WO2004061444A1

WO2004061444A1 - 薄型分析用具

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Publication number: WO2004061444A1
Application number: PCT/JP2003/016132
Authority: WO
Inventors: Hideaki Yamaoka
Original assignee: Arkray, Inc.
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2004-07-22
Also published as: CN1729394A; EP1577665B1; JP4352153B2; EP1577665A1; EP1577665A4; JPWO2004061444A1; US20060231396A1; CN100487442C; AU2003289373A1

Abstract

　本発明は、試薬部(33)が配置され、かつ試料液を保持するための反応空間(６)を備えた分析用具(１)に関する。試薬部(33)は、反応空間(６)に試料液が保持されたときに溶解するように構成されている。反応空間(６)の一部は、互いに対面する第１および第２面(31ｃ,5a)によって規定されており、第１および第２面(31ｃ,5a)の対面距離(H1)が45μm以下に設定されている。対面距離(H1)は、たとえば第１または第２電極(31,32)の上面(31ｃ,32ｃ)から、第２板材(５)における当該電極(31,32)の上面(31ｃ,32ｃ)に対面する部分(5a)までの最小距離とされる。

Description

明細書薄型分析用具技術分野

本発明は、血液などの試料液中の特定成分 (たとえばグルコースゃコレステロ一ル)の濃度を分析する際に使用される分析用具に関する。背景技術

糖尿病患者にとつては、血糖値を管理するために日頃から自己の血糖値を把握しておくことは重要である。その一方、頻繁に医療機関に足を運ぶのが煩わしいこと力ら、患者自身が簡易に血糖値の測定を行え、しかも出先などでも血糖値の測定を手軽に行えるように、手のひらに納まるようなサイズの携帯型の簡易血糖値測定装置が用いられている。このような血糖値測定装置を用いての血糖値測定は、酵素反応場を衝共するグルコースセンサを血糖値測定装置に装着し、ダルコースセンサに対して血液 (検体)を供給することにより行われている。

グルコースセンサとしては、アンべロメトリー法やクーロメトリー法に代表される電気ィ匕学的手法を利用して、簡易血糖値測定装置においてグルコース濃度を測定できるように構成されたものがある。この種のグルコースセンサは、たとえば 1対の電極 (作用極および対極）と、試薬層と、この試薬層を内部に収容したキャビラリと、を備えたものとして構成されている。

アンぺロメトリ一法を採用する ¾ ^には、たとえば作用極および対極は同一平面状に横並びして、あるいは互いに対向して配置され、クーロメトリー法を採用する^^には、一般に、作用極および対極は対向するようにして配置される。試薬層は、酸化還元酵素および電子伝達物質を含んだものとして構成されるが、酸ィ匕還元酵素としては GODが、電子伝達物質としてはフエリシアン化力リゥムが汎用されている。このようなグルコースセンサでは、キヤビラリを利用して試薬層に検体が供給されたときに、酸化還元酵素によって、たとえばグルコースの酸化反応が触媒される一方で、電子伝達物質の還元反応が触媒される。グノレコースセンサに対する血液の供給は、一般に、測定者の皮膚を切開して血液を出液させ、この血液をグルコースセンサに導入することにより行われている。この方法では、血液採取に対する測定者への負担を小さくする観点からは、採取すべき血液量が少なレ、ほうが好ましレ、。そのため、検体量の低減のために様々な改良が検討されている（たとえば日本国特表 2000-509507号公報および米国特許出願公開第 2002/0092612号明細書参照)。

日本国特表 2000- 509507号公報には、クーロメトリ一法を利用して少なレ、サンプル量でグルコース濃度を測定できるように、作用極および対極を対向配置し、かつ電極間の離間距離を 50 m以下としたグルコースセンサが開示されている。このグルコースセンサでは、使用すべき血液量を少なくすることはできるが、クーロメトリー法は殆ど全てのグ'ルコースを反応させる方法であるため、測定時間が著しく長くなつてしまうといった問題がある。

これに対して、米国特許出願公開第 2002/0092612号明細書には、サンプル量を 1. 5 L以下と少なくしつつも、測定時間を 10秒と短くしたグルコースセンサが開示されている。このグノレコースセンサでは、基板とカバーとの間に、作用極、対極およひ層を配置したキヤビティが形成されており、基板とカバーとの間の距離が 200 m以下とされている。このダルコ一スセンサでは、試薬層は、たとえばグルコースォキシダーゼおよびフエリシアン化物を含んだ状態で作用極の表面に固定化され、非水溶性とされている。

しかしながら、米国特許出願公開第 2002/0092612号明細書に開示されたダルコースセンサにおいても、測定時間の縮が十分であるとは言レ、難く、また測定精度の面にぉレ、て未だ改善の余地がある。発明の開示

本発明は、測定時間を短く維持しつつも、微量の試料液によって精度良く濃度測定を行えるようにすることを目的としている。

本発明者は、上記した目的を達成すべく鋭意検討した結果、従来のグルコースセンサにおいて測定時間を短くすることができない原因の 1つが試薬層の構成にあることに着目し、本発明をするに至った。すなわち、従来のグルコースセンサの試薬層では、試薬層を作用極の表面に固定化しているために、グルコースとグルコースォキシダーゼとの反応が作用極の表面にぉレ、てのみ生じ、グルコースとグルコースォキシダーゼの反応に時間を要して測定時間が長くなる。このような不具合を解消するためには、試薬層を試料液 (血液)によって溶解しやすレヽ構成とすることが考えられる。この、電子伝達物質が試料液 (血液)中を拡散することとなるため、電子伝達物質の拡散に影響を与える因子、たとえば試料液の固体成分 (血液における血球成分など)の割合の影響、あるいは試料液のの影響を排除する必要が生じる。また、フェリシアン化物のように血液に対する溶解性が比較的に小さいものを用いると、溶解時間が長くなつて測定時間が長くなる。

