WO2003056312A1 - Procede de mesure de la concentration - Google Patents

Description

明 細 書 濃度測定方法 技術分野

本発明は、 測定交豫物質を含む反応系からの出力値と、 検 4 /線 （測定纖物質 の濃度と出力値との関係を示すもの） と、 に基づいて、 測定対象物質の濃度演算 を行う濃度測定方法に関する。

尿などの検体中の抗原濃度を測定する方法としては、 抗体反応と光学的手 法とを組み合わせたものがある。 この方法では、 たとえば検体と抗体とを混合し て i¾g抗体反応を起こさせ、 この反応系に光を照射したときの吸光度に基づレ、て 濃度演算が行われる。 この方法では、 反応系の觸濃度が小さい範囲では、 濃度 が大きくなるにしたがって測定される吸光度が大きくなる。 その一方で、 反応系 の fe¾濃度が大きい範囲では、 濃度が大きくなるにしたがって測定される吸光度 が小さくなるといつた現象が見受けられる（プロゾーン現象)。このような現象は、 抗体反応を利用する に限らず、 生化学的分野 におレヽて見受けられる (以下、 当該現象を生化学的分野も含めて 「プロゾーン様現象」 と表現する） 。 プロゾーン様現象が生じる系においては、 実際には測定対象成分の濃度が大き レ、にもかかわらず、 測定される吸光度が小さいために演算された結果が実際のも -のよりも小さくなつてしまうといつた不具合が生じ得る。 このような不具合を解 消するためには、 たとえば検体を希釈した上で、 吸光度を再測定する必要が生じ る。

しかしながら、 同一の検体について複数回の測定を行うのは、 抗原が高価であ ることに鑑みれば好ましくなく、 もちろん、 作業性を考慮した場合には、 測定回 数が少ないほうが好ましい。また、尿中のグルコース濃度などの測定においては、 プロゾーン様現象が生じなレ、ものの、 高濃度にぉレヽて^能が低下するという問 題がある。 そのため、 プロゾーン様現象が生じない系においても、 高濃度域にお レ、て、 測定精度が小さいとレ、つた問題が生じ得る。 発明の開示

本発明は、 プロゾーン様現象の影響や高濃度領域での分解能の低下による高濃 度試料液の測定精度低下を、 簡易カゝっ安価に抑制することを目的としている。 本発明の第 1の側面により ¾される濃度測定方法は、 測定^^物質およびこ の物質と反応し得る反応物質を含む反応系からの出力値に基づ ヽて、 複数の検量 線の中から上記測定対象物質の濃度演算に最も適合した; ¾検嶽泉を選択し、 か つ当該最適検 ft線および上記出力値に基づレ、て、 上記測定 物質の濃度演算を 行う濃度測定方法であって、 上記各検量線は、 濃度が既知の標職薬と上記反応 物質とを含む標準反応系の出力値を、 濃度の異なる複数の標準試薬のそれぞれに ついて、 反応時間を同一として測定し、 そのときに得られる複数の出力値に基づ レ、て作成されており、 上記複数の検通は、 相互に異なる反応時間を基礎として 作成されたものであることを特徴としている。

好ましい実施の形態においては、 上記複数の検 *1泉は、 上記測定文豫物質の濃 度が予め定められた濃度用閾値よりも大きいと予想される に選択される第 1 _検¾線と、 上記濃度用閾値よりも小さいと予想される に選択される第 2検量 線と、 を有しており、 かつ、 上記第 1検 ¾锒は、 濃度が既知の標準物質と上記反 応物質との反応の初期段階におレ、て測定される出力値に基づレ、て作成されており、 上記第 2検量線は、 上記第 1検量線の作成の基礎となった出力値の測定時よりも 後にぉレ、て測定される出力値に基づレ、て作成されている。

この 、 第 2検猶泉を用いて演算された第 2濃度演算値が、 濃度用閾値より も大きいと予想される^^には、 第 1検氲镍を用レヽて演算された第 1濃度演算値 と、 第 2濃度演算値とを比較し、 値の大きい演算値を最終的な演算値として採用 するのが好ましい。 これに対して、 第 2濃度演算値が、 濃度用閾値よりも小さい と予想される には、 第 2濃度演算値が測定 物質の濃度を反映したもので ある力否かを判断するのが好ましい。 この^^、 第 2濃度演算値が測定交豫物質 の濃度を反映している齢には、第 2濃度演算値を最終的な演算値として採用し、 -第 ²濃度演算値が測定交橡物質の濃度を反映してレ、なレ、 には、 第 1検纖を 用レ、て演算された第 1濃度演算値を最終的な演算値として採用する。

