WO2005035755A1 - 核酸導入方法 - Google Patents

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WO2005035755A1
WO2005035755A1 PCT/JP2004/012004 JP2004012004W WO2005035755A1 WO 2005035755 A1 WO2005035755 A1 WO 2005035755A1 JP 2004012004 W JP2004012004 W JP 2004012004W WO 2005035755 A1 WO2005035755 A1 WO 2005035755A1
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electrode substrate
cationic
nucleic acid
cells
substrate
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PCT/JP2004/012004
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English (en)
French (fr)
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Hiroo Iwata
Koichi Kato
Fumio Yamauchi
Original Assignee
Kyoto University
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Publication date
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Priority to JP2005514533A priority patent/JP4534043B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a nucleic acid, and more particularly, to a method for introducing a nucleic acid into cells by an electoral port method.
  • a method for introducing a gene into a cell is used to elucidate the function of a gene or the properties of a protein encoded by the gene, or to produce a large amount of a recombinant protein.
  • the method of gene transfer into cells is also used when treating a disease by introducing the gene for the target enzyme or cytokinin into the cells of a patient and producing the target substance in the body using the gene. Have been.
  • Techniques for introducing a gene into a cell include biological methods, that is, an introduction method using a virus vector derived from adenovirus, retrovirus, and lentivirus; a lipofection method (ribosome method); Method (electroporation method), microinjection method, particle gun method and other physical methods.
  • the method using a virus vector has high gene transfer efficiency, but has disadvantages such as complicated production of the virus vector and a problem in safety.
  • the lipofection method is highly safe, but has disadvantages such as low gene transfer efficiency and high cytotoxicity as compared with the method using virus.
  • Non-Patent Document 3 Since this method uses the Lipoff exclusion method for the transfection, the above-mentioned difficulties caused by the Lipoff exclusion method still exist.
  • Non-Patent Document 4 an alternate adsorption method has been reported as a method for immobilizing biomolecules such as nucleic acids and proteins on a substrate surface while maintaining their activities.
  • polymer molecules having different charges are alternately adsorbed on a substrate, and polymer thin films are successively laminated by electrostatic interaction (polyion complex formation). Examples applied to have been reported.
  • Non-Patent Document 1 ⁇ Journal, 1982, Vol. 1, 841-845
  • Non-Patent Document 2 Bioelectrochemistry and Bioenerg. 1999, Vol. 48, pp. 3-16
  • Non-Patent Document 3 Nayiya, 2001, Vol. 411, pp. 107-110
  • Non-Patent Document 4 Biosensors & Bioelectronics, 1994, Vol. 9, pp. 677-684.
  • An object of the present invention is to provide a gene transfection method that solves the problem of the conventional electoral poration method. More specifically, the present invention provides a gene transfection method that efficiently transduces a cell without damaging the cell. The present invention also provides a method for performing gene transfer at a desired and location in a cell population at the desired time. Another object of the present invention is to provide a cell An object of the present invention is to provide a method capable of carrying out the above-described gene introduction using an electrode substrate capable of providing a favorable observation environment for microscopic observation.
  • the inventors of the present invention have conducted various studies to improve the conventional gene transfer method using the electoporation method, and as a result, have carried a nucleic acid on the surface of the electrode and obtained a cell on the surface of the obtained nucleic acid carrying electrode.
  • the gene can be efficiently introduced into the cells without causing any significant damage to the cells, and the electoral mouth poration can be performed at the desired time and at the desired position. I found that I could do it.
  • the present inventors have further studied and found that if a transparent semiconductor electrode is used as the electrode, the cells can be favorably observed under a microscope.
  • the present inventors have completed the present invention based on the above findings.
  • the present invention provides:
  • step (c) adhering cells to the surface of the nucleic acid-carrying electrode substrate obtained in step (b);
  • a monomolecular film of a thiol compound, a disulfide compound or a sulfide compound having an auronic functional group at a terminal is formed on the surface of the electrode substrate, and the monomolecular film is formed.
  • a cationic functional group is added to the end of the electrode substrate surface.
  • a monomolecular film of a thiol compound, a disulfide compound or a sulfidic conjugate, or a silane treating agent is formed, and an anionic polymer is adsorbed on the surface of the monomolecular film, and a cationic polymer is further adhered to the surface.
  • cationic surface electrode substrate is a cationic surface electrode substrate obtained by adsorbing a cationic polymer on the surface of a transparent electrode substrate.
  • step (b) a force to directly adsorb nucleic acid only once on the surface of the cationic surface electrode substrate, or alternately nucleic acid and cationic polymer on the surface in the order of nucleic acid, cationic polymer, and nucleic acid
  • the electrode substrate is a metal electrode substrate selected from platinum, gold and aluminum.
  • the transparent electrode substrate is a glass substrate or a transparent plastic substrate on which an indium tin oxide is deposited.
  • R 1 represents an a-on functional group, and n represents an integer of 1 to 40.
  • R 1 is a group selected from the group consisting of a carboxyl group, a phosphate group, a sulfonic acid group and a phosphonic acid group.
  • a thiol conjugate having a cationic functional group at the terminal is represented by the formula (2):
  • R 2 represents a cationic functional group, and n represents an integer of 1 to 40.
  • nucleic acid is DNA, RNA, antisense nucleic acid, siRNA, or an expression vector thereof.
  • step (B) is performed by culturing the cells on the surface of the nucleic acid-carrying electrode
  • step (c) is performed by culturing cells on a surface of the nucleic acid-carrying electrode substrate
  • step (C) is carried out by providing an opposite electrode facing the electrode substrate through the cell and generating an electric pulse between the two electrodes
  • step (d) is carried out by providing an opposite electrode facing the electrode substrate via the cell and generating an electric pulse between the two electrodes, and
  • a thiol compound having an ionic functional group at the terminal on the surface of the electrode substrate A cationic surface electrode substrate in which a monomolecular film of a rufidiated compound or a sulfide compound is formed, and a cationic polymer is adsorbed on the surface of the monomolecular film; and gold deposited on a glass substrate by gold.
  • R 1 represents an a-on functional group, and n represents an integer of 1 to 40.
  • a cationic surface electrode substrate in which a monomolecular film of a thiol compound represented by is formed, and a cationic polymer is adsorbed on the surface of the monomolecular film,
  • an electoporation that can efficiently introduce a nucleic acid that does not impair the cell into the cell and that can introduce the nucleic acid into the cell at a desired position at a desired time on the electrode.
  • a method for introducing a nucleic acid by the method is provided.
  • FIG. 1 is a layout view of a nucleic acid-carrying gold electrode substrate for introducing a gene into an adherent cell and an electric pulse loading system on the substrate.
  • FIG. 3 is a bar graph showing the effect of electric field strength on gene transfer efficiency.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between cell viability and electric field strength.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of the molecular weight of polyethyleneimine and polyallylamine on the gene transfer efficiency.
  • FIG. 1 is a diagram showing the amount of supported on various cation surfaces.
  • FIG. 7 is a diagram showing the amount of DNA released after a pulse on the surface of various cations.
  • FIG. 1 is a correlation diagram showing the relationship between gene transfer efficiency and released amount.
  • FIG. 9 is a fluorescence microscopic image after the application of the electric pulse when the cell culture period until the application of the electric pulse is changed.
  • FIG. 11 Phase-contrast microscopy images (left) and fluorescence microscopy images (middle and right) 48 hours after electric pulse loading when a gene (mixture of pEGFP and pDsRed) was introduced into cultured primary nerve cells. .
  • the upper and lower photographs are observation images in different visual fields when gene transfer was performed under the same conditions.
  • FIG. 13 is a diagram showing ATR-infrared absorption spectra of surfaces having different numbers of layers.
  • FIG. 14 is a diagram showing the relationship between the number of layers and two peak areas derived from phosphate groups.
  • FIG. 15 is a diagram showing the relationship between the number of layers and the water contact angle on the surface.
  • FIG. 16 Photographs of phase contrast microscopy (A) and fluorescence microscopy (B) of HEK293 cells 48 hours after the application of an electric pulse (electric field intensity 250 VZcm, pulse width 10 msec, pulse number 1) and power 48 hours later.
  • an electric pulse electric field intensity 250 VZcm, pulse width 10 msec, pulse number 1
  • FIG. 17 is a diagram showing the effect of electric field strength on gene transfer efficiency and cell viability.
  • FIG. 18 is a graph showing the effect of the number of layers on gene transfer efficiency and cell viability.
  • FIG. 19 is a diagram showing the amount of DNA carried on surfaces having different numbers of layers.
  • FIG. 20 is a correlation diagram showing the relationship between gene transfer efficiency and DNA release.
  • FIG. 22 is a fluorescence microscopic image 48 hours after electric pulse loading when different genes (pEGFP, pDsRed or a mixture of both) were introduced into HEK293 cells at limited locations.
  • a elect opening porator B Elect mouth correction buffer
  • One aspect of the present invention is a method for introducing a nucleic acid into a cell by an electoral port method
  • a cationic surface electrode substrate is provided, and a nucleic acid and a cationic polymer are alternately adsorbed on the surface of the cationic surface electrode substrate to provide a cationic polymer
  • the cationic surface electrode substrate may be any one as long as the surface of the electrode substrate is positively charged.
  • a monomolecular film of a thiol compound, a disulfide compound or a sulfide compound having an aionic functional group at a terminal is formed, and the surface of the monomolecular film is formed on the surface of the monomolecular film.
  • a cationic surface electrode substrate on which a cationic polymer is adsorbed (a2) A monomolecular film of a thiol compound, a disulfide compound, a sulfide compound, or a silane treatment agent having a cationic functional group at a terminal is formed on the surface of the electrode substrate, and the surface of the monomolecular film is formed.
  • the cationic surface electrode substrate (al) may be, for example, 1) a single molecule of a thiol conjugate, a disulphide compound or a sulphide conjugate having an ionic functional group at a terminal on the surface of the electrode substrate. A film is formed, and then 2) a cationic polymer is adsorbed on the surface of the monomolecular film.
  • the cationic surface electrode substrate (a2) includes, for example, 1) a thiol compound, a disulfide compound, a sulfidic conjugate, or a silane treatment having a cationic functional group at a terminal on the surface of the electrode substrate.
  • the cationic surface electrode substrate of the above (a3) can be produced, for example, by adsorbing a cationic polymer on the surface of the electrode substrate.
  • the "substrate" in the electrode substrate is a plate, a chip (including a microchip), an array, or the like that supports the electrodes, and the base material that forms them is an insulating material that can support the electrodes.
  • inorganic insulating materials such as glass, myritsu, quartz, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, silicon nitride, or polyethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, Unsaturated polyester, fluorinated resin, polyvinyl chloride, polyvinyl chloride, polyacetic acid butyl, polybutyl alcohol, polybutylacetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide , Phenolic resin, urea resin, epoxy resin, Ramin ⁇ , styrene 'acrylonitrile copolymer, acrylonitrile
  • the base material of the “substrate” in the cationic surface electrode substrates (al) and (a2) is glass, mylite, quartz, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide.
  • An inorganic insulating material such as silicon, silicon oxide, silicon nitride, or a transparent plastic is preferred.
  • the substrate of the “substrate” in the cationic surface electrode substrate (a3) is particularly preferably glass or glass, which is preferably a transparent plastic.
  • the transparent plastic is not particularly limited as long as it is a transparent polymer material which does not emit autofluorescence and may be a known one.
  • Such transparent plastics include, for example, the above-described organic insulating materials, and among them, polyethylene terephthalate is preferable.
  • an electrode having a metallic force such as platinum, gold, and aluminum which is not particularly limited, is preferably used as long as it can be an electrode in the election port method.
  • a transparent electrode is also preferably used for facilitating microscopic observation of cells.
  • ITO indium tin oxide
  • ITO InO-SnO
  • tin oxide doped with (SnO) and the like Preference is given to tin oxide doped with (SnO) and the like.
  • the electrode substrate composed of the "substrate” and the “electrode” include, for example, a metal electrode such as platinum, gold, and aluminum or a transparent electrode provided on one surface of a glass substrate, a plastic substrate, or a my-force substrate. More preferred examples of the former include those in which a gold electrode is provided on one surface of a glass substrate, a micro-substrate or a transparent plastic substrate, and more preferred examples of the latter are a glass substrate and a transparent substrate.
  • a transparent substrate such as a plastic substrate provided with a transparent electrode of an indium oxide on one side is exemplified.
  • a known method may be used, for example, by using a known method such as combining the above metals on an inorganic insulating substrate by heating or Z and pressing. There is a method.
  • a vacuum deposition method, a sputtering method, an ion implantation method, a plating method, and the like can also be mentioned.
  • the thiol-conjugated compound having an aionic functional group at the terminal used for forming a monomolecular film on the surface of the electrode substrate includes, for example, the following general formula (1): R 'CCH) -SH (1)
  • R 1 which is an ionic functional group is a carboxyl group, a phosphoric acid group, a sulfonic acid group or a phosphonic acid group
  • n is 1 to 40, preferably 7 to There are 18 things.
  • R 1 and n have the same meanings as described above, and m represents an integer of 1 to 40).
  • the disulphide conjugate or the sulphide conjugate may be symmetric or asymmetric, but a symmetric type is preferred in that a uniform monomolecular film is formed.
  • Specific examples of the preferred compound (1) or a disulfide or a sulfidide conjugate thereof include, for example, 11 mercaptundecanoic acid, 8 mercaptooctanoic acid, 15 mercaptohexadecanoic acid, 10-carboxydecyldisulphide and the like. Is raised.
  • the thiol conjugate having a cationic functional group at a terminal used for forming a monomolecular film on the surface of the electrode substrate includes, for example, the following general formula (2):
  • R 2 represents a cationic functional group, and n has the same meaning as described above
  • a thiolly ligated product represented by Examples of the cationic functional group represented by R 2 include an amino group, and n represents an integer of 1 to 40, preferably 7 to 18.
  • the disulphide conjugate or the sulphide conjugate may be symmetric or asymmetric.
  • the symmetric type is preferable in that a uniform monomolecular film is formed.
  • Preferable examples of the compound (2) or a disulfide or a sulfidide conjugate thereof include, for example, 11-amino-1-opendecanethiol.
  • silane treatment agent having a cationic functional group at the terminal used for forming a monomolecular film on the surface of the electrode substrate examples include, for example, the following general formula (3)
  • R 2 has the same meaning as described above, p is an integer of 1 to 40, and OR represents an alkoxy group).
  • examples of the cationic functional group represented by R 2 include an amino group, p is an integer of 114, preferably 7 to 18, and OR is an integer having 1 to 16 carbon atoms. Preferably, there are 13 to 13 lower alkoxy groups.
  • a conventional method can be used.
  • a thiol compound (Formula 1 or 2) or a disulfide compound thereof (Formula 1A or It can be carried out by immersion in a solution of 2A) or a sulfido conjugate (formula 1B or 2B) or a silane treatment agent (3).