本発明者はさらに、測定精度をさらに向上させるためには、次に説明する点を改善することが望ましいとの知見も得ている。すなわち、第 1に、フェリシアンィヒ物のように血液に対する溶解性が比較的に小さいものを用いると、？容角針生のバラツキに起因して測定精度が割匕する虞がある。また、フェリシアン化物は保存安定†生が悪く、保存時において容易に還元体へと樹亍するため、この点においても測定精度が低下することが懸念される。第 2に、グルコースォキシダーゼは、グルコースとの反応速度が比較的に小さレ、 (Km (ミカエリス定数)が大きい)ため、グルコースォキシダーゼを使用することは測定時間を短縮する上では好ましくなレ、。

以上の事情に鑑み、本発明においては、試料液を保持するための反応空間を備えた分析用具であって、上記反応空間には、試料液力 S保持されたときに溶解する試薬部が配置されており、上記反応空間の一部は、互いに対面する第 1および第 2面によつて規定されており、力つ上記第 1および第 2面の対面距離が 45 μ m以下に設定されている、薄型分析用具が ¾f共される。対面距離は、好ましくは 25〜45 の範囲とされる。

本発明の薄型分析用具は、たとえば互ヽに対向した状態で間隔を隔てて配置され、力反応空間を規定する第 1および第 2板材を備えたものとして構成される。この、第 1および第 2面は、たとえば第 1および第 2板材の厚み方向に直交する方向に広がりをもつ面とされる。本発明の薄型分析用具は、たとえば第 1板材の一面に設けられ、カゝっ少なくとも一部が反応空間に臨むとともに、試料液に mffiを印加するために利用される第

1および第 2電極を備えたものとして構成される。この、対面距離は、第 1 または第 2 ®t亟の上面 (たとえば第 1面に相当）から、第 2板材における当該電極の上面に対面する部分 (たとえば第 2面に相当）までの最小距離として定義される。本発明の薄型分析用具は、第 1板材に設けられた第 1電極と、第 1電極に対面するように第 2板材に設けられ、力ゝっ第 1電極とともに試料液にを印加するために利用される第 2電極と、を備えたものとして構成してもよい。この^、対面距離は、第 1電極の上面 (たとえば第 1面に相当）と第 2電極の上面 (たとえば第 2面に相当）との間における最小距離として定義される。

反応空間は、たとえば毛細管力により試料を移動させることができるように構成される。

試薬部は、たとえば電子伝達物質および酸化還元酵素を含んだものとして構成される。 '

電子伝達物質としては、 Ru化合物を用いるのが好ましレヽ。 Ru化合物としては、下記化学式 (1)で示されるものを使用することができる。

[Ru (NH₃) ₅Χ] ^{η +} · · - (1)

化学式 (1)においては、 Xとしては、 NH₃、ハロゲンイオン、 CN、ピリジン、ニコチンアミド、あるレ、は 0が挙げられる力 Xは NH₃またはハロゲンイオンであるのが好ましい。ィ匕学式 (1)における n+は、 Xの種類により決定される酸化型 Ru(ni) 錯体の価数を表している。

酸化還元酵素としては、分析文像成分がグルコースである場合には、ダルコ一ス ¾素活性を有する GDHを使用するのが好ましい。 GDHとしては、 FADを補欠因子とするグルコース IfcK素酵素 GDH)を使用するのが好ましい。 GDHとしてはさらに、 a GDHにチトクロム Cが結合した GDH (CyGDH)を使用するのが好ましレ、。 CyGDH および aGDHとしては、国際公開^ W002/36779号パンフレツトに開示されているものが挙げられる。 GDHとしては、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来のものを使用するのが好ましいが、 CyGDHや aGDHと同じ FADおよびチトクロム Cをもつ他属の微生物に由来の GDHを使用することもできる。他属の例として Ralstonia あるいは^ £/c/cW7077aS属の中で病原性を持つグラム陰性菌が挙げられる。

たとえば aGDHは、グルコース fcK素活性を有するサブュニットとして、還元条件下での SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約 60kDaである GDH活性タンパク質サブユニット）を含んだものである。一方、 CyGDHは、 αサブュニットと、還元条件下での SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約 43kDaである電子伝達タンパク質 (チトクロム C)と、をサブュニットとして含むものである。 Q; GDHや CyGDHとしては、サブュニットゃチトクロム C以外のサブュニットをさらに有するものを使用することもできる。

CyGDHは、たとえばブルクホルデリア ·セパシァに属する微生物が菌体外に分泌した酵素を精製し、あるいは当該菌体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。一方、 aGDHは、たとえばブルクホルデリア'セパシァに属する微生物から採取したひ GDHをコードする遺伝子が移入された形質転換体を形成し、この形質転換体から外部に分泌された酵素を精製し、あるいは当該形質転換体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。

ブルクホルデリァ ·セパシァに厲する微生物としては、たとえばブルクホルデリァ ·セパシァ KS1株を使用することができる。この KS1株は、平成 12年 9月 25日に独立特許法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（亍 305 - 8566 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 )に微生物受託番号薪 ERM BP - 7306として寄託されている。

試料液としては、たとえば血液、尿、唾液およびこれらの調整液などの生化学的試料が挙げられ、分析対象成分としては、たとえばグルコース、コレステロ一ル、乳酸およびァスコルビン酸が挙げられる。図面の簡単な説明