一方、 第 1検 ¾锒を用いて演算された第 1濃度演算値に基づいて、 第 1検 *線 および第 2検量線のうちのいずれの検 *1泉を選択するかを決定してもよい。 たと えば、 第 1濃度演算値が濃度用閾値よりも大きいと予想される には、 第 1濃 度演算値を最終的な演算値として採用する。 これに対して、 第 1濃度演算値が濃 度用閾値よりも小さいと予想される には、 第 2検嶽泉を用いて演算された第 2濃度演算値を最終的な演算値として採用する。

測定文像物質の濃度が濃度用閾値よりも大きいか、あるいは小さいかの予想は、 たとえば出力値が予め定められた出力値用閾値よりも大きレ、か小さいかに基づい て行うようにしてもよレ、。

濃度演算用閾値は、 たとえば第 2検崖泉の 性が髙レ、濃度範囲内に、 あるい は第 1検獻泉と第 2検量線との交点に対応する濃度に設定される。

本発明においては、 複数の検慰泉を 3つ以上 しておき、 それらの中から最 適検 線を選択するように構成してもよい。 すなわち、 複数の検量線は、 濃度が 既知の標載薬と上記反応物質とを含む標準反応系の出力値を、 濃度の異なる複 数の標準試薬のそれぞれについて一定時間毎に複数 （3以上） の測定点において 測定することにより、 各測定点毎に ί乍成されたものであってもよレ、。 この ¾^の 最適検 *1泉の選択は、 測定文像物質と反応物質との反応の初期段階である時間範 囲内において測定される出力値に基づいて行うのが好ましい。

本発明の第 2の側面にぉレ、ては、 測定女豫物質およびこの物質と反応し得る反 応物質を含む反応系からの出力値と、 上記測定文豫物質の濃度と出力値との関係 を示す検 ft锒と、 に基づいて、 上記測定 物質の濃度演算を行う濃度測定方法 であって、 上記検爆泉は、 濃度が既知の標 ¾m薬と上記反応物質とを含む標準反 応系の出力値を、 濃度の異なる複数の標準試薬のそれぞれについて特定時間範囲 内にお！/ヽて経時的に測定し、 各濃度の標職薬を用いた ¾ ^における出力値の最 大値の集合に基づレ、て作成されていることを樹敫とする、 濃度測定方法が 共さ れる。

本発明の第 3の側面においては、 測定 物質およびこの物質と反応し得る反 応物質を含む反応系に光を照射したときの出力値と、 上記測定豫物質の濃度と 出力値との関係を示す検 4泉と、 に基づいて、 上記測定 物質の濃度演算を行 う濃度測定方法であって、 上記検 ft镍は、 濃度が既知の標準物質と上記反応物質 との反応の初期段階におレ、て測定される出力値に基づいて作成された第 1検量線 と、 上記第 1検 ®泉の作成の基礎となった出力値の測定時よりも後におレヽて測定 される出力値に基づいて作成された第 2検量線と、 を複合したものとして作成さ れており、 力つ、 上記検厳泉は、 上記第 1検 線と上記第 2検 線との交点に相 当する交点濃度よりも大きレ、濃度領域については、 上記第 2検 泉における上記 交点濃度よりも大きい濃度領域の部分が採用され、 上記交点濃度よりも小さい濃 度領域については、 上記第 1検 4 における上記交点濃度よりも小さい濃度領域 の部分が採用されていることを擀敫とする、 濃度測定方法が樹共される。

本発明における出力値は、 たとえば反応系に光を照射したときの応答値 （光学 的応答値） として得られる。 もちろん、 反応系に ®王を印加し、 あるいは電流を 流したときの電気的な応答値などであってもよい。 ここで、 「光学的応答値」 と は、 ρ及光度、 濁度、 透過度などを含む概念である。 吸光度は、 反応容器内に液相 反応系が設定された場合において、 液相反応系を透過した光の光量に基づいて決 定されるものの他、多孔質体などの固相に反応系が保持形成された：！^において、 固相からの反射光の光量に基づいて決定されるもの力 s含まれる。 図面の簡単な説明

