for forming the electrodes and the like is prepared.
  • the material of the substrate 11 is preferably electrically insulating, and examples thereof include plastic, glass, paper, and ceramics.
  • the plastic include polyethylene terephthalate (PET), PS, PMMA, polypropylene (PP) and the like.
  • an electrode system including a working electrode 12 and a counter electrode 13 is formed on the substrate 11.
  • the electrode is preferably a gold electrode, a carbon electrode, or the like, and can be formed by a known method according to the type.
  • the gold electrode can be formed by, for example, an evaporation method, a plating method, a gold foil sticking method, or the like.
  • the deposition process can be carried out, for example, by vacuum 1. 3 3 X 1 0- 4 P a, the input path Wa 300 W, rate 5 A / sec, ion plating ting method under the conditions of time 2 minutes.
  • This is, for example, a method in which gold is deposited on a plastic sheet such as PET, and a kiss cut device is used to make a cut in the gold foil layer deposited on the shield. Thereby, the cut portion becomes an insulating portion, and a working electrode and a counter electrode can be formed.
  • a carbon ink can be formed on the substrate 11 by means of screen printing, coating, plating, or the like.
  • a hydrophilization treatment it is preferable that the electrode surface is subjected to a hydrophilization treatment. Thereby, even if the electrode surface is hydrophobic, the electrode surface is hydrophilized by the treatment, so that when the reagent layer is formed using the reagent solution as described later, the reagent layer is easily formed uniformly.
  • the hydrophilic treatment can be appropriately determined depending on the type of the electrode.
  • the electrode is a gold electrode, for example, the electrode may be immersed in a hydrophilizing solution such as a mercaptoethanol solution or a mercaptoethanol solution, and then washed and dried.
  • the solvent for the hydrophilic solution examples include organic solvents such as ethanol, butanol, acetone, and tetrahydrofuran.
  • the concentration of the hydrophilizing solution is, for example, in the range of 100 to 0.01 mmO1ZL, and preferably in the range of 50 to 0.05 mmO1ZL.
  • an organic solvent such as ethanol, methanol, butanol, acetone, and tetrahydrofuran
  • a washing solution such as purified water
  • the electrode is a carbon electrode, for example, the electrode can be hydrophilized by a method of immersion in a surfactant and washing with purified water.
  • spacers 15a and 15b are arranged on the substrate 11 on which the electrode system is formed. As shown, by arranging the two spacers 15a and 15b in parallel with each other at a fixed interval in the width direction, a formation portion of a reagent layer 16 described later can be secured.
  • a resin film or tape can be used as the material of the spacer 15, for example.
  • a cover described later can be easily bonded.
  • a spacer can be formed by, for example, means such as resist printing.
  • a single-layer reagent layer 16 containing a reagent and fine particles is formed in the gap between the spacers 15a and 15b.
  • This reagent layer can be formed by preparing a solution containing the fine particles and various reagents and injecting the solution into the gap of the spacer 15.
  • the solution is preferably prepared by, for example, dissolving a reagent sufficiently and further dispersing the fine particles.
  • the solvent is not particularly limited, but for example, water, a buffer, an organic solvent such as ethanol, methanol, butanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), and tetrahydrofuran can be used.
  • the buffer examples include a phosphate buffer, a citrate buffer, an acetate buffer, a Tris-HCl buffer, a Good buffer, and the like, and the pH thereof is preferably in the range of 4 to 9, and more preferably. It is in the range of 5-8.
  • the water examples include purified water, distilled water, and ultrapure water. Among them, ultrapure water is preferable because it has a very small amount of impurities and can produce a high-precision biosensor.
  • the concentration of the fine particles in the solution is not particularly limited, but is preferably in the range of 1,000 to 10 g / L, and more preferably in the range of 500 to 50 g / L. '
  • the concentration of the reagent in the solution is not particularly limited.
  • it is preferably in the range of 10,000 to 10 KUZL, and more preferably in the range of 5,000 to 50 KUZL.
  • the range is preferably 10 to 0.01mo1 ZL, and more preferably the range is 5 to 0.05mb1 ZL.
  • the solution is injected into the gap between the spacers 15a and 15b.
  • the injection is not particularly limited, and can be performed using, for example, an automatically driven dispenser.
  • Injection amount of the solution, the size of the formed reagent layer, can be appropriately determined by the content and the like of the fine particles and reagents, area 1 0 mm 2 per 10 forming
  • the range is preferably from 0.1 to 0.1 L, more preferably from 5 to 0.2 L.
  • a reagent layer After the injection, this is dried to form a reagent layer.
  • the means for drying is not particularly limited, and for example, methods such as natural drying, air drying, vacuum drying, and freeze vacuum drying can be employed. Further, these means may be combined.
  • the conditions are, for example, a temperature range of 10 to 60 ° C, a relative humidity RH of 5 to 40%, and a time period of 1 to 30 minutes.
  • a cover 17 is arranged on the spacers 15a and 15b so as to cover the reagent layer 16.
  • the pores formed between the reagent layer 16 and the cover 17 become the sample supply holes 18.
  • the material of the cover 17 is not particularly limited, and for example, various plastics can be used.
  • the biosensor 1 When the biosensor 1 thus manufactured is stored for a long period of time, it is preferable that the biosensor 1 be sealed and stored together with a desiccant such as molecular sheep, silica gel, or calcium oxide in order to prevent the influence of moisture.
  • a desiccant such as molecular sheep, silica gel, or calcium oxide in order to prevent the influence of moisture.
  • the biosensor 1 includes, for example, a unit that applies a predetermined voltage for a certain period of time, a unit that measures an electric signal transmitted from the biosensor, and a calculation unit that calculates the concentration of the electric signal to be measured. It can be used in combination with measuring instruments equipped with various means.
  • the method of using the biosensor 1 will be described using an example in which the sample is whole blood, the measurement target is glucose, and the reagents are GOD and ferricyanide force rim.
  • a whole blood sample is sucked into the hole 18 of the biosensor 1 by capillary action or the like. Then, the presence of the fine particles prevents impurities in whole blood such as blood cells from adhering to the electrode.
  • glucose in whole blood is oxidized by the GOD of the reagent layer 16 and is transferred by electrons transferred by the oxidation reaction. Then, the ferricyanide power is reduced to produce a ferrosyanide power dream.
  • a voltage is applied between the counter electrode 13 and the working electrode 12 by the voltage applying means, and the reduced ferrocyanation force rim is electrochemically applied.
  • the oxidation current at that time is detected by means for measuring the electric signal. Since the peak value of the oxidation current is proportional to the glucose concentration in the sample, the glucose concentration in the sample can be obtained by calculating this value into the glucose concentration by the calculating means. According to such a biosensor, the impurity in the sample does not adsorb to the electrode as described above, so that a decrease in sensitivity is prevented and measurement can be performed with high accuracy. It is not affected by humidity.
  • the reagent layer may further contain an inorganic gel.
  • the inorganic gel those described above can be used.
  • the content of the inorganic gel in the reagent layer can be appropriately determined depending on the type of the inorganic gel, the type of the sample, the amount thereof, and the like. For example, 100 to 0.1 g for about 2 L of the sample And preferably in the range of 50 to 0.5 g.
  • the reagent layer containing such an inorganic gel may be formed in the same manner as described above by preparing a solution containing the above-mentioned reagent, microparticles and inorganic gel.
  • FIG. 2 shows another example of the biosensor of the present invention.
  • FIG. 3A is a plan view of the biosensor
  • FIG. 3B is a cross-sectional view taken along the line III-III of FIG. 3A
  • FIG. 3C is a cross-sectional view of FIG. IV—a sectional view in the IV direction.
  • the same parts as those in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals.
  • this biosensor 2 has a working electrode 12 and a working electrode 12 on a substrate 11.
  • An electrode system composed of an electrode system 13 and a counter electrode 13 is arranged.
  • an inorganic gel-containing layer 21, a reagent layer 16 and a surfactant are provided at one end (upper right in FIGS. 7A and 7B).
  • a laminate is formed by laminating the containing layer 22 in this order.
  • the reagent layer 16 contains a reagent and fine particles.
  • the two counter electrodes 13 are arranged at both ends in the width direction (arrow b direction) of the substrate 11, and the working electrode 12 is arranged at the center in the width direction of the substrate 11, and these electrodes 12, 13 are arranged on the substrate 11. 11.
  • a first spacer 15a, 15b is arranged to be perpendicular to the electrode system, and between the spacers 15a, 15b.
  • the stacked bodies 21, 16, and 22 are arranged at the center.
  • second spacers 23a and 23b there are further disposed second spacers 23a and 23b.
  • a cover 24 is arranged on the second spacers 23 a, 23 b so as to cover the upper portions of the laminates 21, 16, 22, and the cover 24 and the laminate 21, A hole extending in the width direction is formed between 16 and 22, and this becomes a sample supply hole 18.
  • the biosensor 2 has the same configuration as the biosensor of the first embodiment, unless otherwise specified.
  • the content of the inorganic gel in the inorganic gel-containing layer 21 can be appropriately determined according to the type and amount of the sample to be supplied, the type of the inorganic gel, and the like. It is in the range of 0.1 g, and preferably in the range of 500 to 0.5 g.
  • the content of the surfactant in the surfactant-containing layer 22 can be appropriately determined according to the type and amount of the sample to be supplied, the type of the surfactant, and the like. It is in the range of 0-0.05 Og, preferably in the range of 50-0.05 g.
  • the inorganic gel containing layer 21, the reagent layer 16 and the surfactant containing The biosensor 2 in which the layers 22 are stacked can be manufactured, for example, as described below. In addition, unless otherwise indicated, it is manufactured in the same manner as in the first embodiment.
  • a solution containing an inorganic gel is prepared, and the spacers 15a and 15a are prepared. Inject into the gap of 5b and dry. Subsequently, in the same manner, the solution containing the reagent and the fine particles and the solution containing the surfactant are respectively poured and dried, and the inorganic gel-containing layer 21, the reagent layer 16 and the surfactant-containing layer 22 are sequentially formed. Laminate.
  • a second spacer 23 a, 23 b is laminated on the first spacer 15 a, 15 b, and the second spacer 23 a, 2 A cover 24 is disposed on 3 b so as to cover the upper surface of the surfactant-containing layer 22.
  • the pores formed between the surfactant-containing layer 22 and the cover 24 become the sample supply holes 18.
  • the second spacer when the second spacer is formed, the height of the hole 18 can be adjusted.
  • the second spacer can be made of the same material as the first spacer, and can be formed in the same manner.
  • the solution containing the inorganic gel is preferably stirred for 1 hour or more, more preferably for 5 hours or more, in order to prevent the inorganic gel from settling. Further, for the same reason, it is preferable to continue stirring during use.
  • the concentration of the inorganic gel in the solution is not particularly limited, but is, for example, in the range of 10 to 0.001% by weight, and preferably in the range of 5 to 0.05% by weight.
  • This embodiment is an example of the biosensor of the present invention in which the reagent layer is a laminate of the reagent-containing layer and the fine particle-containing layer.
  • This biosensor is shown in the cross-sectional view of FIG. In the figure, the same parts as those in FIG. I have.
