WO2002095385A1

WO2002095385A1 - Biocapteur

Info

Publication number: WO2002095385A1
Application number: PCT/JP2002/004826
Authority: WO
Inventors: Miwa Hasegawa; Tomohiro Yamamoto; Motokazu Watanabe; Takahiro Nakaminami; Shin Ikeda; Toshihiko Yoshioka; Shiro Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
Priority date: 2001-05-22
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2002-11-28
Also published as: CN1463360A; US20030183519A1; EP1318396A4; USRE39390E1; JP2002340839A; US6706232B2; JP4213361B2; CN1207563C; EP1318396B1; EP1318396A1

Description

明細書

パイォセンサ技術分野

本発明は、試料中の特定成分について、迅速、高感度、かつ簡便に定量することができるバイオセンサ、特にコレステロールセンサに関する, 背景技術

従来のバイォセンサの例を、グルコースセンサについて説明する。代表的なものとして、絶縁性の基板上にスクリーン印刷などの方法により、少なくとも測定極および対極を含む電極系を形成し、この電極系上に、親水性高分子、酸化還元酵素および電子メデイエ一夕を含む酵素反応層を形成して得られるグルコースセンサがある。酸化還元酵素にはグルコースォキシダーゼが、また電子メディエー夕にはフエリシアン化カリウム、フエ口セン誘導体、キノン誘導体などの金属錯体ゃ有機化合物などがそれぞれ用いられる。酵素反応層には、必要に応じて緩衝剤が加えられる。

このバイォセンサの酵素反応層上に、基質を含む試料液を滴下すると. 酵素反応層が溶解して、酵素と基質が反応し、この反応に伴い電子メデイエ一夕が還元される。酵素反応終了後、この還元された電子メデイエ一夕を電気化学的に酸化する酸化電流値から試料液中の基質濃度を求めることができる。

このタイプのグルコースセンサでは、酵素反応の結果生じた電子メディエー夕の還元体を電極で酸化し、その酸化電流値からグルコース濃度を求める。

このようなバイォセンサは、測定対象物質を基質とする酵素を用いることで、様々な物質に対する測定が原理的には可能である。例えば、酸化還元酵素にコレステロールォキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを用いれば、各種医療機関で診断指針に用いられる血清中のコレステロール値を測定することができる。

コレステロールエステラーゼの酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤を添加することにより、コレステロールエステラーゼの活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮することができる。

しかし、反応系に界面活性剤が含まれることから、界面活性剤が血球に悪影響を及ぼすため、グルコースセンサのように全血そのものを測定することは不可能である。

そこで、血球をろ過した血漿のみを迅速にセンサ内に供給するために. 試料液供給路の開口部付近にフィルタ（血球ろ過部）を設ける提案がなされている。しかし、センサ内へのフィル夕の組み込み方が適していないと、フィルタ内に捕捉される血球が破壌され、ヘモグロビンが溶出してしまう。ヘモグロビン程度にまで小さくなると、血球成分をフィルタでろ過することが困難となり、試料液供給路内にヘモグロビンが流入し. 測定誤差の原因となってしまう。

これは、試料液を吸収する前のフィルタの厚みと、試料液を吸収した後に膨張したフィル夕の厚みとの差が、フィル夕を上下から保持している押さえ部の間隔と適合していない点に原因があると考えられる。フィル夕を上下から保持している押さえ部の間隔が、膨張したフィルタの厚みに対して狭すぎると、フィルタの膨張が妨げられる。そして、膨張が妨げられたフィルタの孔径は十分に広がることができず、浸透してきた血球を破壊してしまうのである。