図 1は、本発明に係るバイォセンサの全体斜視図である。

図 2は、図 1の Π - Π線に沿う断面図である。

図 3は、図 1に示したバイォセンサの分解 # 見図である。

図 4は、図 1ないし図 3に示したバイォセンサを濃度測定装置に装着した状態を示すものであり、バイオセンサについては平面図で、濃度測定装置についてはプロック図で示したものである。

図 5 Aおよび図 5 Bは、バイオセンサの作用を説明するためのものであり、バィォセンサの要部断面図である。

図 6 Aおよび図 6 Bは、バイオセンサの他の例を示す断面図である。

図 7は、本案バイオセンサ 1に対する血液のへマトクリツト値の影響を示すグラフである。

図 8は、本案バイォセンサ 2に対する血液のへマトクリツト値の影響を示すグラフである。

図 9は、比較バイオセンサ 1に対する血液のへマトクリツト値の影響を示すグラフである。

図 10は、本案バイォセンサ 1に対する血液の温度の影響を示すグラフである。図 11は、本案バイオセンサ 2に対する血液の温度の影響を示すグラフである。図 12は、比較バイォセンサ 1に対する血液の温度の影響を示すグラフである。図 13は、本案バイォセンサ 1に対する測定レンジの評価結果を示すグラフである。

図 14は、本案パイォセンサ 3に対する再現性を、応答電流値のタイムコースとして評価した結果を示すダラフである。

図 15は、本案バイオセンサ 4に対する再現性を、応答電流値のタイムコースとして評価した結果を示すダラフである。

図 16は、比較バイオセンサ 2に対する再現性を、応答電流値のタイムコースとして評価した結果を示すグラフである。

図 17は、本案バイォセンサ 3， 4および比較バイォセンサ 2に対する再現性を、 C. V.のタイムコースとして評価した結果を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面を参照しつつ具体的に説明する。本実施の形態においては、血糖値を測定するように構成されたグノレコースセンサを例にとって説明するが、本発明は、血糖値を測定する場合に限定されず、血液中の他の成分あるいは血液以外の試料液を分析する分析用具に対しても適用することができる。

図 1ないし図 3に示したグルコースセンサ 1は、濃度測定装置 2に装着して使用するものであり（図 4参照)、長矩形状の基板 3に対して、スぺーサ 4を介してカバー 5を積層した形態を有している。このグノレコースセンサ 1においては、各要素 3〜 5により反応空間 6が規定されている。この反応空間 6は、矩形断面を有する柱状の空間として規定されており、開口部 (導入口） 61から導入された試料液を毛細管力を利用して移動させ、カゝっ導入された試料液を保持することができる。

スぺーサ 4は、基板 3の上面 30からカバー 5の下面 5 aまでの距離、すなわち反応空間 6の高さ寸法を規定するためのものである。このスぺーサ 4には、先端部が開放したスリツト 41が形成されている。スリツト 41は、反応空間 6の幅寸法を規定するためのものであり、スリット 41における先端の開放部は、反応空間 6 の内部に試料液を導入するための導入口 61を構成するためのものである。

カバー 5は、排気口 51を有している。非気口 51は、反応空間 6の内部の気体を外部に排出するためのものであり、反応空間 6の内部と連通している。したがつて、導入口 61を介して反応空間 6内に試料液が導入された:^には、反応空間 6 において生じる毛細管力により、試料液がカバー 5に形成された排気口 51に向けて反応空間 6の内部を移動する。

図 3によく表れているように、基板 3の上面 30には、作用極 31、対極 32および試薬部 33が形成されている。作用極 31および対極 32は、全体として纖 3の長手方向に延ぴている。作用極 31および対極 32の端部 31 a , 32 aは、鎌 3の短手方向に延び、力つ長手方向に並んでいる。一方、作用極 31および対極 32の端部 31 b，32 bは、後述する濃度測定装置 2の第 1および第 2端子 20 a，20 b (図 4参照）と翻させるための端子部を構成している。

作用極 31および対極 32は、たとえばスクリーン印刷、メツキ、あるいはスパッタリングにより、厚み寸法 D (図 2参照)が 20 μ ιη以下にされている。好ましくは、作用極 31および対極 32の厚み寸法 Dは、：！〜 10 ηιに設定される。作用極 31の上面 31 cからカバー 5の下面 5 aまでの対面距离 IH1 (図 2参照）は、 45 μ m以下、好ましくは 25〜45 μηιに設定されている。これは、対面距离 |Η1が不当に大きいと、後述するように血液のやへマトクリツト値の影響を受け易レヽ反面、対面距离 IH1が不当に小さいと、反応空間 6の内部にお!/、て血液を適切に移動させることができなくなるからである。

試薬部 33は、たとえばメディエータ（電子伝達物質)および相対的に少量の酸化還元酵素を含む固体状に形成されており、図 2および図 3によく表れて！/、るように、作用極 31および対極 32の端部 31 a， 32 aどうしを撟渡すようにして設けられている。この試薬部 33は、血液に対して容易に溶解するものとされている。したがつて、反応空間 6に血液を導入した:^には、メディエータ、酸化還元酵素およぴグルコースを含む液相反応系力 S構築される。この液相反応系においては、作用極 31の上面 31 cのみならず、反応空間 6における広範囲にわたってグルコースの酸化反応と、メディエータの還元反応が生じる。したがって、作用極の表面にメディエータゃ酸化還元酵素を固定化するに比べて、より短時間でより多くのグルコースを酸化させることができる。これにより、測定時間の失縮を図ることができるようになる。

メディエータとしては、 Ru化合物を使用するのが好ましい。 Ru化合物としては、たとえば錯体が挙げられる。 Ru錯体としては、電子伝達体として機能すればその配位子の種類は特に限定されなレヽが、試薬部 33に酸化型の状態で含ませるのが好ましく、たとえは化型が下記化学式 (2)で示されるもの力 S使用される。