図 1 Αおよぴ図 1 Bは、 光学的応答値の測定方法を説明するための概略図であ る。

図 2は、 本発明の第 1の実施の形態に係る濃度演算で用いる第 1および第 2検 41泉（1 )， （ 2 )を示すグラフである。

図 3は、 吸光度の経時的変化にっレ、て、 濃度の異なる複数の標準反応液につ! ヽ て示したグラフである。

図 4は、 標準反応液のダイナミックレンジを示すグラフである。

図 5は、 濃度演算手順の一例を説明するためのフロー図である。

図 6は、 濃度演算手順の他の例を説明するためのフロー図である。

図 7は、 本発明の第 2の実施の形態に係る濃度演算で用いる複数の検量線 (A) 〜(H)を示すグラフである。

図 8は、 濃度演算手順の一例を説明するためのグラフである。

図 9は、 検 を説明するためのグラフである。 発明を実施するための最良の形態

以下、 本発明を実施するための最良の形態を、 図面を参照して具体的に説明す る。

本発明は、 反応系に光を照射したときの光学的応答値と、 検爾泉と、 に基づい て、 測定刘象物質の濃度演算を行う方法に関するものである。 ここで、 検量線と は、 測定 ^物質の濃度と光学的応答値との関係を示すものをいい、 少なくとも 関数として表現されたもの、およびテーブルとして表現されたものを含んでいる。 反応系は、 測定 物質およびこの物質と反応し得る反応物質を含むものであ る。 この反応系は、 測定 物質と反応物質との反応により生じた反応生成物質 の量に応じて、 色調や濁度などが変化するものである。 その結果、 反応の進行具 —合や測定纖物質の量に応じて、 反応系での光学的応答状態が変化する。 この反 応系は、 図 1 Aに示したように容器 10内に反応液 11を保持することにより構成さ れる の他、 図 1 Bに示したように固相 20に反応液を保持させることにより構 成される ¾ ^もある。 固相 20は、 たとえば紙やフェルト様部材のような吸水性に 優れる材料により構成される。 '

測定文豫物質としては、 ァノレブミン、 グルコース、 アミラーゼ、 クレアチニン などが挙げられる。 もちろん、 特定の物質の濃度を測定する場合に限らず、 たん ばく質ゃコレステロールの総量を測定する場合のように、 複翻重の類似物質の合 計量を測定する にも、 本発明を適用することができる。 これに対して反応物 質としては、 発色指示薬が用いられるが、 その種類は測定文豫物質に応じて選択 される。

光学的応答値は、 たとえば吸光度、 濁度、 あるいは 度として得られる。 図 - 1 Aに示した反応系では、 発光素子 12からの光を反応系に照射したときの 光 が受光素子 13において受光される。 この反応系では、 受光素子 13での受光量と反 応系への入射光量 （たとえば発光素子 12での発光量)に基づいて、光学的応答値が 演算される。 一方、 図 I Bに示した反応系では、 発光素子 21からの光を反応系に 照射したときの反射光が、 受光素子 22において受光される。 この反応系では、 受 光素子 22での受光量と反応系への入射光量 （たとえば発光素子 21での発光量)に 基づいて、 光学的応答値が演算される。 ただし、 図 1 Bに示した反応系では、 透 過度や濁度を測定することができず、 吸光度として光学的応答値が測定される。 本発明の第 1の実施の形態に係る濃度測定方法は、 比較的高濃度な試料に用レ、 る検 線と比較的ィ 度な試料に用いる検 Λ镍を使レ、分けて濃度演算を行うもの である。 2種類の検 ¾線 (1)， (2)を使レ、分ける濃度演算の具体的手法については後述 することとして、 それに先んじて、先に説明した 2種類の検 ¾線(1)， (2)を用いる理 由について説明する。

" 図 2には、 測定豫物質がたんぱく質（ヒト血清アルブミン)である: t につレヽ て、 2種類の検 41 (1), (2)を示してある。 これらの検置線 (1), (2)は、 たとえば人尿 中のたんぱく質濃度を測定する際に使用されるものである。

検置線 (1)は、高濃度たんばく質反応液 (lOOOmg/dL)を用い、力 反応の初期段階 において測定された吸光度に基づいて作成されたものである。 ここで、 反応の初 期段階とは、 高濃度反応液における吸光度の経時的変化において、 吸光度が最大 もしくはそれに近い状態となる反応段階をさしている。

一方、 検 *泉(2)は、 農度たんぱく質反応液 (100m_g/dL)を用い、 力 反応液に ぉレ、て反応 に到達し、 あるレ、は略反応 ¥§ίに達した反応 ί奐 Ϊ段階にぉレ、て測 定された吸光度に基づいて作成されたものである。 ここで、 反応 §ϊ段階とは、 { 農度反応液における吸光度の経時的変ィヒにおいて、 吸光度が一定値に漸近し、 もしくはそれに近レ、状態となる反応段階をさしてレ、る。

図 3には、たんぱく質濃度が 0〜1000rag/dLの範囲にある 11種類のたんぱく質標 準液のそれぞれにつレヽて、 反応物質と反応させたときの吸光度の経時的変ィ匕を示 した。図 3においては、吸光度を反応開始から 21. 5秒毎に測定した場合について、 各測定点を測定ポイント 1、 測定ポイント 2といったように表した。 たとえば測 定ポイント 10は、反応時間が 215秒（21. 5秒 X 10) に対応している。 測定ポイント という用語は、 以下の説明において、 あるいは他の図面においても使用されてい る力 これらの：^におレヽても、先に説明したのと同様の意味で使用されている。 吸光度の経時変化の測定に当たっては、 測定驗物質と反応物質との反応原理 として色素金属結合法を採用した。 すなわち、 反応物質としては、 ブロモピロガ ローノレレツド (色素）とインジウム (金属）とが結合した錯体化合物を使用した。 一 方、たんぱく質標準液としては、健常者プール尿にヒト血清アルブミン (HAS)を添 加して、 たんぱく質濃度を調製したものを使用した。 吸光度は、 全自動尿成分定 量分析装置 （ォーシヨンマスター UM3410：アークレイ (株） 製） を用い、 測定 波長を 600nmとして孭 []定した。