これに対し、試料液によってそのへマトクリット値（赤血球容積比）が異なり、これに起因してフィルタの膨張の程度も異なるため、あらかじめ膨張したフィル夕の厚みを想定して前記押さえ部の上下の間隔を広めに設定すると、保存期間中にフィル夕がずれてしまうおそれがある。さらに、試料液の量を低減するために従来よりもフィルタの厚みを薄くすると、従来法（特願 2 0 0 0— 3 9 9 0 5 6号）のようにフィルタの一次側部分の端部から試料液を吸引させただけでは、一定時間内に吸収できる試料液の量が減ってしまう。そのため、フィル夕の二次側部分から出る血漿の流出速度が遅くなり、センサ内、特に試料液供給路内が血漿で飽和する速度が遅くなることから、測定時間が長くなつてしまう', これに対し、一定時間内に吸収できる試料液の量を増やすために吸引面積を広くし、フィルタの上部から試料液を滴下すると、フィルタに試料液が浸透する速度よりも試料液がフィル夕の表面を流れる速度の方が速くなる。そのため、フィルタの表面を流れた試料液が、試料液供給路とフィルタを接続する試料液供給路の開口部から、試料液供給路内へ流入し、測定誤差を引き起こす原因となってしまう。

本発明は、上記のような不都合をなくし、血球をろ過された血漿が迅速に電極系に達するように改良したバイオセンサを提供することを目的とする。

本発明は、高精度で応答性に優れ、全血を測定対象とするコレステロールセンサを提供することを目的とする。発明の開示

本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板、前記基板上に設けられた作用極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メディェ一夕を含む試薬、前記電極系と前記試薬とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供給路、試料液供給部、および前記試料液供給路と試料液供給部との間に設けられた、血球をろ過するフィルタを具備し、前記フィルタで血球をろ過された血漿が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイオセンサであって、前記フィル夕の一次側部分を下から保持する第一押さえ部、前記フィルタの二次側部分を上下から保持する第二押さえ部、前記フィル夕の中央部分を上から保持する第三押さえ部、および前記第二押さえ部と第三押さえ部との間において前記フィル夕を囲む空隙部を有することを特徴とする。

前記フィル夕の一次側部分が、バイォセンサの上面から外部に露出しているのが有効である。また、前記フィル夕の二次側部分と前記作用極とが非接触であるのが有効である。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の一実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。

図 2は、本発明の一実施の形態に係るバイオセンサの斜視図である。図 3は、図 2に示すバイオセンサの概略縦断面図である。

図 4は、本発明の他の実施の形態に係るバイオセンサの電極系付近の拡大断面図である。

図 5は、本発明の実施例のコレステロールセンサの応答特性を示す図である。発明を実施するための最良の形態

上述のように、本発明は、電極系と試薬とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供給路と、試料液供給部との間に設けられた、血球をろ過するフィル夕を具備し、前記フィルタで血球をろ過された血漿が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイォセンサにおいて、前記フィルタの一次側部分を下から保持する第一押さえ部. 前記フィル夕の二次側部分を上下から保持する第二押さえ部、前記フィル夕の中央部分を上から保持する第三押さえ部、および前記第二押さえ部と第三押さえ部との間において前記フィルタを囲む空隙部を具備することを特徴とする。この構成により、フィルタを上下から保持する押さえ部の間隔が、膨張したフィルタの厚みに適合しなくても、フィルタの膨張が妨げられることにより起こる血球破壊を防止することができる。また、試料液を直接フィル夕に滴下することにより、血球がフィルタの表面を流れて試料液供給路内に流入して生じる測定誤差を抑制することができる。

本明細書において、フィルタの「一次側部分」とは、試料が供給される試料供給部に近い方の部分のことを指し、フィルタの「二次側部分」とは、電極系が設けられる試料供給路に近い方の部分のことを指す。また、フィル夕の基板側を「下」、フィル夕の基板と反対側を「上」とする。