  • a high-density, highly-oriented monomolecular film is formed on the electrode substrate.
  • a thiol compound (1) having a terminal anionic functional group or its disulfide or sulfido conjugate (1A or 1B) is used as the thiol compound
  • a monomolecule of the compound is used.
  • the cationic polymer By adsorbing the cationic polymer on the surface of the membrane, the above-mentioned cationic surface electrode substrate (a1) is obtained.
  • the "cationic polymer” used herein is a highly cationic polymer that is bonded to the monomolecular film formed on the surface of the electrode substrate by electrical bonding (for example, ionic bonding).
  • Any molecule can be used, for example, polyethyleneimine, polyallylamine, polybutylamine, polybutylpyridine, aminoacetalized polybutyl alcohol, and acrylic or methacrylic polymers having a quaternary amine at the side chain terminal (for example, poly, N-dimethylaminoethyl methacrylate), acid-treated gelatin, polylysine, polyortin, polyarginine, protamine, chitosan, DEAE cellulose, DEAE-dextran, polyamidoamine dendrimer, etc.
  • the average molecular weight of the cationic polymer is from 500 to 5,000,000, preferably from 600 to 100,000.
  • the average molecular weight is between 200 and 25,000, especially between 500 and 10,000.
  • the average molecular weight is preferably from 500 to 150,000, particularly preferably from 1,000 to 70,000.
  • the cationic polymer can be adsorbed on the surface of the monomolecular film by bringing a solution of a cationic polymer into contact with the surface of the monomolecular film. It can be suitably carried out by adding a solution in which a cationic polymer is dissolved in an appropriate buffer (for example, phosphate buffered saline), and allowing it to stand at room temperature.
  • the concentration of the cationic polymer solution is not particularly limited, but is preferably 0.1% to 10%.
  • the "anionic polymer” refers to an anionic polymer that is bonded to the monomolecular film formed on the surface of the electrode substrate by electrical bonding (for example, ionic bonding) to the surface of the monomolecular film.
  • synthetic polymers such as polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polystyrenesulfonic acid, and poly (2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid), alginic acid, hyaluronic acid, and chondroitin sulfate
  • natural polymers such as alkali-treated gelatin.
  • the anionic polymer can be adsorbed on the surface of the monomolecular film by bringing a solution of the anionic polymer into contact with the surface of the monomolecular film.
  • a solution obtained by dissolving the aionic polymer in a suitable buffer for example, a phosphate buffered saline
  • a suitable buffer for example, a phosphate buffered saline
  • the cationic surface electrode substrate of the above (a2) is obtained by adsorbing the cationic polymer on the surface of the adsorbed aionic polymer.
  • Cationic high used here The same molecules as described above can be used, and the adsorption treatment can be performed in the same manner as described above.
  • the surface of the electrode substrate is treated with a cationic polymer so that the cationic polymer is applied to the electrode surface.
  • the adsorbed cationic surface electrode substrate of (a3) is obtained.
  • the same cationic polymer can be used here, and the treatment with the cationic polymer is preferably carried out by adding a solution of the cationic polymer to the surface of the electrode substrate and allowing it to stand at room temperature. Can be implemented.
  • the nucleic acid-carrying electrode substrate is obtained by supporting the nucleic acid on the surface of the cationic surface electrode substrate provided above.
  • nucleic acid used in the present invention may be a polynucleotide or an oligonucleotide, and may be a DNA or an RNA. In the case of DNA, it may be plasmid DNA, cDNA, genomic DNA or synthetic DNA.
  • nucleic acid includes a DNA derivative or an RNA derivative, which is a nucleic acid having a phosphorothioate bond or a phosphate moiety, a sugar moiety, or a base moiety of an internucleotide in order to avoid degradation by an enzyme. Means a nucleic acid that has been chemically modified.
  • nucleic acid includes a plasmid DNA encoding a protein having a physiological activity having a therapeutic or ameliorating effect on a disease symptom, or a protein which induces an immune response having a preventive, therapeutic or ameliorating effect on a disease symptom.
  • Nucleic acid also includes antisense nucleic acids.
  • An “antisense nucleic acid” is a DNA or RNA molecule that is complementary to at least a part of a specific mRNA molecule.When introduced into a cell, it hybridizes with the corresponding mRNA to form a double-stranded molecule. To Since cells do not translate double-stranded mRNA, antisense nucleic acids interfere with translation of the mRNA. “Nucleic acid” further includes siRNA (short double-stranded RNA that causes RNA interference). Further, “nucleic acid” includes expression vectors such as antisense nucleic acid and siRNA.
  • Nucleic acid force In the case of a plasmid DNA encoding an S protein, Sometimes it contains elements necessary for the expression of the gene of interest, such as a promoter, which is preferably in a form configured to express the encoded genetic information in the cell. When it is necessary to confirm whether or not the target gene has been introduced into cells, a DNA containing a reporter gene in addition to the target gene may be used.
  • a promoter which is preferably in a form configured to express the encoded genetic information in the cell.
  • the size of the "nucleic acid” is not particularly limited, but is generally lObp-200kbp, preferably 15bp-lOOkbp.
  • the nucleic acid can be adsorbed and carried on the surface of the cationic surface electrode substrate by bringing a solution of the nucleic acid into contact with the surface of the cationic surface electrode substrate.
  • a solution obtained by dissolving a nucleic acid in an appropriate buffer for example, phosphate buffered saline
  • an appropriate buffer for example, phosphate buffered saline
  • the nucleic acid-carrying electrode substrate can also be formed by laminating the nucleic acid and the cationic polymer on the surface of the cationic surface electrode substrate in the order of nucleic acid, cationic polymer, and nucleic acid by the alternate adsorption method. can get.
  • the nucleic acid adsorption and the cationic polymer adsorption alternately carried out can be carried out in the same manner as described above.
  • This step is a step of adhering cells to the surface of the nucleic acid-carrying electrode substrate obtained above.
  • a ⁇ cell '' as used in the present invention may be a cell from any organism (e.g., any type of (e.g., bacteria, yeast) or multicellular organism (e.g., animal (e.g., , Vertebrates, invertebrates), plants (eg, monocotyledonous, dicotyledonous, etc.), etc.
  • organism e.g., any type of (e.g., bacteria, yeast) or multicellular organism
  • animal e.g., Vertebrates, invertebrates
  • plants eg, monocotyledonous, dicotyledonous, etc.
  • vertebrates eg, metal eel, japonicus, cartilaginous fish, teleost, amphibian, reptile
  • Birds mammals, etc.
  • mammals eg, monotremes, marsupials, oligodonts, skin wings, wing-hands, carnivores, carnivores
  • cells from primates eg, chimpanzees
  • primates eg, from long nose, odd ungulates, artiodactyla, tubulars, squamata, sponges, whales, primates, etc. , Macaques, and humans
  • human-derived cells include, for example, human-derived cell lines such as human cervical cancer cells (HeLa); human fetal kidney-derived cells, human umbilical vein endothelial cells, human vascular endothelial cells, and human aortic smooth muscle cells.
  • Primary human cultured cells such as vesicles, human hepatocytes, human fibroblasts, human corneal epithelial cells, and human corneal endothelial cells; human-derived stem cells such as mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, and neural stem cells.
  • the method for adhering the cells to the surface of the nucleic acid-carrying electrode substrate is not particularly limited.
  • a cell suspension is added on the substrate, or the cells are suspended in an appropriate medium.
  • the obtained cell suspension can be dropped on the substrate and cultured under conditions suitable for the cells.
  • Adhere to the surface Cells that do not adhere are preferably removed before applying the electrical pulse. Non-adherent cells can be removed, for example, by replacing the medium with an appropriate buffer.
  • the electric pulse is applied to the cell by using the electrode of the nucleic acid-carrying electrode substrate with the cell adhered to the surface as one electrode (with the first electrode! /, Etc.).
  • An electrode (referred to as a second electrode) may be provided, and an electric pulse may be generated between the first electrode and the second electrode using an appropriate electoral port porator.
  • the electric pulse may be generated by a shift of AC or DC !, but it is generally preferable to generate the pulse by DC.
  • the second electrode is the anode (+).
  • the first electrode is a cathode (-) and the second electrode is an anode (+).
  • the material of the second electrode is not particularly limited as long as it is conductive.
  • metals such as gold, platinum, copper, aluminum, stainless steel, tungsten, titanium, cobalt chromium alloy, and cobalt chromium molybdenum alloy (pitanium),
  • a transparent electrode material such as ITO (indium stannate), indium sulfide, and the like can be given.
  • the conditions of the electric pulse include the type of electrode material, the type of cell, the type of nucleic acid to be introduced, and the type of substrate.
  • the electric field strength, the length of the electric pulse, the number of times of pulse application, and the like may be appropriately selected depending on the type of the cationic polymer on the plate.
  • the electric field strength is 10 to 500 VZcm, preferably 25 to 300 VZcm
  • the length of the electric pulse is 1 to 99 msec, preferably 1 to 50 msec
  • the number of pulse application is 1 to 99 times, preferably 1 to 99 times.
  • the force that is five times is not limited to these.
  • the timing for applying the electric pulse is not particularly limited, and can be appropriately selected. That is, after seeding the cells on the nucleic acid-carrying electrode substrate, culturing the cells, and adhering the cells to the substrate, it is not necessary to immediately apply an electric pulse. It is possible to apply the electric noise freely within approximately 415 days after the cell seeding. By the application of the electric pulse, the nucleic acid is efficiently introduced into the cells.
  • FIG. 1 shows an example of an arrangement diagram of the nucleic acid-carrying electrode substrate and the electric pulse loading system used in carrying out the method of the present invention.
  • the method of the present invention will be described with reference to this figure.
  • the cell (C) adheres to the surface.
  • These cells are partitioned by, for example, a silicone spacer (G), and the well is filled with an election port buffer (B).
  • a gold electrode (F) serving as an opposite electrode is provided in parallel with the gold thin-film electrode (E).
  • the gold thin film electrode (E) and the gold electrode (F) are connected to the electoral port porator (A), which is an electric pulse generator.
  • the distance between the gold thin-film electrode (E) and the gold electrode (F) is set to 2 mm, and the area of the well is set to 13 ⁇ 13 mm 2 .
  • the electric pulse is applied to the cell (E) by using the gold thin-film electrode (E) as the cathode (1), the gold electrode (F) as the anode (+), and the electoral port porator (A) to generate electric pulses.
  • a nucleic acid (DNA) is introduced into C).
  • the above-described nucleic acid introduction method can be carried out using a substrate having a micropatterned surface.
  • the micropatterning can be performed by a method known per se.
  • the surface of the cationic surface electrode substrate before supporting the nucleic acid is partitioned by a suitable means, and a plurality of different patterns are prepared.
  • a micropatterned nucleic acid-carrying electrode substrate can be obtained.
  • a photomask is fixed to the surface of the electrode substrate.
  • an organosilane compound for example, octadecyltriethoxysilane
  • alkanethiol alkanethiol
  • a photomask is fixed to the surface of the electrode substrate.
  • a micropatterned electrode substrate can be obtained. If a powerful substrate is used, nucleic acids are arranged in an array. can do. Therefore, if the present invention is carried out using the above-described micropatterned nucleic acid-carrying metal substrate or electrode substrate, it is possible to limit the place where the nucleic acid is introduced.
  • a cationic surface electrode substrate for electrostatically supporting DNA was prepared. First, a monomolecular film of a thiol-conjugated product having a carboxyl group at a terminal (11-mercaptundecanoic acid, manufactured by Sigma) was formed on a glass substrate having a thin gold film deposited on one surface. A phosphate buffer solution (PH7.4) containing polyethyleneimine having an average molecular weight of 800 (hereinafter, referred to as PEI800, manufactured by Aldrich) at a concentration of 1% was added to the monolayer, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Placed. The surface of the obtained substrate was sufficiently washed with water and dried with nitrogen gas to obtain a cationic surface gold electrode substrate.
  • PEI800 polyethyleneimine having an average molecular weight of 800
  • a silicone spacer (internal area: 1.3 ⁇ 1.3 cm 2 , height: 2 mm) sterilized with ethanol was pressure-bonded to the surface of the cationic surface gold electrode substrate obtained above. And fixed.
  • 0.05 mgZmL of a phosphate-buffered saline (pH 7.4) of plasmid DNA (pEGFP-Cl, Clontech) encoding green fluorescent protein was applied to the surface of a metal electrode substrate with a thion-type surface in a silicone spacer.
  • DNA was electrostatically adsorbed and carried on the surface. The surface was sufficiently washed with a phosphate-buffered saline to remove unadsorbed particulate DNA to obtain a DNA-supporting gold electrode substrate.
  • Human embryonic kidney-derived cells (HEK293: purchased from Human Science Foundation) were prepared from a serum-containing medium (medium composition: minimum essential medium (MEM) (Gibco Life Technology)), 10% fetal serum, lOOunitZml penicillin, 0. , And the suspension was dropped on the surface of the DNA-supporting gold electrode substrate. At 37 ° C and 5 The cells were adhered to the surface and grown by culturing in an atmosphere of% CO. 24 hours later,
  • MEM minimum essential medium
  • the medium was replaced with phosphate-buffered saline (pH 7.4) at 4 ° C to remove non-adherent cells, filled with phosphate-buffered saline, and placed on a glass substrate with a thin gold film deposited on one side.
  • Two electrodes were fixed on a silicone spacer.
  • Figure 1 shows their arrangement.
  • a DNA-supporting gold electrode substrate was connected to a high-voltage pulse generator (Electrosquareporator T820, manufactured by ⁇ ⁇ ⁇ ) using the cathode (-) as the cathode and the other as the anode (+), and applied an electric field strength of 75 VZcm and a pulse width of 10 msec.
  • An electric pulse was applied under the condition of one time to perform election port poration.
  • the mixture was incubated at room temperature for 5 minutes, and the phosphate buffered saline in the well was replaced with a serum-containing medium that had been kept at 37 ° C. The cell culture was performed under an atmosphere of.
  • transient expression of the transgene was also analyzed after 48 hours with respect to the electoral opening force.
  • EGFP green fluorescent protein
  • FIG. 2 shows a phase-contrast microscope image (A) and a fluorescence microscope image (B) of HEK293 cells 48 hours after electoral poration.
  • A phase-contrast microscope image
  • B fluorescence microscope image
  • Example 1 In the same manner as in Example 1, HEK293 cells were seeded on a DNA-carrying gold electrode substrate, allowed to adhere, and electric pulses were applied to perform electoral port poration. At that time, the effect of the electric field strength on the gene transfer efficiency was examined by changing the voltage of the electric pulse.
