WO2002090988A1 - Gegenstand mit einer ungeladenen, funktionalisierten hydrogeloberfläche - Google Patents

Gegenstand mit einer ungeladenen, funktionalisierten hydrogeloberfläche Download PDF

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WO2002090988A1
WO2002090988A1 PCT/EP2001/005288 EP0105288W WO02090988A1 WO 2002090988 A1 WO2002090988 A1 WO 2002090988A1 EP 0105288 W EP0105288 W EP 0105288W WO 02090988 A1 WO02090988 A1 WO 02090988A1
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hydrogel
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residues
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Andreas Hofmann
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Jandratek Gmbh
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
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    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • the present invention relates to an object with an uncharged surface comprising a hydrogel which is functionalized with residues which allow a direct attachment of biomolecules with amino or thio groups without additional activation reagents and a method for its production. Furthermore, the invention relates to new organic molecules for connecting biomolecules to a hydrogel.
  • hydrogel It is also known to provide surfaces with hydrogel layers in order to suppress unspecific adsorption phenomena, the hydrogel having additional functional residues which enable the binding of biomolecules.
  • functional groups such as. B. carboxy or amino groups are used, which have charges depending on the pH and which must be reacted in a further step with an activating reagent before a molecule of interest can be bound (Sensing Surfaces Capable of Selective Biomolecular Interactions, To Be Used in Sensor Systems, EP-B-0589867).
  • the aim of the invention is therefore to provide objects, such as sensors, quartz scales or objects which have microcavities, with surfaces which avoid the disadvantages of the known systems and are easy to handle for the end user.
  • Another object of the invention is to provide a method for producing an article of the type mentioned. Furthermore, new connections are to be provided which are used to produce the above surfaces.
  • the invention thus relates to an object with an uncharged, functionalized surface comprising a hydrogel which has hydroxyl groups to which organic molecules are bound via the radicals A, the organic molecules used being one or more radicals A which can react with hydroxyl groups and have one or more radicals B which can react with amino groups or thio groups, and in the reaction with hydroxyl groups the radical A or the radicals A react selectively.
  • a preferred object according to the invention has an uncharged, functionalized surface comprising a hydrogel which has hydroxyl groups to which organic molecules are bound, the organic molecules used one or more radicals A selected from acid chloride groups and diazo groups and one or more radicals B selected from vinylsulfone groups , N-hydroxysuccinimide ester groups and maleimide groups.
  • the invention further provides a method for producing an article with an uncharged, functionalized surface, comprising the steps:
  • a method for producing an object with an uncharged, functionalized surface comprises the steps: (a) providing an article with a non-functionalized hydrogel surface;
  • the invention further provides new compounds with one or more radicals A, selected from acid chloride groups and diazo groups, and one or more radicals B, selected from vinylsulfone groups, N-hydroxysuccinimide ester groups and maleimide groups.
  • radicals A selected from acid chloride groups and diazo groups
  • radicals B selected from vinylsulfone groups, N-hydroxysuccinimide ester groups and maleimide groups.
  • the object described above is used to bind biomolecules with amino or thio groups. These biomolecules serve as receptors for analyte molecules.
  • the objects according to the invention can be used as microcavities or in a wide variety of analytical measurement methods, such as, for. B. surface plasmon resonance (SPR), quartz scales, or interferometric measurement methods, for. B. reflection interference contrast microscopy. They are particularly suitable for use in the SPR.
  • SPR surface plasmon resonance
  • quartz scales quartz scales
  • interferometric measurement methods for. B. reflection interference contrast microscopy. They are particularly suitable for use in the SPR.
  • the structure of the non-functionalized surface of the object according to the invention depends on the analytical method in which the object according to the invention is to be used and is known to the person skilled in the art (Journal of Biomedical Materials Research, 18 (953-959) (1984) and J. Chem Soc, Chem. Commun., 1990, 1526).
  • non-functionalized surface is used to denote the surface of an object with the hydrogel layer prior to the attachment of the organic molecules with the residues A and B.
  • the term "functionalized surface” is used to refer to the surface an object with the hydrogel layer after the attachment of the organic molecules with the residues A and B.
  • “uncharged” means that in the pH range between 4 and 11, preferably between 5 and 9, less than 0.1% of all functional groups on the hydrogel are present in a charged state. The charge state of these groups can be calculated from their pK a value.
  • the object of the invention has a base surface comprising z. B. a glass, metal or plastic layer.
  • Preferred metal layers are precious metal layers such. B. of gold or silver such as. B. find use in the SPR.
  • plastic layers in the corresponding applications such. B. in micro cavities, for example polyethylene, polypropylene, polystyrene and Makrolon ® known.
  • the non-functionalized article has a hydrogel layer on the surface.
  • This layer serves to prevent unspecific adsorption, which falsifies the measurement signal.
  • Hydrogels are water-swellable polymers.
  • the hydrogels must have hydroxyl groups in order to make it possible to bind the organic molecules with the residues A.
  • the hydrogels can be e.g. B. a polysaccharide, a derivative thereof or a swellable organic polymer such as poly ⁇ N- [tris (hydroxymethyl) methyl] acrylic acid amide ⁇ , polyvinyl alcohol or polyethylene glycol with terminal hydroxyl groups.
  • Polysaccharides are preferred. Examples of polysaccharides are amylose, inulin, pullulan or dextran. Pullulan or dextran are preferred. Dextran is particularly preferred.
  • the hydrogel layer should be several nanometers thick. It swells in water
  • the adsorption of molecules other than the molecules to be analyzed is effectively suppressed.
  • the swollen hydrogel layer is able to compensate for irregularities in the surface: the linker molecules and thus the biomolecules are also bound in the swollen matrix and not only directly on the surface. This reduces the importance of surface irregularities, which otherwise contribute to a poorly defined surface and thus to poorly quantifiable measurement results.
  • Bifunctional organic molecules which have at least one radical A and at least one radical B are bound to this non-functionalized hydrogel layer.
  • the residues A and B are chosen so that when the organic molecule is attached to the hydrogel, the residue A selectively reacts with the hydrogel. Since the selectivity of the connection to a hydrogel is difficult to quantify, the degree of selectivity is determined in the context of this invention by means of a model test in solution, an alcohol being used as the model compound for the hydroxyl groups of a hydrogel: 0.4 mol of the organic to be investigated Compound are placed in dry dichloromethane with 0.4 mol isopropanol. The solution is stirred at 25 ° C for 12 hours.
  • the residue is extracted with 500 ml of dichloromethane.
  • the organic phase is with 500 ml Washed water and 500 ml of 0.1 N sodium hydroxide solution, dried over magnesium sulfate and concentrated by evaporation of the solvent.
  • the respective proportion of the products which have arisen from the reaction of the radical A with the alcohol and which have arisen from the reaction of the radical B with the alcohol is determined by ⁇ -NMR spectroscopy. This is determined by comparing the area among appropriately selected signals from the products.
  • “selective” means that less than 5% of the organic molecules are linked to the alcohol via the radical B, preferably less than 1% of the organic molecules are linked to the alcohol via the radical B.
  • Linkage means a covalent reaction between the rest and the hydrogel.
  • radical A examples of the radical A are: acid chloride groups -COCI and diazo groups
  • Hydroxy groups of the hydrogel is preferably between 5 and 30%, particularly preferably between 8 and 15%.
  • residue A the organic molecules have another residue B.
  • This residue is chosen so that on the one hand it does not react under the chosen reaction conditions when the difunctional organic molecules are attached and, on the other hand, after the difunctional organic molecules have been attached to the hydrogel, without using one or more activation reagents with a biomolecule with amino or Thio groups can react.
  • the rest B should be chosen so that it can react immediately with no further intermediate steps with a biomolecule with amino or thio groups.
  • radical B are z.
  • B vinyl sulfone groups (I), N-hydroxysuccinimide ester groups (II), maleimide groups (IM), or other active ester groups. * indicates the binding site to the rest of the organic molecule. Vinyl sulfone groups, N-hydroxysuccinimide ester groups and maleimide groups are particularly preferred.
  • the residues A and B in the difunctional organic molecules can be connected by a residue X.
  • the choice of the radical X can vary within wide limits, whereby it should neither react with the hydrogel nor with the biomolecule with amino 5 or thio groups, nor should it be charged.
  • the radical X is preferably a single bond or a branched or unbranched carbon hydrogen chain which has a chain length of up to 15 carbon atoms and which can be interrupted up to twice by a phenylene group or a heteroatom-containing group , Heteroatom-containing groups are e.g. B. -O-, -S-, -CONH- or -COO-.
  • the hydrocarbon chain preferably has a chain length of up to 6 carbon atoms.
  • the hydrocarbon chain is preferably unbranched and preferably has no phenylene groups or heteroatom-containing residues.
  • the conditions for the synthesis of suitable molecules depend heavily on the individual case. Synthetic routes for selected organic molecules are given in the examples.
  • organic molecules of the formula A-X-B are:
  • the radicals A and B are bound to a polymer or oligomer.
  • the polymer or oligomer must have at least one radical A and at least one radical B.
  • the polymer or oligomer preferably has residues A and / or B on at least every fifth repeating unit.
  • the residues A and B can each be linked independently of one another either via a spacer (i.e. a hydrocarbon chain, which may be interrupted by heteroatom-containing units such as amide, ether, sulfide) or directly to the backbone of the polymer or oligomer.
  • the residues can be either terminally or non-terminally bound to the polymer.
  • the polymer or oligomer can be produced from monomers which have both a radical A and a radical B. However, it is also possible to synthesize the polymer or oligomer from monomers, where at least one monomer has a radical A, while at least a second monomer has a radical B. It is also possible to synthesize a polymer or oligomer and then to derivatize it with the residues A and B. Polymerization processes are known to the person skilled in the art (Bruno Volimert, Floor plan of Macromolecular Chemistry, Volume 1, E. Vollmert-Verlag, Düsseldorf 1988).
