WO2004099245A1 - Stabilised interferon-ϝ - Google Patents

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WO2004099245A1
WO2004099245A1 PCT/EP2004/004677 EP2004004677W WO2004099245A1 WO 2004099245 A1 WO2004099245 A1 WO 2004099245A1 EP 2004004677 W EP2004004677 W EP 2004004677W WO 2004099245 A1 WO2004099245 A1 WO 2004099245A1
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WO
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interferon
amino acid
polyethylene glycol
homologous
cysteine
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/004677
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German (de)
French (fr)
Inventor
Herwig Brunner
Hayssam Zakaria
Bernd Otto
Tobias Thomas
Florian Battermann
Marco Kresin
Andreas Busche
Christian Schmalz
Original Assignee
Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma

Definitions

  • the present invention relates to a stabilized interferon- ⁇ , in particular to a recombinantly produced, human interferon- ⁇ .
  • Human interferon- ⁇ is genetically derived from bacterial cells and is already used in two different indications. Clinical trials on pulmonary fibrosis patients are also so successful that therapy success and therefore a large market can generally be expected for fibrosis diseases.
  • Natural interferon- ⁇ is glycosylated twice. In the case of genetically engineered interferon- ⁇ , however, this glycosylation is absent in the production by means of bacterial systems. Although the biological activity in in vitro systems is not impaired by recombinant interferon- ⁇ , the unmodified interferon- ⁇ is pharmacokinetically very much less
  • glycosylated interferon- ⁇ is very complex and costly.
  • the interferon- ⁇ according to the invention is now modified by means of polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the polyethylene glycol is coupled to certain individual amino acids of an interferon- ⁇ .
  • Such coupling can take place via an amino or thiol group.
  • the amino acids cysteine, asparagine, glutamine, lysine, arginine and / or histidine are therefore particularly suitable for this purpose.
  • the interferon- ⁇ to be modified can be a recombinantly produced interferon- ⁇ , in particular human interferon- ⁇ .
  • Interferon- ⁇ is understood here to mean a protein which has an amino acid sequence which is essentially homologous to the native, in particular human, interferon- ⁇ .
  • the amino acid sequence can be one or more amino acid exchanges, deletions, shortenings at their ends or extensions at their ends have as long as the biological function of an interferon- ⁇ , in particular its pharmacological effects, are maintained.
  • interferon- ⁇ advantageously have the following sequences or are homologous to them:
  • IFN- ⁇ D63C in which aspartic acid D63 is replaced by cysteine and PEGylated:
  • IFN- ⁇ S99C in which serine S99 is replaced by cysteine and PEGylated:
  • IFN- ⁇ 7/69 D63C in which aspartic acid D63 has been replaced by cysteine and PEGylated and amino acids 7 and 69 have also been replaced by cysteine and bridged with a disulfide bridge:
  • IFN- ⁇ 7/69 S99C in which serine 99 is exchanged for cysteine and PEGylated, and furthermore amino acids 7 and 69 are exchanged for cysteine and bridged with a disulfide bridge:
  • Interferon- ⁇ contains many lysines and is strongly basic. It can therefore only be heterogeneously amino-PEGylated. PEGylation is therefore advantageously carried out via the thiol groups of free cysteines.
  • the amino acids aspartic acid 63 or serine 99 were exchanged for cysteines and the corresponding variants were produced by genetic engineering. Polyethylene glycol was then coupled to the thiol groups of these cysteines. It was found that these variants in both PEGylated and non-PEGy- form, regardless of the chain length of the polyethylene glycol, had largely the same biological activity as unchanged and unmodified interferon- ⁇ .
  • the interferon- ⁇ modified with polyethylene glycol is pharmacokinetically much more stable ' .
  • a PEG can be used which has a molecular weight between 5,000 mol and 40,000 Da.
  • interferon- ⁇ In addition to native interferon- ⁇ , various modified variants of interferon- ⁇ can also be used, for example with or without a disulfide bridge.