  • the biosensor 3 has the same configuration as that of the first embodiment except that a fine particle-containing layer 32 is laminated on a substrate 11 on which electrodes are arranged via a reagent-containing layer 31. It is.
  • the reagent-containing layer 31 and the fine particle-containing layer 32 are prepared, for example, by preparing a solution containing a reagent and a solution containing fine particles, injecting the solution containing the reagent into the gap between the spacers, and drying the solution. It can be formed by injecting a solution containing the fine particles and drying the solution.
  • an inorganic gel-containing layer is separately formed on the electrode,
  • the reagent-containing layer or the like may be formed on the inorganic gel layer, or a surfactant-containing layer may be further laminated on the fine particle-containing layer.
  • biosensor of the present invention is not limited to the above embodiments.
  • all layers may contain fine particles, inorganic gel, or both.
  • a gold electrode biosensor similar to that of FIG. 2 was produced.
  • a transparent PET sheet (hereinafter, the same) having a length of 30 cm, a width of 30 cm, and a thickness of 250 m was prepared as a support, and one surface thereof was subjected to gold vapor deposition.
  • the deposition conditions are the same as described above.
  • the purity of the gold used is greater than 99.95%.
  • a depth of 0.1 mm was applied to the gold deposition surface of the PET sheet.
  • mm 0.1 mm wide straight line cuts were made alternately at 1 mm and 5 mm intervals in one direction (hereinafter referred to as “Haf cut”).
  • This cut portion becomes an insulating portion 14, and the deposited gold is divided into a working electrode 12 and a counter electrode 13.
  • the width of the working electrode 12 of the biosensor is 1 mm
  • the width of the counter electrode 13 is 2.5 mm
  • the width of the insulating part 14 is 0.1 mm.
  • the PET sheet was cut to have a length of 20 mm and a width of 170 mm using a cutting device (trade name: MatriX 2360, manufactured by KINEMATIC).
  • the cut sheet was immersed in 1 Ommo 1 ZL 2 -mercaptoethanol solution (solvent: ethanol) for 30 minutes, washed with ethanol and then with purified water, and dried at room temperature in a clean bench.
  • the gold-deposited surface was hydrophilized.
  • two single-sided tapes made of polyamide manufactured by Sumitomo 3LEM Co., Ltd., product name: Y-55579, thickness: 42 m
  • the first spacers 15a and 15b were applied to the gold vapor deposition. It was affixed to a predetermined position on the surface. In this case, the distance between the spacer 15a and the spacer 15b is 1 mm, the length of the spacers 15a and 15b is 5 mm, and the width is 17 Omm. I did it.
  • an inorganic gel-containing layer 21 was formed in a gap between the spacers 15a and 15b.
  • 150 mg of inorganic gel (Cup Chemical Co., Ltd., trade name: Lucentite SWN) and 50.0 g of purified water were placed in a silicone-treated wide robin, and stirred overnight at room temperature (500 rms for 10 hours or more). )
  • liquid A a raw material liquid for the inorganic gel-containing layer 21
  • the solution A was dispensed using a syringe into the gap between the first spacers 15a and 15b of the PET sheet.
  • the dispensing amount of the solution A is the dispensing surface 1.74 L for an area of 6 mm X lmm (equivalent to one biosensor). After the dispensing, this was allowed to dry at room temperature for 30 minutes or more in a clean bench or desiccator.
  • the inorganic gel-containing layer 21 was formed by drying in an atmosphere at 35 ° C. and a relative humidity of 10% or less for 30 minutes using a drier (hereinafter, referred to as “honey dry drying”).
  • a single-layer reagent layer 16 containing fine particles, an inorganic gel and a reagent was formed on the inorganic gel-containing layer 21.
  • a raw material liquid for the reagent layer 16 (hereinafter, referred to as “solution B”) was prepared. 400 mg of the inorganic gel (the above-mentioned Lucentite SWN) and 50.0 g of purified water were put into a silicone-treated wide-mouth bottle, and stirred at room temperature (at least 10 hours, 500 rpm). Into a brown bottle, add 1.0 mL of the inorganic gel solution, 3.
  • the solution B was dispensed on the surface of the inorganic gel-containing layer 21 on the sheet using a dispensing device (trade name: Dispenser System, manufactured by Bio Dot).
  • the dispensing amount of the solution B was 1.30 ⁇ L with respect to the dispensing surface area of 6 mm x lmm (corresponding to one biosensor). After dispensing, this was dried in an oven at 50 ° C. in a windless state for 10 minutes, and the above-mentioned honey dry drying was similarly performed for 10 minutes to form a reagent layer 16. Next, a surfactant-containing layer 22 was formed on the reagent layer 16.
  • C solution the raw material solution of the surfactant-containing layer 22 (hereinafter, referred to as "C solution") was prepared.
  • the solution C was dispensed on the surface of the reagent layer 16 of the sheet 11 using the dispensing device.
  • the dispensed amount of the solution C was 0.3 OL with respect to the dispensed surface area of 6 mm x i mm (corresponding to one biosensor).
  • a double-sided PET film core double-sided tape (Dai Nippon Ink Co., Ltd., trade name: Dedac double-sided adhesive tape, thickness: 150 im) was used. , Placed on 15b.
  • One second spacer 23 a has a length of 5 mm and a width of 160 mm
  • the other second spacer 23 b has a length of 5 mm and a width of 160 mm.
  • a PET film having a length of 15 mm, a width of 160 mm, and a thickness of 188 m is attached so as to cover the second spacers 23a and 23b and the gap therebetween.
  • hippo 24 a double-sided PET film core double-sided tape
  • the obtained laminate was cut by the cutting device to a width of 6 mm to produce a target biosensor having a length of 20 mm and a width of 6 mm.
  • the biosensor was stored in brown bottles with 3 g or more molecular sieves until use. (Example 2)
  • the Lucenite SW A biosensor was produced in the same manner as in Example 1 except that Rabotite XL S (manufactured by Laborte) was used instead of N.
  • a biosensor was prepared in the same manner as in Example 1 except that in the preparation of the solution B, 1. OmL of purified water was used instead of 1. OmL of the inorganic gel solution.
  • the working electrode 12 and the counter electrode 13 were formed by applying carbon printing to one surface of the transparent PET sheet to be the substrate 11 by using a pressure ink. Printing was performed using a screen printing machine, under the following conditions: SUS300 mesh, squeegee pressure 3 to 5 MPa, print speed 0.5 mZs, coat speed 0.5 m / s, clearance 2. Omm The contact was 15 degrees. The sheet was dried at 90 ° C. for 30 minutes.
  • resist printing is performed on the electrode side surface of the PET sheet using a resist ink containing an insulating UV curable resin as a main component, and this is dried to form a first spacer 15a, 15b.
  • This resist printing is Using a clean printing machine, the conditions are polyester 250 mesh, squeegee pressure 3-5 MPa, print speed 0.15 mZs, coat speed 0.15 m / s, clearance 4.Omm, off-contact 15 degrees And
  • the size and the like of the first spacer were set in the same manner as in Example 1, and the thickness of the first spacer was adjusted so that the thickness after drying described later becomes 10. The drying was performed using a UV dryer under the condition of 3.7 mZs.
  • an inorganic gel-containing layer 21 was formed in the gap between the spacers 15a and 15b.
  • the Rabonit XL S15 Omg was used instead of the lucentite S WM as an inorganic gel, and the dispensed amount of the solution A was a dispensed surface area of 6 mm x lmm (equivalent to one sensor). Was set to 1.45 L.
  • Solution B as a raw material was prepared as follows. 3. OmL of purified water, 75 Omg of the fine particles described above and 24 Omg of potassium ferricyanide were placed in a brown bottle and stirred, and a potassium ferricyanide solution was prepared by completely dissolving the potassium ferricyanide. Subsequently, in another brown bottle, 2.40 KU of glucose oxidase and 2.OmL of the lysium ferricyanide solution were added, and the mixture was sufficiently stirred until the mixture became homogeneous. The dispensing amount of the solution B was 1.08 L with respect to the dispensing surface area of 6 mm X lmm (corresponding to one sensor).
  • Example 6 Thereafter, in the same manner as in Example 1, a laminate was prepared by forming the surfactant-containing layer 22 and arranging the second spacers 23a, 23b and the cover 24. This was cut to obtain the target biosensor. (Example 6)
  • a biosensor was produced in the same manner as in Example 5, except that the inorganic gel-containing layer 21 was not formed. (Comparative Example 1)
  • a conventional biosensor was manufactured as follows. First, a carbon electrode was formed on the PET sheet in the same manner as in Example 5, and a spacer was formed in the same manner as in Example 1. Then, after preparing a 3% by weight aqueous solution of carboxymethylcellulose (CMC), this was dispensed on the electrode system of the PET sheet and dried to form a CMC layer. The dispensed amount of the CMC solution was 3 L for a dispensed surface area of 6 mm ⁇ 1 mm. Next, add 3.2 mg of potassium ferricyanide to 4.0 mL of purified water, stir the mixture completely, and add 2.40 KU of glucose oxidase to 2 mL of this aqueous potassium ferricyanide solution. Stirred.
  • CMC carboxymethylcellulose
  • This reagent solution was dispensed on the CMC layer and dried in the same manner as in Example 1 to form a reagent layer.
  • the dispensed amount of the reagent solution was 1.30 ⁇ L for the dispensed surface area of 6 mm x 1 mm.
  • the second spacer was arranged, and a cover was attached.
  • Various tests described below were performed on the biosensors of each of the examples and comparative example 1 obtained as described above.
  • the current value was measured for each of the biosensors of Examples 1 to 4 and the biosensor of Comparative Example.
  • physiological saline hereinafter referred to as “Sa1”
  • GSa1 physiological saline
  • WB human Blood
  • P human plasma
  • WB human whole blood
  • P human plasma
  • the Het of the human whole blood (WB) was 46%
  • the glucose concentration in the plasma of human whole blood (WB) and human plasma (P) was 127 OmgZL.
  • each biosensor was connected to a potentiometer (BAS, product name: CV100W), the sample was aspirated into the biosensor at room temperature, and the open circuit state was maintained for 25 seconds. Then, the current value at the time when the voltage was applied for 5 seconds was measured. The voltage was set to 25 OmV for the sensors of Examples 1-4 and 50 OmV for the biosensor of the comparative example. The current value was measured three times for each biosensor and each sample under the same conditions, and the average value was obtained. For each biosensor, the divergence rate A () and divergence rate B (%) were determined by the following equations (1) and (2), respectively.
  • E S al, E GS al , The E WB and E P wherein an average value of said current value when measured with each sample.
  • the divergence rate A and the divergence rate B are values indicating the degree of the influence of impurities in the sample, and the divergence rate A is a value mainly related to the influence of blood cells, and the divergence rate B is It is a value related to the influence. It can be determined that the smaller these absolute values are, the smaller the influence of the impurities is.
  • Deviation rate A (%) [(E WB -E P ) / E P ] XI 00
  • Deviation rate B (%) [(E WB -E P ) / (E P -E S a !)] XI 00
  • Table 1 shows the average value of the current values, and the divergence rates A and B calculated from the equations (1) and (2) using the average values.