[Ru(NH₃) ₅X] ^{n +} · · ' (2)

化学式 (2)における Xとしては、 NH₃、ハロゲンイオン、 CN、ピリジン、ニコチン了ミド、あるいは 0が挙げられる力 NH₃またはハロゲンイオンが好ましい。一方、ィ匕学式における n+は Xの種類により決定される酸化型 (m)錯体の価数を表してレ、る。

Ru錯体は、還元型（Π)が不安定なために通常は酸化型 (ΙΠ)として存在する。そのため、グルコースセンサ 1の試薬部 33に Ru錯体を混在させた状態で光や水に曝露されたとしても、メディエータが容易に還元してしまうことはない。そのため、メディエータの曝露に起因して測^ m差が生じることを抑制することができるようになる。また、 Ru錯体は結晶化しにくく、微粉末状態を適切に維持することができるといった特性を有している。そのため、 Ru錯体を用レヽれば、保存時に試薬部 33の溶解性が匕することもなレヽ。さらには、 Ru錯体と a GDHや CyGDHとの組み合わせにっレ、ていえば、 Ru錯体の電子伝達速度が大きレ、ために測定時間を短くすることができるといつた利点がある。

—方、酸化還元酵素としては、上述した a GDHまたは CyGDHを使用するのが好ましい。これらの酵素は、グノレコースォキシダーゼに比べてグノレコースに対する反応速度が大きいといった利点がある。この点からも、測定時間の短縮を図ることができるようになる。

図 4に示したように、濃度測定装置 2は、第 1および第 2端子 20 a , 20 b , W± 印加部 21、電流値測定部 22、検知部 23、制御部 24、演算部 25および表示部 26を備えている。

第 1および第 2端子 20 a , 20 bは、濃度測定装置 2に対してダルコースセンサ 1 を装着した ^に、グルコースセンサ 1における作用極 31および対極 32の端部 31 b， 32 bに翻虫させるためのものである。

印加部 21は、第 1および第 2端子 20 a , 20 bを介して、グノレコースセンサ 1 の作用極 31と対極 32との間に ®£を印加する際に利用される。 ®£印加部 21としては、たとえば乾電池または充電池などの直流原が使用される。

電流値測定部 22は、作用極 31および対極 32間への電圧印加時における作用極 31 とメディエータとの間の電子の授受量を、応答電流値として測定するためのものである。

検知部 23は、濃度測定装置 2にグルコースセンサ 1を装着した後において、電流値測定部 22によつて測定された電流値に基づレ、て、試薬部 33 (図 1ないし図 3参照)に試料液が供給された力ゝ否カゝを石健忍するためのものである。

制御部 24は、 ®ΞΕ印加部 21を制御し、作用極 31および対極 32の間に王が印カロされる状態 (閉回路）と印加されない状態 (開回路）とを選択するものである。

演算部 25は、電流値測定部 22により測定された応答電流値に応じて、ダルコ一ス濃度の演算を行うものである。演算部 25は、たとえばグルコース濃度をアンべロメトリックな手法により演算できるように構成されている。アンべロメトリツクな手法を用レ、れば、クーロメトリックな手法を採用するよりも、短時間で濃度測定を行うことができる。検知部 23、制御部 24、および演算部 25のそれぞれは、たとえば CPUおよひ 0Mや丽などのメモリにより構成される力検知部 23、制御部 24、および演算部 25の全てを、 1つの CPUに対して複数のメモリを接続することにより構成することも可能である。

表示部 26は、演算部 25による演算結果の他、たとえばエラーである旨や操作手順などを表示するためのものであり、たとえば液晶表示装置により構成される。次に、グルコースセンサ 1および濃度測定装置 2を用いたグルコース濃度の測定の手順にっレ、て説明する。

図 4に良く表れているように、まずグルコースセンサ 1を濃度測定装置 2に装着する。そうすると、グルコースセンサ 1の作用極 31および対極 32の端部 31 b， 32 bが濃度測定装置 2の第 1および第 2端子 20 a , 20 bに翻虫する。この状態では、第 1および第 2端子 20 a， 20 bを介して、作用極 31および対極 32の間への電圧の印加が可能とされている。実際の測定においては、濃度測定装置 2にグルコースセンサ 1を装着した時点から、作用極 31と対極 32との間に定 ®ΐが印加される。 Ru 錯体は、低 ABEでメディエーシヨンを起こすため、 Ru錯体を用いる: ^には、作用極 31および対極 32の間に印加する定電圧は、たとえば 100〜500mVの範囲に設定される。本実施の形態では、作用極 31および対極 32の間への定¾£の印加は、グルコース濃度を演算するための応答電流値が測定されるまでは継镜して行われているものとする。

次いで、グルコースセンサ 1の導入口 61を介して反応空間 6に血液を導入する。血液は、毛細管力により導入口 61からカバー 5に形成された排気口 51に向けて反応空間 6内を進行する。その過程においては、血液力 S試薬部 33を溶解させる。

—方、試薬部 33に血液が供給されれば、酸化還元酵素によりグルコースがダルコノラタトンに酸ィ匕されるとともにメディエータが還元型とされる。なお、ダルコノラタトンは非酵素的にグノレコン酸となる。