  • the pulse application conditions other than the applied voltage were the same as in Example 1 (pulse width: 10 msec, number of pulses: 1), and the gene transfer efficiency was calculated as the percentage of EGFP-positive cells 48 hours after the electric pulse. evaluated. The results are shown in FIG. At the same time, the effect of electric field strength on cell viability was examined.
  • the cell viability was evaluated by trypan blue exclusion 3 hours after the application of the electric pulse, the cells were collected by trypsin treatment. That is, trypan The number of viable cells not stained by blue (the number of viable cells) was determined, and the survival rate was calculated according to the following equation. The results are shown in FIG.
  • HEK293 cells were seeded on a DNA-supporting gold electrode substrate in the same manner as in Example 1 and allowed to adhere, and then an electric pulse was applied with an impulsive force U (electric field intensity of 75 VZcm, pulse width of 10 msec, pulse frequency of 1). Turn) to perform elect-portation. At that time, the molecular weight of the cationic polymer to be immobilized was changed, and the effect of the molecular weight of the cationic polymer on the gene transfer efficiency was investigated.
  • U electric field intensity of 75 VZcm, pulse width of 10 msec, pulse frequency of 1
  • Polyethyleneimine with molecular weights of 800, 25,000 and 750,000 (displayed as ⁇ 800, ⁇ 25000, ⁇ 750000, Co., Ltd.) and positive azinoleamine hydrochloride having a molecular weight of 15,000 and 70,000 (designated as PAA15000, PAA70000, both of which are Aldrich).
  • FIG. 5 shows the relationship between the gene transfer efficiency and the molecular weights of polyethyleneimine and polyallylamine.
  • Figure 6 shows the amount of DNA carried on each surface. Furthermore, after applying an electric pulse (electric field strength 75 VZcm, pulse width 10 msec, pulse number 1), the amount of DNA in the supernatant was measured with Picogreen to evaluate the amount of DNA with released surface force. Was. The results are shown in FIG. As is clear from these figures, as the molecular weight increased, the amount of DNA carried increased. The amount of DNA released from the surface after the application of an electric pulse was extremely small. Conversely, on the low molecular weight polyethyleneimine surface (PEI800), although the amount of DNA carried was small, about 30% of the carried DNA was released by the application of the electric pulse.
  • PEI800 low molecular weight polyethyleneimine surface
  • FIG. 8 shows the relationship between the gene transfer efficiency on each cation surface and the amount of DNA released after pulsing. As is apparent from this figure, a positive correlation was observed between the gene transfer efficiency and the amount of released DNA. This result suggests that, in the present invention, the gene transfer efficiency strongly depends on the amount of released DNA even though the surface force is high.
  • HEK293 cells were seeded on a DNA-carrying gold electrode substrate in the same manner as in Example 1, and allowed to adhere. Then, an electric pulse was applied to perform electoral port poration. At that time, the time from the cell seeding to the application of the electric pulse was changed, and the effect of the cell culture period on the gene transfer efficiency was tested.
  • FIG. 9 shows a phase-contrast microscope image of cells 48 hours after application of an electric pulse after application of a pulse 24, 48, or 72 hours after cell seeding. From this figure, it can be seen that the gene was efficiently introduced and expressed in all cases at 24, 48 and 72 hours after the cell seeding power.
  • FIG. 10 shows the relationship between the electric pulse application time and the gene transfer efficiency (%). From these results, it can be seen that the high gene transfer efficiency was maintained at 12, 24, 48, and 72 hours after cell seeding, and that the gene could be transferred to the adherent cells at the desired time.
  • Example 5 shows a phase-contrast microscope image of cells 48 hours after application of an electric pulse after application of a pulse 24, 48, or 72 hours after cell seeding. From this figure, it can be seen that the gene was efficiently introduced and expressed in all cases at 24, 48 and 72 hours after the cell seeding power.
  • FIG. 10 shows the relationship between the electric pulse application time and the gene transfer efficiency (%). From these results, it can be seen that the high gene transfer efficiency was maintained at 12,
  • Hippocampus of rat fetal brain was collected to obtain nerve cells. Plasmids encoding EGFP or red fluorescent protein (DsRed) were introduced into the primary neurons in the same manner as in Example 1.
  • plasmid DNAs pEGFP and pDsRed
  • EGFP green fluorescent protein
  • DsRed red fluorescent protein
  • Fig. 11 shows phase contrast microscopy images (left, phase contrast) and fluorescence microscopy images (middle, right, EGFP, DsRed) 48 hours after the electric pulse load.
  • the microscope image in the left figure there is no cell damage due to electo-portion.
  • the fluorescence micrographs in the middle and right panels it can be confirmed that both the pEGFP and pDsRed genes have been introduced into the cells, and the expression of the fluorescent proteins EGFP and DsRed encoded by those genes has been confirmed. It is also clear from this figure that the present gene transfer method allows efficient transfer of a plurality of genes into cells.
  • the gene transfer efficiency was 20%, and the gene transfer was confirmed as in the case of the HEK293 cells.
  • the gene pEGFP / pDsRed
  • the introduction efficiency was 10-20%, and no significant difference from the method according to the present invention was observed.
  • the dead cell rate at that time was 20-30%.
  • no cell damage was observed in the gene transfer method according to the present invention.
  • the collected hippocampal neurons were washed with PBS to prepare a cell suspension of 1 ⁇ 10 6 cells ZmL.
  • 15 ⁇ g of plasmid DNA (pEGFP) was mixed with kamen. This solution was poured into an election port cuvette and left on ice for 10 minutes. After that, election port polish was performed under the conditions of electric field strength of 625 VZcm (distance between electrodes: 4 mm), pulse width of 10 msec, and one pulse. After the treatment, the plate was left at room temperature for 10 minutes, and then seeded on a PLL-coated 60 mm cell culture dish. 48 hours after electoral opening, EGFP expression was confirmed by fluorescence microscopy. As mentioned above, the gene transfer efficiency was 10-20%.
  • FIG. 12 shows a phase contrast microscope (left) and a fluorescence microscope image (right) 48 hours after the electric pulse load.
  • low magnification observation was performed to observe the entire substrate (approximately 1.5 ⁇ 1.5 cm 2 ). It can be seen that the cells are uniformly adhered to the substrate surface.
  • the fluorescence of the region where the pEGFP and pDsRed genes are fixed is observed and superimposed, and the fluorescence derived from the gene product can be observed in the fixed region of each gene. From these facts, it is understood that the method of the present invention enables gene transfer in a limited place.
  • a glass substrate on one side of which an indium tin oxide (hereinafter referred to as ITO) is deposited is subjected to an oxygen plasma treatment (output 30W, pressure 5Pa) using a plasma treatment apparatus (manufactured by Okuma Engineering, type: PA300AT). ) At room temperature for 5 minutes to clean the ITO surface.
  • ITO indium tin oxide
  • a phosphate buffer solution PH7.4 containing polyethyleneimine having an average molecular weight of 800 (hereinafter referred to as PEI800, manufactured by Aldrich) at a concentration of 1% was added to the ITO surface, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. At rest. The surface of the obtained substrate was sufficiently washed with water and dried with nitrogen gas to obtain a cationic surface ITO electrode substrate. Next, a silicone spacer (internal area: 1.3 X 1.3 cm 2 , height: 1 mm) sterilized with ethanol is pressed on the surface of the cationic surface ITO electrode substrate obtained above and fixed. did.
  • PEI800 polyethyleneimine having an average molecular weight of 800
  • plasmid DNA encoding green fluorescent protein (pEGFP-Cl, manufactured by Clontech) was added to the cationic surface ITO in the silicone spacer.
  • the DNA was added on the surface of the electrode substrate and left at room temperature for 30 minutes to electrostatically adsorb and carry DNA on the surface.
  • the surface was thoroughly washed with phosphate buffered saline to remove unadsorbed DNA. Thereafter, the stacking was repeated by alternately adsorbing PEI800 and DNA in the same manner, and the surface was sufficiently washed with a phosphate buffered saline to obtain a DNA-carrying transparent electrode substrate.
  • the unprocessed ITO electrode substrate has the number of laminations of 0, and the number of times of adsorption of PEI and DNA is shown as the number of laminations. That is, the number of laminations on the surface of PEI800-DNA-PEI800 is shown as 3.
  • the elemental composition of the ITO electrode substrate surface where PEI800 and DNA were alternately adsorbed and laminated was measured by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The results are shown in Table 1.
  • FIG. 13 shows an ATR-IR spectrum of the surface of the ITO electrode substrate on which PEI800 and DNA are alternately adsorbed and laminated.
  • the two absorptions at 1065 and 1230 cm- 1 are derived from the phosphate groups that make up the DNA backbone.
  • Figure 14 plots these two peak areas against the number of layers. As the number of layers increased, the peak area increased linearly. This result indicates that the amount of DNA carried on the surface of the ITO substrate increased as the number of layers increased.
  • Example 8 The electoral port was applied to the cells on the DNA-carrying ITO electrode substrate prepared according to Example 7.
  • human embryonic kidney-derived cells ⁇ 293: Human Science Foundation
  • serum-containing medium medium composition: minimum essential medium (MEM) (Gibco Life Technology), 10% fetal serum, lOOunitZml penicillin, 0.1 mg / ml Streptomycin
  • MEM minimum essential medium
  • fetal serum fetal serum
  • lOOunitZml penicillin 0.1 mg / ml Streptomycin
  • the cells were adhered to the surface and grown by culturing in two atmospheres. After 24 hours, replace the medium with phosphate buffered saline (pH 7.4) at 4 ° C to remove non-adherent cells, fill with phosphate buffered saline, and deposit a thin gold film on one side
  • the resulting glass substrate was fixed to a silicon spacer as a second electrode.
  • the DNA-carrying transparent electrode substrate was connected to a high-voltage pulse generator (Electrosquareporator T820, manufactured by ⁇ ⁇ ⁇ ) with the cathode (-) and the other as the anode (+), and an electric field strength of 250 VZcm and a pulse width of 10 msec.
  • An electric pulse was applied under the condition that the number of times of application was one, and election port polish was performed.
  • After pulse application incubate at room temperature for 5 minutes, and then replace the phosphate buffered saline in the wells with a serum-containing medium that has been kept at 37 ° C at 37 ° C and 5% Cell culture was performed under an atmosphere of CO.
  • transient expression of the transgene was also analyzed after 48 hours with respect to the electoral port poling force.
  • EGFP green fluorescent protein
  • FIG. 16 shows a phase-contrast microscope image (A) and a fluorescence microscope image (B) of HEK293 cells 48 hours after electoral poration. As can be seen from the figure, about 70% of the cells on the substrate surface expressed EGFP. This clearly shows that the method of the present invention is a method that allows efficient gene transfer. In the bright field and fluorescence observation of the cells, very clear and bright images were obtained (when glass was used as the base material). This indicates that observation of cells can be performed very well by using a transparent electrode.
  • Example 9 As in Example 8, HEK293 cells were seeded on a DNA-carrying transparent electrode substrate (number of laminations 5, base material: PET), allowed to adhere, and an electric pulse was applied to adjust the electoral opening. I went. At that time, the effect of the electric field strength on the gene transfer efficiency was examined by changing the voltage of the electric pulse. The pulse application conditions other than the applied voltage were the same as in Example 8 (pulse width 10 msec, number of pulses 1), and the gene transfer efficiency was evaluated as the percentage of EGFP-positive cells 48 hours after the application of the electric pulse. At the same time, the effect of electric field strength on cell viability was examined. Cell viability is determined by electric pulse force!
  • HEK293 cells were seeded on a DNA-carrying ITO electrode substrate (number of laminations 5, base material: PET) in the same manner as in Example 8 and allowed to adhere, and then an electric pulse was applied thereto (electric field strength of 250 VZcm The pulse width was 10 msec and the number of pulses was once. At that time, the number of layers of PEI800 and DNA was changed, and the effect of the number of layers on gene transfer efficiency was examined.
  • Fig. 18 shows the relationship between the gene transfer efficiency and the number of layers. As can be seen from this figure, as the number of layers increased, gene transfer efficiency increased while maintaining cell viability.
  • FIG. 19 shows the amount of DNA carried on the surface of each number of layers. As the number of layers increased, the amount of loaded DNA increased.
  • FIG. 20 shows the relationship between the gene transfer efficiency and the amount of DNA released after pulsing under each condition. As the number of layers increased, the amount of DNA released after pulse application increased. Approximately 10-30% of the supported DNA was released by the application of electric noise. As is clear from this figure, a positive correlation was observed between the gene transfer efficiency and the amount of released DNA. This result suggests that, according to the present invention, the gene transfer efficiency depends on the amount of DNA released as a surface force.
  • Hippocampus of rat fetal brain was collected to obtain nerve cells.
  • Two types of plasmids respectively encoding EGFP and red fluorescent protein (DsRed) were introduced into the primary neurons in the same manner as in Example 8.
  • Example 8 green fluorescent protein (EGFP) and red fluorescent
  • the primary neurons were placed on a transparent electrode substrate (5 layers, electrodes: ITO, substrate: glass) carrying a plasmid DNA (pEGFP and pDsRed, manufactured by Clontech) encoding a protein (DsRed).
  • pEGFP and pDsRed plasmid DNA
  • Clontech Clontech
  • an electric pulse 200 VZcm, 10 msec, 1 pulse
  • Fig. 21 shows a phase contrast microscope image (left, phase contrast) and a fluorescence microscope image (middle, right, EGFP, DsRed) of the electric pulse load force after 48 hours.
  • the microscope image in the left figure no cell damage due to electoru-portation is seen.
  • the fluorescence microscopy images in the middle and right panels it can be confirmed that both the pEGFP and pDsRed genes have been introduced into the cells, and the expression of the fluorescent proteins EGFP and DsRed encoded by those genes has been confirmed.
  • the present gene transfer method allows efficient transfer of multiple genes into the same cell.
  • the results show that gene transfer can be performed efficiently even when electroporation is performed after a culture period of 3 days from cell seeding. From this, it was found that this method can set the timing of gene transfer arbitrarily.
  • the surface of the ITO electrode substrate (substrate: glass) was cleaned by oxygen plasma treatment.
  • the ITO electrode substrate was immersed in a 1% toluene solution of octadecyltriethoxysilane (LS-6970, Shin-Etsu-Danigaku) and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Thereafter, the electrode substrate was sufficiently washed with toluene and ethanol, and then left at 80 ° C for 12 hours.
  • a photomask in which a chromium pattern was deposited on quartz glass was overlaid and fixed on the surface of the electrode substrate, and irradiated with ultraviolet light at room temperature for 1 hour.
  • the substrate was washed with ethanol, and the organic silane layer decomposed by ultraviolet irradiation was removed.
  • the organic silane layer decomposed by ultraviolet irradiation was removed.
  • PEI800 and plasmid DNA were formed on the surface of the ITO spot on the patterned ITO electrode substrate (round spot with exposed ITO: lmm, 10 x 10 points).