すなわち、前記フィルタの一次側部分では、第一押さえ部が下側にのみ接しているため、前記フィルタは、試料液を吸引した際に上側に膨張することができる。また、前記フィルタの中央部分においては、第三押さえ部が上側にのみ接しているため、前記フィルタは、試料液を吸引した際に下側に膨張することができる。さらに、前記第二押さえ部と第三押さえ部との間において前記フィルタを囲むように存在する空隙部においても、試料液を吸引したフィルタが膨張することができる。かつ、フィルタを囲む空隙部がないと、フィルタを通過せずにフィルタ押さえ部を伝わった血球が電極系へ流入する可能性がある。このように、フィル夕を保持する部材が、膨張によるフィル夕の寸法変化を妨げる部分を極力減らすことにより、フィルタの孔径を自由に変化させ、かっ血球破壊のないろ過が可能になる。また、本発明のバイォセンサにおける前記フィル夕の 1次部側部分では、第一押さえ部が下側にのみ接しているため、上部に開口部を設けて一次側部分をパイォセンサの外部へ露出させることができ、これにより . 試料液を直接フィルタに滴下させることができる。

さらに、前記フィルタの中央部分の上側に存在する第三押さえ部は、前記開口部から滴下された試料液がフィル夕の上側の表面を流れることを防止する堰のような役割を果たす。これにより、試料液がろ過工程を経ずに試料液供給路へ侵入することを防止することができる。

本発明に用いる電子メディェ一タとしては、フェリシアン化カリウムの他、コレステロールォキシダ一ゼなどの酸化還元酵素との電子伝達能を有するレドックス化合物から選択することができる。

酸化還元酵素は、測定対象物を基質とする酵素であり、グルコースを測定対象とするセンサでは、グルコースォキシダーゼを用いる。診断指針に用いられる血清中のコレステロール値を測定するには、コレステロールの酸化反応を触媒する酵素であるコレステロールォキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼとコレステロールエステルをコレステロールに変化させる過程を触媒する酵素であるコレステロールエステラーゼを用いる。コレステロールエステラーゼの酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤を添加することにより、コレステロールエステラーゼの活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮することができる。

これらは、センサ内の電極系上またはその近傍の位置に反応層として配置する。または、電極を構成する導電性材料と試薬とを混合して、電極系を形成してもよい。電極系を設けた基板に組み合わされて基板との間に電極系に試料液を供給する試料液供給路を形成するカバ一部材を有するセンサでは、前記試料液供給路に露出する部分や試料液供給路の開口部などに設けることができる。いずれの位置であっても、導入された試料液によって試薬が容易に溶解して電極系に到達できることが好ましい。電極を保護し、形成される試薬の剥離を抑制するために、電極系上に接して親水性高分子層が形成されることが好ましい。また、電極系以外でも、試薬を形成する際の下地として親水性高分子層が形成されるか, または最下層の試薬に親水性高分子が含まれることが好ましい。

電子メデイエ一夕を含む層は、溶解性を高めるために、界面活性剤と分離することが好ましい。また、保存安定性のために、コレステロールの酸化反応を触媒する酵素コレステロールォキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼと分離することが好ましい。

血糖値を測定するバイオセンサでは、試料液が容易に試薬へ導入されるように、電極系上に形成された層などを被覆すべく、脂質を含む層を形成する例がある（例えば特開平 2— 0 6 2 9 5 2号公報）。本発明のコレステロールを測定するバイオセンサにおいては、試薬の一部を凍結乾燥法により形成すること（例えば特願 2 0 0 0— 0 1 8 8 3 4号明細書）、またはカバ一部材の表面に、界面活性剤またはプラズマ照射などにより処理して、親水性を付与することが好ましい。このような構成をとると、脂質層は設けなくてもよい。

親水性高分子としては、例えば、水溶性セルロース誘導体、特にェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースの他、ポリビエルピロリドン、ポリビエルアルコール、ゼラチン, ァガロース、ポリアクリル酸およびその塩、デンプンおよびその誘導体, 無水マレイン酸の重合体およびその塩、ポリアクリルアミド、メタクリレート樹脂、ポリ一 2—ヒドロキシェチルメタクリレートなどを用いることができる。