還元型のメディエータは、作用極 31および対極 32の端部 31 b , 32 bを介して作用極 31および対極 32に定を印カロした状態では、作用極の端部 31 a側に移動し、この端部 31 aに電子を放出して酸化型のメディエータとなる。したがって、 ®ΐ 印加部 21により作用極 31および対極 32間に定 ®£を印カロした状態では、還元型メディエータから付与された電子量が作用極 31および第 1端子 20 aを介して電流値測定部 22において応答電流として測定される。この応答電流値は、 ΜΙΪ印加によつて試薬部 33を移動した還元型のメディエータに由来する電子量に相関するものであり、いわゆる拡散電流と呼ばれるものである。

一方、電流値測定部 22において測定された応答電流値は、検知部 23においてモユタリングされており、応答電流値が閾値を越えた時点で、検知部 23は試薬部 33 に血液が供給され、試薬部 33が溶解したことを検知する。検知部 23において血液が供給されたことが検知されたには、この検知から一定時間経過したカゝ否かが検知部 23により判断される。

検知部 23におレ、て一定時間が経過したと判断されたには、電流値測定部 22 にお！/、て応答電流値を測定し、この応答電流値に基づレ、て、演算部 25におレ、てグルコース濃度が演算される。グルコース濃度の演算は、応答電流値を値に換算した後に、この値を、予め作成しておいた. mm値とグルコース濃度との関係を示す検 ϋ泉に当てはめることにより演算される。演算部 25における演算結果は、たとえば表示部 26において表示される。

作用極 31に撤虫している還元型のメディエータは、良 Ρ座に作用極 31に対して電子を放出して酸化型となる力作用極 31から一定距離離れた還元型のメディエータであっても、作用極 31に対して電子を放出して酸化型となる。以下、作用極 31 に対して還元型のメディエータが電子を放出可能な領域を電子放出領域、作用極 31に対して還元型のメディエータが電子を放出することができなレ、領域を非電子放出領域ということとする。

後述する実施例から推測できるように、電子放出領域における作用極の表面からの距離は、 45 μ πιよりも小さくなることはなレ、。したがって、図 5 Αに示したように、作用極 31の上面 31 cからカバー 5の下面 5 aまでの対面距离 |H1が比較的に大きい^ \たとえば対面距离 IH1が 50 μ m以上のには、作用極 31の直上にぉレヽては、電子放出領域 70の上方に非電子放出領域 71が被することとなる。

これに対して、本願のグルコースセンサ 1のように、作用極 31の上面 31 cからカバー 5の下面 5 aまでの対面距離 HIが 45 μ ηι以下に設定されている場合には、図 5 Βに示したように、電子放出領域 70における作用極 31の直上に位置する部分の厚み寸法 (以下、単に「電子放出領域 70の厚み寸法」という）が対面距讓 1に一致し、この電子放出領域 70の厚み寸法は、図 5 Aに示した場合と同等かもしくはそれよりも/ J、さくなる。

このように、対面距离 IH1が大きい:^ (図 5 A参照）と小さい (図 5 B参照）とでは、作用極 31の直上における様子が異なったものとなる。その結果、後述する本発明の実施例からも推測できるように、対面距离 IH1の大小により、還元型メディエータが消費される様子が異なったものとなる。

ここで、 mm非印加状態において、電子放出領域に存在する還元型のメデイエータ（以下、「非拡散メデエータ」という）の濃度と、非電子放出領域に存在する還元型のメデイエータ（以下、「拡散メディエータ」という）の濃度とが同一である系を考える。

図 5 Aに示した対面距离 IH1が大きレ、ケースでは、電子放出領域 70 (点泉で囲まれた部分)の厚み寸法が大きレ、ために、印加時に非拡散メディエータの全てが酸化されるわけではなレ、。したがって、非拡散メディエータが一定量ずつ消費され、これに起因して電子放出領域 70と非電子放出領域 71との間に還元型メディエータの濃度差が生じる。これにより、電子放出領域 70に対しては、その上方およ則方から、拡散メディエータが拡散してくる。その後は、電子放出領域 70に存在する還元型メディエータの酸化、および電子放出領域 70に ¾H "る拡散メディエータの拡散が重畳的に生じる。このため、対面距離 HIが大きいケースでは、大きく分けて、初期は非拡散メディエータの消費、中期は非拡散メディエータおよび拡散メディエータの消費、後期は拡散メディエータの消費というプロセスを経ることとなる。

ここで、拡散メディエータの拡散速度は、電子放出領域 70と非電子放出領域 71 との間における還元型メディエータの濃度差に加えて、拡散媒体 (血液)のや移動抵抗 (血液のへマトクリット値)の影響を受ける。したがって、対面距离 IH1が大きいケースでは、血液のやへマトクリット値の影響が経時的に徐々に大きくなる。

これに対して、対面距离 IH1が小さいケース（図 5 B参照）では、電子放出領域 70 の厚み寸法が小さレヽために、初期にぉレヽて非拡散メディエータが殆ど全て消費され、次レヽで電子放出領域への拡散メディエータの拡散および消費が生じる。このため、対面距离 IH1が小さいケースでは、大きく分けて、初期は非拡散メディエータの消費、後期は拡散メディエータの消費というプロセスを経ることとなる。したがって、対面距离 IH1が小さいケースでは、血液のやへマトクリット値の影響を受けにくい段階と、それらの影響を大きく受ける段階とに分力れることになる。

