WO2003095088A1 - Procede et appareil pour le prelevement d'un micromateriau - Google Patents

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Fumihito Arai
Toshio Fukuda
Akihiko Ichikawa
Tohoru Katsuragi
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Japan Science And Technology Agency
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    • G01N2015/1497—Particle shape

Definitions

  • the present invention relates to a method and an apparatus for recovering a specific minute object from a large number of minute objects. More specifically, the present invention relates to a method in which a particular minute object such as a DNA molecule, a cell, or a microorganism is mixed with another minute object. The present invention relates to a method and an apparatus for collecting. Conventional technology
  • the cell sorter method is effective for objects with a size of around several tens of m, it is difficult to apply it to microorganisms and other objects with a size of about several m, and the samples are arranged in a line. Because of this, sequential separation work was performed, and it was not possible to quickly extract an arbitrarily selected target from randomly dispersed samples.
  • the inventors have devised a high-speed separation system using a non-contact mobilization method in which separation is performed using a combination of a laser trap, dielectrophoresis, and microphone-cavity flow in a microfluidic circuit ( JP-A-11-346756, Japanese Patent Application No. 11-210750, JP-A-2001-095558, and JP-A-2001-145478). Since the microorganisms are transported directly by the laser trap, there is a risk of damaging the microorganisms. To avoid this, laser traps on the micro tools are used to push and pull the microorganisms, which is indirect. We have also devised a method of transporting to There was power S. Problems to be solved by the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for recovering a specific minute object such as a DNA molecule, a cell or a microorganism from a mixture of other minute objects, and which can solve the following problems. I do.
  • a substance that reversibly causes a phase transition between gel and sol is used. Focusing on using it as a medium, By devising a simple method for causing phase transition, we have completed a method for accurately and easily recovering minute objects.
  • a substance or a solution containing the substance that reversibly induces a phase transition between a gel and a sol in which a large number of minute substances are dispersed is poured into the minute channel.
  • a small object existing in a specific observation area is observed and selected, for example, with a microscope.
  • the target object is selected from those existing in the vicinity of the support (the bottom of the container, etc.), and the surrounding area is Gerried with the target locally. ) Can be fixed to. After the target is fixed to the support together with the gel, it flows into the microchannel to remove the non-fixed one. After sufficient removal, the medium is solified to lower the viscosity.
  • the target can be collected by regenerating the flow for collecting the target. '
  • the present invention relates to a method for recovering a desired minute object in a system including a medium, a support, and a minute object that causes a phase transition between a sol and a gel reversibly, and a method for recovering the minute object to be collected.
  • the minute object includes a desired minute object to be collected and an unnecessary minute object. According to the present invention, only the desired minute object can be extracted from the mixture with high accuracy.
  • This medium can be used in the method of the present invention as long as it causes reversible phase transition between sol and gel. Among them, it is convenient to use one that causes such a phase transition depending on the temperature. That is, the medium has a sol-gel phase transition temperature, and preferably gels when heated above the phase transition temperature and sol when cooled below the phase transition temperature. ,.
  • This phase transition temperature is preferably room temperature to 90 ° C., more preferably 20 to 85 ° (:, still more preferably 30 to 60 ° C.), although it depends on the properties of the microscopic object which is the object of the present invention. In particular, in order to separate and recover microorganisms, the phase transition temperature is preferably 30 to 50 ° C.
  • the medium is preferably a water-soluble cellulose derivative or a solution thereof.
  • the cellulose derivative is more preferably methylcellulose.
  • a medium a polymer of poly (N-isopropylacrylamide) and a polyethylene dalicol derivative may be used as a medium. This polymer is commercially available, for example, as Meviol Gel (registered trademark, Ikeda Rika Co., Ltd., transition temperature: 22 ° C). It is also possible.
  • methylcellulose (Metro ⁇ "'s SM) is usually turbid and gelich when heated with a 2% solution to about 55 ° C, and resolubilizes when cooled.
  • Methylcellulose is a fiber and is harmless to living organisms and humans because it is a fiber
  • the mixing temperature lowers when mixed with NaC1 or NaOH.
  • the addition of 15% NaC lowers the genoleration temperature to about 40 degrees.
  • methylcellulose exhibits a hysteresis characteristic in response to temperature-induced changes in viscosity. Therefore, if this property is used, multiple targets can be extracted.
  • the flow is as follows: 1. Heat the electrode to T2, which is just before the gelation start temperature, and the solution is completely sol.
  • step 3 multiple objects can be held on the heating electrode.
  • Steps 2 to 5 are repeated, and an arbitrary number of objects can be held.
  • the support is used for fixing the target object and for fixing the target object when removing unnecessary objects, so that there is no particular limitation as long as it can meet such a purpose.
  • it is a container in which a minute object and a medium are stored, but a support having a rod-like, plate-like, mesh-like, or lattice-like shape may be used separately from the container.
  • the material of the support There is no particular limitation on the material of the support.
  • the support is transparent, it is possible to illuminate the light and observe the target through the support, and further, it is possible to use a microscope of a type that is observed by a transmission illumination method. Therefore, it is preferable.
  • the medium causes a phase transition between sol and Ge / depending on the temperature, it is advantageous if the medium can be heated.