界面活性剤としては、例えば、 n—才クチルー /3—D—チォダルコシド、ポリエチレングリコールモノドデシルエーテル、コール酸ナトリウム、ドデシルー jS—マルトシド、ジユークロースモノラウレート、デォキシコ一ル酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、 N , N 一ビス（ 3— D—ダルコンアミドプロピル）デォキシコ一ルアミドおよびポリオキシエチレン（ 1 0 ) ォクチルフエ二ルエーテルなどがあげられる。

脂質としては、使用する場合、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質で、両親媒性脂質が好適に用いられる。

酸化電流の測定方法としては、測定極と対極のみの二電極方式と、参照極を加えた三電極方式があり、三電極方式の方がより正確な測定が可能である。

以下'、具体的な実施の形態により本発明を詳細に説明する。

図 1は、好ましい実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である < 絶縁性の基板 1は、例えばポリエチレンテレフ夕レートなどの絶縁性樹脂からなる。図 1における基板 1上の左側部分には、スパッタまたは蒸着にて、パラジウム薄膜を形成し、かつレーザ一トリミングすることにより、作用極 2と対極 3を含む電極系が形成されている。電極の面積は、後述するスぺーサ 6の上に形成されるスリット 9の幅に対応して決定される。また、基板 1には孔 4が形成されている。

前記基板 1に組み合わせるスぺーサ 6には、フィルタ 5を収納する補助スリット 7、試料液供給路 9 ' を構成するスリット 9、および補助スリット 7からスリット 9に通じる開口部 8が形成されている。

また、カバー 1 0には、孔 1 1および空気孔 1 2が形成されており、補助板 1 3には、フィル夕 5に試料液を供給するための孔 1 4が形成され、さらに、孔 1 5、および第 3の押さえ部となる仕切り部 1 8が形成されている。

補助上カバー 1 6には、試料液をフィルタ 5に滴下するための試料液供給部を構成する孔 1 7が形成されており、補助下カバー 2 0は、平板で構成されている。

図 1に示される各部材を一体化した際には、図 1における補助スリット 7の右俯部分、カバ一 1 0に形成されている孔 1 1の右側部分、補助板 1 3に形成されている孔 1 4、および補助上カバー 1 6に形成されている孔 1 7は連通する。

フィルタ（血球ろ過部） 5は、ガラス繊維ろ紙からなり、基板 1 と同じ平面への投影図において、図 1に示すように、底辺が 3 m m、高さが 5 m mの二等辺三角形の形状を有する。そして、二次側部分の先端には半径 0 . 4 m mの半円部（図示せず。）が形成されている。フィルタ 5の厚みは約 3 0 0〜 4 0 0 mである。

このセンサを組み立てるには、まず、図 1に示す一点鎖線で示すような位置関係で、補助下カバー 2 0上に基板 1をのせ、補助下カバ一 2 0 および基板 1の右端が一致するようにして、合体基板 Aを得る。

つぎに、カバ一 1 0およびスぺーサ 6を、図 1に示す一点鎖線で示すような位置関係で、それぞれの右側、すなわち基板 1と同じ平面への投影図において、孔 1 1および補助スリット 7に形成された二等辺三角形状の底辺側に相当する部分が一致するように組み合わせ、合体基板 Bを得る。このとき、カバー 1 0のスリット 9に面する部分、すなわち試料供給路 9 ' の上側部分に、後述するように反応層を形成する。

さらに、基板 1および補助下カバ一 2 0からなる合体基板 Aとカバ一 1 0およびスぺ一サ 6からなる合体基板 Bを、図 1に示す一点鎖線で示すような位置関係で組み合わせ、基板 1と同じ平面への投影図において、二等辺三角形状を有するフィルタ 5の一次側部分の右端（底辺側）が、前記孔 1 1および補助スリット 7の右端部分と一致するように、フィル夕 5を設置する。換言すると、フィルタ 5は、基板 1上に配置され、かっスぺーサ 6の補助スリット 7およびカバー 1 0の孔 1 1にはめ込まれた状態になる。

また、フィルタ 5の二次側部分の先端は、スリット 9によって形成される試料供給路 9 ' に入り込み、基板 1とカバー 1 0とに挟まれ、この部分が第二押さえ部を構成する。なお、詳細は後述する。