  • the mixture of the two was adsorbed and carried alternately by the method described above, limiting the site on the electrode (5 layers).
  • HEK293 cells were adhered and grown on the surface of the DNA-carrying transparent electrode substrate in the same manner as in Example 8, and after 24 hours after seeding, non-adhered cells were removed, followed by electric pulse (200 VZcm, 10 msec, 1 pulse) Was loaded.
  • Fig. 22 shows a fluorescence microscope image 48 hours after the application of the electric pulse load.
  • the entire board (about 1.7
  • the nucleic acid introduction method of the present invention can efficiently introduce a gene without causing cell damage, and can limit the time and place of gene introduction. For this reason, the nucleic acid introduction method according to the present invention can efficiently carry out functional analysis of genes and gene products at the cell level, greatly promotes cell biology, post-genome and proteome research, and does not greatly contribute to medical care. It is something.

Abstract

　エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、（Ａ）電極の表面に核酸を担持させる工程；（Ｂ）得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および（Ｃ）接着した細胞に電気パルスを印加する工程、からなる方法。本方法により、接着性細胞に障害を与えることなく、遺伝子を効率よく細胞に導入できるとともに、望ましい時期に望ましい位置で遺伝子を導入できる。

Description

明 細 書
核酸導入方法
技術分野
[0001] 本発明は核酸導入方法に関し、さらに詳しくは、エレクト口ポレーシヨン法により核酸 を細胞に導入する方法に関する
背景技術
[0002] 細胞への遺伝子導入方法は、遺伝子の機能や遺伝子にコードされているタンパク 質の性質を解明したり、組み換えタンパク質を多量に生産する場合に利用されてい る。また、細胞への遺伝子導入法は、 目的の酵素やサイト力インの遺伝子を患者の 細胞内に導入し、その遺伝子により体内に目的とする物質を生産させて疾患の治療 を行う場合にも利用されている。
[0003] ヒトゲノムの DNA塩基配列の解読がほぼ終了し多くの機能未知の遺伝子の存在が 予測され、今後、これらの新規ヒト遺伝子の機能解析が研究の大きなターゲットとなる 力 数万種類に及ぶ遺伝子の機能解析を行うには、網羅的かつ高速に遺伝子の過 剰発現やノックアウトできる手法が必要である。
[0004] 細胞内に遺伝子を導入する技術としては、生物学的手段、すなわちアデノウイルス 、レトロウイルス、レンチウィルス由来のウィルスベクターを利用する導入方法と、リポ フエクシヨン法（リボソーム法）、エレクト口ポレーシヨン法（電気穿孔法）、マイクロイン ジェクシヨン法、パーティクルガン法などの物理的手段を用いる導入方法とに大別さ れる。
[0005] これらのうち、ウィルスベクターを利用する方法は、遺伝子導入効率は高いが、ウイ ルスベクターの作製が煩雑である、安全性に問題があるなどの難点がある。リポフエ クシヨン法は、安全性は高いが、ウィルスを利用する方法に較べて、遺伝子導入効率 が低 、、細胞毒性が強 、などの難点がある。
[0006] マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの直接導入法は、細胞の障害 が大きぐ効率よく遺伝子を導入するための最適化条件の検討が煩雑であり、また技 術的操作に関しても特殊な技能や装置が必要であるなどの難点がある。 [0007] また、従来のエレクト口ポレーシヨン法は、遺伝子と細胞とを懸濁させた媒体を平行 板などの電極間に配置し、両電極間に電気パルスを印加して細胞の細胞膜に小孔 を生じさせ、それが修復される前に細胞外の遺伝子を細胞内に取り込ませる方法が とられていた (非特許文献 1、 2)。この方法は、遺伝子導入効率は高いものの、細胞 の障害が大きい、遺伝子導入する時期や場所を自由に選択し難いなどの難点がある
[0008] さらに、近年、遺伝子の機能を高速に解析するため、発現プラスミドをプリントしたガ ラス基板上で細胞を培養し、細胞に遺伝子をリポフエクシヨン法により導入するトラン スフエクショナルアレイが開発された (非特許文献 3)。この方法は、トランスフエクショ ンにリポフエクシヨン法を用いるものであるため、リポフエクシヨン法に起因する前記し た難点が依然として存在して 、る。
[0009] 一方、核酸やタンパク質などの生体分子を、その活性を維持した状態で基材表面 に固定化する方法として交互吸着法が報告されている (非特許文献 4)。この方法は 、基板上に電荷の異なる高分子を交互に吸着させ、静電的な相互作用（ポリイオンコ ンプレックス形成）により、逐次的に高分子薄膜を積層する方法であるが、遺伝子導 入法に適用された例は報告されて ヽな ヽ。
非特許文献 1 : ΕΜΒΟジャーナル、 1982年、第 1卷、 841— 845頁
非特許文献 2 :バイオエレクトロケミストリー アンド バイオエネルゲテイクス（Bioelect rochem. Bioenerg. ) 1999年、第 48卷、 3— 16頁
非特許文献 3 :ネイチヤー、 2001年、第 411卷、 107— 110頁
非特許文献 4 :バイオセンサーズ アンド バイオエレクトロニクス（Biosensors & B ioelectronics) , 1994年、第 9卷、 677— 684頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明の目的は、従来のエレクト口ポレーシヨン法の問題を解決した遺伝子導入方 法を提供するものであり、より具体的には、細胞に障害を与えることなぐ遺伝子を効 率よく細胞に導入するとともに、望まし 、時間に細胞集団内の望まし 、位置で遺伝子 導入を実施し得る方法を提供するものである。また、本発明の他の目的は、細胞の顕 微鏡観察にぉ ヽて良好な観察環境を提供できる電極基板を用いて、上記のような遺 伝子導入を実施し得る方法を提供するものである。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、従来のエレクト口ポレーシヨン法による遺伝子導入方法を改良すベ く種々研究を重ねた結果、電極の表面に核酸を担持させ、得られた核酸担持電極の 表面に細胞を接着させ、ついで接着した細胞に電気パルスを印加すれば、細胞にさ ほど障害を与えることなぐ効率よく遺伝子を細胞に導入し得るとともに、所望の時期 にかつ所望の位置でエレクト口ポレーシヨンを実施し得ることを見出した。また、本発 明者らはさらに研究を重ねた結果、電極として透明半導体電極を用いれば、細胞の 顕微鏡観察が良好に実施し得ることを見出した。本発明者らは、上記のような知見に 基づいて、本発明を完成するに至った。
[0012] すなわち、本発明は、
(1) エレクト口ポレーシヨン法により細胞に核酸を導入する方法であって、
(A)電極の表面に核酸を担持させる工程；
(B)得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および
(C)接着した細胞に電気パルスを印加する工程；
からなる方法、
(2) エレクト口ポレーシヨン法により細胞に核酸を導入する方法であって、
(a)カチオン性表面電極基板を提供する工程；
(b)該カチオン性表面電極基板の表面に核酸を吸着、担持させる工程；
(c)工程 (b)で得られた核酸担持電極基板の表面に細胞を接着させる工程；および
(d)該細胞に電気パルスを印加する工程；
からなる方法、
(3) カチオン性表面電極基板力 電極基板の表面に、末端にァ-オン性官能基を 有するチオール化合物、ジスルフイド化合物もしくはスルフイドィ匕合物の単分子膜が 形成されており、かつ該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチ オン性表面電極基板である前記（2)記載の方法、
(4) カチオン性表面電極基板力 電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を 有するチオール化合物、ジスルフイド化合物もしくはスルフイドィ匕合物またはシラン処 理剤の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にァニオン性高分子が 吸着され、さらにその表面にカチオン性高分子が吸着させてなるカチオン性表面電 極基板である前記（2)記載の方法、
(5) カチオン性表面電極基板が、透明電極基板の表面にカチオン性高分子を吸着 させてなるカチオン性表面電極基板である前記（2)記載の方法、
(6) 工程 (b)を、カチオン性表面電極基板の表面に直接核酸を 1回だけ吸着させる 力 あるいは該表面に核酸およびカチオン性高分子を、核酸、カチオン性高分子、 核酸の順序で交互吸着法により積層させることにより行う前記（2)記載の方法、
(7) 電極基板が、白金、金およびアルミニウムから選ばれる金属の電極基板である 前記（3)または (4)記載の方法、
(8) 電極基板が、金電極基板である前記（3)または (4)記載の方法、
(9) 金電極基板が、金蒸着したガラス基板もしくは透明プラスチック基板である前記 (8)記載の方法、
(10) 透明電極基板が、インジウムースズ酸ィ匕物、酸化インジウム、アルミニウムをド ープした酸ィ匕亜鉛、アンチモンをドープした酸化スズを蒸着したガラス基板もしくは透 明プラスチック基板である前記（5)記載の方法、
(11) 透明電極基板が、インジゥムースズ酸ィ匕物を蒸着したガラス基板もしくは透明 プラスチック基板である前記（5)記載の方法、
(12) 末端にァ-オン性官能基を有するチオールィ匕合物が、式（1)：
(1)
2 n
(式中、 R1はァ-オン性官能基を表し、 nは 1一 40の整数を表す。 )
で示されるチオール化合物である前記（3)記載の方法、
(13) R1がカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基およびホスホン酸基力 選ばれ る基である前記（12)記載の方法、
(14) 式（1)で示されるチオール化合物力 11 メルカプトゥンデカン酸、 8 メルカ プトオクタン酸および 15 メルカプトへキサデカン酸カゝら選ばれるメルカプトアルカン 酸である前記（ 12)記載の方法、 (15) カチオン性高分子力 ポリエチレンィミン、ポリアリルァミン、ポリビュルァミン、 ポリビュルピリジン、アミノアセタール化ポリビュルアルコール、 1一 4級ァミンを側鎖 末端に持つアクリル系またはメタクリル系ポリマー、酸処理ゼラチン、プロタミン、ポリリ ジン、ポリオル二チン、ポリアルギニン、キトサン、 DEAE—セルロース、 DEAE—デキ ストランおよびポリアミドアミンデンドリマーカ 選ばれる高分子である前記（3)、（4)ま たは（5)記載の方法、
(16) 末端にカチオン性官能基を有するチオールィ匕合物が、式 (2)：
R2 (CH ) -SH (2)
2 n
(式中、 R2はカチオン性官能基を表し、 nは 1一 40の整数を表す。 )
で示されるチオール化合物である前記 (4)記載の方法、
(17) R2がァミノ基である前記（16)記載の方法、
(18) 核酸が DNA、 RNA、アンチセンス核酸、 siRNAまたはそれらの発現べクタ 一である前記（1)または（2)記載の方法、
(19) 核酸力タンパク質をコードする DNAまたはその一部である前記（1)または（2) 記載の方法、
(20) 工程 (B)を、核酸担持電極の表面で細胞を培養することにより行う前記（1)記 載の方法、
(21) 工程 (c)を、核酸担持電極基板の表面で細胞を培養することにより行う前記（ 2)記載の方法、
(22) 工程 (C)を、細胞を介して電極基板に対畤して反対電極を設け、両電極間に 電気パルスを発生させることにより行う前記（1)記載の方法、
(23) 工程 (d)を、細胞を介して電極基板に対畤して反対電極を設け、両電極間に 電気パルスを発生させることにより行う前記（2)記載の方法、および
(24) カチオン性表面電極基板が、ミクロパターンィ匕表面をもつ基板である前記（2) 記載の方法、
である。
また、本発明は、
(25) 電極基板の表面に、末端にァ-オン性官能基を有するチオール化合物、ジス ルフイドィ匕合物もしくはスルフイド化合物の単分子膜が形成されており、かつ該単分 子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板、および ガラス基板上に金蒸着した金電極基板の表面に、式（ ：
2 n
(式中、 R1はァ-オン性官能基を表し、 nは 1一 40の整数を表す。 )
で示されるチオール化合物の単分子膜が形成されており、該単分子膜の表面にカチ オン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板、
である。
発明の効果
[0014] 本発明によれば、細胞に障害を与えることなぐ核酸を効率よく細胞に導入すること ができるとともに、望ましい時期に電極上の望ましい位置で細胞に導入することがで きる、エレクト口ポレーシヨン法による核酸導入方法が提供される。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]接着細胞への遺伝子導入を行うための核酸担持金電極基板ならびに該基板 への電気パルス負荷システムの配置図である。
[図 2]電気パルス（電場強度 75VZcm、パルス幅 10msec、パルス回数 1回）を印加 して力も 時間後の 細胞の位相差顕微鏡写真 および蛍光顕微鏡写 真（ である。 スケールバー