  • FIG. 1 shows the course of the activity of various forms of interferon- ⁇ and their decay over time in an animal experiment.
  • the solid line denotes human recombinant interferon- ⁇ that has not been PEGylated. This shows a high activity at the beginning (logarithmic scale of FIG. 1!). This activity then quickly subsides within a few hours.
  • the other three curves show human recombinant interferon- ⁇ which has been modified with various polyethylene glycols.
  • the modification was carried out, as indicated in the legend of FIG. 1, with polyethylene glycol with a molecular weight of 5,000 Da, 20,000 Da and 40,000 Da, respectively.
  • IFN- ⁇ 7/69 was used as the non-PEGylated Ifn- ⁇ and IFN- ⁇ 7/69 S99C was used as the PEGylated IFN- ⁇ , in which the amino acid serine 99 was replaced by cysteine and PEGylated.
  • a blood sample was taken retrobulously, a serum preparation was carried out and the IFN- ⁇ - Serum levels determined using an antiviral assay.

Abstract

The invention relates to a stabilised interferon-gamma. One or several amino acids of the inventive interferon-gamma is modified by thiol or amino side groups containing polyethylene glycol. Amino acid cysteine, asparagine, glutamine, lysine, arginine, and/or histidine are particularly suitable for said type of modification.

Description

Stabilisiertes Interferon-γStabilized interferon-γ
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein stabilisiertes Interferon-γ insbesondere auf ein reko bi- nant hergestelltes, humanes Interferon-γ.The present invention relates to a stabilized interferon-γ, in particular to a recombinantly produced, human interferon-γ.
Humanes Interferon-γ wird gentechnisch aus Bakterienzellen gewonnen und bereits bei zwei verschiedenen Indikationen eingesetzt. Auch klinische Versuche an Lungenfibrose-Patienten sind so erfolgreich, dass allgemein bei Fibroseerkrankungen ein Therapieerfolg und damit auch ein großer Markt erwartet werden kann.Human interferon-γ is genetically derived from bacterial cells and is already used in two different indications. Clinical trials on pulmonary fibrosis patients are also so successful that therapy success and therefore a large market can generally be expected for fibrosis diseases.
Natürliches Interferon-γ ist zweifach glykosyliert . Bei gentechnisch hergestelltem Interferon-γ fehlt bei der Herstellung mittels bakterieller Systeme jedoch diese Glykosylierung. Zwar ist die biologische Aktivität in in-vitro-Systemen von rekombinantem Interferon-γ nicht beeinträchtigt, pharmakokinetisch ist das nicht modifizierte Interferon-γ jedoch sehr viel we- Natural interferon-γ is glycosylated twice. In the case of genetically engineered interferon-γ, however, this glycosylation is absent in the production by means of bacterial systems. Although the biological activity in in vitro systems is not impaired by recombinant interferon-γ, the unmodified interferon-γ is pharmacokinetically very much less
niger stabil als die glykosylierte Form und muss daher bei einer Therapie sehr viel häufigerAnjiziert werde .less stable than the glycosylated form and must therefore be injected much more frequently during therapy.
Die Herstellung von glykosyliertem Interferon-γ ist jedoch sehr aufwendig und kostenintensiv.However, the production of glycosylated interferon-γ is very complex and costly.
Hier setzt nun die vorliegende Erfindung an, die es sich zur Aufgabe macht, ein Interferon-γ und Nukleo- tidsequenzen, die dieses kodieren, zur Verfügung zu stellen, das stabil ist und dennoch eine biologische Aktivität vergleichbar dem nativen Humaninterferon-γ besitzt .This is where the present invention comes in, which makes it its task to provide an interferon-γ and nucleotide sequences which encode it, which is stable and nevertheless has a biological activity comparable to native human interferon-γ.
Diese Aufgabe wird durch das Interferon-γ nach Patentanspruch 1 sowie das zugehörige Polynukleotid nach Patentanspruch 15 gelöst .This object is achieved by the interferon-γ according to claim 1 and the associated polynucleotide according to claim 15.