図 3から分かるように、低濃度たんぱく質標準液 (100mg/dL) については、測定 ポイント 14, 15で吸光度が一定値に漸近し、 吸光度が一定値化している。 つまり、 ィ«度たんぱく質標準液 (100mg/dL)を用レ、た齢には、測定ボイント 14, 15で反応

¥1街に近い状態となっている。 これに対して、 たんぱく質標準液のたんぱく質濃 度が大きくなれば、 反応時間が長くなるほど吸光度が小さくなる傾向にある。 つ まり、 たんぱく質標準液のたんぱく質濃度が 400mg/dL以上であると、 プロゾーン 様現象が生じている。 この現象が生じる測定ポイントは、 たんぱく質標準液のた んぱく質濃度が大きくなるにつれて小さくなつている。 たとえば、 中濃度たんぱ く質標準液 (400mg/dL)では測定ボイント 7で吸光度がピーク値に達しているのに 対して、高濃度たんぱく質標準液 (lOOOmg/dL)では測定ボイントが 1 , 2で吸光度 -がピーク値に達している。 .

図 3の結果からは、 反応液における測定対象物 （たとえばたんぱく質） の濃度 が大きレヽ には、 吸光度がピークとなる前後の時間範囲で測定した吸光度に基 づいて作成した検 ft線 (1) (図 2参照）を用いるのが好ましいのが分かる。 これに対 して、 反応液における測定対象物 （たとえばたんぱく質） の濃度が小さい場合に は、 反応が ¥1街に達し、 あるいは ¥tiに る直前の時間範囲で測定した吸光度 に基づレヽて作成した検 ft線 (2) (図 2参照）を用いるのが好ましいのが分かる。

図 3を参照して説明した理由から、図 2に示した 2つの検嶽泉 (1), (2)を使レ、分け る理由については十分趣军できる。 しかしながら、わざわざ 2つの検量線 (1)， (2)を 使い分けなくとも、 全ての濃度範囲において検 Λ锒 (1)を使用すればよいのではな いかとの疑問も生じる。 すなわち、 比較的低濃度の試料用の検 41泉として、 検量 線 (2)を使用する意義について疑問が生じうる。 この疑問は、 以下に説明するダイ ナミックレンジおよび再現†生の検.討結果によって角旱決することとなるだろう。

- ダイナミックレンジは、 HSAの濃度が 0または lOOmg/dLであるたんぱく質標準液 を用レ、て、 測定ボイント 1 , 2および測定ボイント 14， 15におレ、て、 先に説明した のと同様にして吸光度を測定し、測定ポイント 1， 2の平均値および測定ポイント 14， 15の平均値として検討した。 その結果を、下記表 1およぴ図 4に示した力 ダ イナミックレンジは、 検量線 (1)を用いた よりも、 検量锒(2)を用いた # ^のほ うが大きくなつている。

表 1

一方、 再現性は、 濃度の異なる 3つの患者尿 A, B， Cを用いて吸光度を測定 し、 その吸光度に基づいて検量線 (1)を用いて演算した 、 検 4泉 (2)を用いて演 算した場合のそれぞれについて検討した。 再現性は、 濃度平均値、 濃度の標準偏 差 (S. D. )および濃度の相 票準偏差 ( V. )の 3つの項目によって検討した。 再現 性の検討に当たっては、 各患者尿 A, B , Cのサンプル数を 10とし、 濃度演算の となる吸光度は、 先に説明したのと同様にして測定した。

下記表 2には、 上記 3つの項目についての演算結果を示した。

表 2

患者尿 A， B , Cは、 相当に 農度であるが、 このような低濃度試料における 標準偏差 . D. )および相対標準偏差 (C. V. )は、 検纖 (1)を用いた に比べて、 検置镍 (2)を用いた のほうが小さくなつている。 つまり、 低濃度領域では、 検 *1泉(2)を用いた齢のほうが、 再現性が良い (測鶴差が小さい）と言える。