[図 3]遺伝子導入効率に対する電場強度の効果を示す棒グラフである。
[図 4]細胞生存率と電場強度の関係の示す線図である。
[図 5]遺伝子導入効率に対するポリエチレンィミン、ポリアリルァミンの分子量の効果 を示す線図である。
[図 各種カチオン表面における の担持量を示す線図である。
[図 7]各種カチオン表面におけるパルス後の DNA遊離量を示す線図である。
[図 遺伝子導入効率と 遊離量の関係を示す相関図である。
[図 9]電気パルスを印加するまでの細胞培養期間を変化させたときの、電気パルス印 カロ 時間後の蛍光顕微鏡像 である。
[図 10]電気ノ ルスを印加するまでの細胞培養期間を変化させたときの、遺伝子導入 効率を示す線図である。
[図 11]初代神経培養細胞に遺伝子 (pEGFPおよび pDsRed混合物）を導入したとき の、電気パルス負荷カゝら 48時間後の位相差顕微鏡像 (左）および蛍光顕微鏡像 (中 、右)である。上段および下段の写真は、同一の条件下で遺伝子導入を行ったときの 異なる視野における観察像である。
[図 12]異なる遺伝子 (pEGFPまたは pDsRed)を、場所を限定して HEK293細胞に 導入したときの、電気パルス負荷から 48時間後の明視野顕微鏡像 (左）および蛍光 顕微鏡像 (右)である。
[図 13]積層数の異なる表面の ATR-赤外吸収スペクトルを示す線図である。
[図 14]積層数とリン酸基に由来する 2つのピーク面積との関係を示す線図である。
[図 15]積層数と表面の水接触角の関係を示す線図である。
[図 16]電気パルス（電場強度 250VZcm、パルス幅 10msec、パルス回数 1回）を印 カロして力も 48時間後の HEK293細胞の位相差顕微鏡写真 (A)および蛍光顕微鏡 写真 (B)である。
[図 17]遺伝子導入効率と細胞生存率に対する電場強度の効果を示す線図である。
[図 18]遺伝子導入効率と細胞生存率に対する積層数の効果を示す線図である。
[図 19]積層数の異なる表面における DNAの担持量を示す線図である。
[図 20]遺伝子導入効率と DNA遊離量の関係を示す相関図である。
[図 21]初代神経培養細胞に遺伝子 (pEGFPおよび pDsRed混合物）を導入したとき の、電気パルス負荷カゝら 48時間後の位相差顕微鏡像 (左）および蛍光顕微鏡像 (中 、右)である。上段および下段の写真は、同一の条件下で遺伝子導入を行ったときの 異なる視野における観察像である。
[図 22]異なる遺伝子 (pEGFP、 pDsRedもしくは両者の混合物）を、場所を限定して HEK293細胞に導入したときの、電気パルス負荷カゝら 48時間後の蛍光顕微鏡像で ある。
符号の説明
図 1における記号の意味は次の通りである。
A エレクト口ポレーター B エレクト口ポレーシヨンバッファー
C 細胞
D 核酸 -力チオン性高分子複合層
E 金薄膜電極 (陰極）
F 金電極（陽極）
G シリコーンスぺーサ
発明を実施するための最良の形態
[0017] 本発明の一側面は、エレクト口ポレーシヨン法により細胞に核酸を導入する方法で あって、
(A)電極の表面に核酸を担持させる工程；
(B)得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および
(C)接着した細胞に電気パルスを印加する工程
力 なる方法である。
[0018] 以下、前記各工程について順次説明する。
工程 (A) :
電極に核酸を担持させるには、たとえば、
(A1)カチオン性表面電極基板を提供し、っ 、で該カチオン性表面電極基板の表面 に核酸を吸着させる方法、
(A2)カチオン性表面電極基板を提供し、っ 、で該カチオン性表面電極基板の表面 に核酸とカチオン性高分子とを交互に吸着させて、カチオン性高分子 核酸一力チォ ン性高分子 核酸のように多層を形成させる方法、
などを採用することができる。
[0019] (カチオン性表面電極基板の提供）
前記カチオン性表面電極基板は、電極基板の表面がプラスに荷電したものであれ ばよぐその様なものとしては、たとえば
(al)電極基板の表面に、末端にァ-オン性官能基を有するチオール化合物、ジス ルフイドィ匕合物もしくはスルフイド化合物の単分子膜が形成されており、かつ、該単分 子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板、 (a2)電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有する、チオール化合物、ジス ルフイドィ匕合物もしくはスルフイド化合物またはシラン処理剤の単分子膜が形成され ており、かつ該単分子膜の表面にァニオン性高分子が吸着され、さらにその表面に カチオン性高分子が吸着させてなるカチオン性表面金属基板、
(a3)電極基板の表面に、カチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面金属 基板、
などがあげられる。
[0020] 前記 (al)のカチオン性表面電極基板は、たとえば、 1)電極基板の表面に、末端に ァ-オン性官能基を有するチオールィ匕合物、ジスルフイド化合物もしくはスルフイドィ匕 合物の単分子膜を形成させ、ついで 2)該単分子膜の表面にカチオン性高分子を吸 着させること〖こより製造できる。
[0021] また、前記 (a2)のカチオン性表面電極基板は、たとえば、 1)電極基板の表面に、 末端にカチオン性官能基を有する、チオール化合物、ジスルフイド化合物もしくはス ルフイドィ匕合物またはシラン処理剤の単分子膜を形成させ、 2)該単分子膜の表面に ァ-オン性高分子を吸着させ、っ 、で 3)該ァ-オン性高分子の表面にカチオン性 高分子を吸着させることにより製造できる。
さらに、前記 (a3)のカチオン性表面電極基板は、たとえば、電極基板の表面に力 チオン性高分子を吸着させることにより製造できる。
[0022] 電極基板における「基板」は、電極を支持するプレート、チップ (マイクロチップを含 む)、アレイなどであり、それらを構成する基材は、電極を支持し得る絶縁性のもので あればとくに制限がなぐたとえば、ガラス、マイ力、石英、アルミナ、サファイア、フォ ルステライト、炭化ケィ素、酸化ケィ素、窒化ケィ素などの無機絶縁材料、あるいはポ リエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリ エステル、含フッ素榭脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩ィ匕ビユリデン、ポリ酢酸ビュル、ポリ ビュルアルコール、ポリビュルァセタール、アクリル榭脂、ポリアクリロニトリル、ポリス チレン、ァセタール榭脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フエノール榭脂、ユリア榭脂、 エポキシ榭脂、メラミン榭脂、スチレン'アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタ ジエンスチレン共重合体、ポリフエ-レンオキサイド、ポリスルホンなどの有機絶縁材 料を用いることができる。
[0023] これらのうち、とくに前記（al)および (a2)のカチオン性表面電極基板における「基 板」の基材は、ガラス、マイ力、石英、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケ ィ素、酸化ケィ素、窒化ケィ素などの無機絶縁材料または透明プラスチックが好まし い。また、前記 (a3)のカチオン性表面電極基板における「基板」の基材は、ガラスま たは透明プラスチックが好ましぐガラスが特に好ましい。上記透明プラスチックは、自 家蛍光のな!、透明な高分子材料であれば特に限定されず、公知のものであってょ 、 。このような透明プラスチックとしては、例えば、上記した有機絶縁材料などが挙げら れるが、中でも好ましくはポリエチレンテレフタレートである。
[0024] 一方、電極基板における「電極」は、エレクト口ポレーシヨン法における電極になりう るものであればとくに制限がなぐ白金、金、アルミニウムなどの金属力もなる電極が 好適にあげられる。また、細胞の顕微鏡観察を容易にするために透明電極も好適に あげられる。このような透明電極としては、インジウムースズ酸化物（ITO : In O -SnO
2 3
)、酸化インジウム（In O )、アルミニウムをドープした酸化亜鉛 (ZnO)、アンチモン
3 2 3
をドープした酸化スズ (SnO )などが好適にあげられ、特にインジゥムースズ酸ィ匕物が
3
好ましい。
[0025] 上記「基板」と「電極」とからなる電極基板の好ま 、例は、ガラス基板、プラスチック 基板もしくはマイ力基板の片面に、白金、金、アルミニウムなどの金属の電極あるいは 透明電極を設けたものがあげられ、前者のより好ましい例としては、ガラス基板、マイ 力基板または透明プラスチック基板の片面に金の電極を設けたものがあげられ、後 者のより好ましい例として、ガラス基板、透明プラスチック基板などの透明基板の片面 にインジウムースズ酸ィ匕物の透明電極を設けたものが挙げられる。
[0026] 基板の片面に電極を設けるには、公知の方法に従って行えばよぐたとえば上記金 属を無機絶縁基板上に加熱または Zおよび加圧などして合体させるなどの公知の手 段を用いる方法があげられる。また、前記方法以外に、真空蒸着法、スパッタリング法 、イオン注入法、メツキ法などもあげられる。
[0027] 電極基板の表面に単分子膜を形成させるのに用いる、末端にァ-オン性官能基を 有するチオールィ匕合物としては、たとえば、下記一般式（1)： R' CCH ) -SH ( 1)
2 n
(式中、記号は前記と同一意味を有する）
で示されるチオールィ匕合物があげられる。化合物（1)の好ましい例としては、ァ-ォ ン性官能基である R1がカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、ホスホン酸基であ り、 nが 1一 40、好ましくは 7— 18のものがあげられる。
[0028] また、チオールィ匕合物（1)の代わりに、下記一般式（1A)または（1B)：
R' CCH ) -S-S- (CH ) — R1 ( 1A)
2 n 2 m
R' CCH ) -S- (CH ) — R1 ( IB)
2 n 2 m
(上記式中、 R1および nは前記と同一意味を有し、 mは 1一 40の整数を表す） で示されるジスルフイドィ匕合物またはスルフイドィ匕合物を用いることもできる。該ジスル フイドィ匕合物またはスルフイドィ匕合物は対称型であっても、非対称型であってもよ 、が 、対称型のもののほうが、均一な単分子膜が形成される意味で好ましい。
[0029] 好ましい化合物（1)またはそのジスルフイドもしくはスルフイドィ匕合物の具体例として は、たとえば、 11 メルカプトゥンデカン酸、 8 メルカプトオクタン酸、 15 メルカプト へキサデカン酸、 10—カルボキシデシルジスルフイドなどがあげられる。
[0030] また、電極基板の表面に単分子膜を形成させるのに用いる、末端にカチオン性官 能基を有するチオールィ匕合物としては、たとえば、下記一般式 (2)：
R2 (CH ) SH (2)
2 n
(式中、 R2はカチオン性官能基を表し、 nは前記と同一意味を有する）
で示されるチオールィ匕合物があげられる。 R2で示されるカチオン性官能基としては、 たとえばァミノ基があげられ、 nとしては、 1一 40、好ましくは 7— 18の整数があげられ る。
[0031] また、チオールィ匕合物（2)の代わりに、下記一般式（2A)または（2B)：
R2 (CH ) -S-S- (CH ) -R2 (2A)
2 n 2 m
R2 (CH ) — S— (CH ) -R2 (2B)
2 n 2 m
(上記式中、 R2および nは前記と同一意味を有し、 mは 1一 40の整数を表す） で示されるジスルフイドィ匕合物またはスルフイドィ匕合物を用いることもできる。該ジスル フイドィ匕合物またはスルフイドィ匕合物は対称型であっても、非対称型であってもよ 、が 、対称型のもののほうが、均一な単分子膜が形成される意味で好ましい。 好ま 、化合物（2)またはそのジスルフイドもしくはスルフイドィ匕合物の具体例として は、たとえば、 11 アミノー 1ーゥンデカンチオールなどが好適にあげられる。
[0032] 電極基板の表面に単分子膜を形成させるのに用いる、末端にカチオン性官能基を 有するシラン処理剤としては、たとえば、下記一般式（3)
R2 (CH ) p-Si (OR) (3)
2 3
(式中、 R2は前記と同一意味を有し、 pは 1一 40の整数、 ORはアルコキシ基を表す） で示されるシラン化合物があげられる。 R2で示されるカチオン性官能基としては、たと えばアミノ基があげられ、 pとしては、 1一 40、好ましくは 7— 18の整数があげられ、 O Rとしては、炭素数が 1一 6、好ましくは 1一 3の低級アルコキシ基があげられる。
[0033] 電極基板の表面に単分子膜を形成させるには、常法にしたがって行えばよぐたと えば、電極基板をチオール化合物（式 1または 2)またはそのジスルフイドィ匕合物（式 1 Aまたは 2A)もしくはスルフイドィ匕合物（式 1Bまたは 2B)あるいはシラン処理剤 (3)の 溶液に浸漬することにより実施することができる。これにより、電極基板上に高密度、 高配向性な単分子膜が形成される。
[0034] チオール化合物として、末端にァニオン性官能基を有するチオールィヒ合物（1)ま たはそのジスルフイドもしくはスルフイドィ匕合物（1Aもしくは 1B)を用いた場合には、こ れら化合物の単分子膜の表面に、カチオン性高分子を吸着させることにより、前記 (a 1)のカチオン性表面電極基板が得られる。
[0035] ここで使用される「カチオン性高分子」は、電極基板の表面に形成された単分子膜 と電気的結合 (たとえばイオン結合）によって該単分子膜の表面に結合するカチオン 性の高分子であればよぐたとえば、ポリエチレンィミン、ポリアリルァミン、ポリビュル ァミン、ポリビュルピリジン、アミノアセタール化ポリビュルアルコール、 1一 4級ァミン を側鎖末端にもつアクリル系あるいはメタクリル系ポリマー（たとえば、ポリ ， N—ジメ チルアミノエチルメタタリレートなど）、酸処理ゼラチン、ポリリジン、ポリオル-チン、ポ リアルギニン、プロタミン、キトサン、 DEAE セルロース、 DEAE—デキストラン、ポリ アミドアミンデンドリマー（力チォニックデンドリマー）などがあげられる。これらのうち、 とりわけポリエチレンィミンおよびポリアリルァミンが好ましい。 [0036] 前記カチオン性高分子の平均分子量は、 500— 5, 000, 000、好ましくは 600— 1 00, 000である。たとえば、ポリエチレンィミンの場合は、その平均分子量は 200— 2 5, 000力 子ましく、とりわけ 500— 10, 000力 子ましい。またポリアリノレアミンの場合 は、その平均分子量は 500— 150, 000、とりわけ 1, 000— 70, 000力 ^好ましい。