Das erfindungsgemäße' Interferon-γ ist nun mittels Po- lyethylenglykol (PEG) modifiziert. Hierzu wird das Polyethylenglykol an bestimmte einzelne Aminosäuren eines Interferon-γ gekoppelt. Eine solche Kopplung kann über eine Amino- oder Thiolgruppe erfolgen. Es eignen sich hierzu also insbesondere die Aminosäuren Cystein, Asparagin, Glutamin, Lysin, Arginin und/oder Histidin.The interferon-γ according to the invention is now modified by means of polyethylene glycol (PEG). For this purpose, the polyethylene glycol is coupled to certain individual amino acids of an interferon-γ. Such coupling can take place via an amino or thiol group. The amino acids cysteine, asparagine, glutamine, lysine, arginine and / or histidine are therefore particularly suitable for this purpose.
Das zu modifizierende Interferon-γ kann dabei ein re- kombinant hergestelltes Interferon-γ, insbesondere humanes Interferon-γ, sein. Unter Interferon-γ wird hier ein Protein verstanden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen homolog zu dem nativen, insbesondere humanen, Interferon-γ ist. Die Aminosäurensequenz kann dabei einzelne oder mehrere Aminosäurenaustausche, Deletionen, Verkürzungen an ihren Enden oder auch Verlängerungen an ihren Enden aufweisen, solange die biologische Funktion eines Interferon-γ, insbesondere seine pharmakologischen Wirkungen, beibehalten werden.The interferon-γ to be modified can be a recombinantly produced interferon-γ, in particular human interferon-γ. Interferon-γ is understood here to mean a protein which has an amino acid sequence which is essentially homologous to the native, in particular human, interferon-γ. The amino acid sequence can be one or more amino acid exchanges, deletions, shortenings at their ends or extensions at their ends have as long as the biological function of an interferon-γ, in particular its pharmacological effects, are maintained.
Vorteilhafterweise weisen die erfindungsgemäßen Interferon-γ die folgenden Sequenzen auf bzw. sind zu diesen homolog:The interferon-γ according to the invention advantageously have the following sequences or are homologous to them:
1. IFN-γ D63C, bei der Asparaginsäure D63 gegen Cystein ausgetauscht und PEGyliert ist:1. IFN-γ D63C, in which aspartic acid D63 is replaced by cysteine and PEGylated:
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2. IFN-γ S99C, bei der Serin S99 gegen Cystein ausgetauscht und PEGyliert ist:2. IFN-γ S99C, in which serine S99 is replaced by cysteine and PEGylated:
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3. IFN-γ 7/69 D63C, bei der Asparaginsäure D63 gegen Cystein ausgetauscht und PEGyliert ist und weiterhin die Aminosäuren 7 und 69 gegen Cystein ausgetauscht und mit einer Disulfidbrücke verbrückt wurden:3. IFN-γ 7/69 D63C, in which aspartic acid D63 has been replaced by cysteine and PEGylated and amino acids 7 and 69 have also been replaced by cysteine and bridged with a disulfide bridge:
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oder . IFN-γ 7/69 S99C, bei der Serin 99 gegen Cystein ausgetauscht und PEGyliert ist und weiterhin die Aminosäuren 7 und 69 gegen Cystein ausgetauscht und mit einer Disulfidbrücke verbrückt wurden:or , IFN-γ 7/69 S99C, in which serine 99 is exchanged for cysteine and PEGylated, and furthermore amino acids 7 and 69 are exchanged for cysteine and bridged with a disulfide bridge:
QDPYVKCAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQS- QIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKCVETI-QDPYVKCAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQS- QIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKCVETI-
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ie jeweils zugehörigen Gensequenzen lauten:The respective gene sequences are:
1. IFN-γ D63C:1. IFN-γ D63C:
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2. IFN-γ S99C:2. IFN-γ S99C:
caagacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatg- caggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcatttt- gaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagcca- aattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgacca- gagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgt-' caagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagct- gactaattgctcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacat- gaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagg- gaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag 3. IFN-γ 7/69 D63Ccaagacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatg- caggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcatttt- gaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagcca- aattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgacca- gagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgt- 'caagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagct- gactaattgctcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacat- gaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagg- gaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag 3. IFN-γ 7/69 D63C