  • the support is a transparent electrode (ITO)
  • ITO transparent electrode
  • it can be heated locally by irradiating it with an infrared laser beam, or the whole or part can be heated by energization.
  • any object can be used as long as it is incorporated into the gelled medium, but the size is particularly several nm to about 200 ⁇ , preferably several nm. Those of about 30 m are suitable.
  • the method of the present invention is particularly suitable for separating and recovering minute objects such as DNA molecules, cells or microorganisms.
  • Such a small object usually has a force capable of visually discriminating the shape, size, color, fluorescence reaction, and the like of the sample by visual observation or through a microscope. May be identified. In the present invention, such selection does not necessarily need to be performed visually, and may be automated using an automatic identification device using a CCD camera or the like or a device that automatically detects a fluorescence reaction. .
  • background noise is regarded as a problem.
  • DNA near a cover glass is used by using thermal gelich. Fixing only the DNA, removing the DNA floating above, then removing the heat gelation and observing it can solve the problem of background noise.
  • the conventional method using evanescent illumination is a method in which evanescent light is used as excitation light to emit only fluorescent molecules in the immediate vicinity of glass.
  • An expensive optical system for evanescent illumination is required. If the method (thermal gelation) of the present invention is used, only the minute objects in the vicinity of the support shown in FIG. 3 can be temporarily fixed, and the fluorescent molecules and observation obstacles that become observation noise can be removed by washing. Observation with high sensitivity (low background noise) is possible with the fluorescent microscope used.
  • the means for reversibly inducing the phase transition between the gel and the sol may be appropriately selected depending on the properties of the substance which causes the phase transition between the gel and the sol. It is convenient to use a substance that causes a phase transition reversibly.
  • a microelectrode may be formed by microfabrication, and resistance wire heating may be performed, or local heating may be performed using an infrared irradiation device.
  • the resistance wire of the heating electrode or the like, and the object is a microorganism or the like
  • the insulator include silicon oxide, silicon nitride, polyimide resin, and the like.
  • the medium is heated to a phase transition temperature or higher by irradiating infrared rays, and the medium is cooled to a phase transition temperature or lower by stopping the irradiation.
  • the infrared irradiation device a known device can be used, but an infrared laser is preferably used. The laser may be applied to the object as it is, or may be irradiated using a lens or the like so as to be focused on the object.
  • the infrared laser, YAG Les one The one (N d-YAG laser), N d: YV_ ⁇ 4 laser, C 0 2 laser, but may use any one, such as ruby laser, YAG laser or N d: It is convenient to use a YVO laser.
  • a heating method hot water may be poured from an injection port.
  • the present invention provides a medium that reversibly causes a phase transition between a sol and a gel due to temperature, a space holding a support, a method of heating the entire support to a temperature equal to or higher than the phase transition temperature of the medium, Means for locally heating the medium above the phase transition temperature of the medium, a flow path for injecting the medium into the space, a flow path for injecting the cleaning liquid into the space, and a flow for discharging the cleaning liquid from the space.
  • An apparatus for collecting a minute object comprising: a path; and a flow path for discharging the medium from the space. These channels may also serve as other channels.
  • the apparatus suitably further infrared irradiation device for irradiating the space as a heating means, preferably infrared laser, more preferably a YAG laser, or N d: YV0 4 may comprise a, single
  • the one further infrared radiation A lens for condensing infrared light of the device into the space may be provided.
  • the apparatus may further include a microscope capable of observing the space. This device may also be equipped with a shape identification device using a CCD camera or the like, or a device that automatically detects the fluorescence reaction, etc. to automate the identification work.
  • FIG. 1 is a graph showing the change in viscosity of methinoresenorelose (Metroze SM) with respect to temperature. Shows hysteresis characteristics.
  • FIG. 2 shows a method of fixing an object by locally heating only the periphery of the object.
  • FIG. 3 shows a method of temporarily fixing only a minute object in the vicinity of the support by the method (thermal gelation) of the present invention and observing the same.
  • Figure 4 shows how the target is fixed with a gel and collected with a pipette.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a microchip.
  • the upper figure is a view of the microchip as viewed from above, and the lower figure is a cross section thereof.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of another microchip.
  • FIG. 3 is a view of the microchip as viewed from above.
  • FIG. 7 shows a state in which the laser was focused on the transparent electrode (left figure) and the methylcellulose was taken in the state of taking in the target in Example 2 (right figure) in Example 2.
  • Fig. 8 shows that in Example 3, the laser was focused on the transparent electrode (left figure) This is a picture of Lurose taking a target object and geroying (right figure).
  • FIG. 9 is a schematic diagram of a microchip.
  • a to D indicate heatable electrodes.
  • the vertical and horizontal channels are the same as those in FIG. The invention's effect
  • a sample is spread two-dimensionally, a special 1 "raw is compared, and a target is selected from randomly dispersed cells according to the present invention.
  • a target is selected from randomly dispersed cells according to the present invention.
  • the target is fixed with a gel and collected with a pipe.
  • Fig. 4 shows the situation.
  • Yeast (size: approx. 6 in) 0.1 Olg was mixed with 8 ml of a 2% aqueous solution of methylcellulose (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd .; t3 ⁇ 4, Methorose SM-400), and the substrate (surface) was spin-coated. (A glass on which an electrode (ITO) is deposited).