したがって、 ダイナミックレンジおよび再現性の検討結果からは、 ί«度領域 では、 検 4線 (1)よりも検慰泉 (2)を用レ、たほうが良いことが分かる。

以上の事実から、 本実施の形態では、 相対的に高濃度の反応液については測定 ポイント 1， 2での吸光度の平均値に基づレ、て作成した検 泉 (1)を用い、相対的に. ίβ度の反応液については測定ボイント 14， 15での吸光度の平均値に基づいて作 成した検 *H(2)を用いることとしている。 なお、 2つの測定ボイントの平均値に より検 ¾線を作成するのは、 測 ¾m差による影響を少なくするためである。

- 次に、 本実施の形態の濃度演算手順を、 図 2を参照しつつ、 図⁵に示したフロ 一に則して説明する。 まず、 測定ボイント 1， 2での吸光度 (A)， (B)を測定すると ともに (S1)、 測定ボイント 14， 15での吸光度 (a)， (b)を測定する（S2)。 もちろん、 一定時間毎 (たとえば 21. 5秒毎)に吸光度を測定し、 その測定値群から測定ボイン ト 1 , 2および測定ボイント 14， 15に相当する測定値 (吸光度）をピックアップして ちょい。

次いで、 測定ポイント 1， 2での吸光度 (A) , (B)の平均値 (C)を演算し (S3) 、 こ の平均値 (C)と検 ¾锒 (1)とに基づいて第 1濃度 (D)を演算する (S4)。 その一方、 測 定ポィント 14, 15での吸光度 (a) , (b)の平均値 (c)を演算し (S5)、 この平均値 (c)と 検 ¾镍(2)とに基づレヽて第 2濃度 (d)を演算する (S6)。

続いて、 第 2濃度 (d)が濃度演算用閾値よりも大きいか否かを判断する (S7) 。 つまり、 測定文豫物質の濃度が相対的に大きなものである力、、 あるいは相対的に 小さなものであるかを予想する。 ここで、 濃度演算用閾値は、 たとえば 2つの検 ¾镍(1), (2)ともに ttf泉性が高い濃度範囲 （200〜300mg/dLの範囲） 内、 あるいは検 と検 镍(2)との交点に相当する濃度 (約 400mg/dL)として設定される。 測定 纖物質の濃度が濃度用閾値よりも大きいか小さレ、かの予想は、 第 2濃度（ d )を 演算することなく、光学的応答値 (たとえば吸光度）が予め定められた光学的応答 値用閾値よりも大きレ、か否かに基づいて行ってもよレ、。

第 2濃度 (d)が濃度演算用閾値よりも大きいと判断された には (S7 :YES)、第 1濃度 (D)と第 2濃度 (d)との大小を比較し (S8)、 値の大きな演算値を採用する (S9, S10)。つまり、第 2濃度 (d)よりも第 1濃度 (D)のほうが大きければ (S8： YES)、 最終的な演算,結果として第 1濃度 (D)を採用し (S10)、第 1濃度 (D)よりも第 2濃度 (d)のほうが大きければ (S8:N0)、最終的な演算結果として第 2濃度 (d)を採用する (S9)。

図 2力 ^分かるように、 検 線 (2)はプロゾーン様現象が生じているときの吸光 度に基づいて作成されたものであるのに対して、 検量線 (1)はプロゾーン様現象が 生じていないときの吸光度に基づいて作成されたものである。 そのため、 検 * /镍 (1)での演算結果と検¾線 (2)での演算結果を比較して値の大きなものを採用すれば、 プロゾーン様現象によって検 Λ線 (2)を使用すれば実際の濃度よりも低値な演算結 果がでる濃度領域では、 検 ¾泉(1)での演算値が採用される。 これにより、 プロゾ 一ン様現象の影響を回避した演算が可能となる。

一方、 第 2濃度 (d)が濃度演算用閾値よりも小さいと判断された ¾ ^には (S7 :N0)、 プロゾーン様現象が生じているために第 2濃度 (d)が小さいの力 \ ある いは単に濃度が小さいのかを判断する（S11)。プロゾーン様現象が生じているため に第 2濃度 (d)が小さいのであれば (S11 :YES)、 最終的な演算結果としては、 検量 線 (1)での演算値である第 1濃度 (D)を採用する（S10)。 一方、 プロゾーン様現象が -生じておらず、単に第 2濃度 (d)が小さいのであれば (S11 :N0)、最終的な演算結果 として第 2濃度 (d)をそのまま採用する（S9)。

以上に説明した手順では、 検量線 (2)を用いた場合に、 プロゾーン様現象の影響 を受ける相対的に高濃度な濃度範囲については、 検 ftH(l)での演算結果力 采用さ れる。そのため、検量線 (1), (2)の使!/ヽ分けという簡易な手法によ'りプロゾーン様現 象の影響を極力回避して、 再測定することなく高濃度領域での演算を適切に行え るようになる。 一方、 低濃度領域については、 検 線 (2)を用いて演算された第 2 濃度 (d)力 S採用されるため、先の再現性の検討結果からも分かるように、低濃度領 域での再現性が高くなる。