caagacccatatgtaaaatgtgcagaaaaccttaagaaatattttaatg- caggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcatttt- gaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagcca- aattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagattgcca- gagcatccaaaagtgtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgt- caagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagct- gactaattatteggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacat- gaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagg- gaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccagcaagacccatatgtaaaatgtgcagaaaaccttaagaaatattttaatg- caggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcatttt- gaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagcca- aattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagattgcca- gagcatccaaaagtgtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgt- caagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagct- gactaattatteggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacat- gaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagg- gaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag
4. IFN-γ 7/69 S99C4. IFN-γ 7/69 S99C
caagacccatatgtaaaatgtgcagaaaaccttaagaaatattttaatg- caggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcatttt- gaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagcca- aattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgacca- gagcatccaaaagtgtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgt- caagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagct- gaetaattattgegtaactgaettgaatgtccaacgcaaagcaatacat- gaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagg- gaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccagcaagacccatatgtaaaatgtgcagaaaaccttaagaaatattttaatg- caggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcatttt- gaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagcca- aattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgacca- gagcatccaaaagtgtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgt- caagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagct- gaetaattattgegtaactgaettgaatgtccaacgcaaagcaatacat- gaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagg- gaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag
Interferon-γ enthält viele Lysine und ist stark basisch. Es kann daher nur heterogen Amino-PEGyliert werden. Vorteilhafterweise erfolgt daher die PEGylie- rung über die Thiolgruppen freier Cysteine. In ersten Beispielen wurden, da das Interferon-γ keine freien Cysteine enthält, die Aminosäuren Asparaginsäure 63 oder Serin 99 gegen Cysteine ausgetauscht und die entsprechenden Varianten gentechnisch hergestellt. An die Thiolgruppen dieser Cysteine wurde dann Polyethy- lenglykol gekoppelt. Es ergab sich, dass diese Varianten sowohl in PEGylierter als auch in nicht PEGy- lierter Form, unabhängig von der Kettenlänge des Po- lyethylenglycols, weitgehend die gleiche biologische Aktivität aufwiesen wie unverändertes und nicht modifiziertes Interferon-γ. Allerdings ist das mit Poly- ethylenglykol modifizierte Interferon-γ pharmakokine- tisch sehr viel stabiler'. Es kann dabei ein PEG eingesetzt werden, das ein Molekulargewicht zwischen 5.000 mol und 40.000 Da aufweist.Interferon-γ contains many lysines and is strongly basic. It can therefore only be heterogeneously amino-PEGylated. PEGylation is therefore advantageously carried out via the thiol groups of free cysteines. In the first examples, since the interferon-γ contains no free cysteines, the amino acids aspartic acid 63 or serine 99 were exchanged for cysteines and the corresponding variants were produced by genetic engineering. Polyethylene glycol was then coupled to the thiol groups of these cysteines. It was found that these variants in both PEGylated and non-PEGy- form, regardless of the chain length of the polyethylene glycol, had largely the same biological activity as unchanged and unmodified interferon-γ. However, the interferon-γ modified with polyethylene glycol is pharmacokinetically much more stable ' . A PEG can be used which has a molecular weight between 5,000 mol and 40,000 Da.
Weiterhin können neben nativem Interferon-γ verschiedene modifizierte Varianten des Interferon-γ eingesetzt werden, beispielsweise mit oder ohne Disul- fidbrücke .In addition to native interferon-γ, various modified variants of interferon-γ can also be used, for example with or without a disulfide bridge.