対面距离 IH1が電子放出領域の厚み寸法と一致するケースでは、電子放出領域に対する拡散メディエータの拡散は、電子放出領域の側方のみから行われる。そのため、対面距飾 1が電子放出領域の厚み寸法よりも大きく、電子放出領域の側方および上方から拡散メディエータが拡散してくる齢に比べれば、対面距离 IH1が小さい ¾ ^には、拡散メディエータの拡散速度などが、測定電流値に与える影響は小さいといえる。とくに、血液のやへマトクリツト値の影響を受けにくレヽ段階にぉレヽては、拡散メディエータの挙動が測定電流値に与える影響は小さレ、。したがって、対面距离 §11を電子放出領域の厚み寸法と同 @f、もしくはそれよりも小さくすれば、血液のやへマトクリツト値の影響を受けにくく、印加開始からの短レヽ時間範囲 (測定時間が短レ、範囲）における再現性が良好なものとなる。本発明に係るグルコースセンサは、上述した実施の形態には限定されず、種々に設計変更可能である。たとえば作用極 31および対極 32は、少なくとも一部が反応空間 6の内部に臨んでレ、ればよく、たとえば図 6 Aおよび図 6 Bに示した構成を採用することもできる。

図 6 Aに示したグルコースセンサ 1 ' は、基板 3 ' に凹部 35' , 36' を形成し、この凹音卩 3 ，3 に作用極 3 および対極 3^ を埋設形成したものである。作用極 3 および対極 3 の上面 31 , 32 c ' は、図示したように基板 3 ' の上面 3( と面一となるようにしてもよく、また面一でなくてもよい。

このグルコースセンサ 1 ' では、対面距離は、作用極の上面 31 からカバー 5 ' の下面 5 a ' までの距離として定義され、作用極 3f および対極 32' の上面 31 c ' , 32 c ' が基板 3 の上面 3( と面一の ¾ ^には、対面距离 fH は、基板 3' とカバー 5' との間の距細に一 ¾ΤΤる。

一方、図 6 Βに示したグルコースセンサ 1 "は、基板 3 "に作用極 31" を形成し、カバー 5 に対極 32" を形成したものである。もちろん、基板に対極を形成し、カバーに作用極を形成してもよい。

このグルコースセンサ 1 "では、対面距离 |Η1〃は、作用極 31〃の上面 31 c と対極 32〃の上面 32 c " との間の距離として定義される。

本発明は、スぺーザによつて反応空間の高さ寸法が規定された分析用具に限らず、反応空間となるべき凹部が形成された基板に対して、カバーを接合した構成の分析用具に対しても適用することができる。

以下においては、本発明に係るグルコースセンサが、応答電流値の測定において、血液中の血球やによる影響が小さく、短時間で精度良くグルコース濃度を測定することができることにつレ、て、実施例 1 ~ 4を通して実証する。

[グルコースセンサの作成]

実施例 1〜 4におレヽては、図 1ないし図 3に示したのと同様な構成のダルコ一スセンサを用いて評価した。各実施例において用いたグルコースセンサは、反応空間 6の長さ寸法し (図 2参照)、 Φ畐寸法 W (図 1参照)、作用極 31および対極 32の厚さ寸法 D (図 2参照）を、それぞれ 3. 4腿、 1. 5mm, 10 ^ mとした。グルコースセンサにおける対面距顧 1、基板 3とカバー 5との間の距幽 2 (図 2参照)、およひ ¾薬部 33の構成にっレ、ては、下記表 1に示した通りとした。グルコースセンサの構成

反応空間の

対面距離 HI 試難の構成高さ寸法 H2

本案グルコースセンサ 1 酵素含有層,

23 μ m 33 μ m

電子伝達層本案グノレコースセンサ 2 酵素含有層

35 μ m 45 m Z 電子伝達層本案グルコースセンサ 3 23 μ m 33 m 液相電子伝達層のみ本案グルコースセンサ 4 44 μ m 54 m 液相電子伝達層のみ酵素含有層/ 比較グノレコースセンサ 1 47 m 57 m

電子伝達層比較グノレコースセンサ 2 47 m 57 m 液相電子達層のみ本案グルコースセンサ 1 , 2および比較グルコースセンサ 1については、試薬部 33を、電子伝達層およひ素含有層からなる 2層構造とした。電子伝達層は、基板 3上に電子伝達物質を含む第 1材料液を 0. 4 L塗布した後に第 1材料液を送風乾燥 (30°C、 10%Rl )することにより形成した。酵素含有層は、電子伝達層上に、酸化還元酵素を含む第 2材料液を 0. 3 μ L塗布した後に第 2材料液を送風乾'燥 (30°C、 10%Rh)することにより形成した。

第 1材料液は、下記表 2に①〜④で示した材料をその番号通りの順序で混合した混合液を、 1〜 3日 ¾gした後、この混合液に電子伝達物質を添加することにより調製した。電子伝達物質としては、 [Ru (NH₃) ₆]Cl₃ (同仁化究所「LM722」）を使用した。

表 2 ：第 1材料液の組成 (電子伝達物質を除く）

表 2などにおいて、 SWNはルーセンタイト SWNの略号であり、 CHAPSは

3-[ (3-cholamidopropyl) dimethylammonioj propanesulfonic acidの略であり、

ACESfiN- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acidの略号である。 SW としては、コープケミカル㈱製「3150」を使用し、 CHAPSとしては同仁化究所製「KC062」を使用し、 ACESとしては同仁化^ ¹究所製「ED067」を使用した。なお、 ACES溶液は

_PHが 7. 5となるように調製した。

一方、第 2材料液は、酸化還元酵素を 0. 1%CHAPSに溶解させることにより調製した。酸化還元酵素としては、 CyGDH (グノレコース素活性が 800U/mg)を使用した。 CyGDHについては、上述した通りである。

これに対して、本案グルコースセンサ 3， 4および比較グルコースセンサ 2については、試薬部 33を、フエリシアン化力リゥムとフエロシアン化力リゥムが共存する構成とした。これは、酸化還元酵素の触媒能、その他の要因の影響を除外し、純粋に、対面距離 HIの高さが再現性に与える影響を判断するためである。より具体的には、試薬部 33は、基板 3上に材料液を保持させることにより液相として形成した。材料液としては、フェリシァンィ匕力リゥムが 20 、フエロシアンィ匕力リゥムが 24mM、塩化カリウムが 1. 5Mとなるように調製されたものを用いた。実施例 1 (へマトクリツト値の影響の検討）