このような効果は、 図 6に示した手順に則して濃度演算を行った:^にも享受 することができる。 この濃度演算手順では、 まず図 5に示したフローの S1〜S6と 同様にして、 第 1濃度 (D)および第 2濃度 (d)を演算する (S20〜S25)。 次いで、 第 1濃度 (D)が濃度演算用閾値よりも大きいか否力を判断する (S26)。 つまり、 第 1 濃度 (D)を基準として、 これを濃度演算用閾値と比較して、測定 物質の相対的 に大きなものである力 \ あるいは相対的に小さなものであるかが判断される。 こ の点において、検 ft線 (2)を用いて演算した第 2濃度 (d)が濃度演算用閾値よりも大 きレ、か否かを判断する図 5に示した濃度演算手 J喟とは異なっている。

S26における判断の結果、 第 1濃度 (D)が濃度演算用閾値よりも大きければ (S26 ： YES)、 つまり相対的に高濃度であると判断された には、 最終的な演算結果 として、 検慰泉(1)での演算結果である第 1濃度 (D)を採用する（S27)。 一方、 第 1 濃度 (D)が濃度演算用閾値よりも小さければ (S26 ： NO)、 つまり相対的に低濃度で あると判断された には、 最終的な演算結果として、 再現性の高い検纖 (2)で の演算結果である第 2濃度 (d)を採用する（S28)。 この濃度演算手順では、 プロゾ ーン様現象の検知が不要であるという利点がある。

なお、 図 6に示した濃度測定手順においても、 濃度演算用閾値は、 2つの検量 線 (1)， (2)ともに直線性が高レ、濃度範囲 (200〜300mg/dLの範囲)内、 あるレ、は検慰泉 (1)と検量線 (2)との交点に相当する濃度 (400iig/dL強）として設定される。 後者のよ うに濃度演算用閾値を定める ¾ ^には、結局、 S27および S28において、検 ft線 (1), (2) での演算結果のうち、 値の大きなほうが最終的な演算結果として採用されること となる。 言い換えれば、 第 1濃度 (D)と第 2濃度 (d)との大小を比較して、 値の大 きなほうを最終的な演算結果として採用したのと同様な結果となる。 これに類似 する演算手法として、 以下に説明する検 ¾镍を使用する方法が挙げられる。 この の検 41泉は、 検纖 (1)と検獻泉(2)との交点を境界として、 これよりも高濃度 領域については検 4|泉(1)における対応部分を採用し、 低濃度領域については検量 線 (2)における対応部分を採用したものである。 この には、第 1濃度 (D)や第 2 濃度 (d)を濃度演算用閾値と比較し、あるいは第 1濃度 (D)と第 2濃度 (d)とを比較 する必要はな!/、といった利点が得られる。

次に、 本発明の第 2 'の実施の形態に係る濃度測定方法を説明する。 この濃度測 定方法では、 図 7に示した複数の検 ft線 (A)〜 (H)を使レ、分けて濃度演算が行われ る。 これらの検量線 (A)〜(H)は、 図 3のグラフを作成する際に測定した複数の吸 光度測定値に基づレ、て作成されたものである。具体的には、複数の検量線 (A)〜 (H) は、 複数の吸光度測定値を同一の測定ポイント毎にグループ化し、 個々のグルー 'プ毎 (測定ボイント毎)に作成したものである。換言すれば、複数の検 ft線 (A)〜 (H) は、 異なる反応時間 (複数の測定ポイント）毎に、 個別に作成されたものである。 これらの検 ¾镍 (A)〜 (H)を用!/ヽて濃度演算を行う ^^には、 図 8に示したよう に、まず上記した各測定ポイントにおいて吸光度を測定する（S30)。次いで、測定 ポイント 1での吸光度に基づいて、 複数の検 線 (A)〜(H)の中から濃度演算に最 適な検 線を選択する（S31)。 ここで、図 3を参照すれば分かるように、測定^ 物質の濃度が大きいほど、初期吸光度 （測定ボイント 1での吸光度)が大きくなつ ている。 そのため、 初期測定値に基づけば、 測定対象物質の濃度を適切に予想す ることができる。 したがって、 S31においては、その予想値に基づいて最適検 4/镍 が選択される。 より具体的には、予想値が大きいほど、測定ポイントの小さい (反 応時間の短い）ときの吸光度に基づく検量線が選択される。たとえば測定ボイント 1での吸光度が大きく、予想濃度が 900mg/dL以上の：^には検 *H(A)が選択され、 測定ボイント 1での吸光度が小さく、 予想濃度が 150mg/dL以下の場合には検 Λ镍 (H)が選択される。