  • the backbone of the polymer or oligomer can vary widely, and should be chemically inert, i. H. it should not react with the hydrogel, nor with the biomolecule with amino or thio groups, nor should it react with groups A and B. Furthermore, it should be uncharged.
  • Polyacrylic acid esters or polyacrylamides are particularly suitable.
  • Suitable polymers should have a molecular weight between 5000 and 20,000 and should be soluble in aprotic organic solvents.
  • low molecular weight compounds as linkers has the advantage that it is possible to work with a uniform, defined compound, which can also be easily analyzed before use.
  • Polymers or oligomers offer the advantage of being able to carry several reactive groups per molecule. This facilitates the covalent connection to the hydrogel surface.
  • reaction conditions for coupling the difunctional organic molecules to the hydrogel layer vary depending on the selected radicals A and B and depending on whether low molecular weight compounds of the type A-X-B or polymeric or oligomeric compounds are used. Examples of these reaction conditions are described below.
  • the object according to the invention has an uncharged surface.
  • activation reagents such as. B. ethyl (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), required.
  • EDC ethyl (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the biomolecules used according to the invention have an amino group, preferably a primary or secondary amino group, or a thio group.
  • biomolecules are proteins, terminally amino-functionalized nucleotides or polynucleotides.
  • Suitable biomolecules are proteins, terminally amino-functionalized nucleotides or polynucleotides.
  • Biomolecules function on receptors. Examples are antibodies (e.g.
  • IgGs or antigens for certain antibodies, but also substrates for enzymes.
  • the objects according to the invention are particularly suitable for the detection of
  • Receptor-ligand interactions via methods based on affinity interactions.
  • the conditions under which the biomolecule with amino or thio groups is covalently bound to the object vary depending on the system selected.
  • the connection is typically made at room temperature
  • a solution of 80% glyoxylic acid (15.1 g, 0.164 mol) in water (162 ml) is placed in a round bottom flask and heated to 60 ° C in a water bath. Then a warm (60 ° C) solution of p-toluenesulfonyl hydrazide (30.37 g, 0.163 mol) in 2.5 M aqueous hydrochloric acid (82 ml) is added. The resulting mixture is heated in a water bath (60 ° C) with constant stirring. Oil drops form immediately. The hydrazone initially separated as an oil solidifies after about 10 minutes. The reaction mixture is slowly cooled to room temperature and then left to stand at 4 ° C. for 6 hours.
  • the crude p-toluenesulfonylhydrazone is filtered, washed with cold water and dried in a high vacuum for one day. The compound is then crystallized out. It is dissolved in boiling ethyl acetate (130 ml) which is then diluted with carbon tetrachloride (260 ml). After a night at 4 ° C., the pure p-toluenesulfonylhydrazone 1 is filtered out as a white solid from the suspension.
  • Thionyl chloride (7.2 ml) is added to a suspension of glyoxylic acid p-toluenesulfonylhydrazone 1 (12 g, 49.54 mmol) in dry benzene (60 ml). The mixture is stirred in a nitrogen atmosphere for 5 minutes and then heated under reflux until the strong gas evolution (HCl, S0 2 ) has ended and most of the suspended solid has dissolved. After 60 to 90 minutes, the initially white suspension turns yellow. The mixture is then immediately cooled and filtered through Celite *. After concentration of the filtrate under reduced pressure, the remaining solid is dissolved in a small amount of boiling anhydrous benzene. Petroleum ether (30 - 60 ° C) is added to the hot solution. Crystallization begins with cooling. After 1 hour, the hydrazone 3 is obtained by filtration.
  • Absolute isopropyl alcohol (1.5 ml) and boron trifluoride etherate (50 ⁇ l) are added successively under a nitrogen atmosphere to a solution of succinimidyldiazoacetic ester 2 (130 mg, 0.71 mmol) in anhydrous dichloromethane (1.5 ml).
  • the mixture is stirred at room temperature for 3 hours and then heated under reflux for 1.5 hours (40 ° C.). After evaporation of the solvent under reduced pressure, the residue is extracted with dichloromethane.
  • the organic phase is washed with water and a sodium hydroxide solution, dried over magnesium sulfate and finally concentrated. The dried compound is dissolved in boiling dichloromethane. After subsequent dilution with hexane, the crystalline alcohol conjugate 6 is obtained.
  • Triethylamine (8.03 ml, 57.6 mmol) is added to a solution of 4- (2-chloroethanesulfonyl) benzoic acid 10 (7.16 g, 28.8 mmol) in chloroform (144 ml). The mixture is stirred at room temperature overnight. After evaporation of the solvent under reduced pressure, the residue is dissolved in water 5 and filtered in order to separate the insoluble parts. Concentrated hydrochloric acid is added to the filtrate. The 4-vinylsulfonylbenzoic acid 11 is obtained from the precipitate by recrystallization in water, subsequent filtration and drying in a high vacuum.
  • a catalytic amount of dry dimethylformamide (38 ul, 0.488 mmol) is added to a solution of 4-vinylsulfonylbenzoic acid 11 (230 mg, 1, 084 mmol) in thionyl chloride (4.6 ml) under a nitrogen atmosphere.
  • the mixture is heated under reflux for 5 hours (85 ° C.).
  • the solution is evaporated to dryness, then taken up twice with dry toluene and at Evaporated to dryness and finally dried for 2 hours under high vacuum.
  • Absolute ethyl alcohol (76 ⁇ l, 1, 3 mmol) and ⁇ /, ⁇ / -diisopropylethylamine (170 ⁇ l, 0.976 mmol) are successively added to a solution of 4-vinylsulfonylbenzoyl chloride 12 in anhydrous dichloromethane (4 ml). The mixture is stirred at room temperature overnight. After evaporation of the solvent under reduced pressure, the residue is extracted with dichloromethane. The organic phase is washed with water, dried over magnesium sulfate and finally evaporated to dryness. After purifying the residue by column chromatography on silica gel with dichloromethane as the eluent, the analytically pure alcohol conjugate 13 is obtained.
  • Butylamine is obtained from the alcoholamine conjugate 14, which is used for microanalysis by column chromatography on silica gel with dichloromethane / methanol: 20/1
  • the alcohol conjugate 13 (54.7 mg, 0.228 mmol) and tert-butylamine (120 ⁇ l, 1, 139 mmol) are stirred in absolute ethanol (4 ml) for 12 hours at room temperature. Evaporation of the solvent and the excess tert-butylamine gives the conjugate 15, which is purified for microanalysis by column chromatography on silica gel with dichloromethane / methanol: 20/1 as the eluent.
  • Absolute isopropyl alcohol (202 ⁇ l, 2.638 mmol) and ⁇ , ⁇ / -diisopropylethylamine (206.8 ⁇ l, 1, 187 mmol) are successively converted to a solution of 4-vinylsulfonylbenzoyl chloride 12 (304.3 mg, 1, 319 mmol) in anhydrous Dichloromethane (3 ml) added. The mixture is stirred at room temperature overnight. A catalytic amount of dimethylaminopyridine is added to the solution to complete the reaction. After one hour the solvent is evaporated under reduced pressure and the residue is then extracted with dichloromethane.
  • the alcohol conjugate 16 (72.6 mg, 0.286 mmol) and diethylamine (148 ⁇ l, 1, 431 mmol) are stirred in absolute ethanol (2.5 ml) for 12 hours at room temperature. Evaporation of the solvent and the excess diethylamine gives the alcohol-amine conjugate 17, which is purified for microanalysis by column chromatography on silica gel with dichloromethane / methanol 30/1 as the eluent.
  • the alcohol conjugate 13 obtained (104 mg, 0.434 mmol) and 1 -dodecanethiol (104 ⁇ l, 0.434 mmol) are poured into absolute ethanol (4 ml) at room temperature and triethylamine (18 ⁇ l, 0.130 mmol) is added. The mixture is stirred at room temperature for 2 hours.
  • the alcohol-thiol conjugate crystallizes in ethanol when it is formed.
  • the alcohol-thiol conjugate 18 is obtained from the crystalline compound by filtering, washing with a little ethanol and then drying in a high vacuum.
  • a gold surface functionalized with a hydrogel of an SPR biosensor is incubated in a solution of 2-diazoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester in dry dichloromethane (5% by weight) under an inert gas atmosphere for 3 h. Then one after the other is rinsed once with dry dichloromethane, isopropanol and ultrapure water. After drying in a stream of nitrogen, the surface according to the invention is ready for use.
  • EXAMPLE 7 Attaching succinimidyldiazoacetic ester to a functionalized SPR sensor and then covalently binding a receptor
  • a hydrogel-functionalized SPR sensor is immersed under inert gas at room temperature for three hours in a solution of succinimidyldiazoacetic ester in dry dichloromethane (5% by weight). After rinsing with dichloromethane, isopropanol and water, the sensor is incubated at room temperature with an aqueous solution of protein A in water (150 ⁇ g * mf 1 ). Then rinse with plenty of water. The success of the binding is checked by surface plasmon resonance.
  • FIG. 1 shows a comparison of the surface plasmon resonance signals of a hydrogel before and after binding of protein A via succinimidyldiazoacetic ester.

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf einen Gegenstand, wie einen Sensor oder eine Mikrokavität, mit einer ungeladenen, funktionalisierten Oberfläche, umfassend ein Hydrogel, das Hydroxygruppen aufweist, an das organische Moleküle gebunden sind, wobei die eingesetzten Moleküle einen oder mehrere Reste A und einen oder mehrere Reste B aufweisen, wobei bei der Anbindung des organischen Moleküls slektiv der Rest A mit den Hydroxygruppen des Hydrogels reagiert und wobei der Rest B so gewählt wird, dass er, nach der Anbindung des organischen Moleküls an das Hydrogel, ohne Verwendung eines oder mehrerer Aktivierungsreagenzien mit einem Biomolekül mit Amino- oder Thiogruppen reagiert. Weiterhin werden ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Gegenstandes und neue organische Moleküle zur Anbindung von Biomolekülen an ein Hydrogel beschrieben.