[0037] 単分子膜の表面にカチオン性高分子を吸着させるには、該単分子膜の表面にカチ オン性高分子の溶液を接触させることにより実施でき、たとえば、該単分子膜の表面 に、カチオン性高分子を適当な緩衝液 (たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）に溶解し た溶液を添加し、室温で静置することにより好適に実施できる。カチオン性高分子溶 液の濃度は、特に限定されないが、 0. 1%— 10%であるのが好ましい。力べして、単 分子膜とカチオン性高分子とがイオン結合により吸着されて、前記 (al)のカチオン 性表面電極基板が提供される。
[0038] 一方、チオール化合物として、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物（ 2)、そのジスルフイドもしくはスルフイド化合物（2Aもしくは 2B)を用いた場合、あるい は、シラン処理剤として末端にカチオン性官能基を有するシラン処理剤 (3)を用いた 場合には、これら化合物の単分子膜の表面に、まずァ-オン性高分子を吸着させる
[0039] ここで使用される「ァ-オン性高分子」は、電極基板の表面に形成された単分子膜 と電気的結合 (たとえばイオン結合）によって該単分子膜の表面に結合するァニオン 性の高分子であればよぐたとえば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンス ルホン酸、ポリ（2—アクリルアミドー 2—メチルプロパンスルホン酸）のような合成高分子 、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アルカリ処理ゼラチンのような天然 高分子があげられる。
[0040] 単分子膜の表面にァニオン性高分子を吸着させるには、該単分子膜の表面にァニ オン性高分子の溶液を接触させることにより実施でき、たとえば、該単分子膜の表面 に、ァ-オン性高分子を適当な緩衝液 (例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した 溶液を添加し、室温で静置することにより好適に実施できる。
[0041] ついで、吸着したァ-オン性高分子の表面に、カチオン性高分子を吸着させること により、前記 (a2)のカチオン性表面電極基板が得られる。ここで用いるカチオン性高 分子は前記と同一のものを使用でき、吸着処理も前記と同様に実施できる。
[0042] さらに、たとえば電極としてインジウムースズ酸ィ匕物、酸化インジウムなどの前記透明 電極を用いる場合には、電極基板の表面をカチオン性高分子で処理することにより、 カチオン性高分子が電極表面に吸着した前記 (a3)のカチオン性表面電極基板が得 られる。ここで用いるカチオン性高分子も前記と同一のものが使用でき、該カチオン 性高分子による処理は、電極基板の表面にカチオン性高分子の溶液を添加し、室温 で静置することにより好適に実施できる。
[0043] (カチオン性表面電極基板への核酸の担持）
前記で提供されたカチオン性表面電極基板の表面に核酸を担持させることにより、 核酸担持電極基板が得られる。
本発明で使用される「核酸」は、ポリヌクレオチドであっても、オリゴヌクレオチドであ つてもよく、また DNAでも RNAでもよい。 DNAの場合、プラスミド DNA、 cDNA、ゲ ノミック DNAあるいは合成 DNAであってもよい。「核酸」には、 DNA誘導体または R NA誘導体が含まれ、該誘導体とはホスホロチォエート結合を有する核酸、または酵 素による分解を避けるためにインターヌクレオチドのリン酸部分、糖部分、塩基部分 に化学修飾を施した核酸を意味する。
[0044] 「核酸」には、疾患症状の治療あるいは改善効果のある生理活性を有するタンパク 質をコードしているプラスミド DNA、または疾患症状の予防、治療あるいは改善効果 のある免疫反応を誘導するタンパク質をコードして 、るプラスミド DNA、ある 、はこれ ら DNAの一部を含む。
「核酸」にはまた、アンチセンス核酸も包含する。「アンチセンス核酸」は特定の mR NA分子の少なくとも一部に相補的な DNA分子または RNA分子であり、細胞内に 導入されることにより、対応する mRNAとハイブリダィズして二本鎖の分子を形成する 。細胞は二本鎖の mRNAを翻訳しないので、アンチセンス核酸は該 mRNAの翻訳 を干渉する。「核酸」には、さらに siRNA(RNA干渉を起こす短い二本鎖 RNA)を包 含する。さらに、「核酸」には、アンチセンス核酸や siRNAなどの発現ベクターを包含 する。
[0045] 核酸力 Sタンパク質をコードしているプラスミド DNAである場合、細胞内に導入された とき、コードする遺伝情報を細胞内で発現するように構成された形態が好ましぐプロ モータ等、目的遺伝子の発現に必要な要素を含有する。また、目的遺伝子が細胞内 に導入されたかどうかを確認する必要がある場合、目的遺伝子のほかにさらにレポ一 ター遺伝子を含んだ DNAでもよ ヽ。
[0046] 「核酸」のサイズは特に制限されないが、一般に、 lObp— 200kbp、好ましくは、 15 bp— lOOkbpである。
[0047] カチオン性表面電極基板の表面に核酸を吸着、担持させるには、カチオン性表面 電極基板の表面に、核酸の溶液を接触させることにより実施でき、たとえば該カチォ ン性表面電極基板の表面に、核酸を適当な緩衝液 (たとえば、リン酸緩衝生理食塩 水）に溶解した溶液を添加し、室温に放置することにより好適に実施できる。吸着しな い核酸は、カチオン性表面電極基板の表面を適当な緩衝液 (たとえば、リン酸緩衝 生理食塩水)で洗浄することにより除去できる。カゝくして、核酸担持電極基板が得られ る。
[0048] なお、カチオン性表面電極基板の表面に、核酸およびカチオン性高分子を、核酸 、カチオン性高分子、核酸の順序で交互吸着法により積層することによつても核酸担 持電極基板が得られる。ここで交互に実施される核酸の吸着およびカチオン性高分 子の吸着は、前記と同様にして実施することができる。
[0049] 工程 (B)：
本工程は、上記で得られた核酸担持電極基板の表面に、細胞を接着させる工程で ある。
本発明で使用される「細胞」は、接着性のものであれば、どの生物由来の細胞 (たと えば、任意の種類の (たとえば、細菌、酵母)または多細胞生物 (たとえば、動物 (たと えば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物 (たとえば、単子葉植物、双子葉植物など)など )でもよい。たとえば、脊椎動物（たとえば、メタラウナギ類、ャッメゥナギ類、軟骨魚類 、硬骨魚類、両性類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞でも用いられ、より 詳細には、哺乳動物 (たとえば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、肉食類 、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類な ど）由来の細胞が用いられる。 1つの実施形態では、霊長類 (たとえば、チンパンジー 、二ホンザル、ヒト）由来の細胞、とくにヒト由来の細胞が用いられる。ヒト由来細胞の 具体例としては、たとえば、ヒト子宫頸部癌細胞 (HeLa)などのヒト由来株化細胞;ヒト 胎児腎臓由来細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト血管内皮細胞、ヒト大動脈平滑筋細 胞、ヒト肝細胞、ヒト繊維芽細胞、ヒト角膜上皮細胞、ヒト角膜内皮細胞などのヒト由来 初代培養細胞；間葉系幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞などのヒト由来幹細胞など があげられる。
[0050] 核酸担持電極基板の表面に細胞を接着させる方法は、特に制限されず、たとえば 、細胞の懸濁液を前記基板の上に添加するか、あるいは細胞を適当な培地に懸濁さ せ、得られた細胞懸濁液を前記基板上に滴下し、該細胞に適した条件下で培養する こと〖こより行うことができる。しかし、核酸を導入する細胞集団内の場所の限定および 導入の効率の観点からは、核酸担持電極基板上で細胞を培養して行うのが好ましく 、培養することにより細胞は増殖し、該基板の表面に接着する。接着しない細胞は、 電気パルスを印加する前に除いておくのが望ましい。非接着細胞の除去は、たとえ ば、培地を適当な緩衝液と交換することにより行うことができる。
[0051] 工程 (C)：
細胞への電気パルスの印加は、表面に細胞が接着した核酸担持電極基板の電極 を一方の電極 (第 1電極と！/、う）とし、細胞を介して第 1電極と対畤して反対電極 (第 2 電極という）を設け、第 1電極と第 2電極の間で、適当なエレクト口ポレーターを用いて 電気パルスを発生させることにより行うことができる。この際、電気パルスは交流また は直流の 、ずれで発生させてもよ!、が、一般に直流で発生させるのが好ま U、。
[0052] 電気パルスを直流で発生させる場合には、核酸を担持した第 1電極を陰極 (一)とし たときには、第 2電極は陽極（+ )とする。あるいはその逆も可能である。好ましくは、 第 1電極を陰極 (-)とし、第 2電極を陽極（+ )とする。第 2電極の材質は、電導性のも のであればとくに限定されないが、たとえば金、白金、銅、アルミニウム、ステンレス、 タングステン、チタン、コバルト クロム合金、コバルト クロム モリブデン合金（パイタ リウム）などの金属、あるいは透明電極材料である ITO (インジゥムースズ酸ィ匕物）、酸 ィ匕インジウムなどがあげられる。
[0053] 電気パルスの条件は、電極材料の種類、細胞の種類、導入される核酸の種類、基 板上のカチオン性高分子の種類などにより、電場強度、電気パルスの長さ、パルス印 加の回数などを適宜選択すればよい。通常、電場強度は 10— 500VZcm、好ましく は 25— 300VZcmであり、電気パルスの長さは 1一 99msec、好ましくは 1一 50mse cであり、パルス印加の回数は 1一 99回、好ましくは 1一 5回である力 これらに限定さ れるものではない。
[0054] 電気パルスを印加する時期は、特に限定されず、適宜選択できる。すなわち、細胞 を核酸担持電極基板の上に播種後、培養し、該基板上に細胞を接着させてから、必 ずしもすぐに電気パルスを印加する必要はなぐ接着後望ましい時期、たとえば、細 胞の播種から約 4一 5 日以内であれば、自由に選択して電気ノ ルスを印加することが できる。この電気パルスの印加により、細胞中に核酸が効率よく導入される。
[0055] 上記本発明方法を実施するに当たって使用される核酸担持電極基板および電気 パルス負荷システムの配置図の一例を示せば、図 1の通りである。この図を用いて本 発明方法を説明すると、たとえばガラス基板の表面に金薄膜電極 (E)が設けられて おり、その上に核酸が担持された核酸一力チオン性高分子複合層 (D)が設けられて おり、さらにその表面に細胞 (C)が接着している。そして、この細胞はたとえばシリコ ーンスぺーサ（G)で区画化されており、ゥエル中にはエレクト口ポレーシヨンバッファ 一 (B)が充填されて 、る。シリコーンスぺーサ (G)の上には金薄膜電極 (E)と平行に 反対電極となる金電極 (F)が設けられて ヽる。金薄膜電極 (E)と金電極 (F)は電気 パルス発信装置であるエレクト口ポレーター (A)に接続されている。本例では、金薄 膜電極 (E)と金電極 (F)との間隔は 2mmに設定されており、ゥエル面積は 13 X 13m m2に設定されている。電気パルスの負荷は、金薄膜電極 (E)を陰極 (一)とし、金電 極 (F)を陽極（ + )とし、エレクト口ポレーター (A)により電気パルスを発生させることに より、細胞 (C)中に核酸 (DNA)が導入される。
[0056] 本発明の別の側面として、上記核酸導入法を、ミクロパターンィ匕した表面を有する 基板を用いて実施することができる。ミクロパターンィ匕はそれ自体公知の方法によつ て行うことができ、たとえば、核酸を担持させる前のカチオン性表面電極基板の表面 を、適当な手段で区画ィ匕しておき、複数の異なった核酸をそれぞれ別個の区画に担 持させることによりミクロパターンィ匕された核酸担持電極基板とすることができる。また 、電極基板の表面を有機シランィ匕合物 (たとえば、ォクタデシルトリエトキシシラン)や アルカンチオールで処理してそれらの自己組織化単分子膜を形成させたのち、フォ トマスクを電極基板表面に固定し、紫外線照射し、ついで紫外線照射によって分解さ れた自己組織ィ匕単分子膜を除去することによるミクロパターン化された電極基板が得 られるので、力かる基板を用いれば核酸をアレイ状に配置することができる。したがつ て、上記のようなミクロパターン化された核酸担持金属基板あるいは電極基板を用い て本発明を実施すれば、核酸を導入する場所を限定することが可能である。
[0057] 以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実 施例によって限定されるものではない。
実施例 1
[0058] DNAを静電的に担持するためのカチオン性表面電極基板を作製した。まず、片面 に金薄膜を蒸着したガラス基板に、末端にカルボキシル基をもつチオールィ匕合物（1 1 メルカプトゥンデカン酸、シグマ社製)の単分子膜を形成させた。この単分子膜上 に、平均分子量 800のポリエチレンィミン（以下、 PEI800と表示、アルドリッチ社製） を 1%濃度で含むリン酸緩衝溶液 (PH7. 4)を添加し、 30分間、室温で静置した。得 られた基板の表面を十分に水洗し、窒素ガスで乾燥させ、カチオン性表面金電極基 板を得た。
[0059] 次に、上記で得られたカチオン性表面金電極基板の表面に、エタノールで殺菌し たシリコーンスぺーサ（内面積： 1. 3 X 1. 3cm2,高さ： 2mm)を圧着し、固定した。次 に、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミド DNA(pEGFP— Cl、クロンテック社製 )の 0. 05mgZmLリン酸緩衝生理食塩水（pH7. 4)を、シリコーンスぺーサ内の力 チオン性表面金電極基板の表面上に添加し、室温、 2時間放置して、表面に DNA を静電的に吸着、担持させた。吸着しなカゝつた DNAを除去するため、リン酸緩衝生 理食塩水で表面を十分に洗浄し、 DNA担持金電極基板を得た。
[0060] ヒト胎児腎臓由来細胞 (HEK293： (財)ヒューマンサイエンス財団より分譲)を血清 含有培地（培地組成：最小必須培地（MEM) (Gibco Life Technology)、 10% ゥシ胎児血清、 lOOunitZmlペニシリン、 0.