Figur 1 zeigt den Verlauf der Aktivität verschiedener Formen von Interferon-γ und deren Abklingen im Laufe der Zeit in einem Tierversuch. Die durchgezogene Linie bezeichnet dabei humanes rekombinantes Interferon-γ, das nicht PEGyliert wurde. Dieses zeigt zu Anfang eine hohe Aktivität (logarithmischer Maßstab der Figur 1!). Diese Aktivität klingt dann innerhalb weniger Stunden rasch ab. Demgegenüber zeigen die weiteren drei Kurven humanes rekombinantes Interferon-γ, das mit verschiedenen Polyethylenglykolen modifiziert wurde .FIG. 1 shows the course of the activity of various forms of interferon-γ and their decay over time in an animal experiment. The solid line denotes human recombinant interferon-γ that has not been PEGylated. This shows a high activity at the beginning (logarithmic scale of FIG. 1!). This activity then quickly subsides within a few hours. In contrast, the other three curves show human recombinant interferon-γ which has been modified with various polyethylene glycols.
Die Modifizierung erfolgte, wie in der Legende von Fig. 1 angegeben, mit Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 5.000 Da, 20.000 Da bzw. 40.000 Da.The modification was carried out, as indicated in the legend of FIG. 1, with polyethylene glycol with a molecular weight of 5,000 Da, 20,000 Da and 40,000 Da, respectively.
Als nicht PEGyliertes Ifn-γ wurde IFN-γ 7/69 und als PEGyliertes IFN-γ wurde IFN-γ 7/69 S99C eingesetzt, bei dem die Aminosäure Serin 99 gegen Cystein ausgetauscht und PEGyliert wurde. Das IFN-γ wurde jeweils 5 bis 6 weiblichen Wistarrat- ten mit einem Gewicht zwischen 210 und 240 g subkutan in einer Dosis von jeweils 8 • 106 IE/kg (IE = internationale Einheiten) injiziert.IFN-γ 7/69 was used as the non-PEGylated Ifn-γ and IFN-γ 7/69 S99C was used as the PEGylated IFN-γ, in which the amino acid serine 99 was replaced by cysteine and PEGylated. The IFN-γ was injected 5 to 6 female Wistar rats weighing between 210 and 240 g subcutaneously in a dose of 8 • 10 6 IU / kg (IU = international units).
Vor der Injektion und 20 min., 1 Std. , 2 Std. , 4 Std., 8 Std., 24 Std. sowie 48 Std. nach der Injektion wurde retrobulbar eine Blutprobe genommen, hiervon eine Serumpräparation durchgeführt und der IFN-γ- Spiegel im Serum mittels antiviralem Assay bestimmt.Before the injection and 20 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 24 hours and 48 hours after the injection, a blood sample was taken retrobulously, a serum preparation was carried out and the IFN-γ- Serum levels determined using an antiviral assay.
Es ist in Fig. 1 zu erkennen, dass die Aktivität der PEGylierten Interferon-γ-Varianten zu Anfang (innerhalb der ersten Stunde) geringer ist, jedoch eine erheblich längere Präsenzzeit über bis zu 48 Stunden erzielt wird. Dies zeigt, dass das PEGylierte Interferon-γ pharmakokinetisch sehr viel stabiler ist als das unmodifizierte Interferon-γ. It can be seen in FIG. 1 that the activity of the PEGylated interferon-γ variants is lower at the beginning (within the first hour), but a considerably longer presence time of up to 48 hours is achieved. This shows that the PEGylated interferon-γ is much more pharmacokinetically stable than the unmodified interferon-γ.

Claims

Patentansprüche claims
1. Interferon-γ, dadurch gekennzeichnet, dass es ein- oder mehrfach mit Polyethylenglykol modifiziert ist.1. Interferon-γ, characterized in that it is modified one or more times with polyethylene glycol.
2. Interferon-γ nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es rekombinant hergestellt ist.2. Interferon-γ according to the preceding claim, characterized in that it is produced recombinantly.