Description

Gegenstand mit einer ungeladenen, funktionalisierten Hydrogeloberfläche
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Gegenstand mit einer ungeladenen Oberfläche umfassend ein Hydrogel, welches mit Resten funktionalisiert ist, die eine direkte Anbindung von Biomolekülen mit Amino- oder Thiogruppen ohne zusätzliche Aktivierungsreagenzien erlauben sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung. Weiterhin betrifft die Erfindung neue organische Moleküle zur Anbindung von Biomolekülen an ein Hydrogel.
Oberflächen für biotechnologische Anwendungen können mit kurzen Linkermolekülen funktionalisiert sein, die auf Grund ihrer chemischen Reaktivität die Anbindung von Biomolekülen gestatten, ohne daß zusätzliche Aktivierungs- reagenzien benötigt werden (Katalog Pierce Coated Microwell Plates, 1998). Diese Oberflächen neigen jedoch zu unspezifischen Adsorptionen, die zu einer Verfälschung des Meßsignals führen. Bei den Meßverfahren, die auf Affinitätswechselwirkung basieren, z. B. bei der biochemischen Interaktionsanalyse mit Hilfe der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), wird in diesem Fall eine höhere Konzentration von Biomolekülen vorgetäuscht als tatsächlich in der Lösung vorhanden ist.
Es ist ferner bekannt, Oberflächen mit Hydrogelschichten zu versehen, um unspezifische Adsorptionsphänomene zu unterdrücken, wobei das Hydrogel zusätzliche funktionelle Reste aufweist, die die Anbindung von Biomolekülen ermöglichen. Als funktionelle Reste werden nach dem Stand der Technik Gruppen, wie z. B. Carboxy- oder Aminogruppen, eingesetzt, die in Abhängigkeit vom pH-Wert Ladungen aufweisen und die in einem weiteren Schritt mit einem Aktivierungsreagenz umgesetzt werden müssen, bevor ein interessierendes Molekül gebunden werden kann (Sensing Surfaces Capable of Selective Biomolecular Interactions, To Be Used in Sensor Systems, EP-B-0589867). Dies hat zwei Nachteile zur Folge: zum einen besteht die Möglichkeit, daß durch unvollständige Umsetzung geladene Gruppen an der Oberfläche vorhanden bleiben, so daß über elektrostatische Wechselwirkungen unspezifische Adsorption erfolgen kann, zum anderen ist die Verwendung eines Aktivierungsreagenz für den Endanwender ein zusätzlicher Arbeitsschritt, der auch zusätzliche Fehlermöglichkeiten birgt.
Ziel der Erfindung ist es daher, Gegenstände, wie Sensoren, Quarzwaagen oder Gegenstände, die Mikrokavitäten aufweisen, mit Oberflächen bereitzustellen, die die Nachteile der bekannten Systeme vermeiden und für den Endanwender leicht handhabbar sind. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Gegenstandes der genannten Art bereitzustellen. Weiterhin sollen neue Verbindungen bereitgestellt werden, die zur Herstellung der vorsteheneden Oberflächen Verwendung finden. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Gegenstand mit einer ungeladenen, funktionalisierten Oberfläche umfassend ein Hydrogel, das Hydroxygruppen aufweist, an das über die Reste A organische Moleküle gebunden sind, wobei die eingesetzten organischen Moleküle einen oder mehrere Reste A, die mit Hydroxygruppen reagieren können, und einen oder mehrere Reste B, die mit Aminogruppen oder Thiogruppen reagieren können, aufweisen und wobei bei der Umsetzung mit Hydroxygruppen selektiv der Rest A bzw. die Reste A reagieren.
Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Gegenstand hat eine ungeladene, funktionalisierte Ober läche umfassend ein Hydrogel, das Hydroxygruppen aufweist, an das organische Moleküle gebunden sind, wobei die eingesetzten organischen Moleküle ein oder mehrere Reste A ausgewählt aus Säurechloridgruppen und Diazogruppen und ein oder mehrere Reste B ausgewählt aus Vinylsulfongruppen, N-Hydroxysuccinimidestergruppen und Maleimidgruppen aufweisen.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Gegenstandes mit einer ungeladenen, funktionalisierten Oberfläche, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Gegenstandes mit einer nicht funktionalisierten Hydrogeloberfläche, wobei das Hydrogel Hydroxygruppen aufweist;
(b) Kovalentes Anbinden an das Hydrogel von organischen Molekülen, die einen oder mehrere Reste A, die mit Hydroxygruppen reagieren können, und einen oder mehrere Reste B, die mit Aminogruppen oder Thiogruppen reagieren können, aufweisen, wobei die organischen Moleküle selektiv über den Rest A bzw. die Reste A mit Hydroxygruppen des Hydrogels reagieren.
Vorzugsweise wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines Gegenstandes mit einer ungeladenen, funktionalisierten Oberfläche zur Verfügung gestellt, das die Schritte umfaßt: (a) Bereitstellen eines Gegenstandes mit einer nicht funktionalisierten Hydrogeloberfläche;
(b) Anbinden an das Hydrogel von organischen Molekülen, die einen oder mehrere Reste A, ausgewählt aus Säurechloridgruppen und Diazogruppen, und einen oder mehrere Reste B, ausgewählt aus Vinylsulfongruppen, N-
Hydroxysuccinimidestergruppen und Maleimidgruppen, aufweisen.
Die Erfindung stellt weiterhin neue Verbindungen mit einem oder mehreren Resten A, ausgewählt wird aus Säurechloridgruppen und Diazogruppen, und einem oder mehreren Resten B, ausgewählt wird aus Vinylsulfongruppen, N- Hydroxysuccinimidestergruppen und Maleimidgruppen, zur Verfügung.
Erfindungsgemäß wird der oben beschriebene Gegenstand zur Anbindung von Biomolekülen mit Amino- oder Thiogruppen verwendet. Diese Biomoleküle dienen als Rezeptoren für Analytmoleküle.
Die erfindungsgemäßen Gegenstände können als Mikrokavitäten oder in den verschiedensten analytischen Meßverfahren, wie z. B. Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), Quarzwaagen, oder interferometrischen Meßmethoden, z. B. Reflektionsinterferenzkontrastmikroskopie, eingesetzt werden. Besonders eignen sie sich zum Einsatz in der SPR. Der Aufbau der nicht funktionalisierten Oberfläche des erfindungsgemäßen Gegenstandes richtet sich nach dem analytischen Verfahren, in dem der erfindungsgemäße Gegenstand eingesetzt werden soll, und ist dem Fachmann bekannt (Journal of Biomedical Materials Research, 18 (953 - 959) (1984) und J. Chem. Soc, Chem. Commun., 1990, 1526).
Im Rahmen der Erfindung wird der Begriff "nicht funktionalisierte Oberfläche" verwendet, um die Oberfläche eines Gegenstandes mit der Hydrogelschicht vor der Anbindung der organischen Moleküle mit den Resten A und B zu bezeichnen.
Der Begriff "funktionalisierte Oberfläche" wird verwendet, um die Oberfläche eines Gegenstandes mit der Hydrogelschicht nach der Anbindung der organischen Moleküle mit den Resten A und B zu bezeichnen. Im Rahmen der Erfindung bedeutet "ungeladen", daß im pH-Bereich zwischen 4 und 11 , bevorzugt zwischen 5 und 9, weniger als 0,1% aller funktioneilen Gruppen am Hydrogel in einem geladenen Zustand vorliegen. Den Ladungszustand dieser Gruppen kann man über ihren pKa-Wert berechnen.
Der erfindungsgemäße Gegenstand besitzt eine Grundoberfläche umfassend z. B. eine Glas-, Metall- oder Kunststoffschicht. Bevorzugte Metallschichten sind Edelmetallschichten z. B. aus Gold oder Silber wie sie z. B. in der SPR Verwendung finden. Als Kunststoffschichten sind in den entsprechenden Anwendungen z. B. bei Mikrokavitäten, beispielsweise Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol und Makrolon® bekannt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es wesentlich, daß der nicht funktionalisierte Gegenstand eine Hydrogelschicht an der Oberfläche aufweist. Diese Schicht dient zur Verhinderung unspezifischer Adsorptionen, die das Meßsignal verfälschen. Hydrogele sind mit Wasser quellbare Polymere. Um die Anbindung der organischen Moleküle mit den Resten A zu ermöglichen, müssen die Hydrogele Hydroxygruppen aufweisen. Bei den Hydrogelen kann es sich z. B. um ein Polysaccharid, ein Derivat davon oder um ein quellbares organisches Polymer wie Poly{N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]-acrylsäureamid}, Polyvinyl- alkohol oder Polyethylenglykol mit endständigen Hydroxygruppen handeln. Bevorzugt sind Polysaccharide. Beispiele für Polysaccharide sind Amylose, Inulin, Pullulan oder Dextran. Bevorzugt sind Pullulan oder Dextran. Besonders bevorzugt ist Dextran.
Die Hydrogelschicht sollte mehrere Nanometer dick sein. Sie quillt im wäßrigen
Milieu zu einer Dicke von ca. 100 nm auf, wodurch die Oberfläche vollständig bedeckt wird. Die gequollene Polymerschicht ahmt die natürliche Umgebung von
Biomolekülen nach und ist geeignet, eine Denaturierung und somit Inaktivierung der Biomolekülen zu verhindern. Zusätzlich wird die Adsorption von anderen als den zu analysierenden Molekülen wirksam unterdrückt. Außerdem ist die gequollene Hydrogelschicht in der Lage, Unregelmäßigkeiten der Oberfläche auszugleichen: Die Anbindung der Linkermoleküle und damit auch der Biomoleküle findet auch in der gequollenen Matrix und nicht nur unmittelbar an der Oberfläche statt. Hierdurch verringert sich die Bedeutung von Oberflächenunebenheiten, die sonst zu einer schlecht definierten Oberfläche und dadurch zu schlecht quantifizierbaren Meßergebnissen beitragen.
Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen mit Hydrogelen sind bekannt und variieren in Abhängigkeit vom gewählten Gegenstand, z. B. Sensor oder Mikrokavität (J. of Biomedical Materials Research, 18, 953 (1984), DE- A 198 17 180). Beispielsweise wird eine entsprechend vorbereitete Oberfläche (Anmeldung DE-A 198 17 180, EP-B-0 589 867) zwischen 1 Stunde und 5 Stunden, typischerweise 3 Stunden, in eine entsprechende, frisch bereitete wäßrige Hydrogellösung, hergestellt aus Hydroxypolymer, gegeben. Die Konzentration des Hydroxypolymers in der Lösung liegt zwischen 10 und 500 mg-rnl"1.
An diese nicht funktionalisierte Hydrogelschicht werden difunktionelle organische Moleküle gebunden, die mindestens einen Rest A und mindestens einen Rest B aufweisen. Die Reste A und B werden so gewählt, daß bei der Anbindung des organischen Moleküls an das Hydrogel selektiv der Rest A mit dem Hydrogel reagiert. Da die Selektivität der Anbindung an ein Hydrogel sich nur schwer quantifizieren läßt wird im Rahmen dieser Erfindung der Grad der Selektivität über einen Modellversuch in Lösung ermittelt, wobei ein Alkohol als Modellverbindung für die Hydroxygruppen eines Hydrogels eingesetzt wird: 0,4 mol der zu untersuchenden organischen Verbindung werden mit 0,4 mol Isopropanol in trockenes Dichlormethan gegeben. Die Lösung wird 12 Stunden bei 25 °C gerührt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bei Unterdruck wird der Rückstand mit 500 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit 500 ml Wasser und 500 ml 0,1 N Natriumhydroxidlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und durch Verdampfen des Lösungsmittels konzentriert. Durch Η-NMR-Spektroskopie wird der jeweilige Anteil der Produkte bestimmt, die durch Reaktion des Restes A mit dem Alkohol entstanden sind, und die durch Reaktion des Restes B mit dem Alkohol entstanden sind. Dies wird durch Vergleich der Fläche unter geeignet ausgewählten Signalen der Produkte bestimmt. Im Rahmen der Erfindung bedeutet "selektiv", daß weniger als 5 % der organischen Moleküle über den Rest B mit dem Alkohol verbunden sind, bevorzugt sind weniger als 1 % der organischen Moleküle über den Rest B mit dem Alkohol verbunden. Unter "Anbindung" wird eine kovalente Reaktion zwischen dem Rest und dem Hydrogel verstanden.
Beispiele für den Rest A sind: Säurechloridgruppen -COCI und Diazogruppen
Θ ©_
CH— N=N Der Rest A reagiert mit den Hydroxygruppen des Hydrogels. Die Funktionalisierung der Hydrogelschicht mit den difunktionellen organischen
Molekülen muß so erfolgen, daß die Oberfläche des Gegenstandes ungeladen ist. Die Menge der mit den difunktionellen organischen Molekülen umgesetzten
Hydroxygruppen des Hydrogels beträgt bevorzugt zwischen 5 und 30%, besonders bevorzugt zwischen 8 und 15%.
Neben dem Rest A weisen die organischen Moleküle einen weiteren Rest B auf. Dieser Rest wird so gewählt, daß er einerseits unter den gewählten Reaktionsbedingungen bei der Anbindung der difunktionellen organischen Moleküle nicht reagiert und er andererseits, nach der Anbindung der difunktionellen organischen Moleküle an das Hydrogel, ohne Verwendung eines oder mehrerer Aktivierungsreagenzien mit einem Biomolekül mit Amino- oder Thiogruppen reagieren kann. Der Rest B soll so gewählt werden, daß er sofort ohne weitere Zwischenschritte mit einem Biomolekül mit Amino- oder Thiogruppen reagieren kann. Durch Auswahl der Reste A und B unter Beachtung der unterschiedlichen Reaktivität zu dem Hydrogel und zu dem Biomolekül mit Amino- oder Thiogruppen ist es somit möglich, ohne die Verwendung von Schutzgruppen für der Rest B zu arbeiten. Dies vereinfacht das Herstellungsverfahren des erfindungsgemäßen Gegenstandes und erspart zudem Kosten.
Als Rest B sind z. B. Vinylsulfongruppen (I), N-Hydroxysuccinimidestergruppen (II), Maleimidgruppen (IM), oder andere Aktivestergruppen geeignet. * gibt die Bindungsstelle zu dem restlichen organischen Molekül an. Besonders bevorzugt sind Vinylsulfongruppen, N-Hydroxysuccinimidestergruppen und Maleimidgruppen.
I O
Figure imgf000009_0001
Die Reste A und B in den difunktionellen organischen Molekülen können durch einen Rest X verbunden sein. Die Wahl des Restes X kann in weiten Bereichen variieren, wobei er weder mit dem Hydrogel noch mit dem Biomolekül mit Amino- 5 oder Thiogruppen reagieren soll, noch geladen sein soll. In den difunktionellen organischen Moleküle der Formel A-X-B ist der Rest X bevorzugt eine Einfachbindung oder eine verzweigte oder unverzweigte Kohlen Wasserstoff kette, die eine Kettenlänge von bis zu 15 Kohlenstoffatomen besitzt und die bis zu zweimal jeweils durch eine Phenylengruppe oder ein heteroatomenthaltende 0 Gruppe unterbrochen sein kann. Heteroatomenthaltende Gruppen sind z. B. -O-, -S-, -CONH- oder -COO-. Bei der Berechnung der Kettenlänge werden die Atome der heteroatomenthaltenden Gruppen bzw. die Kohlenstoffe der Phenylengruppen nicht mitgezählt. Die Kohlenwasserstoffkette weist bevorzugt eine Kettenlänge von bis zu 6 Kohlenstoffatomen auf. Die Kohlenwasserstoffkette ist 5 vorzugsweise unverzweigt und weist vorzugsweise keine Phenylengruppen oder heteroatomenthaltende Reste auf. Die Bedingungen für die Synthese geeigneter Moleküle sind stark vom Einzelfall abhängig. Synthesewege für ausgewählte organische Moleküle sind in den Beispielen angegeben.
Beispiele für organische Moleküle der Formel A-X-B sind:
Figure imgf000010_0001
In einer weiteren möglichen Ausführungsform sind die Reste A und B an ein Polymer bzw. Oligomer gebunden. Das Polymer bzw. Oligomer muß mindestens einen Rest A und mindestens einen Rest B aufweisen. Bevorzugt weist das Polymer bzw. Oligomer an mindestens jeder fünften Wiederholungseinheit Reste A und/oder B auf. Die Reste A und B können jeweils unabhängig voneinander entweder über einen Spacer (d. h. eine Kohlenwasserstoffkette, die ggf. durch heteroatomenthaltende Einheiten, wie Amid, Ether, Sulfid, unterbrochen sein kann) oder direkt an das Rückgrat des Polymers bzw. Oligomers gebunden sein. Die Reste können entweder terminal oder nicht terminal an das Polymer gebunden sein.
Das Polymer bzw. Oligomer kann aus Monomeren hergestellt werden, die sowohl einen Rest A als auch einen Rest B aufweisen. Es ist aber ebenfalls möglich, das Polymer bzw. Oligomer aus Monomeren zu synthetisieren, wobei mindestens ein Monomer einen Rest A aufweist, während mindestens ein zweites Monomer einen Rest B aufweist. Es ist weiterhin möglich, ein Polymer bzw. Oligomer zu synthetisieren und es anschließend mit den Resten A und B zu derivatisieren. Polymerisationsverfahren sind dem Fachmann bekannt (Bruno Volimert, Grundriß der Makromolekularen Chemie, Band 1, E. Vollmert-Verlag, Karlsruhe 1988).
Das Rückgrat des Polymers oder Oligomers kann in weiten Bereichen variieren, wobei es chemisch inert sein sollte, d. h. es sollte weder mit dem Hydrogel noch mit dem Biomolekül mit Amino- oder Thiogruppen reagieren, noch sollte er mit den Gruppen A und B reagieren. Weiterhin sollte es ungeladen sein. Geeignet sind z. B. Polyacrylsäureester, Polymethacrylsäureester, Polyacrylamide, Poly- vinylverbindungen, Polystyrolderivate oder Copolymere hiervon. Besonders geeignet sind Polyacrylsäureester oder Polyacrylamide. Geeignete Polymere sollten eine Molmasse zwischen 5000 und 20000 aufweisen und in aprotischen organischen Lösungsmitteln löslich sein.
Die Verwendung niedermolekularer Verbindungen als Linker hat den Vorteil, daß man mit einer einheitlichen, definierten Verbindung arbeiten kann, die vor ihrer Verwendung auch leicht analysiert werden kann. Polymere oder Oligomere hingegen bieten den Vorteil, mehrere reaktive Gruppen pro Molekül tragen zu können. Dies erleichtert die kovalente Anbindung an die Hydrogeloberfläche.
Die Reaktionsbedingungen zur Kopplung der difunktionellen, organischen Moleküle an die Hydrogelschicht variieren in Abhängigkeit von den gewählten Resten A und B und in Abhängigkeit davon, ob niedermolekulare Verbindungen vom Typ A-X-B oder polymere bzw. oligomere Verbindungen eingesetzt werden. Beispiele für diese Reaktionsbedingungen werden nachstehend beschrieben.