  • a target object can be observed with an inverted microscope.
  • N d: YV0 4 laser Spectra-Physics Inc., J20- iR-2E, Wavelength: 1 064 nm
  • an objective lens Olympus, UPlanApo III / 1.35
  • irradiation the periphery of the substrate is locally heated by the laser, and methylcellulose is gerried with the target. Therefore, this target is fixed on the substrate.
  • multiple targets were fixed to maintain the gel generated by laser irradiation for a certain period of time.
  • FIGS. 5 and 6 Schematic diagrams of the microchip used in this example are shown in FIGS. 5 and 6.
  • microchips have two intersecting channels. These two channels were molded by micromachining, and then molded using PDMS (polydimethylsiloxane) to produce microfluidic chips.
  • Fig. 5 shows two channels crossing each other in a cross shape
  • Fig. 6 shows two channels crossing a T type, and one discharge port for discharging sample and washing solution. Also serves as.
  • One flow path is a water flow path for introducing the sol / gel phase change material containing the target substance to be separated, and then washing and removing unnecessary substances other than the fixed target substance, and the other flow path.
  • the path is a flow path for collecting a fixed target.
  • the transparent electrode is energized and warmed, the surface of the transparent electrode is gelled, and the sample and impurities present near the surface are once fixed on the transparent electrode. Then, water is injected from the washing water injection port to remove unfixed methyl cellulose and the like.
  • the cooled transparent electrode is heated to a temperature close to the thermal gelation start temperature by passing current until the temperature does not exceed the thermal gelation start temperature, and the vicinity of the intersection of the two microchannels is observed with an inverted microscope, and the target object is observed. select.
  • the laser is focused and irradiated on the transparent electrode near the target (the sample above).
  • the transparent electrode near the focused area is heated, and the methylcellulose in the vicinity is gelled with the target taken in.
  • Fig. 7 shows the situation. After that, wash water is flown from the wash water inlet port to remove unnecessary substances such as unfixed methyl cellulose and discarded from the discharge port.
  • valve of the extraction port is opened to generate a flow for recovery, the energization of the transparent electrode is stopped, heating is stopped, and the target is recovered from the extraction port.
  • Example 2 The same microchip as in Example 1 was used except that transparent electrodes (ITO) were provided above and below the observation area.
  • ITO transparent electrodes