本実施例においては、本案グルコースセンサ 1， 2および比較グルコースセンサ 1を用いて、へマトタリット（Hct)値が応答電流値に与える影響を評価した。

この評価においては、血液としては、グルコース濃度が 412mg/dL、Hct値が 19%、 42%、ある！/、は 69%のレ、ずれかのものを用いた。

作用極 31と対極 32との間への E印カ卩は、印加値を 200mVとして血液の供給と同時に開始し、応答電流値は、 ®£印加の開始から 5 sec、 7 sec, および lOsec 後に測定した。各 Hct値の血液については、 5回ずつ応答電流値を測定した。

応答電流値の測定結果は、本案グルコースセンサ 1につレ、ては図 7に、本案グルコースセンサ 2につ!/、ては図 8に、比較グルコースセンサ 1につレ、ては図 9にそれぞれ示した。また、図 7〜図 9におレ、ては、横軸を時間（sec)、縦軸を Bias (%) として示してある。 Bias (%)は、 Hct値が 42%のときの応答電流値を基準とし、この基準値に対するずれ量を示すものであり、各図においては、 Bias (%)は 5回の測定の平均値として示してある。

図 7〜図 9を比較すれば分かるように、 mil印加時間の如何に拘わらず、対面距离 IH1が小さいほど Biasが小さくなる傾向にある。したがって、対面距离 fHlが小さレ、ほど、血液の Hct値の影響が小さくなる傾向が伺える。実施例 2 の影響）

本実施例にぉレ、ては、本案グルコースセンサ 1， 2および比較グルコースセンサ 1を用いて、血液の温度が応答電流値に与える影響を評価した。

この評価においては、血液としては、 Hct値が 42%、グルコース濃度が 100. Omg/dL, 422. Omg/dL, あるいは 636. Omg/dLのいずれかで、カ 5 °じ、 25°Cあるいは 45°C に調製されたものを用いた。

作用極 31と対極 32との間への 1£印カロは、印加値を 200mVとして血液の供糸合開^から行い、応答電流値は、 ffi印加開始から 5 sec後に測定した。各ダルコ一ス濃度の血液にっレ、ては、 5回ずつ応答電流値を測定した。

応答電流値の測定結果は、本案グルコースセンサ 1については図 10に、本案グルコースセンサ 2については図 11に、比較グルコースセンサ 1については図 12にそれぞれ示した。また、図 10〜図 12においては、横軸を (°C)、縦軸を Bias (%) として各グルコース濃度について個別に示した。ここで、 Bias (%)は、温度が 25°C のときの応答電流値を基準とし、この基準に対するずれ量を示すものであり、各図においては、 Bias (%)は 5回の測定の平均として示してある。

図 10〜図 12を比較すれば分かるように、グルコース濃度および電圧印加時間の如何に拘わらず、対面距离 IH1が小さいほど Biasが小さくなる傾向にある。したがつて、対面距离 IH1が小さいほど、血液のの影響が小さくなる傾向力 S伺える。実施例 3 (測定レンジの評価)

本実施例では、本案グルコースセンサ 1を用いて、測定レンジを評価した。測定レンジは、グルコース濃度と応答電流値との関係 (S 性)により評価した。この評価においては、血液としては、 Hct値が 42%、グルコース濃度が 0mg/dL、 100mg/dL, 200mg/dL、 400mg/dL、 610mg/dL、 805mg/dLあるいは 980mg/dLのものを用いた。作用極 31と対極 32との間への E印カ卩は、印加 Mffi値を 200mVとして血液の供給開始から行い、応答電流値は、 ®£印加の開始から 3 sec後に測定した。各グノレコース濃度の血液にっレ、ては、 10回ずつ応答電流値を測定した。

応答電流値の測定結果は、図 13に示した。ただし、図 13においては、応答電流値（μΑ)は、 10回の測定の平均値として示してある。

図 13から分かるように、本案グルコースセンサ 1では、グルコース濃度力〜 1000m_g/dLの範囲で高レ、¾ 性を示しており、グノレコース濃度が比較的に大きレ、場合 (600rag/dL以上)であっても、適切にグルコース濃度を測定できるといえる。したがって、本案グルコースセンサ 1のように、酸化還元酵素として CyGDHを、メデイエータとして Ru錯体を使用すれば、対面距离 IH1を小さくして設定しても、 3秒程度の短、測定時間で、 0〜1000mg/dLの範囲にあるグルコースの濃度を適切に測定できるといえる。実施例 4 (再現性の評価）

本実施例では、本案グルコースセンサ 3 , 4および比較グルコースセンサ 2を用いて、複数回の応答電流値の測定のタイムコースおよび相対標準偏差 C. V. (%)のタイムコースに基づレヽて、応答電流ィ直の再現†生を評価した。

この評価においては、血液として Hct値が 42%、グルコース濃度が 412mg/dLのものを用いた。作用極 31と対極 32との間への ®£印加は、印加値を 200mVとして血液の供給開始から 5秒後に開始し、応答電流値は、 ¾ΞΕ印カ卩の開始から、 50msec 毎に経時的に測定した。

タイムコースの測定結果については、図 14〜図 16に示した。これらの図においては、 5回分の測定の応答電流値のタイムコースを同時に示してあり、図 14は本案グノレコースセンサ 3、図 15は本案グノレコースセンサ⁴、図 16は比較グノレコースセンサ 2を用いたときの結果をそれぞれ示している。一方、図 17には、 C. V. (%) のタイムコースを示した。このタイムコースは、応答電流値のタイムコースを得るための 5回の応答電流値の測定に基づレ、て作成した。