Der erfindungsgemäße Gegenstand weist eine ungeladene Oberfläche auf. Zur Anbindung von Biomolekülen an Gegenständen, wie Sensoroberflächen, werden im Stand der Technik, z. T. in einem getrennten Verfahrensschritt, Aktivierungsreagenzien, wie z. B. Ethyl-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) und N- Hydroxysuccinimid (NHS), benötigt. Diese Aktivierungsreagenzien müssen an funktionelle Gruppen der Oberfläche gebunden werden, um diese in eine reaktive Form zu überführen, wodurch dann erst eine kovalente Bindung von Biomolekülen an die Oberfläche möglich wird. Da dieser Schritt von dem Endanwender durchgeführt werden muß, ist ein großes Interesse vorhanden an Gegenständen, wie Sensoren, die diese Zwischenbehandlung nicht benötigen. Durch die
5 Verwendung von Aktivierungsreagenzien können die funktioneilen Gruppen am Hydrogel nicht quantitativ umgesetzt werden, so daß eine kovalente Bindung von Biomolekülen mit Amino- oder Thiogruppen nur an einem Teil der dafür vorgesehenen funktioneilen Gruppen erfolgt. Bisher war es nicht möglich, dem Anwender gebrauchsfertige Gegenstände mit einer ungeladenen, funktional-
. J isierten Oberfläche, die eine Hydrogelschicht umfassen, zur Verfügung zu stellen, die in einem Schritt, ohne die Verwendung von Schutzgruppen oder Aktivierungsreagenzien, hergestellt wurden. Es waren keine geeigneten Reagenzien der Struktur A-X-B bekannt, deren Gruppen A und B eine ausreichende Selektivität aufweisen und deren Gruppen A direkt mit Hydroxygruppen eines Hydrogels
15 reagieren können.
Die erfindungsgemäß verwendeten Biomoleküle weisen eine Aminogruppe, bevorzugt eine primäre oder sekundäre Aminogruppe, oder eine Thiogruppe auf.
Beispiele für geeignete Biomoleküle sind Proteine, endständig amino- Ό funktionalisierte Nucleotide oder Polynucleotide. Typischerweise weisen die
Biomoleküle die Funktion von Rezeptoren auf. Beispiele sind Antikörper (z. B.
IgGs) oder Antigene für bestimmte Antikörper, aber auch Substrate für Enzyme.
Besonders eignen sich die erfindungsgemäßen Gegenstände zur Detektion von
Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen über Verfahren, die auf Affinitätswechsel- 25 Wirkung basieren.
Die Bedingungen, bei der die kovalente Anbindung des Biomoleküls mit Amino- oder Thiogruppen an den Gegenstand erfolgt, variieren in Abhängigkeit von dem gewählten System. Typischerweise erfolgt die Anbindung bei Raumtemperatur
30 und in wässrigen Lösungen. Typische Reaktionsdauern betragen 10 Minuten bis 2 Stunden. Die organischen Moleküle werden in einer Konzentration von 10 μg-ml-1 bis zu 500 μg ml"1 verwendet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
5
BEISPIELE
.0 ALLGEMEINES:
Wasserfreie Lösungsmittel (Fa. SDS) auf Molekularsieben (3 - 4 Ä) wurden so verwendet wie erhalten. Säulenchromatographie (Fa. CC): Silicagel 60 (0,040 - 0,063 mm) der Fa. Merck oder Silicagel der Fa. SDS. Analytische und
15 Dünnschichtchromatographie (DC): Silicagelplatten der Fa. Merck; Erfassung durch UV (254 nm), l2, 5% H2S04 oder [Mo04(NH4)2 (2,5 g), (NH4)2Ce(N03)6 (1 ,2 g), H2S04 (100 ml, 3,6 M)]. Schmelzpunkt (Smp): Büchi 510. 1H-NMR und 13C- NMR Spektren: AM-250 Bruker; chemische Verschiebungen in ppm bezogen auf protoniertes Lösungsmittel als internen Referenzwert (1H: CHCI3 in CDCI3, 7,27
"0 ppm; CHD2SOCD3 in CD3SOCD3, 2,49 ppm. 13C: 13CDCI3 in CDCI3, 76,9 ppm, 13CD3SOCD3 in CD3SOCD3, 39,6 ppm); Kopplungskonstanten J in Hz. Die massenspektrometrischen Untersuchungen wurde im Service de Spectrometrie de masse de l'ENS durchgeführt. Die Mikroanalysen wurden durchgeführt vom Service de Microanalyses de l'Universite Pierre et Marie Curie, Paris.
25 BEISPIEL 1: Herstellung von Succinimidyldiazoessigester über Glyoxylsäure p-Toluolsulfonylhydrazon
Glyoxylsäure p-Toluolsulfonylhydrazon 1
HOOC— + H2N-NH— SOs — V— CH3
OH \=/
»► HCXX:-CH=N— NH— SOz — P Γ — CH3
1
Eine Lösung von 80% Glyoxylsäure (15,1 g, 0,164 mol) in Wasser (162 ml) wird in einen Rundkolben gegeben und im Wasserbad auf 60 °C erwärmt. Dann wird eine warme (60 °C) Lösung von p-Toluolsulfonylhydrazid (30,37 g, 0,163 mol) in wäßriger 2,5 M Salzsäure (82 ml) hinzugefügt. Die entstandene Mischung wird im Wasserbad (60 °C) unter ständigem Rühren erhitzt. Es bilden sich sofort Öl- tropfen. Das anfangs als Öl abgeschiedene Hydrazon verfestigt sich nach ca. 10 Minuten. Die Reaktionsmischung wird langsam auf Raumtemperatur abgekühlt und dann bei 4 °C 6 Stunden stehengelassen. Das rohe p-Toluolsulfonylhydrazon wird filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Hochvakuum einen Tag getrocknet. Die Verbindung ist dann auskristallisiert. Sie wird in kochendem Ethylacetat (130 ml) aufgelöst und welches dann mit Tetrachlorkohlenstoff (260 ml) verdünnt wird. Nach einer Nacht bei 4 °C wird aus der Suspension das reine p-Toluolsulfonylhydrazon 1 als weißer Feststoff herausgefiltert.
Ausbeute: 33,2 g, 84%
Smp: 150 °C.
1H-NMR (DMSO, 250 MHz): δ (ppm): 2,21 (s, 3H, CH3); 7,02 (s, 1 H, NH); 7,27,
7,55 (2d, 4H, J8.2 Hz, H-ar); 12,12 (s, 1 H, =CH). Succinimidyldiazoessigester 2
HOOC— CH=N— NH
Figure imgf000015_0001
Eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 ,7 g, 8,264 mmol) in Dioxan (16 ml) wird tropfenweise zu einer Lösung von Λ/-hydroxysuccinimid (0,951 g, 8,264 mmol) und Glyoxylsäuretosylhydrazon 1 (2 g, 8,264 mmol) in kaltem (0 °C) Dioxan (83 ml) hinzugefügt. Die Mischung wird auf Raumtemperatur gebracht und bei Raumtemperatur 4h gerührt. Die entstandene Suspension wird filtriert. Das Filtrat wird bei Unterdruck konzentriert und das Rohprodukt anschließend chromatographisch auf Silicagel mit Dichlormethan als Elutionsmittei gereinigt. Durch anschließende Kristallisation der Verbindung aus CH2CI2/Hexan, Auflösung in einer geringen Menge von kochendem CH2CI2 und Hinzufügen von Hexan gewinnt man Succinimidyldiazoessigester 2 als weißen Feststoff.
Ausbeute: 0,759 g, 39% Smp: 118 °C. 1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ(ppm): 2,85 (s, 4H, 2 CH2 Succinimid); 5,12 (s breit,
1H, CH-). 3C-NMR (CDCI3, 62,90 MHz): δ (ppm): 25,40 (CH2-Succinimid); 45,03 (CH2-Succinimid); 162,00 (CO-Diazoacetyl); 169,30 (CO-Succinimid).
BEISPIEL 2: Herstellung von Succinimidyldiazoessigester über Glyoxyl- säurechlorid-p-toluolsulfonylhydrazon
Glyoxylsäurechlorid-p-toluolsulfonylhydrazon 3
Figure imgf000016_0001
3
Thionylchlorid (7,2 ml) wird zu einer Suspension von Glyoxylsäure-p- Toluolsulfonylhydrazon 1 (12 g, 49,54 mmol) in trockenem Benzol (60 ml) hinzugefügt. Die Mischung wird in Stickstoffatmosphäre 5 Minuten gerührt und dann unter Rückfluß erhitzt, bis die starke Gasentwicklung (HCI, S02) beendet ist und sich der größte Teil des suspendierten Feststoffs aufgelöst hat. Nach 60 bis 90 Minuten färbt sich die anfangs weiße Suspension gelb. Die Mischung wird dann sofort abgekühlt und über Celite* filtriert. Nach Konzentration des Filtrats bei Unterdruck wird der verbleibende Feststoff in einer geringen Menge kochendem wasserfreien Benzol aufgelöst. Petrolether (30 - 60 °C) wird zur heißen Lösung hinzugefügt. Die Kristallisation setzt mit der Abkühlung ein. Nach 1 Stunde wird das Hydrazon 3 durch Filtrieren gewonnen.
Ausbeute: 9,8 g, 76% Smp: 100 - 110 °C.
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 2,30 (s, 3H, CH3); 7,20 (s, 1 H, NH); 7,39, 7,67 (2d, 4H, 8.25 Hz, H-ar), 12,36 (s, 1 H, =CH).