Figure imgf000019_0001
に懸濁さ せ、その懸濁液を DNA担持金電極基板の表面上に滴下した。これを 37°Cおよび 5 %COの雰囲気下で培養することで、細胞を表面に接着、成長させた。 24時間後、
2
培地を 4°Cのリン酸緩衝生理食塩水 (pH7. 4)と交換して非接着細胞を除去し、リン 酸緩衝生理食塩水を満たした後、片面に金薄膜を蒸着したガラス基板を第 2電極と してシリコーンスぺーサに固定した。それらの配置を図 1に示す。
[0061] 次に、 DNA担持金電極基板を陰極 (-)、他方を陽極（+ )として高電圧パルス発生 装置（Electrosquareporator T820、 ΒΤΧ社製）に接続し、電場強度 75VZcm、 パルス幅 10msec、印加回数 1回の条件で電気パルスを印加し、エレクト口ポレーショ ンを行った。ノ ルス印加後、室温で 5分間インキュベーションした後、ゥエル内のリン 酸緩衝生理食塩水をあら力じめ 37°Cに保温してあった血清含有培地で交換し、 37 °Cおよび 5%COの雰囲気下で細胞培養を行った。
2
[0062] エレクト口ポレーシヨン力も 48時間後に導入遺伝子の一過的発現の解析を行った。
方法は、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光タンパク質 (EGFP)に起因する緑色蛍光を発す る細胞をカウントし、遺伝子導入効率を全細胞数当たりの EGFP陽性細胞数として算 出した。
[0063] 図 2にエレクト口ポレーシヨンから 48時間後の HEK293細胞の位相差顕微鏡像 (A )と蛍光顕微鏡像 (B)を示す。この図からわ力るように、基板表面上の細胞は障害を 受けることなく EGFPを発現しており、その EGFP陽性細胞率、すなわち遺伝子導入 効率は 80%であった。このことは、本発明の手法が効率的に遺伝子導入できる方法 であることを明確に示す。
実施例 2
[0064] 実施例 1と同様に、 DNA担持金電極基板上に HEK293細胞を播種し、接着させ た後、電気パルスを印加してエレクト口ポレーシヨンを行った。その際、電気パルスの 電圧を変化させ、遺伝子導入効率に対する電場強度の効果について検討した。な お、印加電圧以外のパルス印加条件は、実施例 1と同じ (パルス幅 10msec、パルス 回数 1回）とし、遺伝子導入効率は、電気パルス印カ卩から 48時間後の EGFP陽性細 胞率として評価した。結果は図 3の通りである。また同時に、細胞生存率に対する電 場強度の効果を検討した。細胞生存率は、電気パルス印加から 3時間後、細胞をトリ プシン処理で回収し、トリパンブルー色素排除法により評価した。すなわち、トリパン ブルーによって染色されな力つた細胞の数 (生細胞数)を求め、次式に従って生存率 を算出した。結果は図 4の通りである。
[数 1] 電気パルスを与えた後の生細胞数
生存率 （％) = X 1 0 0 播種細胞数
[0065] 図 3に示すように、電圧をカ卩えない場合では全く遺伝子導入が起こらな力つた。一 方、電圧を印加することにより遺伝子導入が確認された。明視野顕微鏡像から求め た電極上の全接着細胞数、ならびに、蛍光顕微鏡像から求めた蛍光タンパク質発現 細胞数を用いて、次式により遺伝子導入効率を算出した。
[数 2] 蛍光タンパク質の発現の見られた細胞数
遺伝子導入効率 （！ ¾ ) = X 1 0 0 電極上に接着していた全細胞数
[0066] 電場強度 75VZcmで遺伝子導入効率は最も高ぐ 200VZcm以上になると導入 効率の著しい低下がみられた。また、図 4に示すように、トリパンブルー色素排除法に よるパルス印加後の細胞生存率は、電場強度 lOOVZcm以下において高い細胞生 存率を維持していたが、 150VZcm以上になると電気パルス印加のショックによる細 胞の剥離や細胞死がみられ、細胞への障害が顕著に認められた。電圧を加えなけ れば遺伝子導入が起こらない結果より、電気パルスにより電極表面からの DNAの剥 離、さらにそれに引き続く電気パルスによる細胞膜の不安定化、もしくは穿孔形成を 経て DNAを取り込んで!/、ることを示す。
実施例 3
[0067] 実施例 1と同様の方法で DNA担持金電極基板の上に HEK293細胞を播種し、接 着させた後、電気パルスを印力 U (電場強度 75VZcm、パルス幅 10msec、パルス回 数 1回）してエレクト口ポレーシヨンを行った。その際、固定化するカチオン性高分子 の分子量を変化させ、遺伝子導入効率に対するカチオン性高分子の分子量の効果 【こつ ヽて検討した。力チ才ン '性高分子 ίま、分子量 800、 25000および 750000のポ リエチレンィミン（ΡΕΙ800、 ΡΕΙ25000, ΡΕΙ750000と表示、 ヽずれもァノレドリツチ 社製）、ならびに分子量 15000および 70000のポジアジノレアミン塩酸塩（PAA1500 0, PAA70000と表示、いずれもアルドリッチ社）を使用した。
[0068] 図 5に遺伝子導入効率とポリエチレンィミン、ポリアリルァミンの分子量の関係を示 す。この図からわ力るように、ポリエチレンィミンの分子量が増加すると、遺伝子導入 効率は低下した。図 6に各表面に担持された DNAの量を示す。さらに、電気パルス（ 電場強度 75VZcm、 ノ ルス幅 10msec、 ノ ルス回数 1回）を印加後、上清中に含ま れる DNA量をピコグリーンで測定することにより、表面力 遊離した DNA量を評価し た。その結果は図 7に示すとおりである。これらの図から明らかなように、高分子量に なるにつれて、 DNAの担持量は増加した力 電気パルス印加後の表面からの DNA 遊離量は極めて少な力つた。反対に、低分子量のポリエチレンィミン表面（PEI800) においては、 DNA担持量は少ないものの、電気パルスの印加によって、担持された DNAの約 30%が遊離した。
[0069] 各カチオン表面における遺伝子導入効率とパルス後に遊離した DNA量の関係を 図 8に示す。この図から明らかなように、遺伝子導入効率と DNA遊離量の間には正 の相関が認められた。この結果は、本発明において遺伝子導入効率は表面力もの D NAの遊離量に強く依存して ヽることを示唆する。
実施例 4
[0070] 実施例 1と同様の方法で DNA担持金電極基板上に HEK293細胞を播種し、接着 させた後、電気ノ ルスを印加しエレクト口ポレーシヨンを行った。その際、細胞播種時 から電気パルスを印加するまでの時期を変化させ、遺伝子導入効率に対する細胞培 養期間の効果について試験した。
[0071] 図 9に、細胞播種から 24、 48、 72時間の所定時間後に電気パルスを印加し、パル ス印加のときカゝら 48時間後の細胞の位相差顕微鏡像を示す。この図から細胞播種 力 24、 48、 72時間後のいずれの場合も、遺伝子が効率よく導入され発現している ことがわかる。また、図 10に、電気パルス印加時間と遺伝子導入効率 (％)との関係 を示す。この結果から、細胞播種から 12、 24、 48、 72時間後のいずれの場合も高い 遺伝子導入効率が保たれており、望ましい時間に接着細胞へ遺伝子を導入すること が可能であることがわかる。 実施例 5
[0072] (初代細胞での実証）
ラット胎児脳カゝら海馬を採取し、神経細胞を得た。この初代神経細胞に対し、実施 例 1と同様の方法で EGFPまたは赤色蛍光タンパク質 (DsRed)をコードするプラスミ ドの導入を行った。
すなわち、実施例 1と同様にして、カチオン性表面金電極基板 (カチオン性高分子 ： PEI800)表面に、緑色蛍光タンパク質 (EGFP)および赤色蛍光タンパク質（DsRe d)をコードするプラスミド DNA (pEGFPおよび pDsRed、クロンテック社製）を担持さ せ、その表面上で前記初代神経細胞を 3日間培養し、電気パルス（125VZcm、 10 msec, ノ ルス回数 1回）を負荷した。電気ノ ルス負荷力ら 48時間後に導入遺伝子の 一過性解析を実施例 1と同様に行った。
[0073] (結果）
図 11に電気パルス負荷力 48時間後の位相差顕微鏡像 (左、 phase contrast) および蛍光顕微鏡像（中、右、 EGFP, DsRed)を示す。左図の顕微鏡像から見る限 り、エレクト口ポレーシヨンによる細胞障害は見られない。また中図および右図の蛍光 顕微鏡像から、 pEGFPおよび pDsRedの両遺伝子が細胞に導入され、それらの遺 伝子がコードしている蛍光タンパク EGFPおよび DsRedの発現した様子が確認でき る。また、この図から、本遺伝子導入方法により複数の遺伝子を効率よく細胞に導入 できることがわ力る。
[0074] 遺伝子導入効率は 20%であり、前記 HEK293細胞と同様に遺伝子導入を確認す ることができた。比較のため、従来の方法であるリポフエクシヨン法（下記比較例 1参照 )およびエレクト口ポレーシヨン法（下記比較例 2参照）により前記初代神経細胞に遺 伝子 (pEGFP/pDsRed)を導入したところ、遺伝子導入効率は 10— 20%と本発明 による手法と有意な差は認められな力つた。し力しながら、従来の方法では、細胞へ の障害が大きぐ多くの死細胞が認められた。そのときの死細胞率は 20— 30%であ つた。一方、本発明による遺伝子導入法では細胞障害は全くみられなかった。
[0075] (比較例 1)
採取した海馬神経細胞を 70— 80%のコンフルエンスになるように、ポリ L—リジンコ ートされた 24ゥエルプレートに播種し、リポフエクタミン (Lipofectamine) 2000 (イン ビトロジェン社製)を用いて遺伝子導入を行った。遺伝子 DNAは: g、リボフエタタミ ン 2000は 2 μ 1を使用した。リポフエクシヨン 2000と DNAは 50 μ 1の Opti—MEM (無 血清培地）にそれぞれ希釈した。両溶液を混合し、 20分室温放置した後、細胞に添 加しリポフエクシヨンを行った。リポフエクシヨンから 48時間後に EGFPの発現を蛍光 顕微鏡で確認した。上述のように、遺伝子導入効率は 10— 20%であった。
[0076] (比較例 2)
採取した海馬神経細胞を PBSで洗浄し、 1 X 106細胞 ZmLの細胞懸濁液を調製 した。その懸濁液 200 μ 1にプラスミド DNA (pEGFP) 15 μ gをカ卩ぇ混合した。この溶 液をエレクト口ポレーシヨンキュベットに注入し、 10分間、氷上に静置した。その後、 電場強度 625VZcm (電極間距離： 4mm)、パルス幅 10msec、パルス回数 1回の 条件でエレクト口ポレーシヨンを行った。処理後、 10分間、室温に放置した後、 PLLコ ート 60mm細胞培養皿に播種した。エレクト口ポレーシヨンから 48時間後に EGFPの 発現を蛍光顕微鏡で確認した。上述のように、遺伝子導入効率は 10— 20%であつ た。
実施例 6
[0077] 実施例 1と同様にして調製したカチオン性表面金電極基板の表面に、異なる遺伝 子（pEGFPまたは pDsRed)を、それぞれ電極上の直径 5mmの部位に限定して、用 手法により担持させた。以下実施例 1と同様にして、 DNA担持金電極基板の表面に HEK293細胞を接着、成長させ、播種 24時間後に非接着細胞を除去した後、電気 パルス（75VZcm、 10msec,パルス回数 1回）を負荷した。
[0078] 図 12に電気パルス負荷から 48時間後の位相差顕微鏡 (左）および蛍光顕微鏡像（ 右)を示す。左図は、基板全体 (約 1. 5 X 1. 5cm2)を観察するために低倍率観察を 行った。細胞が基板表面に均一に接着していることがわかる。また右図は、 pEGFP および pDsRedの遺伝子を固定した領域についての蛍光を各々観察し、重ね合わ せ処理したものであり、各遺伝子の固定化領域において、その遺伝子産物に由来す る蛍光が観察できる。これらのことから、本発明方法は、場所を限定した遺伝子導入 が可能であることがわかる。 実施例 7
[0079] 片面にインジゥムースズ酸ィ匕物（以下、 ITOと表示する）を蒸着したガラス基板をブラ ズマ処理装置（大熊エンジニアリング製、形式: PA300AT)を用いて、酸素プラズマ 処理（出力 30W、圧力 5Pa)を室温で 5分間行うことで ITO表面を清浄ィ匕した。
[0080] 次に、平均分子量 800のポリエチレンィミン（以下、 PEI800と表示、アルドリッチ社 製)を 1%濃度で含むリン酸緩衝溶液 (PH7. 4)を ITO表面に添加し、 30分間、室温 で静置した。得られた基板の表面を十分に水洗し、窒素ガスで乾燥させ、カチオン性 表面 ITO電極基板を得た。次に、上記で得られたカチオン性表面 ITO電極基板の 表面に、エタノールで殺菌したシリコーンスぺーサ（内面積： 1. 3 X 1. 3cm2 ,高さ： 1 mm)を圧着し、固定した。次に、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミド DNA(p EGFP— Cl、クロンテック社製）の 0. 05mg/mLリン酸緩衝生理食塩水（pH7. 4)を 、シリコーンスぺーサ内のカチオン性表面 ITO電極基板の表面上に添カ卩し、室温、 3 0分間放置して、表面に DNAを静電的に吸着、担持させた。吸着しなかった DNAを 除去するため、リン酸緩衝生理食塩水で表面を十分に洗浄した。以後、同様にして P EI800と DNAとを交互に吸着させることで積層を繰り返した後、リン酸緩衝生理食塩 水で表面を十分に洗浄し、 DNA担持透明電極基板を得た。
[0081] 以下、未処理の ITO電極基板を積層数 0とし、 PEIと DNAの吸着回数を積層数と して示した。すなわち、 PEI800— DNA— PEI800の表面では、積層数は 3と示した。 PEI800と DNAを交互に吸着積層させた ITO電極基板表面の元素組成を X線光電 子分光分析法 (XPS)で測定した。その結果を表 1に示す。
[表 1]
(単位：パーセント） 積層数 C N 0 P I n S n
0 8 . 9 0 7 0 . 5 0 1 7 . 9 2 . 7
1 1 9 . 7 9 . 3 5 5 . 5 0 1 3 . 5 2 . 1
2 3 5 . 4 1 5 . 9 3 8 . 2 3 . 5 5 . 9 1 - 1
3 4 3 . 3 1 8 - 2 3 0 . 1 3 - 2 4 . 5 0 . 7 7
4 4 8 . 3 1 6 . 8 2 7 . 8 4 - 7 1 . 9 0 . 4 5
5 5 2 . 2 2 2 . 3 2 0 . 9 3 . 7 0 . 7 5 0 . 1 9
6 4 8 . 3 2 0 . 7 2 6 . 7 3 . 8 0 . 4 9 0 . 0 6
7 5 5 . 8 2 2 1 8 . 7 3 . 5 0 . 0 1 0
[0082] 上記表 1から分力るように、 PEI800の吸着によって Nが検出され、 DNAの吸着に より Pが検出された。また、積層数が増加するとともに、基材の ITOに由来する Inと Sn の存在比が減少した。これらの結果は、 ITO電極基板表面上に PEI800と DNAが存 在すること、積層によってその膜厚が増加して 、ることを示す。
[0083] 図 13には PEI800と DNAを交互に吸着積層させた ITO電極基板表面の ATR— IR スペクトルを示す。 1065、 1230cm— 1の 2つの吸収は DNAの骨格を構成するリン酸 基に由来するものである。図 13からわ力るように、積層数が増加すると、それらの吸 収は増加した。図 14は、これら 2つのピーク面積を積層数に対してプロットしたもので ある。積層数の増加によって、ピーク面積は直線的に増加した。この結果は、積層数 の増加によって、 ITO基板表面への DNAの担持量が増加していることを示す。
[0084] 次に、 PEI800と DNAを交互に吸着させたときの ITO電極基板表面の水接触角測 定を行い、表面の濡れ性の変化を調査した。図 15にその結果を示す。最表面が PEI 800のときの水接触角は約 45度であり、最表面が DNAのときは約 32度であった。図 15からわかるように、最表面の種類に応じて、接触角が変化した。この結果は、 PEI8 00と DNAの交互積層膜が ITO電極基板表面に形成されて!、ることを示す。 PEI80 0を 1層吸着させた表面では、その接触角がその後の PEI800表面と比べて低いこと から、 PEI800が ITO表面を完全に覆っておらず、基材の ITO表面が部分的に露出 していると考えられる。
実施例 8 [0085] 実施例 7に従って作製した DNA担持 ITO電極基板上で細胞へのエレクト口ポレー シヨンを行った。まず、ヒト胎児腎臓由来細胞 (ΗΕΚ293 : (財)ヒューマンサイエンス 財団より分譲)を血清含有培地 (培地組成:最小必須培地 (MEM) (Gibco Life T echnology) , 10%ゥシ胎児血清、 lOOunitZmlペニシリン、 0. lmgZmlストレプト マイシン）に懸濁させ、その懸濁液を DNA担持透明電極基板 (積層数 5、基材:ポリ エチレンテレフタレート（PET) )の表面上に滴下した。これを 37°Cおよび 5%COの