  • the current value was measured using the gold electrode biosensor of Example 4 in order to investigate the effect of the open circuit time.
  • physiological saline containing glucose concentration: 500 Omg / L was used.
  • FIG. 3 is a graph showing a correlation between an open circuit time and a current value. As shown in Fig. 4, the current value was hardly affected by the open circuit time. This indicates that, in the biosensor of Example 4, the enzyme reaction rapidly progressed in a short time after aspirating the sample. From this, it can be said that the biosensor of the present invention is capable of quick measurement and has excellent operability. (Confirmation of the effect of Hct on the carbon electrode sensor)
  • the current values of the carbon electrode biosensor of Example 5 and the gold electrode biosensor of Example 4 and the biosensor of Comparative Example were measured.
  • Physiological saline (Sal), human whole blood (WB), and human plasma (P) were used for the biosensors of Examples 4 and 5, respectively.
  • Human whole blood (WB) and human plasma (P) were used.
  • the Het of the human whole blood (WB) was 49%, and the plasma glucose concentration of human whole blood (WB) and human plasma (P) was determined to be 110 mg / L.
  • the gold electrode biosensor of Example 4 and the carbon electrode biosensor of Example 5 were respectively connected to the potentiostat. Then, after aspirating the sample into the biosensor, a current value was measured when a voltage was applied for 20 seconds. The voltage was 250 mV for the gold electrode sensor and 35 OmV for the carbon electrode sensor.
  • the biosensor of the comparative example after the sample was connected to the potentiostat and the sample was sucked into the biosensor, the circuit state was held for 25 seconds, and the current value at the time when the voltage was applied for 5 seconds was measured. Was measured. About each biosensor Under the same conditions, the current value was measured four times, and the average value was obtained. The divergence rate A (%) and the divergence rate B (%) were determined in the same manner as described above. Table 2 below shows the average value of the current values and the results of the deviation rate A and the deviation rate B.
  • Deviation rate A (%) ⁇ 1.0 -6.0 ⁇ 8.2
  • the absolute value of the deviation rate A in the biosensor of both examples is smaller than the absolute value of the deviation rate A in the biosensor of the comparative example.
  • the absolute value of the deviation rate B in both examples was almost the same as the absolute value of the deviation rate A, respectively.
  • the gold electrode biosensor of Example 4 The force of Example 5 and Example 6, and the biosensor of Comparative Example
  • the current value was measured by the following method in order to investigate the influence of the current.
  • the current value was measured using an unused biosensor that was sufficiently dried.
  • Physiological saline (S a1) and physiological saline (GS a1) supplemented with glucose (concentration 10 Omg / L) were used as samples.
  • a biosensor was connected to the potentiostat, and after the sample was aspirated into the biosensor, the open circuit state was maintained for 25 seconds. Then, the current value at the time when the voltage was applied for 5 seconds was measured.
  • the voltage was set at 25 OmV for the gold electrode biosensor of Example 4, 35 OmV for the carbon electrode biosensors of Examples 5 and 6, and 500 mV for the biosensor of Comparative Example. did.
  • the current value was measured twice under the same conditions, and the average value was determined.
  • the biosensor of the present invention is not easily affected by substances other than the object to be measured, such as solid components, soluble components, and insoluble components in the sample, and by humidity. It is possible to measure. In addition, operability is excellent because the enzyme reaction proceeds quickly.

Description

明 細 書 バイオセンサ 技術分野
本発明は、 バイオセンサに関する。 背景技術
従来、 特定の測定対象物を含む試料について、 例えば、 試料の希釈や 攪拌等を行わずに、 簡便かつ迅速に前記測定対象物を定量できるバイオ センサが広く使用されている。 このようなバイオセンサは、 例えば、 特 許第 2 5 1 7 1 5 3号公報等に開示されているように、 通常、 電気絶縁 性の基板上に、 スクリーン印刷等の方法により作用極 （測定極ともいう ) と対極とを有する電極系を形成し、 その上に、 前記測定対象物と反応 する酸化還元酵素および電子受容物質等を含む反応層を形成することに より作製できる。 この反応層に、 前記測定対象物を含む試料を接触させ ると、 前記酸化還元酵素の触媒作用により、 前記測定対象物が酸化され 、 同時に前記電子受容物質が還元される。 前記還元された電子受容物質 を電気化学的手法により再酸化し、 これにより得られた酸化電流値から 前記試料中の測定対象物の濃度が算出できる。
しかし、 このようなバイオセンサによると、 試料の物性等によって測 定誤差を生じる場合がある。 例えば、 試料が全血の塌合、 血液中に含ま れる血球等の固形成分、 脂質、 タンパク質、 糖質等の可溶成分や不溶成 分等がバイオセンサの電極表面に吸着するため、 正確な測定が困難であ つた。 また、 全血に対する赤血球の容積比であるへマトクリット （H e t ) 値は、 個人差が大きいため、 検体によってバイオセンサに対する前 述のような影響にも差が見られた。 このような不純物による影響は、 例 えば、 前記試料を希釈してからバイオセンサに供すること等により緩和 できるが、 これでは手間がかかり操作が煩雑になる。
そこで、 前記不純物による影響を回避するために、 以下に示すような 方法が提案されている。 例えば、 電極上に吸水性高分子層を形成する方 法（特公平 6— 5 4 3 0 4号公報）、反応層上に非水溶性高分子および水 溶性高分子を含有する層を形成する方法 （特開平 6— 2 1 3 8 5 8号公 報）、電極上に脂溶性高分子と両親媒性高分子との混合物からなる高分子 膜を形成する方法（特開平 9一 3 1 8 5 8 8号公報）、反応層上に固形成 分の透過を抑制するァニオン性フィルタ一を形成する方法 （特開平 1 0 - 2 2 1 2 9 3号公報）、クェン酸ナトリウム水溶液を封入したマイクロ カプセルを、 グルコースォキシダーゼを固定化した電極上に固定し、 こ れを作用極とする方法 （特開平 5— 1 3 3 9 2 9号公報） 等がある。 発明の開示