Figure imgf000016_0002
Succinimidyldiazoessigester 2
Eine Lösung von Glyoxylsäurechlorid-p-toluolsulfonylhydrazon 3 (9,8 g, 37,63 5 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (95 ml) wird im Laufe von 45 Minuten zu einer gerührten und auf 0 °C gehaltenen Suspension von Λ/-Hydroxysuccinimid (6 g, 52,17 mmol) und trockenem Na2C03 (7,54 g, 71,16 mmol) in trockenem Dichlormethan (72 ml) hinzugefügt. Nach dem Hinzufügen wird die entstandene Suspension auf Raumtemperatur gebracht und bei Raumtemperatur 3 Stunden .0 gerührt. Die Reaktionsmischung wird erst durch einen Sandfilter und dann durch Celite* filtriert. Das Filtrat wird bei Unterdruck konzentriert. Durch anschließende Rekristallisation der Rohverbindung aus Dichlormethan/Hexan, Auflösung in einer geringen Menge kochendem Dichlormethan und Hinzufügen von Hexan gewinnt man Succinimidyldiazoessigester 2 (Ausbeute: 3,44 g, 50%).
15
BEISPIEL 3: Reaktivität von Succinimidyldiazoessigester
1. Sequentielle Reaktivität auf primäre Alkohole sowie primäre Amine
"0 a) Reaktion mit Alkohol
Figure imgf000017_0001
Absoluter Ethylalkohol (5 ml) wird zu einer Lösung von Succinimidyldiazo- 5 essigester 2 (400 mg, 2,186 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (4 ml) bei
Raumtemperatur hinzugefügt. Die Lösung wird mit Stickstoff durchgespült, danach wird Bortrifluoridetherat (83 μl) langsam hinzugefügt. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 3,5 Stunden gerührt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bei Unterdruck wird der Rückstand mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser und einer 1 %-igen Natriumhydroxidlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend konzentriert. Der Ether-NHS- Ester 4 wird im Hochvakuum eine Nacht getrocknet. Eine Reaktion zwischen Alkohol und der difunktionellen organischen Verbindung wird in keinem der Beispiele beobachtet.
Ausbeute: 307 mg, 70%
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 4,42 (s, 2H, CO-CH -O); 3,67 (q, 2H, J l Hz, O-CH2-CH3); 2,87 (s, 4H, CH2-Succinimid); 1 ,27 (t, 3H, OCH2-CH3). 13C-NMR (CDCI3, 62,90 MHz): δ (ppm): 14,91 (CH3), 25,60 (2 CH2-Succinimid), 65,87 (0-CH2-CH3), 67,87 (CO-CH2-0), 166,06 (COO), 168,79 (2 CO- Succinimid).
MS (CI/NH3) m/z 219 (M+18). HRMS (CI.OU) (M+1): m/z: berechnet für C8H12N05: 202,0715. Festgestellt 202,0707.
b) Reaktion mit Aminen
Figure imgf000018_0001
π-Butylamin (42 μl, 0,428 mmol) wird zu einer Lösung des Alkoholkonjugats 4 (43 mg, 0,214 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (1 ,5 ml) unter Stickstoff- atmosphäre hinzugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bei Unterdruck wird der Rückstand mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird zweimal mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die entstandene Verbindung 5 wird im Hochvakuum 2 Minuten getrocknet. Wegen seiner Flüchtigkeit läßt sich nach dem Isolieren keine genaue Ausbeute angeben.
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 0,87 (t, 3H, J3Λ 7,24 Hz, CH3 4); 1 ,19 (t, 3H, Ja.b 7,03 Hz, CH3 b); 1 ,53 - 1 ,12 (m, 4H, CH2 2 and CH2 3); 3,23 (dd, 2H, Jι,2a 6,76 Hz, J1p2b 13,23 Hz, CH2 1); 3,49 (q, 2H, Ja>b 7,01 Hz, CH2 a); 3,85 (s, 2H, CO-CHs- 0); 6,5 (s, 1H, NH). 13C-NMR (CDCI3, 62,90 MHz): δ (ppm): 13,74 (CH3 4), 15,06 (CH3 b), 20,09 (CH2 3), 31 ,70 (CH2 2), 38,56 (CH2 1-NH), 67,11 (0-CH2 a), 69,98 (O-CHz-CO), 170,00 (CONH).
MS (CI/NH3) m/z 160 (M+1), 177 (M+18). HRMS (CI,CH4) (M+1): m/z: berechnet für C8H18N02: 160,1338. Festgestellt 160,1348.
2. Sequentielle Reaktivität auf sekundäre Alkohole sowie sekundäre Amine
a) Reaktion mit Alkohol
Figure imgf000019_0001
Absoluter Isopropylalkohol (1 ,5 ml) und Bortrifluoridetherat (50 μl) werden nacheinander unter Stickstoffatmosphäre zu einer Lösung von Succinimidyldiazoessigester 2 (130 mg, 0,71 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (1 ,5 ml) hinzugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt und dann unter Rückfluß 1 ,5 Stunden erwärmt (40 °C). Nach Verdampfen des Lösungsmittels bei Unterdruck wird der Rückstand mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser und einer Natriumhydroxidlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und schließlich konzentriert. Die getrocknete Verbindung wird in kochendem Dichlormethan aufgelöst. Nach anschließender Verdünnung mit Hexan gewinnt man das kristalline Alkoholkonjugat 6.
Ausbeute: 107 mg, 70%
Smp: 49,5 - 49,8 °C.
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 1 ,23 (d, 6H, J 6,11 Hz, 2 CH3iso); 2,86 (s,
4H, 2 CH2-Succinimid); 3,76 (m, 1 H, CH-iso); 4,43 (s, 2H, CO-CH2-0). 13C-NMR (CDCI3, 62,90 MHz): δ (ppm): 21 ,72 (2 CH3iso), 25,60 (2 CH2- Succinimid), 63,60 (CH-iso), 73,57 (CO-CHP-O). 166,48 (COO), 168,83 (2 CO- Succinimid).
MS (CI/NH3) m/z 233 (M+18). Analyse: berechnet C9H1305N: C, 50,23; H, 6,088; N, 6,508. Festgestellt: C, 50,20; H, 6,21 ; N, 6,53.
Figure imgf000020_0001
b) Reaktion mit Diethylamin
Diethylamin (42 μl, 0,404 mmol) wird zu einer Lösung des Alkohoikonjugats 6 (43,4 mg, 0,202 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (1 ,5 ml) unter Stickstoffatmosphäre hinzugefügt. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bei Unterdruck wird der Rückstand mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das entstandene Konjugat 7 wird im Hochvakuum 2 Minuten getrocknet. Diese flüssige Verbindung läßt sich leicht destillieren; eine genaue Ausbeute kann nicht angegeben werden.
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 1,06 (t, 3H, J 7,13 Hz, CH3amin); 1 ,10 (t, 3H, J7,5 Hz, CH3amin); 1 ,13 (d, 6H, 6,13 Hz, 2 CH3iso); 3,28 (q, 2H, CH2amin);
3,31 (q, 2H, CH2amin); 3,63 (m, 1H, CH-iso); 4,05 (s, 2H, CO-CH2-O).
13C-NMR (CDCI3, 62,90 MHz): δ (ppm): 12,85, 14,27 (2 CH3amin), 21 ,91 (2
CH3iso), 40,05, 41 ,34 (2 CH2amin), 68,01 (CH-iso), 72,33 (CO-CHjj-O), 168,98
(CON). MS (CI/NH3) m/z 174 (M+1). HRMS (CI,CH4) (M+1): m/z: berechnet für
C9H20NO2: 174,1494. Festgestellt 174,1476.
c) Reaktion mit Dioctadecylamin
Figure imgf000021_0001
Eine Lösung von Alkoholkonjugat 6 (59,4 mg, 0,277 mmol) und Dioctadecylamin (144 mg, 0,277 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (2 ml) wird unter Stickstoffatmosphäre bei 50 °C 3 Stunden gerührt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bei Unterdruck wird der Rückstand mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen. Anschließend wird das Lösungsmittel verdampft. Das entstandene Konjugat 8 wird im Hochvakuum 3 Stunden getrocknet.
Ausbeute: 150 mg, 87% 1H-NMR (CDCI3) 250 MHz): δ (ppm): 0,89 (t, 6H, 6.89 Hz, 2 CH3amin); 1 ,20 (d, 6H, J 6.11 Hz, 2 CH3iso); 1 ,26 (s, 60H, 30 CH2); 1 ,53 (m, 4H, 2 CH2 b); 3,26 (m, 4H, 2 CH2 a); 3,69 (m, 1H, CH-iso); 4,11 (s, 2H, CO-CHz-O). 13C-NMR (CDCI3, 62,90 MHz): δ (ppm): 14,12 (2 CH3amin), 21 ,91 (2 CH3iso), 22,72, 26,95, 27,10, 27,56, 29,00, 29,39, 29,46, 29,62, 29,70, 29,73, 31 ,96 (32 CH2), 45,77, 47,20 (2 CH2 a), 67,86 (CH-iso), 72,18 (CO-CHT-O), 169,22 (CO). MS (CI/NH3) m/z 622 (M+1). HRMS (CI,CH4) (M+1): m/z: berechnet für C41H84N02: 622,6502. Festgestellt 622,6490.
BEISPIEL 4: Herstellung von 4-Vinylsulfonylbenzoylchlorid
1 -(2-Chlorethansulfonyl)-4-methylbenzol 9
Figure imgf000022_0001
9
1-Brom-2-chlorethan (11 ml, 0,132 mol) wird zu einer Lösung des Natriumsalzes der Toluol-4-sulfinsäure (19,623 g, 0,11 mol) in trockenem Dimethylformamid (180 ml) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur 2 Tage gerührt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bei Unterdruck wird der rohe Rückstand mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Durch anschließende Rekristallisation des Rückstands in kochendem 80%igem Ethanol gewinnt man 1-(2-Chlorethansulfonyl)-4-methylbenzol 9 als weiße Kristalle.