最後に、カバー 1 0の上に、図 1に示す破線で示すような位置関係で. 孔 1 4および孔 1 7の右端が、力パー 1 0の孔 1 1およびスぺーサ 6の補助スリット 7の右端と一致するように、補助板 1 3および補助上カバ — 1 6を力パー 1 0の上に配置する。

以上のようにして得られる本発明のバイォセンサの概略斜視図を図 2 に示す。また、その断面構造を図 3に示す。図 3は、本発明のバイオセンサの概略縦断面図であり、図 2に示す X— X線断面図に相当する。図 2に示す本発明のバイオセンサにおいては、図 3に示すように、フィル夕 5と他の部材とが非接触となる孔 1 5および 4が形成される。

すなわち、図 3に示すように、フィル夕 5の一次側部分を下から保持する第一押さえ部 a、フィルタ 5の二次側部分を上下から保持する第二押さえ部 bおよび b ' 、フィルタ 5の中央部分を上から保持する第三押さえ部 c、ならびに第二押さえ部 bおよび b ' と第三押さえ部 c との間においてフィルタ 5を囲む孔（空隙部） 1 5が形成される。そして、さらにフィル夕 5の下側であって第三押さえ部 cの下側に相当する部分には、空洞が存在し、これが孔 1 5とつながった孔（空隙部） 4を形成している。

ここで、図 4は、本発明のバイオセンサのさらに別の態様を示す概略縦断面図である。図 2では反応層および電極系を省いたが、図 4は反応層および電極系を示している。基板 1の電極系（2および 3 ) 上に、親水性高分子の層 2 1 と反応層 2 2 aが形成されている。また、試料液供給路の天井に相当するカバー 1 0の下面側に反応層 2 2 bが形成されている。なお、図 4に示すその他の部材は、図 3に示すものと同じである, 図 1〜 4に示す本発明のバイオセンサは、その構造をわかりやすく説明するために、 6種類の部材から作製されているが、補助上カバ一 1 6 と補助板 1 3とが一つの部材で構成されていてもよく、また、これらとカバー 1 0が一つの部材で構成されていてもよい。さらに、補助下カバ一 2 0と基板 1がーつの部材から構成されていてもよい。

このセンサを用いて血液中のコレステロールを測定するには、補助上カバー 1 6の孔 1 7で構成される試料液供給部から、フィルタ 5を保持する部分（試料供給部）へ試料液である血液を供給する。ここに供給された血液は、フィル夕 5の一次側部分の上表面からその内部へ浸透する < フィルタ 5内では、血球の浸透速度は液体成分である血漿の浸透速度より遅いので、血漿がフィルタ 5の二次側部分の端部からしみ出す。そしてしみ出した血漿は、電極系を覆う位置および/またはカバー 1 0の裏面に担持された反応層を溶解しながら、電極系近傍、さらに空気孔 1 2 の部分まで延びるスリット 9で構成される試料液供給路 9 ' 全体を満たす。試料液供給路 9 ' 全体が液体で満たされると、フィルタ 5内の液体の流動も停止し、その時点で、血球はフィル夕 5の二次側部分の端部に到達せず、フィル夕 5内に残る。したがって、フィル夕 5は、試料液供給路 9 ' 全体を満たすだけの量の血漿が通過してもなお血球がフィル夕 5の二次側部分に達しない程度に、血漿と血球との流通抵抗に差を有するように設計する必要がある。本発明のフィル夕としては、孔径 1〜 7 m程度のディブスフィルタが好適である。また、本発明の実施例の場合、フィル夕の厚みは 3 0 0〜4 0 0 mであるのがよい。このような血球ろ過の過程を経て、血漿により溶解された反応層と血漿中の測定成分（コレステロールセンサであればコレステロール）との化学反応が生じ、一定時間経過後、電極反応により電流値を測定し、血漿中の成分を定量することができる。