しかしながら、 前記ァニオン性フィルターを用いる方法では、 固形成 分のみに有効であり、 例えば、 タンパク質等の試料中の可溶成分に対し ては効果が見られないという問題があった。 また、 前述のその他の方法 では、 水溶性高分子等を用いるため吸水性が高く、 湿度の影響を受けや すくなり、 酵素反応が遅くなる等の問題があった。
そこで、 本発明の目的は、 試料中の不純物や湿度の影響を受けること なく、 前記試料中の測定対象物を高精度で測定できるバイオセンサの提 供である。
前記課題を解決するため、 本発明のバイオセンサは、 基板、 試薬を含 有する試薬層、 および作用極と対極とを含む電極系を備え、 前記基板上 に電極系が配置され、 前記電極系の上に前記試薬層が形成されているバ ィォセンサであって、 前記試薬層がさらに微粒子を含有することを特徴 とする。
本発明のバイオセンサは、 このように前記電極系上に形成された試薬 層が前記微粒子を含むことにより、 試料中の不純物が前記電極表面に付 着することを防止できる。 また、 前述のような水溶性高分子等を使用す る必要がないため、 湿度の影響も受けない。 このため、 前述のような試 料の物性に関らず、 感度の低下が防止され、 測 ½対象物を高精度で測定 することができる。 なお、 前記微粒子により電極表面への不純物の付着 を防止できる理由は不明であるが、 前記不純物の前記微粒子への物理的 吸着等によると考えられる。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記試薬層は単層であってもよいし 、 前記試薬を含有する試薬含有層と前記微粒子を含有する微粒子含有層 とを含む積層体であってもよい。
前記試薬層が前記積層体の場合、 前記電極上に前記微粒子含有層を介 して前記試薬含有層が形成されてもよいが、 例えば、 より一層、 不純物 の電極への吸着を排除でき、 前記試料中の測定対象物と試薬とが反応し 易いことから、 前記電極上に前記試薬含有層を介して前記微粒子含有層 が形成されることが好ましい。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記微粒子の平均粒径は、 例えば、 0 . ；!〜 4 5 mの範囲であり、 好ましくは 0 . 5〜 3 0 mの範囲、 より好ましくは 1〜 2 0 mの範囲、 特に好ましくは 3〜 1 5 の範 囲である。 前記平均粒子径が 0 . 1 m以上であれば、 前記試薬層に試 料が十分に浸透し易くなり、 バイオセンサの感度を向上できる。 また、 平均粒子径が 4 5 m以下であれば、 前記試料中の不純物の影響を十分 に排除することができる。
前記平均粒径は、 例えば、 電子顕微鏡を用いて前記微粒子を直接観察 し、 その粒径を測定して平均値を算出することにより求めることができ る。 この際、 前記微粒子の測定個数は特に制限されないが、 例えば、 1 0 0個以上、 好ましくは 1 0 0〜3 0 0個の範囲である。
また、 前記微粒子の粒度分布は、 特に限定されないが、 0 . 0 1〜 1 0 0 mの範囲であることが好ましく、 より好ましくは 0 . 0 5〜6 0 mの範囲であり、 特に好ましくは平均粒径 0 . l ~ 4 0 /x mの範囲で ある。
前記微粒子の形態は、 例えば、 球状、 扁球状でもよいし、 微粒子が固 まって球状になったもの等も使用できるが 前記微粒子を含む層が、 均 一かつ適度な疎密性を保持できることから、 球状であることが好ましい また、 前記微粒子は、 高分子化合物から形成されることが好ましく、 より好ましくは、 電解を起こす不純物を含まず、 電気化学的に不活性で ある高分子化合物である。 また、 前記高分子化合物は、 非水溶性である ことが好ましい。 前記高分子化合物の具体例としては、 例えば、 ァクリ ル酸、 メタクリル酸、 マレイン酸、 アクリル酸エステル、 メタクリル酸 エステル、 マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマ一のうち少 なくとも一つを含む重合体もしくは共重合体等があげられる。 前記スチ レン誘導体ポリマーとしては、 例えば、 スチレン、 アルキルスチレン等 があげられる。 また、 例えば、 ポリウレタン、 ポリウレァ等のウレタン 化合物、 ポリエチレン、 ポリプロピレン等のポリオレフイン系高分子化 合物、 ポリ塩化ビニル等のポリオレフイン誘導体、 およびポリアミド化 合物等も使用できる。 また、 高分子化合物以外に、 例えば、 シリカゲル 、 アルミナ、 ゼォライト、 アパタイト、 ガラスやエーライト等に代表さ れるセラミックス等の無機化合物から形成されてもよい。 これらの中で も、 電気化学的に不活性であることから、 より好ましくは、 アクリル酸 、 メタクリル酸、 マレイン酸、 アクリル酸エステル、 メタクリル酸エス テル、 マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマーのうち少なく とも一つを含む重合体もしくは共重合体、 またはポリアミド系高分子化 合物である。 具体的には、 ポリメタクリレート （PMMA)、 ポリスチレ ン （P S)、 ポリアミド （PA) 等が特に好ましい。
このような微粒子としては、 例えば、 市販の商品名テックポリマー b mx- 5 (積水化成品工業社製、 PMMA、 球状、 粒径 5 m)、 商品名 ガンツパール GM— 0 6 0 0 (ガンツ化成社製、 PMMA、 球状、 粒径 6 m), 商品名ガンツパール GS— 0 8 0 5 (ガンツ化成社製、 架橋 P S、 球状、 粒径 8 ^m)、 商品名ガンツパール P S— 8 F (ガンツ化成社 製、 PMMA、 球状、 粒径 0. 4 ΠΙ)、 商品名オーガゾル 2 0 0 2 E X D NAT COS Ty p e S (エルファトケム社製、 ナイロン、 扁 球状、 サイズ 1 0 im)、 商品名トレフィル E_ 5 0 6 C (東レダウコ一 ニングシリコーン社製、 架橋シリコーン末、 球状、 粒径 1 0 im)、 商品 名サラミックス末 S N— E— 0 2 (宇部興産社製、 窒化ゲイ素、 球状、 粒径 1 zm)、 商品名ゴットポール （鈴木油脂社製、 シリカ、 球状、 粒径 1 0 m), 商品名ガラスビーズ （ポリサイエンス社製、 ライムガラス、 球状、 粒径 3〜 1 0 m) 等が使用できる。
また、 前記微粒子は、 電気的に不活性であり、 試料中の除去しようと する不純物に応じて粒径を変化させるとともに、 微粒子表面の特性を変 化させることが望ましい。 例えば、 微粒子表面の特性を疎水性に設定し たい場合は、 P Sから形成された微粒子が好ましく、 P Sよりも親水性 に設定したい場合は、 PMMAや P A等から形成された微粒子が好まし レ^ また、 前記特性を負電荷を帯びるように設定したい場合は、 力ルポ キシル基を導入した P S等から形成された微粒子が好ましく、 正電荷を 帯びるように設定したい場合は、 アミノ基を導入した P S等から形成さ れた微粒子が好ましい。
また、 具体的には、 全血中の血球除去を目的とする場合、 血球成分の 大部分を占める赤血球は、 平均直径が約 7 /i mであるため、 例えば、 平 均粒径約 7 m以下の大きさの微粒子を選択すれば、 効率よく赤血球の 分離を行うことができる。 また、 全血中の複数のタンパク質除去を目的 とする場合、 例えば、 P S、 力ルポキシル基を導入した P s、 およびァ ミノ基を導入した P S等を適宜混合して用いることによって、 不特定多 数のタンパク質を吸着除去できる。 なお、 これらの方法には制限されな い。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記試薬層がさらに無機ゲルを含ん でいることが好ましい。 前記無機ゲルを含むことにより、 不純物の電極 への吸着をより一層防止でき、 さらに、 試料の拡散を防止できることか ら、 狭い範囲で酵素反応が起こるため、 速やかに試薬と測定対象物とが 反応できる。
また、 同様の理由から、 前記電極と、 前記試薬層との間に、 別途、 無 機ゲルを含有する無機ゲル含有層が形成されてもよい。
前記無機ゲルとしては、 粘土鉱物が好ましく、 例えば、 膨潤性層状ケ ィ酸塩等があげられる。 前記膨潤性層状ケィ酸塩としては、 例えば、 ス メクタイト、 膨潤性雲母等が好ましい。 前記スメクタイトとしては、 例 えば、 ヘクトライト、 サボナイト、 モンモリロナイト等が好ましく、 前 記膨潤性雲母としては、 例えば、 ナトリウムフッ化四ケィ素雲母、 テニ オライト等が好ましい。 これらは、 いずれか一種類でもよいし、 二種類 以上を併用してもよい。
スメクタイトとしては、 例えば、 市販の合成へクトライトである、 商 品名ラボナイト X L Gおよび商品名ラボナイト X L S (それぞれラボー トインダストリー社製）、商品名ルーセンタイト S WNおよび商品名ルー セン夕イト SWF (コープケミカル社製） ならびに商品名チキソピー W (協和化学工業社製） 等、 市販の合成サボナイトである商品名スメクト ン S A (クニミネ工業社製）、市販の天然モンモリ口ナイト精製物である 商品名クニピア F (クニミネ工業社製） 等が使用できる。
また、 膨潤性雲母としては、 例えば、 市販のナトリウムフッ化四ケィ 素雲母である商品名 N a— TS (トピ一工業製）、市販のテニォライトで ある商品名 L i一 TN (トピー工業製） 等があげられる。
本発明のバイオセンサにおいて、 さらに、 前記試薬層の上に界面活性 剤を含む界面活性剤含有層が形成されていることが好ましい。 このよう に前記界面活性剤含有層を設ければ、 前記試薬層表面に親水化膜が形成 されるため、 試料と試薬とが素早くかつ均一に混和する。 このため、 反 応が迅速に進み、 再現性も向上する。
また、 前述のような積層体の場合、 前記微粒子含有層上に界面活性剤 を含む界面活性剤含有層が形成されていることが好ましい。
前記界面活性剤としては、 例えば、 陽イオン性界面活性剤、 陰イオン 性界面活性剤、 両イオン性界面活性剤、 非イオン性界面活性剤、 天然型 界面活性剤等があげられ、 この中でも好ましくは、 陽イオン性界面活性 剤、 非イオン性界面活性剤、 天然型界面活性剤であり、 より好ましくは 非イオン性界面活性剤、 天然型界面活性剤である。 前記天然型界面活性 剤としては、 例えば、 リン脂質があげられ、 好ましくは、 卵黄レシチン 、 大豆レシチン、 水添レシチン、 高純度レシチン等のレシチン等が使用 できる。 また、 非イオン性界面活性剤としては、 例えば、 商品名 Twe e n 20等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、 商品名で r i r o nX—' 1 0 0等のポリオキシエチレンアルキルエーテル、 商品 名 T r i t o nX—405等のポリオキシエチレンフエニルアルキルェ 一テル等があげられる。 これらの中でも特に好ましくはリン脂質であり 、 最も好ましくは、 高純度レシチン等のレシチンである。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記電極としては、 測定対象物と試 料との反応を電気化学的に検出するのに使用できればよく、 例えば、 金 電極、 カーボン電極、 銀電極等があげられる。 この中でも、 電気伝導性 および化学的安定性に優れることから、 金電極、 カーボン電極が好まし く、 より好ましくはカーボン電極である。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記試薬は、 測定対象物と反応し、 その反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されないが、 例えば、 酵素を含むことが好ましい。 前記酵素としては、 例えば、 酸化 還元酵素等があげられる。