図 14〜図 16から分かるように、本案グルコースセンサ 3， 4では、比較ダルコ一スセンサ 2と同様に応答電流値のタイムコースに殆どバラツキが見られず、複数回の測定において良好な再現性が得られた。一方、図 17から分かるように、本案グルコースセンサ 3では、印加開始初期、すなわち Iff印加開始から 0. 5〜

3. 0 (sec)の時間範囲において、本案グルコースセンサ 4や比較グルコースセンサ

2に比べて C. V.が小さく、 C. V.値が概ね 2. 5%以下と小さくなっている。本案グノレコースセンサ 4では、電圧印カ卩開始から 3. 0〜7. 0 (sec)の時間範囲において、比較グルコースセンサ 2に比べて C. V.が小さく、 C. V.値が概ね 2. 5%以下と小さくなつている。これらの結果から分かるように、対面距讓 1が小さく設定すれば、 W± 印加開始から短い時間範囲において、再現性が良好なものとなっている。したがつて、再現性の観点からは、対面距离 IH1を小さく設定したグルコースセンサは、短い測定時間に適したものであるといえる。

Claims

請求の範囲

1 . 試料液を保持するための反応空間を備えた分析用具であって、

上記反応空間には、試料液力 S保持されたときに溶解する試薬部が配置されており、

上記反応空間の一部は、互いに対面する第 1および第 2面によって規定されており、力つ上記第 1および第 2面の対面距離が 45 μ m以下に設定されている、薄型分析用具。

2 . 互いに対向した状態で間隔を隔てて配置され、力つ上記反応空間を規定する第 1および第 2板材を備えており、

上記第 1および第 2面は、上記第 1および第 2板材の厚み方向に直交する方向に広がりをもつ面である、請求項 1に記載の薄型分析用具。

3. 上記第 1板材の一面に設けられ、力少なくとも一部が上記反応空間に臨むとともに、試料液に ffiを印加するために利用される第 1および第 2電極をさらに備えており、

上記対面距離は、上記第 1または第 2電極の上面から、上記第 2板材における当該 ®t亟の上面に対面する部分までの最小距離である、請求項 2に記載の薄型分析用具。

4 . 上記対面距離は、 25〜45 ^ mの範囲である、請求項 3に記載の薄型分析用具。

5.上記第 1板材に設けられた第 1電極と、上記第 1電極に対面するように上記第 2板材に設けられ、カゝっ上記第 1電極とともに試料液に MEを印加するために利用される第 2電極と、をさらに備えており、

上記対面距離は、上記第 1電極と上記第 2電極との間における最小距離である、請求項 2に記載の薄型分析用具。

6 . 上記対面距離は、 25〜45 z mの範囲である、請求項 5に記載の薄型分析用具。

7. 上記反応空間は、毛細管力により試料を移動させるように構成されている、請求項 1に記載の薄型分析用具。

8 . 上記試薬部は、電子伝達物質および酸化還元酵素を含んでいる、請求項 1に記載の薄型分析用具。

9 . 上記電子伝達物質は、 Ru化合物である、請求項 8に記載の薄型分析用具。

10.上言 SRu化合物は、下記化学式 (1)で示されるものである、請求項 9に記載の薄型分析用具。

[Ru(NH₃) ₅Χ] ^{η +} · · ' (1)

上記ィヒ学式 (1)'においては、 Xは、 NH₃、ハロゲンイオン、 CN、ピリジン、ニコチンアミド、あるいは 0であり、 n+は Xの種類により決定される酸化型 Ru(m) 錯体の価数を表している。

11. 上記化学式 (1)における Xは、 NH₃またはハロゲンイオンである、請求項 10に記載の薄型分析用具。

12.上記酸化還元酵素は、グルコース月脉素活性を有するものである、請求項 8に記載の薄型分析用具。

13.上記酸化還元酵素は、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来のグルコース IfcK素酵素である、請求項 12に記載の薄型分析用具。

14. 上記酸化還元酵素は、グルコース脱水素活性を有し、かつ還元条件下での SDS-ポリアクリルァミドゲル電気泳動における分子量が約 60kDaであるひサブュニットを有している、請求項 13に記載の薄型分析用具。

15.上記酸化還元酵素は、還元条件下での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量力 S約 43kDaであるチトクロム Cを有している、請求項 14に記載の薄型分析用具。

16. 上記電子伝達物質は、 Ru化合物であり、

上記酸化還元酵素は、ブノレクホルデリア属に属する微生物に由来のダルコ一ス脱冰素酵素である、請求項 8に記載の薄型分析用具。

17. 上言 ERu化合物は、下記化学式 (2)で示されるものであり、

上記酸化還元酵素は、グルコース脱水素活性を有し、かつ還元条件下での SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約 60kDaであるひサブュニットと、還元条件下での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約 43kDaであるチトクロム Cと、を有している、請求項 16に記載の薄型分析用具。

[Ru(NH₃) ₅X] ⁿ⁺ · · * (2)

上記化学式 (2)においては、 Xは、 NH₃、ハロゲンイオン、 CN、ピリジン、ニコチンアミド、あるいは ¾0であり、 n+は Xの種類により決定される酸化型 R_U (IH) 錯体の価数を表している。

18.試料液として、血液、尿、唾液、あるいはこれらの調整液などの生化学的試料を使用し、グルコース、コレステロール、乳酸、あるいはァスコノレビン酸を分析できるように構成されている、請求項 1に記載の薄型分析用具。