3. Interferon-γ nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäurensequenz aufweist, die derjenigen der humanen Interferon-γ weitgehend oder vollständig homolog ist.3. Interferon-γ according to any one of the preceding claims, characterized in that it has an amino acid sequence which is largely or completely homologous to that of human interferon-γ.
4. Interferon-γ nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenglykol an Aminosäuren mit Thiol- oder Aminoseitengruppen gebunden ist.4. Interferon-γ according to any one of the preceding claims, characterized in that the polyethylene glycol is bound to amino acids with thiol or amino side groups.
5. Interferon-γ nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenglykol an Cystein, Asparagin, Glutamin, Lysin, Arginin und/oder Histidin gebunden ist.5. Interferon-γ according to any one of the preceding claims, characterized in that the polyethylene glycol is bound to cysteine, asparagine, glutamine, lysine, arginine and / or histidine.
6. Interferon-γ nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenglykol an Cystein gebunden ist.6. Interferon-γ according to the preceding claim, characterized in that the polyethylene glycol is bound to cysteine.
7. Interferon-γ nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenglykol ein Molekulargewicht zwischen 5000 Da und 40000 Da, vorteilhafterweise zwischen 10000 Da und 25000 Da aufweist. 7. Interferon-γ according to one of the preceding claims, characterized in that the polyethylene glycol has a molecular weight between 5000 Da and 40,000 Da, advantageously between 10,000 Da and 25,000 Da.
8. Interferon-γ nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure Asparaginsäure D63 gegen Cystein und/oder die Aminosäure Serin S99 gegen Cystein ausgetauscht ist.8. Interferon-γ according to one of the preceding claims, characterized in that the amino acid aspartic acid D63 is replaced by cysteine and / or the amino acid serine S99 by cysteine.
9. Interferon-γ nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenglykol an die Aminosäuren Cys63 und/oder Cys99 gebunden ist.9. Interferon-γ according to the preceding claim, characterized in that the polyethylene glycol is bound to the amino acids Cys63 and / or Cys99.
10. Interferon-γ nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich glykosyliert ist.10. Interferon-γ according to one of the preceding claims, characterized in that it is additionally glycosylated.
11. Interferon-γ nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Aminosäuresequenz aufweist oder zu ihr homolog ist (D63C) :11. Interferon-γ according to one of claims 1 to 10, characterized in that it has the following amino acid sequence or is homologous to it (D63C):
QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQS- QIVSFYFKLFKNFKDCQSIQKSVETI-QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQS- QIVSFYFKLFKNFKDCQSIQKSVETI-
KEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQV- MAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ .KEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQV- MAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ.
12. Interferon-γ nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Aminosäuresequenz aufweist oder zu ihr homolog ist (S99C) :12. Interferon-γ according to one of claims 1 to 10, characterized in that it has the following amino acid sequence or is homologous to it (S99C):
QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQS- QIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETI-QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQS- QIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETI-
KEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYCVTDLNVQRKAIHELIQ - MAELSPAΔ.KTGKRKRSQMLFRGRRASQKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYCVTDLNVQRKAIHELIQ - MAELSPAΔ.KTGKRKRSQMLFRGRRASQ
13. Interferon-γ nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Aminosäuresequenz aufweist oder zu ihr homolog ist (7/69 D63C) : QDPYVKCAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQS- QIVSFYFKLFKNFKDCQSIQKCVETI-13. Interferon-γ according to one of claims 1 to 10, characterized in that it has the following amino acid sequence or is homologous to it (7/69 D63C): QDPYVKCAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQS- QIVSFYFKLFKNFKDCQSIQKCVETI-
KEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQV-KEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQV-
MAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ
14. Interferon-γ nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Aminosäuresequenz aufweist oder zu ihr homolog ist (7/69 S99C) :14. Interferon-γ according to one of claims 1 to 10, characterized in that it has the following amino acid sequence or is homologous to it (7/69 S99C):
QDPYVKCAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQS- QIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKCVETI-QDPYVKCAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQS- QIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKCVETI-
KEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYCVTDLNVQRKAIHELIQV- MAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYCVTDLNVQRKAIHELIQV- MAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ
15. Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die derjenigen des Gens für Interferon-γ homolog ist, diese enthält oder ihr entspricht, dadurch gekennzeichnet, dass das Codon für die Aminosäure 63 des Interferon-γ ein Codon für Asparagin und/oder das Codon für die Aminosäure 99 des Interferon-γ ein Codon für Serin ist.15. Polynucleotide with a nucleotide sequence which is homologous to, contains or corresponds to that of the gene for interferon-γ, characterized in that the codon for amino acid 63 of interferon-γ is a codon for asparagine and / or the codon for the amino acid 99 of interferon-γ is a codon for serine.