前記酸化還元酵素は、 例えば、 前記測定対象物の種類により適宜決定 でき、 具体的には、 グルコースォキシダーゼ、 グルコースデヒドロゲナ ーゼ、 乳酸ォキシダ一ゼ、 乳酸デヒドロゲナ一ゼ、 フルクトースデヒド ロゲナーゼ、 ガラクトースォキシダーゼ、 コレステロールォキシダーゼ 、 コレステロールデヒドロゲナーゼ、 アルコールォキシダーゼ、 アルコ 一ルデヒドロゲナーゼ、 ピリルビン酸ォキシダーゼ、 グルコース一 6— リン酸デヒドロゲナーゼ、 アミノ酸デヒドロゲナーゼ、 ギ酸デヒドロゲ ナーゼ、 グリセロールデヒドロゲナ一ゼ、 ァシル— C o Aォキシダーゼ 、 コリンォキシダ一ゼ、 4ーヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、 マ レイン酸デヒドロゲナーゼ、 サルコシンォキシダーゼ、 ゥリカーゼ等が あげられる。
また、 前記酵素が酸化還元酵素の場合、 さらに前記酵素の反応におけ る電子受容体を含むことが好ましい。
前記電子受容体としては、 例えば、 フェリシアン化カリウム、 P—べ ンゾキノン、 フエナジンメトサルフェート、 インドフエノールおよびそ の誘導体、 /3—ナフトキノンー4ースルホン酸カリウム、 メチレンブル 一、 フエ口センおよびその誘導体、 ォスニゥム錯体、 ルテニウム錯体、
NAD+、 NADP+、 ピロ口キノリンキノン （PQQ) 等が使用できる 。 この中でも好ましくはフェリシアン化カリウム、 フエ口セン、 ォスニ ゥム錯体、 NAD +、 NADP+等である。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記測定試料は特に制限されないが 、 例えば、 前記可溶性成分、 不溶性成分、 固形成分等の不純物を含む試 料に対して有用である。 前記不純物としては、 例えば、 タンパク質、 脂 質、 糖質、 血球等があげられる。 具体的な測定試料としては、 例えば、 全血、 血漿、 血清、 唾液、 尿、 髄液等の生体試料や、 ジュース等の飲料 水、 醤油、 ソース等の食品類等、 排水、 雨水、 プール用水等が使用でき 、 この中でも好ましくは全血、 血漿、 血清、 唾液、 髄液等であり、 より 好ましくは全血である。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のバイオセンサの一例を示す図であり、 （A) は、 その 平面図であり、 （B) および （C) は、 その断面図である。
図 2は、本発明のバイオセンサのその他の例を示す図であり、 （A)は 、 その平面図であり、 （B) および （C) は、 その断面図である。
図 3は、 本発明のバイオセンサのさらにその他の例を示す断面図であ る。
図 4は、 本発明の一実施例における、 電流値と開回路時間との相関を 示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。 (実施形態 1 )
図 1に本発明のバイオセンサの一例を示す。 同図 （A) は前記バイオ センサの平面図であり、 同図 （B) は前記同図 （A) の I一 I方向断面 図であり、 同図 （C) は前記同図 （A) の II一 II方向断面図である。 図 示のように、 このバイオセンサ 1では、 基板 1 1上に作用極 1 2および 対極 1 3から構成される電極系が配置され、 この一方の端部上 （同図 1 (A) において右側、 図 1 (B) において右上） に、 試薬および微粒子 を含む単層の試薬層 1 6が形成されてい 。 2つの対極 1 3は基板 1 1 の幅方向 （矢印 b方向） 両端にそれぞれ配置され、 作用極 1 2は基板 1 1の幅方向中央に配置され、 これらの電極 1 2、 1 3は、 基板 1 1の長 手方向 （矢印 a方向） に沿って延びている。 また、 作用極 1 2と対極 1 3との間には、 絶縁部 14が形成されている。 この電極系の一端の上に おいて、 スぺ一サー 1 5 a、 1 5 bが、 前記電極系と垂直になるように 配置され、 このスぺーサ一 1 5 a、 1 5 bの間に試薬層 1 6が配置され ている。 そして、 試薬層 16の上部を覆うようにしてカバー 1 7がスぺ ーサー 1 5 a、 1 5 b上に配置され、 カバー 1 7と試薬層 1 6との間に 、 幅方向に貫通する孔が形成され、 これが試料供給用孔 1 8となる。
このバイオセンサ 1の大きさは、 特に制限されず、 供給する試料の量 等により適宜設定できるが、 例えば、 全体長さ 50〜 1 0mm、 全体幅 20〜 2 mm、 最大厚み 1 500〜 50 0 zm、 最小厚み 50 0〜 30 0 mであり、 好ましくは、 全体長さ 3 0〜 1 0 mmの範囲、 全体幅 1 0〜 2 mm, 最大厚み 1 000〜 5 00 m、 最小厚み 400〜 30 0 β mである。
試薬層 1 6の大きさは、 例えば、 長さ 1 0〜0. 2mm、 幅 20〜2 mm、 厚み 40 0〜 5 mであり、 好ましくは、 長さ 5〜0. 2mm、 幅 1 0〜2mm、 厚み 200〜： L 0 mである。 基板 1 1の大きさは、 例えば、 長さ 50〜 10mm、 幅 20〜2mm、 厚み 1000〜50 mであり、 好ましくは、 長さ 30〜： L 0 mm、 幅 10〜 2 mm、 厚み 5 00〜50 mである。 スぺーサー 15 a、 15 bの大きさは、 例えば 、 長さ 20〜lmm、 幅 20〜2mm、 厚み 500〜： L 0 ^ mであり、 好ましくは、 長さ 1 0〜2mm、 幅 10〜2mm、 厚み 300〜20 mである。 カバ一 1 7の大きさは、 例えば、 長さ 50〜10mm、 幅 2 0〜2mm、 厚み 1000〜50 mであり、 好ましくは、 長さ 30〜 10 mm、 幅 10〜 2 mm、 厚み 500〜 50 mである。 孔 18の大 きさは、 例えば、 長さ 10〜 0. 201111、 幅20〜0. 2 mm、 高さ 5 00〜 5 mであり、 好ましくは、 長さ 5〜 0. 2mm、 幅 10〜2m m、 高さ 300〜 10 zmである。 なお、 各部位の 「長さ」 とは、 バイ ォセンサの長手方向の長さをいい、 「幅」とは、 幅方向の長さをいう。 具体的には、 試料約 2 Lを供給する場合、 試薬層 16の大きさは、 例えば、 長さ 2〜0. 2mm、 幅 20〜2mm、 厚み 400〜5^mで あり、 好ましくは、 長さ 1〜0. 4mm、 幅 10〜2mm、 厚み 200 〜10 mである。 孔 18の大きさは、 例えば、 長さ 2〜0. 2mm、 幅 20〜2mm、 高さ 500〜 50 mであり、 好ましくは、 長さ；！〜 0. 4mm、 幅 10〜 2mm、 高さ 300〜 ： 100 mである。
前記試薬層 16における微粒子の含有量は、 供給する試料の種類やそ の量等に応じて適宜決定できるが、 試料約 2 Lに対して、 例えば、 1 〜0. 0 lmgの範囲であり、 好ましくは、 0. 5〜0. 05mgの範 囲である。
また、 前記試薬層 16における試薬の含有量は、 特に制限されず、 試 薬の種類、 試料の種類やその量等に応じて適宜決定できる。 例えば、 試 薬として酵素を使用する場合、 その含有量は、 試料約 2 Lに対して、 50〜0. 05Uが好ましく、 より好ましくは 20〜0. 1Uである。 さらに電子受容体を使用する場合、 その含有量は、 試料約 2 Lに対し て、 1 0 0〜0. 0 1 imo lが好ましく、 より好ましくは 5 0〜0. 0 5 mo 1である。 具体的に、 酵素として G〇D、 電子受容体として フェリシアン化カリウムを使用する場合、 試料約 2 Lに対して、 GO D 20〜0. 1 U、 フェリシアン化カリウム 50〜0. 0 5 ΠΙΟ 1で あることが好ましく、 より好ましくは GOD 10〜0. 2U、 フエリシ アン化カリウム 1 0〜0. l mo lである。
このようなバイオセンサは、 例えば、 以下に示すようにして製造でき る。 まず、 前記電極等を形成するための基板 1 1を準備する。 基板 1 1 の材料としては、 電気絶縁性であることが好ましく、 例えば、 プラスチ ック、 ガラス、 紙、 セラミックス等があげられる。 前記プラスチックと しては、 例えば、 ポリエチレンテレフタレート （PET；)、 P S、 PMM A、 ポリプロピレン （PP) 等があげられる。
つぎに、 前記基板 1 1上に、 作用極 1 2および対極 1 3からなる電極 系を形成する。 前記電極としては、 前述のように、 金電極やカーボン電 極等が好ましく、 その種類に応じた公知の方法により形成できる。
前記金電極は、 例えば、 蒸着法、 メツキ法、 金箔貼付法等により形成 できる。 前記蒸着法は、 例えば、 真空度 1. 3 3 X 1 0— 4P a、 入力パ ヮー 300W、 レート 5 A/秒、 時間 2分の条件でイオンプレーティン グ法により行うことができる。 これは、 例えば、 PETなどのプラスチ ックシート上に金を蒸着して、 さらにキスカット装置を用いて、 前記シ 一ド上に蒸着された金箔層に切れ目を入れる方法である。 これにより、 切れ目部分が絶縁部となり、 作用極および対極が形成できる。
また、 カーボン電極の場合は、 例えば、 カーボンインキを前記基板 1 1上にスクリーン印刷する手段、 コーティングする手段、 メツキ手段等 により形成できる。 前記電極上に後述する試薬層 1 6を形成する前に、 前記電極表面を親 水化処理することが好ましい。 これにより電極表面が疎水性であっても 、 前記処理によって親水化されるため、 後述するように試薬溶液を用い て試薬層を形成する場合に、 前記試薬層を均一に形成し易くなる。 前記親水化処理は、 電極の種類に応じて適宜決定できる。 前記電極が 金電極の場合、 例えば、 メルカプトエタノール溶液、 メルカプトェ夕ノ ールァミン溶液等の親水化溶液に前記電極を浸漬後、 洗浄 ·乾燥すれば よい。
前記親水化溶液の溶媒としては、 例えば、 エタノール、 ブタノール、 アセトン、 テトラヒドロフラン等の有機溶剤等があげられる。 また、 前 記親水化溶液の濃度は、 例えば、 1 0 0〜 0 . 0 l mm o 1 Z Lの範囲 であり、 好ましくは 5 0〜 0 . 0 5 mm o 1 Z Lの範囲である。 また、 洗浄には、 例えば、 エタノール、 メタノール、 ブ夕ノール、 アセトン、 テトラヒドロフラン等の有機溶剤、 精製水等の洗浄液が使用できる。 また、 電極がカーボン電極の場合は、 例えば、 界面活性剤に浸漬して から精製水で洗浄する方法等により親水化処理できる。
次に、 前記電極系を形成した基板 1 1上にスぺーサー 1 5 a、 1 5 b を配置する。 図示のように、 二つのスぺーサ 1 5 a、 1 5 bを、 一定間 隔おいて幅方向に平行に配置することによって、 後述する試薬層 1 6の 形成部を確保できる。 前記スぺーサ一 1 5の材料としては、 例えば、 樹 脂製フィルムやテープ等が使用できる。 また、 両面テープであれば、 後 述するカバーを容易に接着できる。 この他にも、 例えば、 レジスト印刷 等の手段によりスぺーサ一を形成できる。
つぎに、 前記スぺ一サー 1 5 a、 1 5 bの間隙部分に、 試薬および微 粒子を含む単層の試薬層 1 6を形成する。