Ausbeute: 18,58 g, 77% Smp: 78 °C. 1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 2,48 (s, 6H, CH3); 3,52 (t, 2H, J 7,5 Hz, CH2S02); 3,74 (t, 2H, CH2CI); 7,40, 7,80 (2d, 4H, J8.30 Hz, H-ar).
4-(2-Chlorethansulfonyl)benzoesäure 10
Figure imgf000023_0001
9 10
Chromtrioxid (14 g) und konzentrierte Schwefelsäure (9,6 ml) werden nacheinander zu einer Lösung von 1-(2-Chlorethansulfonyl)-4-methylbenzol 9 (7,687 g, 35,15 mmol) in Essigsäure (115 ml) hinzugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt und dann in Eiswasser gegossen. Aus dem weißen Niederschlag wird durch Filtrieren, Waschen und Rekristallisation 4-(2- Chlorethansulfonyl)benzoesäure 10 gewonnen.
Ausbeute: 7,16 g, 82% Smp: 220 CC.
1H-NMR (DMSO, 250 MHz): δ (ppm): 3,97 (t, 2H, 6,5 Hz, CH2S02); 4,12 (t, 2H, CH2CI); 8,23, 8,34 (2d, 4H, J8.30 Hz, H-ar), 13,66 (s breit, 1H, OH).
4-Vinylsulfonylbenzoesäure 11
Figure imgf000023_0002
11
10 Triethylamin (8,03 ml, 57,6 mmol) wird zu einer Lösung von 4-(2- Chlorethansulfonyl)benzoesäure 10 (7,16 g, 28,8 mmol) in Chloroform (144 ml) hinzugefügt. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bei Unterdruck wird der Rückstand in Wasser 5 aufgelöst und filtriert, um die unlöslichen Teile abzuscheiden. Zu dem Filtrat wird konzentrierte Salzsäure hinzugefügt. Aus dem Niederschlag wird durch Rekristallisation in Wasser, anschließendes Filtrieren und Trocknen im Hochvakuum die 4-Vinylsulfonylbenzoesäure 11 gewonnen.
.0 Ausbeute: 5 , 10 g , 84%
Smp: 228 °C.
1H-NMR (DMSO, 250 MHz): δ (ppm): 6,26 (d, 1 H, J a.c 9,92 Hz, CHa=); 6,38 (d,
1 H, JbιC 16,48 Hz, CHb=); 7,15 (dd, 1H, CHc=); 7,96, 8,14 (2d, 4H, J 8.50 Hz, H- ar); 13,56 (s, 1 H, OH). 5 13C-NMR (DMSO, 62,90 MHz): δ (ppm): 128,02, 130,69 (4 CH-ar), 130,20, 138,25
(CH=, CH2=), 135,73, 143,39 (2 Cq-ar), 166,32 (CO).
4-Vinylsulfonylbenzoylchlorid 12
"0
Figure imgf000024_0001
11 12
Eine katalytische Menge trockenes Dimethylformamid (38 μl, 0,488 mmol) wird unter Stickstoffatmosphäre zu einer Lösung von 4-Vinylsulfonylbenzoesäure 11 (230 mg, 1 ,084 mmol) in Thionylchlorid (4,6 ml) hinzugefügt. Die Mischung wird 5 unter Rückfluß 3 Stunden erhitzt (85 °C). Die Lösung wird zur Trockene eingedampft, dann jeweils zweimal mit trockenem Toluol aufgenommen und bei Unterdruck zur Trockene eingedampft und schließlich 2 Stunden im Hochvakuum getrocknet.
H-NMR (DMSO, 250 Mhz): δ (ppm): 6,30 (d, 1H, Ja>c 9,85 Hz, CHa=); 6,42 (d, 1H, b,c 16,47 Hz, CHb=); 7,2 (dd, 1H, CHc=); 8,00, 8,18 (2d, 4H, J 8,54 Hz, H- ar).
BEISPIEL 5: Reaktivtät von 4-Vinylsulfonylbenzoylchlorid
1. Sequentielle Reaktivität auf primäre Alkohole sowie primäre Amine
a) Reaktion mit Alkohol:
Figure imgf000025_0001
Absoluter Ethylalkohol (76 μl, 1 ,3 mmol) und Λ/,Λ/-Diisopropylethylamin (170 μl, 0,976 mmol) werden nacheinander zu einer Lösung von 4-Vinylsulfonylbenzoyl- chlorid 12 in wasserfreiem Dichlormethan (4 ml) hinzugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bei Unterdruck wird der Rückstand mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und schließlich zur Trockene eingedampft. Nach Reinigen des Rückstands durch Säulenchromatographie auf Silicagel mit Dichlormethan als Elutionsmittei gewinnt man das analytisch reine Alkoholkonjugat 13.
Ausbeute: 206 mg, 79% Smp: 39 - 40 °C. 1H-NMR (DMSO, 250 MHz): δ (ppm): 1 ,51 (t, 3H, 7.14 Hz, CH3 ß); 4,53 (q, 2H, CH2«); 6,48 (d, 1 H, a,c 9,85 Hz, CHa=); 6,59 (d, 1 H, b.c16,46 Hz, CHb=); 7,37 (dd, 1H, CHc=); 8,2, 8,36 (2d, 4H, 8.43 Hz, H-ar).
13C-NMR (DMSO, 62,90 MHz): δ (ppm): 14,51 (CH3), 61 ,98 (CH2α), 128,33, 130,73 (4 CH-ar), 130,52 (=CH2), 134,85 (Cq-ar), 138,40 (=CHc), 143,90 (Cq-ar), 164,96 (COO), MS (CI/NH3) m/z 258 (M+18).
Analyse: berechnet CnH1204S: C, 54,98; H, 5,033. Festgestellt: C, 55,43; H, 4,96.
b) Reaktion mit n-Butylamin:
Figure imgf000026_0001
Das Alkoholkonjugat 13 (64,6 mg, 0,269 mmol) und n-Butylamin (133 μl, 1 ,345 mmol) werden in absolutem Ethanol (2 ml) 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Verdampfen des Lösungsmittels und des überschüssigen n-
Butylamin gewinnt man das Alkoholaminkonjugat 14, das für die Mikroanalyse durch Säulenchromatographie auf Silicagel mit Dichlormethan/Methanol: 20/1 als
Elutionsmittei gereinigt wird.
Ausbeute: 75,8 mg, 90%
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 0,9 (t, 3H, J6ι5 7,1 Hz, CH3 6); 1 ,22 - 1 ,49 (m,
4H, CH2 4+CH2 5); 1 ,42 (t, 3H, Ja,b 7,14 Hz, CH3 b); 2,56 (t, 2H, J3l4 7,07 Hz, CH2 3); 3,03 (t, 2H, J ι,2 6,42 Hz, CH2 2); 3,33 (t, 2H, CH2 1); 4,435 (q, 2H, 0-CH2 a); 7,21 (m, 1 H, NH); 8,00, 8,23 (2d, 4H, J 8,45 Hz, H-ar). 13C-NMR (CDCI3, 62,90 MHz): δ (ppm): 13,918, 14,259 (2 CH3), 20,326 (CH2 5),
31 ,982 (CH2 4), 43,064 (CH2 1), 49,270 (CH2 2), 61 ,850 (<3-CH2 a), 128,078 (2 CH- ar), 130,426 (2 CH-ar), 135,335 (Cq-ar), 143,138 (Cq-ar), 164,964 (COO). MS (CI/NH3) m/z 314 (M+1). Analyse: berechnet Cι5H2304NS: C, 57,48; H, 7,396; N, 4,469. Festgestellt: C, 57,53; H, 7,41 ; N 4,31.
c) Reaktion mit tert-Butylamin:
Figure imgf000027_0001
Das Alkoholkonjugat 13 (54,7 mg, 0,228 mmol) und tert-Butylamin (120 μl, 1 ,139 mmol) werden in absolutem Ethanol (4 ml) 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Verdampfen des Lösungsmittels und des überschüssigen tert- Butylamin gewinnt man das Konjugat 15, das für die Mikroanalyse durch Säulenchromatographie auf Silicagel mit Dichlormethan/Methanol: 20/1 als Elutionsmittei gereinigt wird.
Ausbeute: 64,1 mg, 90%
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 1 ,07 (s, 9H, (CH3)3); 1 ,43 (t, 3H, 7.13 Hz, CHz-Chb); 2,98 (t, 2H, J 6,42 Hz,CH2-S02); 3,31 (t, 2H, CHz-NH); 4,43 (q, 2H,
OCH2); 7,22 (m, 1H, NH); 8,00, 8,23 (2d, 4H, 8.39 Hz, H-ar).
13C-NMR (CDCI3, 62,90 MHz): δ (ppm): 14,25 (CHg-CHa), 28,81 ((CH3)3), 36,38
(CH2-S02), 50,75 (Cq-aliphatisch), 57,27 (CH∑-NH), 61 ,85 (0-CH2), 128,09 (2
CH-ar), 130,38 (2 CH-ar), 135,30 (Cq-ar), 143,25 (Cq-ar), 164,98 (COO). MS (CI/NH3) m/z 314 (M+ ).
Analyse: berechnet Cι5H2304NS: C, 57,48; H, 7,396; N, 4,469. Festgestellt: C,
57,55; H, 7,44; N, 4,39. 2. Sequentielle Reaktivität auf sekundäre Alkohole sowie sekundäre Amine
a) Reaktion mit Alkohol:
Figure imgf000028_0001
12 16
Absoluter Isopropylalkohol (202 μl, 2,638 mmol) und Λ,Λ/-Diisopropylethylamin (206,8 μl, 1 ,187 mmol) werden nacheinander zu einer Lösung von 4- Vinylsulfonylbenzoylchlorid 12 (304,3 mg, 1 ,319 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (3 ml) hinzugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Um die Reaktion zu Ende zu führen, wird der Lösung eine katalytische Menge Dimethylaminopyridin zugesetzt. Nach einer Stunde wird das Lösungsmittel bei Unterdruck verdampft und dann der Rückstand mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und schließlich zur Trockene eingedampft. Nach Reinigen des Rückstands durch Säulenchromatographie auf Silicagel mit Dichlormethan als Elutionsmittei gewinnt man das reine Alkoholkonjugat 16.