図 4は、試料液供給路 9 ' の電極系近傍における反応層の配置の例を示す。基板 1の電極系上には、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（以下、単に「C M C」と表す）などの親水性高分子の層 2 1、および例えば電子メディエー夕などの反応試薬を含む反応層 2 2 aが形成されている。また、カバー 1 0とスぺ一サ 6を組み合わせたカバー部材の裏面には、試料液供給路 9 ' に露出する面に、酸化還元酵素を含む反応層 2 2 bが形成されている。

¾ 1〜 4に示すように、スリット 9が構成する試料液供給路 9 ' の、液体が流通する方向に垂直な方向における断面積は、フィルタ 5の一次側部分の断面積に比べて小さくしてあるが、フィルタ 5の二次側部分から l mmの部分は、試料液供給路 9 ' の開口部 8付近に圧縮して設置されている。ここで、フィルタ 5の圧縮される部分は、本発明の実施例におけるセンササイズの吸引力の場合は、二次側部分の端部から約 1 mm 程度までであるのが好ましかった。また、フィル夕 5の二次側部分を圧縮する程度については、二次側部分が一次側部分の約 1 / 4〜 1 Z 3になるように圧縮すればよかった。この圧縮条件において、センサの吸引力を数値で表すことは困難であるが、スぺーサ厚が 1 0 0 mの場合、フィルタ厚 3 7 0 mの測定結果（流入速度）が良好であった。なお、フィルタ厚 3 1 0 m以下の場合は、流入速度が遅かった。

このように、試料液供給路 9 ' の断面積をフィルタ 5の一次側部分の断面積よりも小さくすることにより、フィル夕 5で血球をろ過された血漿が毛細管現象によって、試料液供給路 9 ' 内に迅速に吸引させることができる。

反応層には、一般に溶解しやすい部分と溶解し難い部分がある。溶解しゃすい部分は、試料液供給路 9 ' の縁、すなわちスぺーサ 6のスリツト 9の壁面に沿う部分や、液体の流れ方向における中央部分は溶解しにくい。フィル夕 5を通過した試料液は、スぺーサ 6に沿って優先的に流れるため、中央部分が完全に溶け終わっていないにもかかわらず、試料液が空気孔を塞いでしまうことがある。フィルタ 5の二次側部分の中央部分が、左右両端部より試料液供給路 9 ' 内へ突出していることにより、試料液供給路 9 ' 内の中央部分を優先的に流れ、これによつて気泡を試料液供給路 9 ' の中央部分に残すことなく、速やかにセンサ内に血漿を流入させることができる。

測定の際、試料液である血液を補助上カバー 1 6の孔 1 7で構成される試料液供給部からフィルタ 5へ供給すると、血液はフィルタ 5の一次側部分の上表面からその内へ浸透する。このとき、仕切りとなる第三押さえ部 cがあるため、試料液をフィルタ 5の表面に滴下しても、試料液がフィルタ 5の表面を優先的に流れて試料液供給路 9内に直接流れ込むことはない。また、基板 1 と同じ平面における投影図において、第三押さえ部 cと第一押さえ部 aの位置は一致していないため、フィルタ 5の膨張を妨げることがなく、血球が破壊される恐れもない。

前記電極系は、貴金属電極であることが好ましい。前記試料液供給路の幅が、好ましくは 1 . 5 mm以下であるため、スクリーンを用いた印刷電極では電極面積を決定する精度が劣るからである。これに対し、貴金属電極は、 0 . 1 mm幅でレーザートリミングすることが可能であり、電極面積を決定する精度が高い。

以下に、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。実施例

反応層 22 aには電子メディェ一夕が含まれ、反応層 22 bにはコレステロ一ルォキシダーゼ、コレステロールエステラーゼおよび界面活性剤が含まれる、図 1〜 4の構成を有するコレステロールセンサを作製した。

まず、基板 1の電極系上に、 CMCの 0. 5 1: %水溶液を 5 1滴下し、 5 0°Cの温風乾燥機中で 1 0分間乾燥させることにより CMC層 2 1を形成した。