前記微粒子および前記試薬としては、 前述のようなものが使用できる 。 この試薬層は、 前記微粒子および各種試薬を含有する溶液を調製し、 これを前記スぺーサー 15の間隙に注入することにより形成できる。 前記溶液は、 例えば、 試薬を十分に溶解させてから、 さらに前記微粒 子を分散させて調製することが好ましい。 前記溶媒としては、 特に制限 されないが、 例えば、 水、 緩衝液、 エタノール、 メタノール、 ブ夕ノー ル、 ジメチルスルホキシド （DM SO) およびテトラヒドロフラン等の 有機溶剤等が使用できる。 前記緩衝液としては、 例えば、 リン酸緩衝液 、 クェン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 トリス塩酸緩衝液、 グッド緩衝液等が あげられ、 その pHは、 4〜 9の範囲が好ましく、 より好ましくは 5〜 8の範囲である。 また、 水としては、 例えば、 精製水、 蒸留水、 超純水. 等があげられ、 この中でも不純物が極めて少なく高精度のバイオセンサ が作製可能であることから超純水が好ましい。
前記溶液中の微粒子の濃度は、 特に制限されないが、 1000〜10 g/Lの範囲が好ましく、 より好ましくは 500〜 50 g/Lの範囲で ある。 '
前記溶液中の試薬の濃度は、 特に制限されないが、 例えば、 酵素の場 合、 10， 000〜10KUZLの範囲が好ましく、 より好ましくは 5 000〜 50 KUZLの範囲である。 さらに、 電子受容体を含む場合、 10〜0. 0 lmo 1 ZLの範囲が好ましく、 より好ましくは 5〜0. 05mb 1 ZLの範囲である。
前記溶液を調製後、 この溶液を前記スぺーサー 1 5 a、 15 bの間隙 に注入する。 前記注入は、 特に制限されず、 例えば、 自動駆動式分注機 等を用いて行うことができる。 なお、 微粒子の沈殿を防ぐため、 前記溶 液を攪拌しながら注入することが好ましい。
前記溶液の注入量は、 形成する試薬層の大きさ、 微粒子および試薬の 含有量等により適宜決定できるが、 形成する面積 1 0mm2当たり 10 〜0 . 1 Lの範囲が好ましく、 より好ましくは 5〜 0 . 2 Lの範囲 である。
前記注入後、 これを乾燥させて試薬層を形成する。 乾燥の手段は、 特 に制限されないが、 例えば、 自然乾燥、 風乾、 減圧乾燥、 凍結減圧乾燥 等の方法が採用できる。 また、 これらの手段を組合わせてもよい。 温風乾燥の場合、 その条件としては、 例えば、 温度 1 0〜 6 0 °Cの範 囲、 相対湿度 R H 5〜4 0 %の範囲、 時間 1〜3 0分の範囲である。 つぎに、 前記スぺーサー 1 5 a、 1 5 b上に前記試薬層 1 6を覆う状 態でカバー 1 7を配置する。 これにより、 試薬層 1 6とカバ一 1 7との 間に形成された細孔が試料供給用の孔 1 8となる。
前記カバー 1 7の材料としては、 特に制限されないが、 例えば、 各種 プラスチック等が使用できる。
このようにして作製したバイオセンサ 1は、 長期間保存する場合、 湿 気の影響を防ぐため、 例えば、 モレキュラーシープ、 シリカゲル、 酸化 カルシウム等の乾燥剤と共に密封保存することが好ましい。
前記バイオセンサ 1は、 例えば、 ある一定の時間で所定の電圧を加え る手段、 バイオセンサから伝達される電気信号を測定する手段、 前記電 気信号を測定対象物濃度に演算する演算手段等の種々の手段を備えた測 定機器と組み合せて使用できる。
このバイオセンサ 1の使用方法について、 試料が全血、 測定対象物が グルコース、 試薬が G O Dおよびフェリシアン化力リゥムである例をあ げて説明する、
まず、 全血試料をバイオセンサ 1の孔 1 8に毛管現象等により吸引さ せる。 すると、 前記微粒子の存在により、 血球等の全血中の不純物が、 電極へ付着することが防止される。 一方、 全血中のグルコースは、 試薬 層 1 6の G O Dにより酸化され、 その酸化反応により移動した電子によ つてフェリシアン化力リウムが還元されてフエロシアン化力リゥムが生 成される。 そして、 全血試料の供給から一定時間経過後、 前記電圧を加 える手段により対極 1 3と作用極 1 2との間に電圧を印加して、 前記還 元型のフエロシアン化力リゥムを電気化学的にフェリシアン化力リウム に酸化し、 その際の酸化電流を、 前記電気信号を測定する手段等により 検出する。 この酸化電流のピークの値は、 試料中のグルコース濃度に比 例するため、 この値を前記演算手段によりグルコース濃度に演算すれば 、 試料中のグルコース濃度を求めることができる。 このようなバイオセ ンサによれば、 前述のように試料中の不純物が電極に吸着することがな いため、 感度の低下が防止され、 高精度に測定できる。 また、 湿度によ る影響も受けない。
このバイオセンサ 1は、 例えば、 前記試薬層がさらに無機ゲルを含有 してもよい。 前記無機ゲルとしては前述のようなものが使用できる。 前 記試薬層における無機ゲルの含有量は、 無機ゲルの種類、 試料の種類や その量等に応じて適宜決定できるが、 試料約 2 Lに対して、 例えば、 1 0 0〜0 . 1 gの範囲であり、 好ましくは、 5 0〜0 . 5 gの範 囲である。 このような無機ゲルを含む試薬層の形成は、 前記試薬、 微粒 子および無機ゲルを含む溶液を調製して、 前述と同様にして形成すれば よい。
(実施形態 2 )
図 2に本発明のバイオセンサのその他の例を示す。 同図 （A ) は前記 バイオセンサの平面図であり、 同図 （B ) は前記同図 （A ) の III一 III 方向断面図であり、 同図 （C ) は前記同図 （A) の IV— IV方向断面図で ある。 同図において、 図 1と同一箇所には同一符号を付した。
図示のように、 このバイオセンサ 2では、 基板 1 1上に作用極 1 2お よび対極 1 3から構成される電極系が配置され、 この一方の端部 （同図 (A), (B) において右上） に、 無機ゲル含有層 2 1と試薬層 1 6と界 面活性剤含有層 22とがこの順序で積層された積層体が形成されている 。 前記試薬層 1 6は、 試薬および微粒子を含んでいる。 2つの対極 1 3 は、 基板 1 1の幅方向 （矢印 b方向） 両端にそれぞれ配置され、 作用極 12は基板 1 1の幅方向中央に配置され、 これらの電極 1 2、 1 3は、 基板 1 1の長手方向 （矢印 a方向） に沿って延びている。 また、 作用極 1 2と対極 1 3との間には、 絶縁部 14が形成されている。 この電極系 の一端の上において、 第 1のスぺーサー 1 5 a、 1 5 bが、 電極系と垂 直になるように配置され、 このスぺ一サー 1 5 a、 1 5 bの間に前記積 層体 2 1、 1 6、 22が配置されている。 第 1のスぺーサー 1 5 a、 1 5 bの上には、 さらに第 2のスぺーサー 2 3 a、 23 bが配置されてい る。 そして、 第 2のスぺーサ一 23 a、 2 3 b上に、 前記積層体 2 1、 1 6、 22の上部を覆うようにしてカバー 24が配置され、 カバ一 24 と積層体 2 1、 1 6、 22と間に、 幅方向に沿って實通する孔が形成さ れ、 これが試料供給用孔 1 8となる。 なお、 このバイオセンサ 2は、 特 に示さない限り、 前記実施形態 1のパイォセンサと同様の形態である。 前記無機ゲル含有層 2 1における無機ゲルの含有量は、 供給する試料 の種類やその量、 無機ゲルの種類等に応じて適宜決定できるが、 試料約 2 Lに対して、 例えば、 1 000〜0. 1 gの範囲であり、 好まし くは、 500〜0. 5 gの範囲である。
前記界面活性剤含有層 22における界面活性剤の含有量は、 供給する 試料の種類やその量、 界面活性剤の種類等に応じて適宜決定できるが、 試料約 2 Lに対して、 例えば、 1 0 0〜0. O l gの範囲であり、 好ましくは、 50〜0. 0 5 gの範囲である。
このように、 無機ゲル含有層 2 1、 試薬層 1 6および界面活性剤含有 層 2 2が積層されたバイオセンサ 2は、 例えば、 以下に示すようにして 製造できる。 なお、 特に示さない限り、 前記実施形態 1と同様に製造で さる。
電極が配置された基板 1 1上に第 1のスぺーサー 1 5 a、 1 5 bを配 置してから、 無機ゲルを含む溶液を調製して前記スぺ一サ一 1 5 a、 1 5 bの間隙に注入 ·乾燥する。 続いて、 同様にして、 試薬および微粒子 を含む溶液、 界面活性剤を含む溶液をそれぞれ注入 ·乾燥して、 無機ゲ ル含有層 2 1、 試薬層 1 6および界面活性剤含有層 2 2を順次積層して いく。 さらに、 前記第 1のスぺーサー 1 5 a、 1 5 bの上に第 2のスぺ —サー 2 3 a、 2 3 bを積層し、 この第 2のスぺーサ一 2 3 a、 2 3 b 上に、 界面活性剤含有層 2 2の上面を覆うようにしてカバ一 2 4を配置 する。 これにより、 界面活性剤含有層 2 2とカバ一 2 4との間に形成さ れた細孔が試料供給用の孔 1 8となる。
このように、 第 2のスぺーサ一を形成すれば、 これにより孔 1 8の高 さを調節することもできる。 第 2のスぺーサ一は、 前記第 1のスぺーサ 一と同様の材料が使用でき、 同様にして形成できる。
前記無機ゲルを含む溶液は、 無機ゲルの沈降を防ぐために、 1時間以 上攪拌することが好ましく、 より好ましくは 5時間以上である。 また、 同様の理由から、 使用時に攪拌を続けることが好ましい。 前記溶液中の 無機ゲルの濃度は、 特に制限されないが、 例えば、 1 0〜 0 . O l 量 %の範囲であり、 好ましくは 5〜 0 . 0 5重量％の範囲である。
(実施形態 3 )
この実施形態は、 試薬層が、 前記試薬含有層と微粒子含有層との積層 体である本発明のバイオセンサの一例である。 このバイオセンサを図 3 の断面図に示す。 同図において、 図 1と同一部分には同一符号を付して いる。
図示のように、 このバイオセンサ 3は、 電極を配置した基板 1 1上に 試薬含有層 3 1を介して微粒子含有層 3 2が積層されている以外は、 前 記実施形態 1と同様の構成である。 試薬含有層 3 1および微粒子含有層 3 2は、 例えば、 試薬を含む溶液と、 微粒子を含む溶液とをそれぞれ調 製し、 スぺーサ一の間隙に前記試薬を含む溶液を注入 ·乾燥した後、 こ の上に前記微粒子を含む溶液を注入 ·乾燥することにより形成できる。 このバイォセンサ 3は、 前記実施形態 2のバイォセンサと同じように 、 試薬層 （本実施形態では試薬含有層および微粒子含有層） を形成する 前に、 電極上に無機ゲル含有層を別途形成し、 それから前記無機ゲル層 上に前記試薬含有層等を形成してもよいし、 微粒子含有層の上に、 さら に界面活性剤含有層を積層してもよい。
本発明のバイオセンサは、 前記各実施形態にはなんら制限されず、 例 えば、 全ての層が微粒子、 無機ゲルまたはこれら双方を含有してもよい
実施例
つぎに、 本発明の実施例について、 比較例と併せて説明する。 (実施例 1 )
以下に示すようにして、 前記図 2と同様の金電極バイオセンサを作製 した。 まず、 支持体として、 長さ 3 0 c m、 幅 3 0 c m、 厚み 2 5 0 mの透明 P E Tシート （以下、 同じ） を準備し、 その一方の表面に金蒸 着を行った。 蒸着条件は、 前述と同様である。 使用した金の純度は、 9 9 . 9 5 %以上である。
キスカット装置を用いて、 前記 P E Tシートの金蒸着面に深さ 0 . 1 mm、 幅 0. 1mmの直線の切れ目を、 一方向に 1 mmと 5 mmの間隔 で交互に入れた （以下、 「八ーフカット」 という）。 この切れ目部分が絶 縁部 14となり、 蒸着した金が、 作用極 1 2と対極 1 3とに分割される 。 なお、 最終的に、 この PETシートを切断してバイオセンサを作成す るため、 バイオセンサの作用極 1 2の幅は 1 mm、 対極 1 3の幅は 2. 5mm、 絶縁部 14の幅は 0. 1mmとなる。