Ausbeute: 247 mg, 74%
Smp: 57 - 58 °C. 1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 1 ,38, 1 ,41 (2s, 6H, 2 CH3iso); 5,28 (m, 1 H,
CH-iso); 6,11 (d, 1 H, Ja, c 9,44 Hz, CHa=); 6,51 (d, 1 H, kι C 16,5 Hz, CHb=); 6,68
(dd, 1H, CHc=); 7,97, 8,20 (2d, 4H, J8.70 Hz, H-ar).
13C-NMR (CDCI3( 62,90 MHz): δ (ppm): 21 ,67 (2 CH3iso), 69,54 (CH-iso), 127,91
(2 CH-ar), 128,84 (CH2=), 130,43 (2 CH-ar), 135,60 (Cq-ar), 136,05 (CHc=), 143,30 (Cq-ar), 164,47 (COO).
MS (CI/NH3) m/z 272 (M+18). Analyse: berechnet Cι2H1 04S: C, 56,67; H, 5,549. Festgestellt: C, 56,65; H, 5,55.
b) Reaktion mit Amin:
Figure imgf000029_0001
Das Alkoholkonjugat 16 (72,6 mg, 0,286 mmol) und Diethylamin (148 μl, 1 ,431 mmol) werden in absolutem Ethanol (2,5 ml) 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Verdampfen des Lösungsmittels und des überschüssigen Diethylamin gewinnt man das Alkohol-Amin-Konjugat 17, das für die Mikroanalyse durch Säulenchromatographie auf Silicagel mit Dichlormethan/Methanol 30/1 als Elutionsmittei gereinigt wird.
Ausbeute: 84 mg, 90%)
1H-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 0,92 (t, 6H, Ja>c = < >,ä 7,12 Hz, CH3 b); 1 ,40,
1 ,42 (2s, 6H, CH3iso); 2,42 (q, 4H, CH2 a); 2,90 (m, 2H, CH2S02); 3,28 (m, 2H,
CHr-N); 5,29 (m, 1 H, CH-iso); 7,99, 8,22 (2d, 4H, J 8.64 Hz, H-ar).
13C-NMR (CDCI3, 62,90 MHz): δ (ppm): 11 ,73 (2 CH3amin), 21 ,68 (2 CH3iso), 45,86 (CHJΪ-SOJ.), 46,75 (2 CH2amin), 53,35 (CH2N), 69,56 (CH-iso), 128,01 (2
CH-ar), 130,26 (2 CH-ar), 135,57 (Cq-ar), 143,34 (Cq-ar), 164,51 (COO).
MS (CI/NH3) m/z 328 (M+1).
Analyse: berechnet C16H2504NS: C, 58,69; H, 7,695; N, 4,277. Festgestellt: C,
58,69; H, 7,70; N 4,28. . Sequentielle Reaktivität auf primäre Alkohole sowie primäre Thiole
Figure imgf000030_0001
Das erhaltene Alkoholkonjugat 13 (104 mg, 0,434 mmol) und 1 -Dodecanthiol (104 μl, 0,434 mmol) werden bei Raumtemperatur in absolutes Ethanol gegossen (4 ml), und Triethylamin (18 μl, 0,130 mmol) wird hinzugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Das Alkohol-Thiol-Konjugat kristallisiert bei seiner Bildung im Ethanol aus. Aus der kristallinen Verbindung gewinnt man durch Filtrieren, Waschen mit wenig Ethanol und anschließendes Trocknen im Hochvakuum das Alkohol-Thiol-Konjugat 18.
Ausbeute: 165 mg, 86%
Smp: 78 - 79 °C.
^-NMR (CDCI3, 250 MHz): δ (ppm): 0,88 (t, 3H, 13,14 7 Hz, CH3 14); 1 ,26 (s, 18H, (CH2)9); 1 ,42 (t, 3H, Ja,b 7,09 Hz, CH3 b); 1 ,5 (m, 2H, CH2); 2,48 (t, 2H, J 7,24 Hz,
CH2 3-S); 2,8 (m, 2H, CH2 2-S); 3,34 (m, 2H, CH2 1-S02); 4,44 (q, 2H, CH2 a); 7,99
(d, 2H, 8,3 Hz, H-ar); 8,24 (d, 2H, H-ar).
13C-NMR (CDCI3, 62,90 MHz): δ (ppm): 14,12, 14,26 (2 CH3), 22,70, 24,26, 28,75,
29,15, 29,34, 29,49, 29,57, 29,63 (10 CH2), 31 ,92, 32,34 (2 CH≥-S), 56,41 (CH2 1- S02), 61 ,90 (CH2 a), 128,22 (2 CH-ar), 130,52 (2 CH-ar), 135,53 (Cq-ar), 142,50
(Cq-ar), 164,91 (COO).
MS (CI/NH3) m/z 460 (M+18).
Analyse: berechnet C23H38θ4S2: C, 62,40; H, 8,652. Festgestellt: C, 62,36; H,
8,61. BEISPIEL 6: Herstellen eines SPR-Sensors
Eine mit einem Hydrogel funktionalisierte Goldoberfläche eines SPR-Biosensors wird in einer Lösung von 2-Diazoessigsäure-N-hydroxysuccinimidester in trockenem Dichlormethan (5 Gew.-%) unter Inertgasatmosphäre 3 h inkubiert. Anschließend wird nacheinander jeweils einmal mit trockenem Dichlormethan, Isopropanol und Reinstwasser gespült. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom ist die erfindungsgemäße Oberfläche einsatzbereit.
BEISPIEL 7: Anbinden von Succinimidyldiazoessigester an einen funktionalisierten SPR-Sensor und anschließende kovalente Bindung eines Rezeptors
Ein mit Hydrogel funktionalisierter SPR-Sensor wird unter Inertgas bei Raumtemperatur für drei Stunden in eine Lösung von Succinimidyldiazoessigester in trockenem Dichlormethan (5 Gew.-%) getaucht. Nach Spülen mit Dichlormethan, Isopropanol und Wasser wird der Sensor bei Raumtemperatur mit einer wässrigen Lösung von Protein A in Wasser (150 μg*mf1) inkubiert. Anschließend wird mit viel Wasser gespült. Der Erfolg der Bindung wird durch Oberflächenplasmonenresonanz überprüft. Figur 1 zeigt ein Vergleich der Oberflächenplasmonenresonanzsignale eines Hydrogels vor und nach Bindung von Protein A über Succinimidyldiazoessigester.

Claims

Patentansprüche
1. Gegenstand mit einer ungeladenen, funktionalisierten Oberfläche umfassend ein Hydrogel, das Hydroxygruppen aufweist, an das über die
Reste A organische Moleküle gebunden sind, wobei die eingesetzten organischen Moleküle einen oder mehrere Reste A, die mit Hydroxygruppen reagieren können, und einen oder mehrere Reste B, die mit Aminogruppen oder Thiogruppen reagieren können, aufweisen und wobei bei der Umsetzung mit Hydroxygruppen selektiv der Rest A bzw. die Reste A reagieren.
2. Gegenstand nach Anspruch 1 , wobei die Reste A aus Säurechloridgruppen und Diazogruppen ausgewählt sind.
3. Gegenstand nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Reste B aus Vinylsulfongruppen, N-Hydroxysuccinimidestergruppen und Maleimidgruppen ausgewählt sind.
4. Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Reste A und B durch eine Einfachbindung oder durch eine verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette X verbunden sind und wobei die Kohlenwasserstoffkette X eine Kettenlänge von bis zu 15 Kohlenstoffatomen besitzt und bis zu zweimal jeweils durch eine Phenylengruppe oder eine heteroatoment- haltende Gruppe unterbrochen sein kann.
5. Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Reste A und B an ein Polymer oder Oligomer gebunden sind.
6. Verfahren zur Herstellung eines Gegenstandes mit einer ungeladenen, funktionalisierten Oberfläche, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Gegenstandes mit einer nicht funktionalisierten Hydrogeloberfläche, wobei das Hydrogel Hydroxygruppen aufweist;
(b) Kovalentes Anbinden an das Hydrogel von organischen Molekülen, die einen oder mehrere Reste A, die mit Hydroxygruppen reagieren können, und einen oder mehrere Reste B, die mit Aminogruppen oder
Thiogruppen reagieren können, aufweisen, wobei die organischen Moleküle selektiv über den Rest A bzw. die Reste A mit Hydroxygruppen des Hydrogels reagieren.
7. Verbindung mit einem oder mehreren Resten A, ausgewählt wird aus Säurechloridgruppen und Diazogruppen, und einem oder mehreren Resten B, ausgewählt wird aus Vinylsulfongruppen, N-Hydroxysuccinimidester- gruppen und Maleimidgruppen.
8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei die Reste A und B durch eine Einfachbindung oder durch eine verzweigte oder unverzweigte Kohlen Wasserstoff - kette X verbunden sind und wobei die Kohlenwasserstoffkette X eine Kettenlänge von bis zu 15 Kohlenstoffatomen besitzt und bis zu zweimal jeweils durch eine Phenylengruppe oder eine heteroatomenthaltende Gruppe unterbrochen sein kann.
9. Verbindung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die Reste A und B an ein Polymer oder Oligomer gebunden sind.
0. Verwendung eines Gegenstandes nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zum Umsetzen mit einem Biomolekül mit mindestens einer Aminogruppe oder Thiogruppe.
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