  • Example 2 The same mixture of the sample and methylcellulose as in Example 1 was injected into this microchip.
  • a method of fixing a target by heating a combination of overheating of the electrodes with electric current and local heating by laser irradiation is used.
  • Fig. 9 shows the outline of the microchip.
  • This microchip is set on the stage of the microscope.
  • the observation area can be changed according to the observation magnification of the microscope, and moving the stage enables observation over a wide area.
  • By preparing a plurality of electrodes it is possible to process a large amount of sample, and work efficiency can be improved.
  • fixing by heating the electrodes it is necessary to increase the number of electrodes in order to fix only one target object of several microns. For this reason, a large number of electrodes are required to extract only one target from thousands to tens of thousands of minute samples, which complicates the system. Therefore, prepare multiple electrodes that can fix thousands to tens of thousands of minute samples at a time. In this embodiment, four independent electrodes A to D were prepared.
  • Example 1 The sample of Example 1 was used, and valves were appropriately controlled at the time of sample introduction, washing, and collection as in Example 1.
  • the separation task can be automated.

Description

明 細 書 微小物体の回収方法及び装置 技術分野
この発明は、 多数の微小物体の中から特定の微小物体を回収する方法及び装置 に関し、 より詳細には、 D N A分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他 の微小物体と混在する中から回収する方法及び装置に関する。 従来技術
従来、 D N A分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体と混 在する中から回収する方法として、 マイクロピぺットを用いてシャーレ等に入つ たターゲットを光学顕微鏡下で観察しながら取り出したり、 セルソーターを用い る方法などがとられていた（日本機会学会論文集 67卷 635号 C編 146-153 (平 成 13年 1月）、 Electrophoresis 2001 , 22 , 283-288)。 し力 し、 マイク 口ピぺットを用いる方法では、 顕微鏡下で微小な試料を高純度で選別し回収する ためにはその作業に熟練した技術を要し、 その実施に膨大な時間と費用を要して いる。 また、 セルソーターによる方法では、 大きさが数十^ m前後の対象物には 有効性が示されているものの、数 ^ m程度の微生物等の対象物への適用は難しく、 サンプルを一列に整列させてシーケンシャルな分離作業を行うため、 ランダムに 分散したサンプルから任意に選ばれたターゲットを高速に取り出すことは不可能 であった。
また、 発明者らはマイクロ流体回路内でレーザートラップ、 誘電泳動、 マイク 口キヤビラリ一フローを複合的に利用して分離を行う非接触式マ-ビレーション 手法を用いた高速分離システムを考案した （特開平 11-346756、 特願平 11- 210750、 特開 2001 - 095558、 特開 2001 - 145478)。 しカ 、 直接レーザート ラップで微生物を搬送するため、 微生物に損傷を与える危惧があり、 これを避け るために、 マイクロツールをレーザートラップして、 微生物を押したり引いたり することで、 間接的に搬送する方法も考案したが、 実際は操作が難しい等の問題 力 Sあった。 発明が解決しょうとする課題
本発明は、 DN A分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体 が混在する中から回収する方法であって、 下記のような課題を解決できる方法を 提供することを目的とする。
1 . ランダムに分散した大量のサンプルから光学顕微鏡で観察しながら必要なサ ンプルを選択する。 これは一般のセルソーターでは不可能である。
2 . ランダムに分散したサンプルから任意のサンプルを選択する。必要なときに、 必要なものだけをとりだせる。
3 . 高速分離を可能とする。
4 . 多量のサンプノレ （例えば、 5万サンプル） 力ら数サンプルを選ぶ場合に、 簡 単かつ精度よく分離する。
5 . レーザーによる分離ターゲットへの直接照射を避け、 分離物の損傷を回避す る。 特に微生物を分離する場合には、 レーザー光が直接あたると、 温度上昇や紫 外線により微生物が死滅してしまう場合がある。