さらに、 前記 P ETシ一トを、 裁断用機器 （K I NEMAT I C社製 、 商品名 M a t r i X 2360) を用いて、 長さ 20mm, 幅 170m mになるように裁断した。この裁断したシートを、 1 Ommo 1 ZL 2 一メルカプトエタノール溶液 （溶媒：エタノール） に 3 0分間浸漬後、 まずエタノール、 ついで精製水で洗浄し、 これをクリーンベンチ内で室 温乾燥することにより、 前記金蒸着表面の親水化を行った。
続いて、 第 1のスぺ一サー 1 5 a、 1 5 bとなる 2枚のポリアミド製 の片面テープ （住友スリーェム社製、 商品名 Y— 5 57 9、 厚み 42 m) を、 前記金蒸着表面の所定位置に貼付した。 このとき、 スぺーサー 1 5 aとスぺ一サ一 1 5 bとの間隔が 1 mm、 前記スぺーサ一 1 5 a、 1 5 bの長さが 5mm、 幅が 1 7 Ommとなるようにした。
つぎに、 前記スぺーサ一 1 5 a、 1 5 bの間隙に無機ゲル含有層 2 1 を形成した。 まず、 無機ゲル （コープケミカル社製、 商品名ルーセンタ イト SWN) 1 50mgと精製水 5 0. 0 gとをシリコーン処理した広 ロビンに入れ、 室温下で一晩攪拌 （ 1 0時間以上、 500 r m)) する ことにより、 無機ゲル含有層 2 1の原料液 （以下 「A液」 という。） を調 製した。 前記 A液は、 無機ゲルの沈殿を防ぐために使用直前に調製し、 後述の分注時にも前記攪拌を継続した。
前記 P ETシートの第 1のスぺーサー 1 5 a、 1 5 bの間隙部分に、 シリンジを用いて前記 A液を分注した。 前記 A液の分注量は、 分注表面 面積 6mmX lmm (バイオセンサ 1個相当） に対し、 1. 74 Lと した。 前記分注後、 これをクリーンベンチまたはデシケ一タ内において 、 室温で 30分以上静置乾燥させた。 さらに、 乾燥機を用いて、 35°C 、 相対湿度 1 0 %以下の雰囲気中で 30分間乾燥することにより （以下 、 「ハニードライ乾燥」 という）、 無機ゲル含有層 2 1を形成した。
続いて、 前記無機ゲル含有層 2 1上に微粒子、 無機ゲルおよび試薬を 含む単層の試薬層 1 6を形成した。 まず、 試薬層 1 6の原料液 （以下、 「B液」 という。） を調製した。 無機ゲル （前記ルーセンタイト SWN) 400mgと精製水 5 0. 0 gとを、 シリコーン処理した広口ビンに入 れ、 室温下で攪拌 （ 1 0時間以上、 500 r pm) した。 褐色ビン中に 、 前記無機ゲル溶液 1. 0mL、 精製水 3. OmLおよびフェリシアン 化カリウム （ナカライテスク社製） 32 Omgを入れて室温で攪拌し、 フェリシアン化力リゥムを完全に溶解させることにより、 フェリシアン 化カリウム溶液を調製した。 つぎに、 別の褐色ビンに、 グルコースォキ シダーゼ （天野製薬社製） 2. 40 KUおよび微粒子 （積水化成社製、 商品名 B MX— 5、 平均粒径 5 im、 原料化合物名 P MM A) 500m gを加え、 さらに前記フェリシアン化カリウム溶液 2. OmLを加えて 、 溶液が均一になるまで十分に攪拌し、 これを B液とした。 攪拌時には 、 溶液中に気泡が生じないよう十分に注意した。 また、 前記 B液は、 微 粒子の沈降を防ぐため、 攪拌しながら下記分注を行った。
前記シート上の無機ゲル含有層 2 1表面に、 分注用機器 （B i o D o t社製、 商品名 D i s p e n s e r S y s t em) を用いて前記 B 液を分注した。 前記 B液の分注量は、 分注表面面積 6 mmx lmm (バ ィォセンサ 1個相当） に対し、 1. 30 ^Lとした。 分注後、 これを、 オーブン中、 50°C、 無風状態で 1 0分間乾燥し、 さらに、 前記ハニー ドライ乾燥を同様にして 1 0分間行い、 試薬層 1 6を形成した。 つぎに、 前記試薬層 1 6上に界面活性剤含有層 2 2を形成した。 まず 、 高純度卵黄レシチン （キューピ一食品社製） 250mgとエタノール 50. OmLとを褐色ビンに入れ、 室温下、 均一になるまで攪拌して、 界面活性剤含有層 2 2の原料液 （以下、 「C液」 という。） を調製した。 そして、 前記シート 1 1の試薬層 1 6表面に、 前記分注用機器を用い て前記 C液を分注した。 前記 C液の分注量は、 分注表面面積 6mmx i mm (バイオセンサ 1個相当） に対し、 0. 3 O Lとした。 分注後、 これを前記八ニードライ乾燥 （乾燥時間 1 5分間） して界面活性剤含有 層 22を形成した。 ついで、 このシートを、 モレキュラーシ一ブと共に 減圧保存容器に入れ、 室温、 圧力約 1 O O P aの条件下で一晩減圧乾燥 した。
次に、 第 2のスぺーサ一として、 P ETフィルム中芯両面テープ （大 日本インキ社製、 商品名ダイダック両面接着テープ、 厚み 1 50 im) を、 第 1のスぺ一サー 1 5 a、 1 5 b上に配置した。 一方の第 2のスぺ ーサー 2 3 aは、 長さ 5mm、 幅 1 60mmであり、 他方の第 2のスぺ —サー 23 bは、 長さ 5mm、 幅 1 6 0 mmである。 そして、 さらに、 前記第 2のスぺーサ一 23 a、 2 3 bおよびその間隙部分を覆うように 長さ 1 5mm、 幅 1 60mm、 厚み 1 8 8 mの P E T製フィルムを貼 付し、 これをカバ一 24とした。
得られたこの積層体を、 前記裁断用機器により、 幅 6mmとなるよう に裁断して、 長さ 20mm、 幅 6mmの目的のバイオセンサを作製した 。 なお、 このバイオセンサは、 使用時まで、 褐色ビン中、 3 g以上のモ レキユラ一シーブと共に保存した。 (実施例 2)
前記 B液の調製において、 無機ゲルとして、 前記ルーセン夕イト SW Nの代わりに、 商品名ラボナイト XL S (ラボルテ社製） を用いる以外 は、 実施例 1と同様にして、 バイオセンサを作製した。
(実施例 3)
前記 B液の調製において、 前記無機ゲル溶液 1. OmLの代わりに、 精製水 1. OmLを用いる以外は、 実施例 1と同様にしてバイオセンサ を作製した。
(実施例 4)
前記 A液の調製において、 無機ゲルとして、 前記ルーセン夕イト SW Nの代わりに、 前記ラボナイト XL Sを用い、 また、 前記 B液の調製に おいて、 前記無機ゲル溶液 1. OmLの代わりに精製水 1. OmLを用 いる以外は、 実施例 1と同様にしてバイオセンサを作製した。 (実施例 5)
以下に示すようにして、 前記図 2と同様のカーボン電極バイオセンサ を作製した。 なお、 特に示さないかぎり、 前記実施例 1と同様である。 力一ボンインキにより、 基板 1 1となる前記透明 P ETシートの一方 の表面にカーボン印刷を施して、 作用極 1 2および対極 1 3を形成した 。 印刷は、 スクリーン印刷機を用い、 その条件は、 SUS · 3 00メッ シュ、 スキ一ジ圧 3〜5MP a、 プリントスピード 0. 5mZs、 コ一 卜スピード 0. 5 m/ s、 クリアランス 2. Omm、 才フコンタク卜 1 5度とした。 前記シートを、 90°Cで 3 0分間乾燥した。
つぎに、 前記 P ETシートの電極側表面に、 絶縁性 UV硬化樹脂を主 成分とするレジストインキによりレジスト印刷を行い、 これを乾燥して 第 1のスぺーサ一 1 5 a、 1 5 bを形成した。 このレジスト印刷は、 ス クリーン印刷機を用い、 その条件は、 ポリエステル · 2 50メッシュ、 スキージ圧 3〜 5 MP a、 プリントスピード 0. 1 5mZs、 コートス ピード 0. 1 5m/ s、 クリアランス 4. Omm、 オフコンタクト 1 5 度とした。 なお、 第 1のスぺーサ一の大きさ等は、 前記実施例 1と同様 に設定し、 その厚みは、 後述する乾燥後の厚みが 1 0 となるように 調整した。 また、 前記乾燥は、 UV乾燥機を用いて 3. 7mZsの条件 で行った。
次に、 前記スぺーサー 1 5 a、 1 5 bの間隙に無機ゲル含有層 2 1を 形成した。 前記 A液の調製には、 無機ゲルとして前記ルーセンタイト S WMの代わりに前記ラボナイト XL S 1 5 Omgを用い、 前記 A液の分 注量は、 分注表面面積 6mmx lmm (センサ 1個相当） に対し、 1. 4 5 Lとした。
次に、 前記無機ゲル含有層 2 1上に試薬層 1 6を形成した。 原料とな る B液は以下のように調製した。 褐色ビン中に、 精製水 3. OmL、 前 記微粒子 7 5 Omgおよび前記フェリシアン化カリウム 24 Omgを入 れて攪拌し、 フェリシアン化力リウムを完全に溶解させることにより、 フェリシアン化カリウム溶液を調製した。 続いて、 別の褐色ビンに前記 グルコースォキシダーゼ 2. 40 KUおよび前記フェリシアン化力リゥ ム溶液 2. OmLを入れて均一になるまで十分に攪拌し、 これを B液と した。 前記 B液の分注量は、 分注表面面積 6mmX lmm (センサ 1個 相当） に対し、 1. 0 8 Lとした。
以後、 前記実施例 1と同様にして、 界面活性剤含有層 22の形成、 第 2のスぺーサー 2 3 a、 2 3 bおよびカバー 24の配置を行うことによ り積層体を作製し、 これを裁断して、 目的のバイオセンサを得た。 (実施例 6)
無機ゲル含有層 2 1を形成しない以外は、 実施例 5と同様にしてパイ ォセンサを作製した。 (比較例 1)
以下のようにして、 従来のバイオセンサ ¾作製した。 まず、 前記 PE Tシ一ト上に実施例 5と同様にしてカーボン電極を形成し、 さらに実施 例 1と同様にしてスぺーサーを形成した。 そして、 3重量％カルポキシ ルメチルセルロース （CMC) 水溶液を調製してから、 これを前記 P E Tシートの電極系上に分注して乾燥し、 CMC層を形成した。 前記 CM C溶液の分注量は、分注表面面積 6mmX 1mmに対して 3 Lとした。 つぎに、 精製水 4. 0 mLにフェリシアン化カリウム 32 0 mgを入れ て攙拌し、 完全に溶解させてから、 このフェリシアン化カリウム水溶液 2mLにグルコースォキシダーゼ 2. 40KUを加え、 均一になるまで 十分に攪拌した。 この試薬液を、 前記 CMC層上に分注して前記実施例 1と同様にして乾燥することにより、 試薬層を形成した。 前記試薬液の 分注量は、 分注表面面積 6mm X 1 mmに対して 1. 3 0 ^Lとした。 そして、 前記実施例 1と同様にして、 第 2のスぺーサーを配置し、 カバ 一を貼付した。 前述のようにして得られた各実施例および比較例 1のバイオセンサに ついて、 以下に示す各種試験を行った。
(金電極バイオセンサに対する H c tの影響）
前記実施例 1〜4の各バイオセンサおよび比較例の'バイオセンサにつ いて、 それぞれ電流値を測定した。 試料としては、 前記実施例 1〜4の バイオセンサに対しては、 生理食塩水 （以下、 「S a 1」という）、 ダルコ ース添加 （濃度 1 00 Omg/L) 生理食塩水 （以下、 「GS a 1」 とい う）、 ヒト全血 （以下、 「WB」 という） およびヒト血漿 （以下、 「P」 と いう） をそれぞれ用い、 比較例のバイオセンサに対しては前記ヒト全血 (WB) およびヒト血漿 （P) を用いた。 前記ヒト全血 （WB) の He tは 46 %であり、 ヒト全血 （WB) およぴヒト血漿 （P) の血漿中グ ルコース濃度は、 1 27 OmgZLであった。