最後に、 髓検嶽泉と、 この 検纖に対応する測定ポイントでの実測吸光 度と、 に基づいて濃度演算を行う（S32)。

S31のような手法により最適検爆泉を選択する^^には、この最適検 線に対応 する測定ボイントでの吸光度は、 図 3から予想されるように、 吸光度の経時変ィ匕 における最大値またはそれに近い値となる。 したがって、 本実施の形態の演算方 法では、 プロゾーン様現象の影響を抑制して、 適切な濃度演算が可能となる。 本実施の形態では、 複数の検 線を作成しておく必要がある反面、 プロゾーン 様現象の検知が不要であり、 また濃度演算用閾値を設定し、 これとの比較を行つ た上で検 ¾線を選択する必要もないため、 濃度測定手順が簡 匕されるといった 利点がある。 また、相対的に低濃度なものについては、測定ポイントの大きい (反 応時間が長い）ときの吸光度に基づいて作成された検 ¾線が選択されるため、低濃 度物質を測定する際の再現性が良好なものとなる。

なお、 本実施の形態にぉレヽては、 8つの測定ボイントにつレ、て作成された検量 線 (A)〜 (H)を用レ、て濃度演算を行う につレ、て説明したが、 検 ¾線の数は 8つ よりも多くてもよいし、 8つよりも少なくてもよレヽ。 また、 第 1の実施の形態に 係る濃度測定方法のように、 2つの測定ボイントの平均値として複数の検量線を 作成し、 これらを用いて同様な手順により濃度演算を行うようにしてもよい。 本実施の形態では、 測定ポイント毎に複数の検 ¾線を作成して、 p及光度の経時 変化における最大値またはそれに近レヽ値に基づいて濃度が演算されるようになさ れてレ、た。 これに類似する演算手法として、 図 9に実線で示した検 Λ锒 )を使 用する方法が挙げられる。 この検 ft锒（α)は、 図 3における同一濃度の複数のフ ロップ点の最大吸光度を集めて作成したものである。 図 9には、 本発明の第 1の 実施の形態で用レヽた検 線 (1)およぴ検嶽泉(2)を同時に示している。

図 9から分かるように、 検纖（a )は、 相対的に高濃度領域ではプロゾーン様 現象の生じてレ、なレ、検 ft線 (1)に相関している一方、 相対的に低濃度領域では再現 性の高レ、検 41 (2)に相関している。 したがって、 検 *H( a )を用いれば、 本発明 の第 1の実施の形態と同様な効果を享受することができる。 さらには、 プロゾー ン様現象の検知が不要であり、また検 41泉を選択するとレヽつた手順も不要となる。 上述の実施の形態では、 光学的応答値に基づレ、て濃度を演算する^を例にと つて説明したが、 本発明は、 反応系の種類によっては、 反応系に電圧を印加し、 あるレ、は電流を流したときの電気的な応答値、 反応の進行に伴う振動数の変化、 反応系に光や振動を与えたときの熱的な応答などに基づレ、て濃度を演算する:^ 'にも適用することができる。

第 1および第 2の実施の形態にぉレヽては、 プロゾーン様現象が生じる場合を例 にとつて説明したが、 本発明は高濃度領域において 旱能が低下する；^にも適 用することができる。 すなわち、 高濃度領域において吸光度が一定値に漸近する ような反応系を用いて濃度測定を行う におレヽて、 高濃度領域での濃度測定を 適切に行うために適用することができる。

Claims

- 請 求 の 範 囲

1 . 測定 物質およびこの物質と反応し得る反応物質を含む反応系からの出力 値に基づ ヽて、 複数の検量線の中から上記測定対象物質の濃度演算に最も適合し た髓検 *ϋを選択し、 カゝっ当該繊検 4 /線および上記出力値に基づいて、 上記 測定対象物質の濃度演算を行う濃度測定方法であって、

上記各検纖は、 濃度が既知の標職薬と上記反応物質とを含む標準反応系の 出力値を、 濃度の異なる複数の標準試薬のそれぞれについて、 反応時間を同一と して測定し、 そのときに得られる複数の出力値に基づレ、て作成されており、 上記複数の検 A は、 相互に異なる反応時間を »として作成されたものであ ることを 敫とする、 濃度測定方法。

2. 上記複数の検 Λ線は、 上記測定文豫物質の濃度が予め定められた濃度用閾値 よりも大きいと予想される^に選択される第 1検 ¾線と、 上記濃度用閾値より も小さいと予想される^ 1こ選択される第 2検 *泉と、 を有しており、 かつ、 上記第 1検置線は、 濃度が既知の標準物質と上記反応物質との反応の初期段階 におレヽて測定される出力値に基づレヽて作成されており、