6 . 蛍光観察と画像処理を組み合わせて， 選択のプロセスを自動化する。 蛍光観 察を行う場合は、 観察面の垂直方向に存在する物体からの蛍光発光により、 バッ クグラウンドノイズが発生し、 蛍光観察の画像の分解能が低下し、 像がぼやける というの問題がある。 このため、ノイズの原因となる不要な物体を除去できれば、 バックグラウンドノイズを大幅に削減でき、 コントラストの高い観察が可能とな り、 近接場のような高額な光学系を備える必要がない等のメリットがある。
7 . 微生物の培養チップとあわせて、 集積ィ匕を可能とし、 分離から培養までをヮ
課題を解決するための手段
本発明においては、 細胞あるいは微生物ある 、は D N A分子などの微小物体を 多数含む溶液の中から目標とする微小物体のみを回収するために、 ゲルとゾルの 相転移を可逆的に引き起こす物質をその媒体として利用することに着目し、 その 相転移を起こさせる簡便な方法を考案して、 微小物体を精度よく力、つ簡便に回収 する方法を完成させた。
本発明の方法においては、 このような多数の微小物を分散したゲルとゾルの相 転移を可逆的に引き起こす物質又はそれを含む溶液を微小流路内に流し込む。 あ る特定の観察領域に存在する微小物体を、 例えば顕微鏡により観察して、 選択す る。 特に支持体 （容器の底面等） 付近に存在しているものの中から目標とするも のを選択して、 その周辺を局所的に目標物とともにゲルィヒすると、 目標物を支持 体 （容器の底面等） に固定することができる。 目標物をゲルとともに支持体に固 定したあとに、微小流路内に流れをおこして、固定されていないものを除去する。 十分に除去した後に媒体をゾル化することで粘度を下げる。 再ぴ、 目標物を回収 するための流れをおこすことで、 目標物を回収することができる。 '
即ち、 本発明は、 ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体、 支持体、 及 び微小物体から成る系において所望の微小物体を回収する方法であって、 回収し ようとする微小物体の周辺の媒体及び支持体を局所的にゲルィ匕して該微小物体を このゲ /レイ匕した媒体と共に該支持体に固定する段階、 該支持体上に固定されてい なレヽ媒体及び微小物体を除去する段階、 及びゲル化した媒体をゾル化して所望の 微小物体を回収する段階から成る微小物体を回収する方法である。 この微小物体 には回収したい所望の微小物体と不要な微小物体とが含まれており、 本発明によ れば、 この混合の中から所望の微小物体のみを高精度で取り出すことができる。 この媒体は、 ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こすものであれば、 本発明 の方法に用いることができる。 その中で特に温度によりこのような相転移を起こ すものを用いるのが簡便である。 即ち、 この媒体は、 ゾルとゲルの相転移温度を 有し、 該相転移温度以上に加熱されることによりゲル化し、 該相転移温度以下に 冷却されることによりゾル化することが好ましレ、。 この相転移温度は、 本発明の 対象である微小物体の性質にもよるが、 好ましくは室温〜 9 0 °C、 より好ましく は 2 0〜 8 5 ° (：、 更に好ましくは 3 0〜 6 0 °C、 である。 特に微生物を分離回収 するためにはこの相転移温度は 3 0〜5 0 °Cが好ましい。またこの場合、媒体は、 水溶性のセルロース誘導体又はその溶液であることが好ましく、 このセルロース 誘導体としてはメチルセルロースがより好ましく、 例えば、 信越化学工業社製メ トローズ SM、 S H、 S E等が挙げられる。 更に、 媒体として、 ポリ Nイソプロ ピルアクリルアミドとポリエチレンダリコール誘導体の重合物等を用いてもよレ、。 この重合物は、 例えば、 メビオールジェル （登録商標、 株式会社池田理化、 転移 温度 2 2 °C) として市販されてレ、る力 分子設計により転換温度を 3 0〜 3 2 °C に設定することも可能である。
例えば、 メチルセルロース （メトロ ^"ズ SM) は、 通常 2 %溶液で約 5 5 °Cに 加熱すると、 白濁してゲルィヒし、 冷却することで再びゾル化する。 この変化は温 度変化に対して可逆性があり、 メチルセルロースは繊維であるため生体、 人体に 無害である。 さらに、 N a C 1や N a OHなどを混入することでゲル化温度が低 下する。 例えば、 この 2 %溶液に N a C 1 5 %を加えるとゲノレ化温度が約 4 0 度に低下する。
メチルセルロース （メトローズ SM) は第 1図にあるように、 温度に起因した 粘度の変化に対して、 ヒステリシス特' I"生を示す。 このため、 この特性を利用する と、 複数のターゲットを取り出すことが可能となる。 以下にその流れを示す。 1 . 電極によりゲル化開始温度直前の T 2に加熱する。 このとき、 溶液中はすべ てゾル化している。
2 . 微生物や細胞や D N Aなどサンプ/レが混入した溶液を流し入れる。
3 . レーザーにより対象周辺のみをゲルイ匕開始温度を超え T 4まで加熱し、 ゲル 化する。 その後すぐにレーザーを切る。 しかし一度ゲルィ匕温度 T 4を超えている ため、 対象周辺はゲルイ匕したままになっており、 底面に保持されたままとなる。 また、 対象物が微生物のように、 直接レーザーを照射したりその他の加熱手段の より直接対象物をカロ熱することが適当でない場合には、 対象物の周辺を局所加熱 して対象物を加熱しないまま支持体に固定してもよい。 その例を第 2図に示す。
4 . 工程 3を繰り返すことで、 複数の対象を加熱電極上に保持することが可能で ある。 なお、 微生物や細胞を対象とする場合には、 通電によりこれらを死滅させ ないように、 加熱電極を絶縁体でカバーする。
5 . 非対象物を除去するためのクリーンな流れを流す。 このとき対象はゲルイ匕し た部分により底面に固定されており、 流されることは無い。 よって非対象のもの のみが除去される。 6 . 工程 2〜5を繰り返し、 対象物を任意数保持することが可能となる。
7 . 電極加熱を切ることで温度は瞬時に T 1になり、 対象周辺のゲル化部分が瞬 時にゾル化して底面に付着することなく流れに乗せることが可能な状態となる。 8 . 回収用の流れを流し、 対象を回収ポートより回収する。