まず、 各バイオセンサをポテンシォス夕ット （BAS社製、 商品名 C V 1 0 0 W) に接続し、 室温で前記試料をバイオセンサ内に吸引した後 、 開回路状態を 25秒間保持した。 そして、 電圧を 5秒間印加した時点 における電流値を測定した。 電圧は、 実施例 1〜4のセンサに対しては 2 5 OmV、 比較例のバイオセンサに対しては 50 OmVに設定した。 各バイオセンサおよび各試料について、 同条件で前記電流値を 3回ずつ 測定し、 その平均値を求めた。 また、 各バイオセンサについて、 乖離率 A ( ) および乖離率 B (%) を、 それぞれ下記式 （1) および式 （2 ) により求めた。 ここで、 ES a l、 EGS a l、 EWBおよび EPとは、 前記 各試料を用いて測定したときの前記電流値の平均値である。 前記乖離率 Aおよび乖離率 Bは、 いずれも試料中の不純物の影響の程度を示す値で あり、 前記乖離率 Aは主として血球の影響に係る値、 前記乖離率 Bは、 それに加えて塩類の影響に係る値である。 これらの絶対値が小さいほど 、 前記不純物の影響が小さいと判断できる。 乖離率 A (%) = [(EWB-EP) /EP] X I 00
• . · ( 1) 乖離率 B (%) = [(EWB-EP) / (EP-ES a！)] X I 00
• · · (2) 前記電流値の平均値、 および前記平均値を用いて前記式 （1) と式 （ 2) から算出した乖離率 Aと乖離率 Bを下記の表 1に示す。
(表 1)
実施例 1 実施例 2 実施例 3 実施例 4 比較例
S a 1 0.509 0.493 0.293 0.231
GS a 1 2.125 2.285 1.808 2.173
WB 2.868 2.539 2.123 2.059 2.364
EP 2.860 2.736 2.395 2.153 2.844 乖離率 A (%) 0.3 ■7.2 -11.3 ■4.4 ■16.9 乖離率 B (%) 0.3 -8.8 -12.9 -4.9 前記表 1に示すように、 実施例のバイオセンサにおける乖離率 Aの絶 対値は、 比較例のバイオセンサにおける乖離率 Aの絶対値と比較して小 さかった。 また、 実施例の乖離率 Bの絶対値も、 実施例の乖離率 Aの絶 対値とほぼ同様であった。 これは、 実施例のバイオセンサによれば、 H c tによる影響が小さく、 血液中の成分を正確に測定できることを示し ている。
(開回路時間の影響確認）
前記実施例 4の金電極バイオセンサを用いて、 開回路時間の影響を調 ベるために電流値測定を行った。 なお、 試料としては、 グルコース添加 (濃度 5 00 Omg/L) 生理食塩水を使用した。
まず、 実施例 4のバイオセンサを前記ポテンシォス夕ットに接続し、 前記バイオセンサに前記試料を吸引させた後、 開回路状態を所定の時間 (0、 5、 1 0、 1 5、 2 5秒） 保持した。 そして、 2 50mVの電圧 を 5秒間印加後の時点における電流値を測定した。 この結果を図 4に示 す。 同図は、 開回路時間と電流値との相関関係を示すグラフである。 図 4に示すように、 電流値は開回路時間による影響をほとんど受けな かった。 これは、 実施例 4のバイオセンサでは、 酵素反応が試料を吸引 してから短い時間に速やかに進行したことを示している。 これから、 本 発明のバイオセンサは、 迅速な測定が可能であり、 優れた操作性を有す るといえる。 (カーボン電極センサに対する H c tの影響確認）
前記実施例 5のカーボン電極バイォセンサおよび実施例 4の金電極バ ィォセンサ、 ならびに比較例のバイオセンサについて、 それぞれ電流値 を測定した。 試料としては、 実施例 4および 5のバイオセンサに対して は生理食塩水 （S a l )、 ヒト全血 （WB)、 ヒト血漿 （P) をそれぞれ 用い、 比較例のバイオセンサに対しては前記ヒト全血 （WB)、 ヒト血漿 (P) を用いた。 前記ヒト全血 （WB) の He tは 49 %であり、 ヒト 全血 （WB) およびヒト血漿 （P) の血漿中グルコース濃度は 1 1 1 0 mg/Lでめった。
まず、 実施例 4の金電極バイオセンサおよび実施例 5のカーボン電極 バイオセンサを、 それぞれ前記ポテンシォスタツトに接続した。 そして 、 前記試料をバイオセンサ内に吸引した後、 電圧を 20秒間印加した時 点における電流値を測定した。 電圧は、 金電極センサに対しては 2 50 mV、 カーボン電極センサに対しては 3 5 OmVとした。 また、 比較例 のバイオセンサについては、 前記ポテンシォスタツトに接続して前記試 料をバイオセンサ内に吸引した後、 回路状態を 2 5秒間保持し、 電圧を 5秒間印加した時点における電流値を測定した。 各バイオセンサについ て、 同条件で前記電流値を 4回ずつ測定し、 その平均値を求めた。 なお 、 乖離率 A ( % ) および乖離率 B ( % ) は前述と同様にして求めた。 前記電流値の平均値、 および乖離率 Aと乖離率 Bの結果を下記表 2に 示す。
(表 2 )
実施例 5 実施例 4 比較例
E S a 1 0.073 0.108
E W B 0.757 1.075 2.206
0.766 1.140 2.404
乖離率 A ( % ) ■1.0 -6.0 ■8.2
乖離率 B ( % ) ■1.2 -6.2 前記表 2からわかるように、 両実施例のバイオセンサにおける乖離率 Aの絶対値は、 比較例のバイオセンサにおける乖離率 Aの絶対値と比較 して小さかった。 また、 両実施例の乖離率 Bの絶対値も、 それぞれ乖離 率 Aの絶対値とほぼ同様であった。 これは、 実施例のバイオセンサによ れば、 H e tによる影響が小さく、 血液中の成分を正確に測定できるこ とを示している。 また、 この H e tによる影響の回避に関しては、 実施 例 4の金電極バイォセンサでも比較例の従来品より優れた効果が得られ るが、 実施例 5のカーボン電極バイオセンサによると、 より一層の効果 を示すことがわかる。
(湿度による影響）
前記実施例 4の金電極バイオセンサと、 実施例 5および実施例 6の力 一ボン電極バイオセンサと、 比較例のバイオセンサについて、 湿度によ る影響を調べるため、 以下の方法により電流値を測定した。
まず、 十分に乾燥した未使用のバイオセンサを用いて電流値を測定し た。 試料としては、 生理食塩水 （S a l ) およびグルコース （濃度 1 0 Omg/L) 添加生理食塩水 （GS a l ) をそれぞれ用いた。 バイオセ ンサを前記ポテンシォスタツトに接続し、 前記試料をバイオセンサ内に 吸引した後、 開回路状態を 2 5秒間保持した。 そして、 電圧を 5秒間印 加した時点における電流値を測定した。 前記電圧は、 実施例 4の金電極 バイオセンサに対しては 2 5 OmV、 実施例 5および 6のカーボン電極 バイオセンサに対しては 3 5 OmV、 比較例のバイオセンサに対しては 500mVに設定した。 各バイオセンサについて、 同条件で前記電流値 を 2回ずつ測定し、 その平均値を求めた。 他方、 温度を 40°C、 相対湿 度を 8 5 %に保った密閉容器 （ADVANTEC社製、 商品名 AE— 2 1 5) 中に、 十分に乾燥した未使用のバイオセンサを 30分間放置した 。 その後、 これらのバイオセンサを用いて、 前述と同じ条件で前記電流 値を 2回ずつ測定し、 その平均値を求めた。
ここで、 前記放置前のバイオセンサにおける電流値の平均値を1 ES a い
Figure imgf000032_0001
とし、 放置後のバイオセンサにおける電流値の平均値を2 ES aい 2EGS a lとした。 また、 前記放置後の電流値の平均値と前記放 置前の電流値の平均値との比 RS a , (%) および RGS a l (%) は、 それ ぞれ下記式 （3) および式 （4) により求めた。 RS a l (%) および Re S a l (%) の値は、 1 0 0に近いほど、 湿度の影響が小さいと判断でき る。 前記各バイオセンサについて測定した結果を下記表 3に示す。
Figure imgf000032_0002
RG S a i (%) = (2EGS aノ1 EGSa l) X 1 00 · · · (4) (表 3)
塞 例
S a 1 0.256 0.212 0.161 0.165 S a I 0.552 0.283 0.315 4.144
Figure imgf000033_0001
G S a 1 2.191 1.614 1.499 2.498
2 F ^ G S a 1 2.357 1.711 1.963 6.164
R G S a 1 ( % ) 108 106 131 247
前記表 3に示すように、 実施例のバイオセンサは、 比較例のバイオセ ンサと比較して、 RS a l (%) および RGS a l (%) が 1 00に近い結果 が得られた。 これは、 湿度による影響が小さいことを示し、 本発明のバ ィォセンサによれば、 湿度の影響をうけていないことがわかる。
産業上の利用の可能性
以上のように、 本発明のバイオセンサは、 試料中の固形成分や可溶性 分、 不溶性分等の、 測定対象物以外の物質の影響や、 湿度の影響を受け にくく、 測定対象物を高精度で測定することが可能である。 また、 酵素 反応が速やかに進行するため、 操作性にも優れる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 基板、 試薬を含有する試薬層、 および作用極と対極とを含む電極 系を備え、 前記基板上に電極系が配置され、 前記電極系の上に前記試薬 層が形成されているバイオセンサであって、 前記試薬層がさらに微粒子 を含有することを特徴とするバイオセンサ。
2. 試薬層が単層である請求の範囲 1記載のバイオセンサ。
3. 試薬層が、 前記試薬を含有する試薬含有層と前記微粒子を含有す る微粒子含有層とを含む積層体である請求の範囲 1記載のバイオセンサ 。
4. 電極系上に試薬含有層を介して微粒子含有層が形成されている請 求の範囲 3記載のバイオセンサ。
5. 試薬層が、 さらに無機ゲルを含んでいる請求の範囲 1記載のバイ ォセンサ。
6. 電極系と試薬層との間に、 無機ゲルを含有する無機ゲル含有層が 形成されている請求の範囲 1記載のバイオセンサ。
7. さらに、 試薬層の上に界面活性剤を含む界面活性剤含有層が形成 されている請求の範囲 1記載のバイオセンサ。
8. 微粒子の平均粒径が、 0. 1〜45 /mの範囲である請求の範囲 1記載のバイオセンサ。
9. 微粒子の粒度分布が 0. 01〜 100 mの範囲である請求の範 囲 1記載のバイオセンサ。
10. 微粒子が、 球状である請求の範囲 1記載のバイオセンサ。
1 1. 微粒子が、 高分子化合物である請求の範囲 1記載のバイオセン サ。
12. 高分子化合物が、 電解を起す不純物を含まず、 電気化学的に不 活性である請求の範囲 1 1記載のバイオセンサ。
1 3. 高分子化合物が、 非水溶性である請求の範囲 1 1記載のバイオ センサ。
14. 高分子化合物が、 アクリル酸、 メ夕クリル酸、 マレイン酸、 ァ クリル酸エステル、 メタクリル酸エステル、 マレイン酸エステルおよび スチレン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共 重合体、 またはポリアミド系高分子化合物である請求の範囲 1 1記載の バイオセンサ。
1 5. 無機ゲルが、 粘土鉱物である請求の範囲 5記載のバイオセンサ 。
1 6. 粘土鉱物が、 膨潤性層状ケィ酸塩である請求の範囲 1 5記載の バイオセンサ。
1 7. 電極が、 金電極、 カーボン電極および銀電極からなる群から選 択された少なくとも一つの電極である請求の範囲 1記載のバイオセンサ 。
1 8. 試薬が、 酸化還元酵素を含む請求の範囲 1記載のバイオセンサ
1 9. 試薬が、 酸化還元酵素および前記酵素の反応における電子受容 体を含む請求の範囲 1記載のバイオセンサ。
20. 測定試料が、 血液である請求の範囲 1記載のバイオセンサ。
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