16. Polynukleotid nach Anspruch 15 mit der folgenden Nukleotidsequenz (D63C) : caagacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattt- taatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttct- taggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatg- cagagccaaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaacttta- aagattgccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaaga- catgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagat- gacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtc- caacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggct- gaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtca- gatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag.16. The polynucleotide of claim 15 having the following nucleotide sequence (D63C): caagacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattt- taatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttct- taggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatg- cagagccaaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaacttta- aagattgccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaaga- catgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagat- gacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtc- caacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggct- gaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtca- gatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag.
17. Polynukleotid nach Anspruch 15 mit der folgenden Nukleotidsequenz (S99C) : caagacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattt- taatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttct- taggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatg- cagagccaaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaacttta- aagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaaga- catgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagat- gacttcgaaaagctgactaattgcteggtaactgacttgaatgtc- caacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggct- gaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtca- gatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag.17. Polynucleotide according to claim 15 with the following nucleotide sequence (S99C): caagacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattt- taatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttct- taggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatg- cagagccaaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaacttta- aagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaaga- catgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagat- gacttcgaaaagctgactaattgcteggtaactgacttgaatgtc- caacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggct- gaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtca- gatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag.
18. Polynukleotid nach Anspruch 15 mit der folgenden Nukleotidsequenz (7/69 D63C) : caagacccatatgtaaaatgtgcagaaaaccttaagaaatattt- taatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttct- taggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatg- cagagccaaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaacttta- aagattgccagagcatccaaaagtgtgtggagaccatcaaggaaga- catgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagat- gacttcgaaaagctgactaattatteggtaactgacttgaatgtc- caacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggct- gaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtca- gatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag18. The polynucleotide of claim 15 having the following nucleotide sequence (D63C 7/69): caagacccatatgtaaaatgtgcagaaaaccttaagaaatattt- taatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttct- taggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatg- cagagccaaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaacttta- aagattgccagagcatccaaaagtgtgtggagaccatcaaggaaga- catgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagat- gacttcgaaaagctgactaattatteggtaactgacttgaatgtc- caacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggct- gaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtca- gatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag
19. Polynukleotid nach Anspruch 15 mit der folgenden Nukleotidsequenz (7/63 S99C) : caagacccatatgtaaaatgtgcagaaaaccttaagaaatattt- taatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttct- taggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatg- cagagccaaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaacttta- aagatgaccagagcatccaaaagtgtgtggagaccatcaaggaaga- catgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagat- gacttcgaaaagctgactaattattgegtaactgacttgaatgtc- caacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggct- gaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtca- gatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag 19. The polynucleotide of claim 15 having the following nucleotide sequence (7/63 S99C): caagacccatatgtaaaatgtgcagaaaaccttaagaaatattt- taatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttct- taggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatg- cagagccaaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaacttta- aagatgaccagagcatccaaaagtgtgtggagaccatcaaggaaga- catgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagat- gacttcgaaaagctgactaattattgegtaactgacttgaatgtc- caacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggct- gaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtca- gatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccag
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