後述の実施例では、 このヒステリシス特性をうまく使うと、 1電極上の複数の サンプルを取り出すことができる。
支持体は目標物を固定し、 不要物を除去する際に目標物を固定しておくための ものであるので、 このような目的にかなうのもであれば特に制限はない。 通常は 微小物体と媒体を入れておく容器であるが、 容器とは別に、 棒状、 板状、 網状あ るいは格子状などの形状をした支持体を用いてもよい。 支持体の材質には特に制 限はない。 但し、 支持体が透明であると、 その支持体を通して光を当てたり、 目 標物を観察したりすることが可能となり、 更に、 透過照明法により観察するタイ プの顕微鏡を利用することができるため、 好ましい。 また、 媒体が、 温度により ゾルとゲ^/の相転移を起こすものである場合には、 この媒体が加熱出来るもので あれば好都合である。 例えば、 支持体が透明電極 ( I T O) であれば、 これに赤 外レーザー光を照射して局部加熱することも出来るし、 通電により全体又は部分 を加熱することも出来るため特に好ましレ、。
また、 本発明の方法の対象である微小物体として、 ゲルイ匕した媒体に取り込ま れるものであればいかなるものでも対象とできるが、 特にサイズが数 n m〜約 2 0 0 μ πι,好ましくは数 n m〜約 3 0 mのものが適している。本発明の方法は、 特に、 DNA分子、 細胞又は微生物等の微小物体を分離回収することに適してい る。 このような微小物体は、 通常、 試料の形、 大きさ、 色、 蛍光反応などを目視 又は顕微鏡を通して目視で識別することができる力 この微小物体が何らかのマ 一力一を有することにより、 これにより識別してもよい。 本発明においては、 こ のような選択は必ずしも目視で行われることを必要とせず、 C C Dカメラなどを 用いた自動識別装置や蛍光反応を自動的に感知する装置などを用いて自動化して もよい。
なお、 D N A等の微小物体を観察するときにはバックグラウンドノィズが問題 視されているが、 本発明のように熱ゲルィヒを用いて、 カバーガラス付近の D NA だけを固定して、 上方に漂っている D N Aを除去した後に、 熱ゲルィ匕を解除して 観察すれば、 バックグラウンドノィズの問題を解決できる。
従来法のエバネッセント照明を利用する方法 （例えば、 ォリンパス光学工業製 の全反射蛍光顕微鏡システム、 T I R FM) は、 エバネッセント光を励起光とし てガラスのごく近傍の蛍光分子のみを光らせる方法であるが、 エバネッセント照 明のための高価な光学系が必要となる。 本発明の方法 （熱ゲル化） を用いれば、 第 3図に示す支持体近傍の微小物体だけを一時固定し、 洗浄によって観察ノイズ になる蛍光分子や観察障害物を除去できるため、 一般的に利用されている蛍光顕 微鏡で感度の高い （パックグラウンドノイズの低い） 観察が可能になる。
一般的に、 通常の水銀ランプによる落射蛍光観察ではバックグラウンドノイズ が観察の妨げとなるが、 本発明の方法を利用して観察したいサンプルだけを蛍光 物質で染色することで、 D NA以外の様々な試料の観察用途にも応用できる。 本発明において、 ゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす手段は、 ゲルとゾ ルの相転移を可逆的に引き起こす物質の性質によつて適宜選択すればよいが、 温 度によりゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質を用いるのが簡便である。 局所加熱の方法としては特に制限はないが、微小電極を微細加工により形成し、 抵抗線加熱を行つたり、 赤外線照射装置により局所的に加熱してもよレ、。
加熱電極等の抵抗線加熱を行う場合であって、 対象物が微生物等の場合には、 抵抗線を絶縁体で被覆して、 これらが通電により死滅しないような配慮をするこ とが好ましい。 絶縁体としては、 酸化シリコン、 窒ィ匕シリコン、 ポリイミド榭脂 等が挙げられる。
この局所加熱方法としては、 特に、 赤外線の照射により媒体を相転移温度以上 に加熱し、 この照射を止めることにより媒体を相転移温度以下に冷却することが 好ましい。 赤外線照射装置は公知のものを用いることできるが、 赤外レーザーを 用いることがよい。 レーザーは対象物にそのまま照射してもよいし、 レンズ等を 用いて対象物に集光するように照射してもよレ、。 赤外レーザーとしては、 YAG レ一ザ一 （N d— YAGレーザー）、 N d ： YV〇4レーザー、 C 02レーザー、 ルビーレーザーなどいかなるものを用いてもよいが、 YAGレーザー又は N d ： YVO レーザーを用いるのが簡便である。 また、 加熱方法として、 注入ポートから湯を注いでもよい。
また、 本発明は、 温度によりゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体及 ぴ支持体を保持する空間、 該支持体全体を該媒体の相転移温度以上に加熱する手 段、 該支持体を局部的に該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、 該空間に該媒 体を注入する流路、 該空間に洗浄用液体を注入する流路、 該空間から洗浄用液体 を排出する流路、 及び該空間から該媒体を排出する流路から成る、 微小物体の回 収装置である。 これらの流路はそれぞれの他の流路を兼ねてもよレ、。
この装置は、適宜、更に、加熱手段として前記空間を照射する赤外線照射装置、 好ましくは赤外レーザー、 より好ましくは YAGレーザー又は N d ： YV04レ 一ザ一を備えてもよく、 更に赤外線照射装置の赤外線を前記空間に集光するレン ズを備えてもよい。 またこの装置は、 更に、 前記空間を観察できる顕微鏡を備え てもよい。 この装置は、 更に、 C C Dカメラなどを用いた形状識別装置や蛍光反 応を自動的に感知する装置などを備え、 識別作業を自動化したものであってもよ レ、。 図面の簡単な説明
第 1図は、 メチノレセノレロース （メトローズ S M) の温度に対する粘度の変化を 示すグラフである。 ヒステリシス特性を示す。
第 2図は、 対象物の周辺のみを局所加熱して対象物を固定する方法を示す。 第 3図は、 本発明の方法 （熱ゲル化） により、 支持体近傍の微小物体だけを一 時固定して観察する方法を示す。