2 雰囲気下で培養することで、細胞を表面に接着、成長させた。 24時間後、培地を 4 °Cのリン酸緩衝生理食塩水 (pH7. 4)と交換して非接着細胞を除去し、リン酸緩衝生 理食塩水を満たした後、片面に金薄膜を蒸着したガラス基板を第 2電極としてシリコ 一ンスぺーサに固定した。それらの配置を図 1 (但し、本実施例では、記号 Eは ITO 電極である）に示す。
[0086] 次に、 DNA担持透明電極基板を陰極 (-)、他方を陽極（+ )として高電圧パルス発 生装置（Electrosquareporator T820、 ΒΤΧ社製）に接続し、電場強度 250VZc m、パルス幅 10msec、印加回数 1回の条件で電気パルスを印加し、エレクト口ポレー シヨンを行った。パルス印加後、室温で 5分間インキュベーションした後、ゥエル内のリ ン酸緩衝生理食塩水をあら力じめ 37°Cに保温してあった血清含有培地で交換し、 3 7°Cおよび 5%COの雰囲気下で細胞培養を行った。
2
[0087] エレクト口ポレーシヨン力も 48時間後に導入遺伝子の一過的発現の解析を行った。
方法は、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光タンパク質 (EGFP)に起因する緑色蛍光を発す る細胞をカウントし、遺伝子導入効率を全細胞数当たりの EGFP陽性細胞数として算 出した。
[0088] 図 16にエレクト口ポレーシヨンから 48時間後の HEK293細胞の位相差顕微鏡像（ A)と蛍光顕微鏡像 (B)を示す。この図からわ力るように、基板表面上の約 70%の細 胞が EGFPを発現していた。このことは、本発明の手法が効率的に遺伝子導入でき る方法であることを明確に示す。また、細胞の明視野、蛍光観察において、非常に鮮 明で明るい像が得られた (基材としてガラスを用いた場合)。このことは、透明電極を 用いることで細胞の観察が非常に良好に実施できることを示す。
実施例 9 [0089] 実施例 8と同様に、 DNA担持透明電極基板 (積層数 5、基材: PET)上に HEK29 3細胞を播種し、接着させた後、電気ノ ルスを印加してエレクト口ポレーシヨンを行つ た。その際、電気パルスの電圧を変化させ、遺伝子導入効率に対する電場強度の効 果について検討した。なお、印加電圧以外のパルス印加条件は、実施例 8と同じ (パ ルス幅 10msec、パルス回数 1回）とし、遺伝子導入効率は、電気パルス印加から 48 時間後の EGFP陽性細胞率として評価した。また同時に、細胞生存率に対する電場 強度の効果を検討した。細胞生存率は、電気パルス印力！]から 48時間後、細胞をトリ プシン処理で回収し、トリパンブルー色素排除法により評価した。すなわち、トリパン ブルーによって染色されな力つた細胞の数 (生細胞数)を求め、電気パルスを印加し ていないコントロールの生細胞数に対する割合を算出した。以下に細胞生存率の計 算式を示す。
[数 3] パルス印加から 4 8時間後の生細胞数
細胞生存率 （％) = X 1 0 0 パルス印加なしで 4 8時間培養後の生細胞数
[0090] 結果は図 17の通りである。図 17に示すように、電圧を加えない場合では全く遺伝 子導入が起こらなカゝつた。一方、電圧を印加することにより遺伝子導入が確認された 。トリパンブルー色素排除法により求めた電極上の全生細胞数、ならびに、蛍光顕微 鏡像から求めた蛍光タンパク質発現細胞数を用いて、次式により遺伝子導入効率を 算出した。
画 蛍光夕ンパク質発現細胞数
遺伝子導入効率 （％) = X 1 0 0
全生細胞数
[0091] 電場強度を増加することで、遺伝子導入効率は直線的に上昇した。 300VZcm以 上になると導入効率はプラトーに達し、約 80%の遺伝子導入効率が得られた。一方 、トリパンブルー色素排除法によるパルス印加後の細胞生存率は、電場強度 250V Zcm以下において良好な細胞生存率を維持していた力 300VZcm以上になると 電気パルス印加のショックによる細胞の剥離や細胞死が顕著に認められた。電圧を 加えなければ遺伝子導入が起こらない結果より、電気パルスによる電極表面からの D NAの剥離、さらに電気ノ ルスによる細胞膜の不安定ィ匕による穿孔の形成が同時に 起こり、その穿孔を通じて剥離した DNAを取り込んでいることを示す。
実施例 10
[0092] 実施例 8と同様の方法で DNA担持 ITO電極基板 (積層数 5、基材： PET)の上に H EK293細胞を播種し、接着させた後、電気パルスを印カロ（電場強度 250VZcm、パ ルス幅 10msec、パルス回数 1回）してエレクト口ポレーシヨンを行った。その際、 PEI8 00と DNAの積層数を変化させ、遺伝子導入効率に対する積層数の効果につ!ヽて 検討した。
[0093] 図 18に遺伝子導入効率と積層数の関係を示す。この図からゎカゝるように、積層数 が増加すると、細胞生存率を維持しながら遺伝子導入効率は増加した。図 19には、 各積層数の表面に担持された DNAの量を示す。積層数が多くになるにつれて、 DN Aの担持量は増加した。
[0094] 次に、電気パルス（電場強度 200— 300VZcm、パルス幅 10msec、ノ レス回数 1 回）を印加後、上清中に含まれる DNA量を蛍光染料であるピコグリーン (モレキユラ 一プローブ社製)で測定することにより、表面から遊離した DNA量を評価した。図 20 に、各条件における遺伝子導入効率とパルス後に遊離した DNA量の関係を示す。 積層数の増加により、パルス印加後の DNA遊離量は増加した。電気ノ ルスの印加 により、担持された DNAの約 10— 30%が遊離した。この図から明らかなように、遺伝 子導入効率と DNA遊離量の間には正の相関が認められた。この結果は、本発明に ぉ 、て遺伝子導入効率は表面力 の DNAの遊離量に依存して 、ることを示唆する 実施例 11
[0095] (初代細胞での実証）
ラット胎児脳カゝら海馬を採取し、神経細胞を得た。この初代神経細胞に対し、実施 例 8と同様の方法で EGFPと赤色蛍光タンパク質 (DsRed)をそれぞれコードする 2種 類のプラスミドの導入を行った。
すなわち、実施例 8と同様にして、緑色蛍光タンパク質 (EGFP)および赤色蛍光タ ンパク質（DsRed)をコードするプラスミド DNA(pEGFPおよび pDsRed、クロンテツ ク社製)を担持させた透明電極基板 (積層数 5、電極: ITO、基材:ガラス)表面上で、 前記初代神経細胞を 3日間培養し、電気パルス（200VZcm、 10msec,パルス回 数 1回）を負荷した。電気ノ ルス負荷力も 48時間後に導入遺伝子の一過性解析を実 施例 8と同様に行った。
[0096] (結果）
図 21に電気パルス負荷力も 48時間後の位相差顕微鏡像 (左、 phase contrast)お よび蛍光顕微鏡像（中、右、 EGFP, DsRed)を示す。左図の顕微鏡像から見る限り 、エレクト口ポレーシヨンによる細胞障害は見られない。また中図および右図の蛍光顕 微鏡像から、 pEGFPおよび pDsRedの両遺伝子が細胞に導入され、それらの遺伝 子がコードしている蛍光タンパク EGFPおよび DsRedの発現した様子が確認できる。 また、この図から、本遺伝子導入方法により複数の遺伝子を効率よく同一細胞に導 入できることがわ力る。さらにこの結果は、細胞播種から 3日間の培養期間後にエレク トロポレーシヨンを実施した場合でも、効率よく遺伝子導入できることを示している。こ のことより、本手法は遺伝子導入のタイミングを任意に設定することが可能であること がわかった。
実施例 12
[0097] (ITO電極基板表面への核酸のアレイ化とエレクト口ポレーシヨン）
ITO電極基板 (基材:ガラス)の表面を酸素プラズマ処理により清浄ィ匕した。次に、 I TO電極基板をォクタデシルトリエトキシシラン (LS— 6970、信越ィ匕学）の 1%トルエン 溶液に浸漬し、室温で 2時間静置した。その後、電極基板をトルエンとエタノールで 十分に洗浄した後、 80°Cで 12時間静置した。次に、石英ガラスにクロムパターンを 蒸着したフォトマスクを電極基板表面上に重ねて固定し、室温で 1時間紫外線を照射 した。マスクを取り外した後、基板をエタノールで洗浄し、紫外線照射によって分解さ れた有機シラン層を除去した。この操作によって、疎水性の有機シラン単分子層の領 域と親水性の ITO表面の露出した領域力もなるパターンィ匕表面が作製できる。
[0098] 作製したパターンィ匕 ITO電極基板 (ITOが露出した丸スポット：直径 lmm、 10 X 1 0点）の ITOスポット表面に、 PEI800とプラスミド DNA (pEGFP、 pDsRed、もしくは 両者の混合物）とを、それぞれ電極上の部位を限定して、用手法により交互に吸着 担持させた (積層数 5)。以下実施例 8と同様にして、 DNA担持透明電極基板の表面 に HEK293細胞を接着、成長させ、播種 24時間後に非接着細胞を除去した後、電 気パルス（200VZcm、 10msec,パルス回数 1回）を負荷した。
[0099] 図 22に電気パルス負荷カゝら 48時間後の蛍光顕微鏡像を示す。基板全体 (約 1. 7
X I. 7cm2)を観察するために低倍率観察を行った。この図は、発現した EGFPおよ び DsRedの蛍光を各々観察し、重ね合わせ処理したものであり、各遺伝子の固定化 領域において、その遺伝子産物に由来する蛍光が観察できる。また、両遺伝子を混 合したスポット上の細胞は両方のタンパク質を共発現した。これらのことから、本発明 方法は、場所を限定した遺伝子導入が可能であることがわかる。
産業上の利用可能性
[0100] 本発明に力かる核酸導入法は、細胞障害を与えず、効率よく遺伝子導入が可能で あり、さらに遺伝子導入の時期、場所を限定できる。このため、本発明にかかる核酸 導入法は、細胞レベルでの遺伝子や遺伝子産物の機能解析が効率よく実施でき、 細胞生物学、ポストゲノム、プロテオーム研究を大きく促し、医療への多大な貢献をな すものである。

Claims

請求の範囲
[1] エレクト口ポレーシヨン法により細胞に核酸を導入する方法であって、
(A)電極の表面に核酸を担持させる工程；
(B)得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および
(C)接着した細胞に電気パルスを印加する工程；
からなる方法。
[2] エレクト口ポレーシヨン法により細胞に核酸を導入する方法であって、
(a)カチオン性表面電極基板を提供する工程；
(b)該カチオン性表面電極基板の表面に核酸を吸着、担持させる工程；
(c)工程 (b)で得られた核酸担持電極基板の表面に細胞を接着させる工程；および
(d)該細胞に電気パルスを印加する工程；
からなる方法。
[3] カチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にァニオン性官能基を有す るチオール化合物、ジスルフイド化合物もしくはスルフイド化合物の単分子膜が形成 されており、かつ該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン 性表面電極基板である請求の範囲第 2項記載の方法。
[4] カチオン性表面電極基板力 電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有す るチオール化合物、ジスルフイド化合物もしくはスルフイドィ匕合物またはシラン処理剤 の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にァニオン性高分子が吸着 され、さらにその表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基 板である請求の範囲第 2項記載の方法。
[5] カチオン性表面電極基板が、透明電極基板の表面にカチオン性高分子を吸着さ せてなるカチオン性表面電極基板である請求の範囲第 2項記載の方法。
[6] 工程 (b)を、カチオン性表面電極基板の表面に直接核酸を 1回だけ吸着させるか、 あるいは該表面に核酸およびカチオン性高分子を、核酸、カチオン性高分子、核酸 の順序で交互吸着法により積層させることにより行う請求の範囲第 2項記載の方法。
[7] 電極基板が、白金、金およびアルミニウムカゝら選ばれる金属の電極基板である請求 の範囲第 3項または第 4項記載の方法。
[8] 電極基板が、金電極基板である請求の範囲第 3項または第 4項記載の方法。
[9] 金電極基板が、金蒸着したガラス基板もしくは透明プラスチック基板である請求の 範囲第 8項記載の方法。
[10] 透明電極基板が、インジウムースズ酸ィ匕物、酸化インジウム、アルミニウムをドープし た酸化亜鉛、アンチモンをドープした酸化スズを蒸着したガラス基板もしくは透明ブラ スチック基板である請求の範囲第 5項記載の方法。
[11] 透明電極基板が、インジゥムースズ酸ィ匕物を蒸着したガラス基板もしくは透明プラス チック基板である請求の範囲第 5項記載の方法。
[12] 末端にァ-オン性官能基を有するチオールィ匕合物が、式（1)：
(1)
2 n
(式中、 R1はァ-オン性官能基を表し、 nは 1一 40の整数を表す。 )
で示されるチオール化合物である請求の範囲第 3項記載の方法。
[13] R1がカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基およびホスホン酸基力 選ばれる基 である請求の範囲第 12項記載の方法。
[14] 式（1)で示されるチオール化合物力 11 メルカプトゥンデカン酸、 8 メルカプトォ クタン酸および 15 メルカプトへキサデカン酸力も選ばれるメルカプトアルカン酸であ る請求の範囲第 12項記載の方法。
[15] カチオン性高分子力 ポリエチレンィミン、ポリアリルァミン、ポリビュルァミン、ポリビ -ルピリジン、アミノアセタール化ポリビュルアルコール、 1一 4級ァミンを側鎖末端に 持つアクリル系またはメタクリル系ポリマー、酸処理ゼラチン、プロタミン、ポリリジン、 ポリオル二チン、ポリアルギニン、キトサン、 DEAE セルロース、 DEAE—デキストラ ンおよびポリアミドアミンデンドリマーから選ばれる高分子である請求の範囲第 3項、 第 4項または第 5項記載の方法。
[16] 末端にカチオン性官能基を有するチオールィ匕合物が、式 (2)：
(2)
2 n
(式中、 R2はカチオン性官能基を表し、 nは 1一 40の整数を表す。 )
で示されるチオール化合物である請求の範囲第 4項記載の方法。
[17] R2がァミノ基である請求の範囲第 16項記載の方法。
[18] 核酸が DNA、 RNA、アンチセンス核酸、 siRNAまたはそれらの発現ベクターであ る請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法。
[19] 核酸力タンパク質をコードする DNAまたはその一部である請求の範囲第 1項また は第 2項記載の方法。
工程 を、核酸担持電極の表面で細胞を培養することにより行う請求の範囲第 項記載の方法。
[21] 工程 (c)を、核酸担持電極基板の表面で細胞を培養することにより行う請求の範囲 第 2項記載の方法。
[22] 工程 を、細胞を介して電極基板に対畤して反対電極を設け、両電極間に電気 パルスを発生させることにより行う請求の範囲第 1項記載の方法。
[23] 工程 (d)を、細胞を介して電極基板に対畤して反対電極を設け、両電極間に電気 パルスを発生させることにより行う請求の範囲第 2項記載の方法。
[24] カチオン性表面電極基板が、ミクロパターンィ匕表面をもつ基板である請求の範囲第 2項記載の方法。
[25] 電極基板の表面に、末端にァ-オン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフ イドィ匕合物もしくはスルフイド化合物の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜 の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板。
[26] ガラス基板上に金蒸着した金電極基板の表面に、式（1)：
(1)
2 n
(式中、 R1はァ-オン性官能基を表し、 nは 1一 40の整数を表す。 )
で示されるチオール化合物の単分子膜が形成されており、該単分子膜の表面にカチ オン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板。
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