つぎに、フェリシアン化カリウム水溶液 4 1 (フェリシアン化カリゥム 7 0 mM相当）を CMC層 2 1上に滴下し、 50°Cの温風乾燥機中で 1 0分間乾燥させることにより、フェリシアン化カリウムを含む反応層 1 8 aを形成した。

ノカルジァ由来のコレステロールォキシダ一ゼ (EC1.1.3.6) およびシユードモナス由来のコレステロールエステラーゼ（EC3.1.1.13) を溶解した水溶液に、界面活性剤であるポリオキシエチレン（ 1 0 ) ォクチルフエニルエーテル（TritonX- 100) を添加した。この混合液 0. 6 4 1 を、カバー 1 0とスぺーサ 6を一体化して形成されるスリット 9の部分 (試料供給路 9 ' ) に滴下し、 — 1 9 6 °Cの液体窒素にて予備凍結した後、凍結乾燥機で 2時間乾燥させることにより、 5 7 0 U/m 1 コレステロールォキシダーゼ、 1 4 2 5 U/m 1 コレステロールエステラーゼおよび 2 w t %界面活性剤を含む反応層 22 bを形成した。

スリット 9の幅は 0. 8 mm、スリット 9の長さ（試料液供給路 9 ' の開口部から空気孔までの長さ）は 4. 5mmとした。また、スぺーサ 6の厚さ（基板 1とカバ一 1 0の間の距離）は 100 mとした。

フィルタ 5としては、厚さ約 370 mのガラス繊維ろ紙からなり、底辺 3 mm、高さ 5 mmの二等辺三角形状のものを用いた。二次側部分の先端（試料液供給路 9 ' の開口部 8と接触する部分）の角は丸く加工し、基板 1および補助下カバー 2 0からなる合体基板 Aとカバ一 1 0およびスぺーサ 6からなる合体基板 Bの間に設置した。

この後、合体基板 Aと合体基板 Bの間にフィルタ 5を設置してなる部材と、補助板 1 3と補助上カバー 1 6を一体化してなる部材とを接着することにより、図 1、 2および 4で示される構造のコレステロールセンサを作製した。

このセンサの試料液供給部に、試料液として全血 1 0 1 を導入し、 3分後に対極を基準にして測定極にァノ一ド方向へ + 0 . 2 Vのパルス電圧を印加し、 5秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。その結果を図 5に示した。図 5は、総コレステロール濃度と応答電流の関係を示すグラフである。

図 5から明らかなように、本発明のセンサによれば、コレステロール濃度と応答電流の値との間に良好な直線性が得られた。図 5において、 Xは赤血球容積比 0 %の血漿、〇は赤血球容積比 3 5 %の全血、口は赤血球容積比 6 0 %の全血の結果である。産業上の利用の可能性

本発明によれば、妨害物質である血球をフィル夕により溶血することなく除去し、フィル夕の厚みが薄くても血球除去後の血漿を迅速に電極系へ供給することができる。したがって、応答特性に優れた化学的バイォセンサを提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 絶縁性の基板、前記基板上に設けられた作用極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メデイエ一夕を含む試薬、前記電極系と前記試薬とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供給路、試料液供給部、および前記試料液供給路と試料液供給部との間に設けられた、血球をろ過するフィルタを具備し、前記フィル夕で血球をろ過された血漿が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイォセンサであって、

前記フィル夕の一次側部分を下から保持する第一押さえ部、前記フィル夕の二次側部分を上下から保持する第二押さえ部、前記フィルタの中央部分を上から保持する第三押さえ部、および前記第二押さえ部と第三押さえ部との間において前記フィルタを囲む空隙部を有することを特徴とするバイォセンサ。

2 . 前記フィル夕の一次側部分が、バイオセンサの上面に露出していることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のバイオセンサ。

3 . 前記フィルタの二次側部分と前記作用極とが非接触であることを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項記載のパイォセンサ。