第 4図は、 目標物をゲルで固定して、 ピペットで回収する様子を示す。
第 5図は、 マイクロチップの概略図である。 上図はマイクロチップを上から見 た図であり、 下図はその断面である。
第 6図は、 別のマイクロチップの概略図である。 マイクロチップを上から見た 図である。
第 7図は、 実施例 2において、透明電極にレーザーを集光し（左図）、 メチルセ ルロースが目標物を取り込んだ状態でゲルイ匕した様子 （右図） を示す。
第 8図は、 実施例 3において、透明電極にレーザーを集光し （左図）、 メチルセ ルロースが目標物を取り込んだ状態でゲルイ匕した様子 （右図） を示す。
第 9図は、 マイクロチップの概略図である。 A〜Dは加熱可能な電極を示す。 縦と横の流路は第 7図のものと同様である。 発明の効果
従来のセルソーターはシリアルな流れをおこして分離を行っている力 本発明 によれば、 2次元的に試料を広げて特 1"生を比較し、 ランダムに分散した中から目 標物を選択することができる。 観察領域を広げることで、 1回の選別で 1万個〜 4万個の微小物体を比較して選別することができるため、 分離速度の高速ィヒが可 能となる。 また、 選択した目標物をマイクロチップの内部あるいはマイクロマ二 ピユレータに取り付け、 吸引したピぺットチップの内部に保持しておくことが可 能となるため、 必要なときに簡単に高速に取り出すことができる。 以下、 実施例により本発明を例証するが、 これらは本発明を制限することを意 図したものではない。
実施例 1
本実施例では、 目標物をゲルで固定して、 ピぺットで回収する。 その様子を第 4図に示す。
イースト菌 （サイズ：約 6 in) 0 . O l gをメチルセルロース （信越化学ェ 業ネ; t¾、 メ トローズ S M— 4 0 0 0 ) の 2 %水溶液 8 m 1に混合したものをスピ ンコートにより基板 （表面に電極 ( I T O) を成膜したガラス） 上に平面状に広 げる。
このように透明な基板を用いることで、 倒立顕微鏡で目標物を観察できる。 こ の基板を倒立型の光学顕微鏡 （オリンパス社製、 1 X 7 0 ) により観察して目標 物を選択する。 特に底面付近に存在しているものの中から目標とするものを選択 して、 その目標物付近の基板を、 N d ： YV04レーザー （Spectra-Physics 社製、 J20- iR-2E、 波長： 1 0 6 4 n m) を対物レンズ （オリンパス社製、 UPlanApo ΙΟΟχ/1 . 35) で集光して照射した。 この照射により、 この基板の周 辺が局所的にレーザーで加熱され、 メチルセルロースが目標物とともにゲルィ匕す るため、 この目標物は基板上に固定される。 この際、 レーザー照射により生成し たゲルは一定時間ゲルを保っため、 複数の目標物を固定した。
目標物をゲルとともに基板底面に固定したあとに、 それ以外の不要物を水で洗 浄し除去した。 十分に除去した後に目標物の加熱をとめて、 ゾノレ化することで固 定を解除し、 マイクロマニピュレータに取り付けた回収用のピペットを用いて目 標物を回収した。 実施例 2
本実施例で用いたマイクロチップの概略図を第 5図と第 6図に示す。
これらのマイクロチップは交差する 2つの流路を備えている。 これら 2つの流 路は微細加工により型をつくり、 P DM S (ポリジメチルシロキサン） により型 どりして微小流体チップを製作した。 第 5図のものは 2つの流路が十文字型に交 差しており、 第 6図のものは 2つの流路が T型に交差しており、 一つの排出ポー トがサンプルと洗浄液の排出を兼ねている。
一方の流路は分離したい目標物を含むゾル /ゲル相転移物質を投入し、 その後 固定した目標物以外の不要物を洗浄して除去するための水の流路であり、 もう一 方の流路は固定した目標物を回収するための流路である。
2つの流路の交差点 （観察領域） を倒立型の光学顕微鏡 （ォリンパス社製、 I X 7 0 ) により観察し、 N d ： Y V 04レーザー （Spectra - Physics社製、 J20- IR- 2E、 波長： 1 0 6 4 n m) を対物レンズ （オリンパス社製、 UPlanApo ΙΟΟχ/1 . 35) で集光して照射することが出来るようになつている。 この観察領域 の底には透明電極（松浪硝子工業 （株） 社製、 I T O付き薄板ガラス） を成膜し、 パターニングしてある。更に、この透明電極の表面を酸ィ匕シリコンでコートした。 このマイクロチップをこの光学顕微鏡のステージの上にセットした。 このステ —ジは可動であり、 観察領域を移動させながら、 顕微鏡による観察とレーザー照 射が出来る。
このマイクロチップの投入ポートから、 イースト菌 (サイズ：約 6 μ m) 0 . 0 1 gをメチルセルロース（信越化学工業社製、商品名：メ トローズ S M)の 2 % 水溶液 8 m 1に混合したものを投入する。 このとき、 抽出ポートのバルブは閉め ておく。
その後、 透明電極を通電して暖め、 透明電極の表面上をゲルィヒし、 表面付近に 存在する試料や不純物を透明電極上に一旦固定する。 その後、 洗浄水注入ポート より水を注入して、 固定されていないメチルセルロース等を除去する。
その後、 冷却した透明電極を、 熱ゲル化開始温度付近まで熱ゲル化開始温度を 超えな 、程度まで通電して暖め、 2本の微小流路の交差点付近を倒立顕微鏡で観 察し、 目標物を選択する。 目標物を選択したら目標物 （上記試料） 付近の透明電 極にレーザーを集光して照射する。 集光した付近の透明電極は加熱されて、 その 付近のメチルセルロースが目標物を取り込んだ状態でゲル化する。 その様子を第 7図に示す。 その後、 洗浄水注入ポートから洗浄水を流して固定されていないメ チルセルロース等の不要物を除去し、 排出ポートから捨てる。
次に、 抽出ポートのバルブを開けて、 回収用の流れを起こし、 透明電極の通電 を止めて加熱をとめ、 抽出ポートから目標物を回収する。
以後、 再び抽出ポートのバルブを閉めて、 投入ポートから試料を含んだ溶液を 投入し、 同様の手順を連続的に繰り返すことで、 目標物を必要数回収した。
第 5図のものに比べて第 6図のものの方が洗浄液や回収液の滞留が少ないため、 回収物の純度が高かった。 実施例 3