上記第 2検 線は、 上記第 1検儘泉の作成の基礎となった出力値の測定時より も後において測定される出力値に基づいて作成されている、 請求項 1に記載の濃 度測定方法。

3. 上記第 2検¾線を用いて演算された第 2濃度演算値が、 上記濃度用閾値より も大きいと予想される には、 上記第 1検 ¾線を用いて演算された第 1濃度演 算値と、 上記第 2濃度演算値とを比較し、 値の大きい演算値を最終的な演算値と して採用する、 請求項 2に記載の濃度測定方法。

4. 上記第 2検 41泉を用いて演算された第 2濃度演算値が、 上記濃度用閾値より も小さいと予想される齢には、 上記第 2濃度演算値が上記測定纖物質の濃度 を反映したものである力否かを判断し、 上記第 2濃度演算値が上記測定驗物質の濃度を反映している: には、 上記 第 2濃度演算値を最終的な演算値として採用し、

上記第 2濃度演算値が上記測定 物質の濃度を反映してレ、な 、 には、 上 記第 1検 線を用いて演算された第 1濃度演算値を最終的な演算値として採用す る、 請求項 2に記載の濃度測定方法。

5. 上記第 1検 »|泉を用いて演算された第 1濃度演算値が上記濃度用閾値よりも —大きいと予想される： tj^には、 上記第 1濃度演算値を最終的な演算値として採用 し、

上記第 1濃度演算値が上記濃度用閾値よりも小さいと予想される には、 上 記第 2検 Λ镍を用レ、て演算された第 2濃度演算値を最終的な演算値として採用す る、 請求項 2に記載の濃度測定方法。

6. 上記測定^物質の濃度が上記濃度用閾値よりも大きいか、 ,あるいは小さい 力の予想は、 上記出力値が予め定められた出力値用閾値よりも大きレ、か否かによ り行う、 請求項 2に記載の濃度測定方法。

7. 上記濃度演算用閾値は、 上記第 2検 の 镍性が高い濃度範囲内に設定さ れる、 請求項 2に記載の濃度測定方法。

8. 上記濃度演算用閾値は、 上記第 1検 ft锒と上記第 2検 ¾線との交点に対応す る濃度に設定される、 請求項 2に記載の濃度測定方法。

9. 上記複数の検聽は、 濃度が既知の標職薬と上記反応物質とを含む標準反 応系の出力値を、 濃度の異なる複数の標準試薬のそれぞれについて一定時間毎に 複数の測定点において測定することにより、 測定点毎に作成されたものであり、 上記最適検 */锒の選択は、 上記測定 物質と上記反応物質との反応の初期段 階である時間範囲内において測定される出力値に基づいて行われる、 請求項 1に 記載の濃度測定方法。

10. 上記出力値は、 上記反応系に光を照射したときの光学的応答値である、 請求 項 1に記載の濃度測定方法。

11. 測定 物質およびこの物質と反応し得る反応物質を含む反応系からの出力 値と、 上記測定対象物質の濃度と出力値との関係を示す検齔線と、 に基づいで、 上記測定対象物質の濃度演算を行う濃度測定方法であって、

上記検 镍は、 濃度が既知の標職薬と上記反応物質とを含む標準反応系の出 力値を、 濃度の異なる複数の標準試薬のそれぞれについて特定時間範囲内におい て経時的に測定し、 各濃度の標^^薬を用いた^^における出力値の最大値の集 合に基づいて作成されていることを樹敷とする、 濃度測定方法。

12. 上記出力値は、 上記反応系に光を照射したときの光学的応答値である、 請求 項 11に記載の濃度測定方法。

"13. 測定 ¾ ^物質およびこの物質と反応し得る反応物質を含む反応系からの出力 値と、 上記測定対象物質の濃度と出力値との関係を示す検層泉と、 に基づいて、 上記測定対象物質の濃度演算を行う濃度測定方法であって、

上記検量線は、 濃度が既知の標準物質と上記反応物質との反応の初期段階にお レヽて測定される出力値に基づいて作成された第 1検爆泉と、 上記第 1検 ¾線の作 成の基礎となった出力値の測定時よりも後において測定される出力値に基づいて 作成された第 2検 4ί泉と、 を複合したものとして作成されており、 カゝつ、 上記検 Λ線は、 上記第 1検量線と上記第 2検 *|泉との交点に相当する交点濃度 よりも大きい濃度領域については、 上記第 2検量線における上記交点濃度よりも 大きい濃度領域の部分が採用され、 上記交点濃度よりも小さい濃度領域について は、 上記第 1検量線における上記交点濃度よりも小さい濃度領域の部分が採用さ

—れてレ、ることを特徴とする、 濃度測定方法。

14. 上記出力値は、 上記反応系に光を照射したときの光学的応答値である、 請求 項 13に記載の濃度測定方法。