観察領域の上部と下部に透明電極 ( I T O) を設けた他は、 実施例 1と同様の マイクロチップを用いた。
このマイクロチップに実施例 1と同様の試料とメチルセルロースの混合物を投 入した。
両方の透明電極を通電して暖め、 試料や不純物を全てー且固定する。 その後、 実施例 1と同様の手順で目標物付近にレーザーを照射する。 その様子を第 8図に 示す。 その後、 透明電極の通電を止め、 洗浄水注入ポートより水を注入して、 不 要物を除去する。 その後、 残った目標物を回収した。 この方法によれば、 下部と上部の電極の局所加熱により固定を行うため、 底面 付近にない試料であっても環境中に固定できるメリットがある。 実施例 4
本実施例では、 加熱による目標物の固定方法として電極への通電過熱とレーザ 一照射による局所加熱を組み合わせた。 そのマイクロチップの概略を第 9図に示 す。
このマイクロチップを顕微鏡のステージ上に設置する。 顕微鏡の観察倍率に応 じて観察領域を変えることができ、 ステージを移動することで、 広範囲の観察が 可能となる。 電極の数は複数用意することで、 大量の試料を処理することが可能 となり作業効率が向上できる。 電極への通電過熱による固定では、 数ミクロン程 度の目標物を一つだけ固定するためには電極の数を増やす必要がある。このため、 数千から数万の微小物試料から目標物を一つだけ取り出すには多数の電極が必要 になり、 システムが複雑になる。 そこで、 一度に数千から数万の微小物試料を一 度に固定できる電極を複数用意する。 本実施例では電極 A〜Dまで 4つの独立し た電極を用意した。
実施例 1の試料を用レヽ、 実施例 1と同様に、 試料導入時や洗浄時や回収時に適 宜バルブの制御を行つた。
まず、 微小物試料を投入後、 全ての電極に通電加熱して、 微小物試料を固定し た。 必要に応じて、 洗浄水を流して固定されていない試料は捨てた。 次に、 電極 Aの通電加熱をやめて、 電極 A上の微小物試料を評価して目標物を決め、 レーザ 一照射による局所加熱により目標物を固定した。 固定後は洗浄水を流して、 電極 A付近の目標物以外の資料を捨てた。 その後、 電極 Aを通電加熱して先ほど選択 した目標物を固定し、 レーザー照射をやめた。 次に電極 B上の微小物試料を評価 して先ほどと同じプロセスを繰りかえした。 電極 C、 Dについても同様の手順を 繰り返して、 少なくとも 4個の目標物を固定した。 最後に洗浄後に欲しい目標物 がのつている電極だけ通電加熱をやめ、 回収用の流れによってその目標物だけを 抽出した。
なお、 ここでは電極が 4つの例を示したが、 電極の数を増やせば、 大量の試料 を高速に処理することが可能となる。 顕微鏡のステージを自動化すれば、 分離作 業を自動化することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ゾルとゲノレの相転移を可逆的に引き起こす媒体、 支持体、 及び微小物体か ら成る系において所望の微小物体を回収する方法であって、 回収しようとする微 小物体の周辺の媒体を局所的にゲルィヒして該微小物体をこのゲル化した媒体と共 に該支持体に固定する段階、 該支持体上に固定されていない媒体及び微小物体を 除去する段階、 及びゲル化した媒体をゾル化して所望の微小物体を回収する段階 力 成る微小物体を回収する方法。
2 . 前記媒体が、 ゾルとゲルの相転移温度を有し、 該相転移温度以上に加熱さ れることによりゲル化し、 該相転移温度以下に冷却されることによりゾル化する 請求項 1に記載の方法。
3 . 前記相転移温度が室温〜 9 0 °Cである請求項 2に記載の方法。
4 . 前記媒体が水溶性のセルロース誘導体又はその溶液である請求項 2又は 3 のいずれか一項に記載の方法。
5 . 前記セルロース誘導体がメチルセルロースである請求項 4に記載の方法。
6 . 前記支持体が透明である請求項 1〜 5のいずれか一項に記載の方法。
7 . 前記支持体が透明電極 ( I T O) である請求項 6に記載の方法。
8 . 前記微小物体が識別のためのマーカーを有する請求項 1〜 7のいずれか一 項に記載の方法。
9 . 前記微小物体が D N A分子、 細胞又は微生物である請求項 1〜 7のいずれ か一項に記載の方法。
1 0 . 前記媒体を相転移温度以上に加熱する手段が赤外線の照射によるもので あり、 相転移温度以下に冷却する手段がこの照射を止めることである請求項 2〜 9のいずれか一項に記載の方法。
1 1 . 前記加熱手段が赤外レーザーである請求項 1 0に記載の方法。
1 2 . 前記赤外レーザーが Y A Gレーザー又は N d ： Y V 04レーザーである 請求項 1 1に記載の方法。
1 3 . 温度によりゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体及び支持体を 保持する空間、 該支持体全体を該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、 該支持 体を局部的に該媒体の相転移温度以上に加熱する手段、 該空間に該媒体を注入す る流路、 該空間に洗浄用液体を注入する流路、 該空間から洗浄用液体を排出する 流路、 及び該空間から該媒体を排出する流路から成る、 微小物体の回収装置。 14 · 前記媒体が水溶性のセルロース誘導体又はその溶液である請求項 13に
5. 前記セルロース誘導体がメチルセルロースである請求項 14に記載の装
16. 前記支持体が透明である請求項 13〜15のいずれか一項に記載の装置。 17. 前記支持体が透明電極 (ITO) である請求項 16に記載の装置。
18. 更に、 加熱手段として前記空間を照射する赤外線照射装置を備えた請求 項 13 -17のいずれか一項に記載の装置。
19. 前記赤外線照射装置が赤外レーザーである請求項 18に記載の装置。 20. 前記赤外レーザーが Y AGレーザー又は Nd ： YV04レーザーである 請求項 19に記載の装置。
21. 更に、 赤外線照射装置の赤外線を前記空間に集光するレンズを備えた請 求項 20に記載の装置。
22. 更に、 前記空間を観察できる顕微鏡を備えた請求項 13〜21のいずれ か一項に記載の装置。
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