WO2006054555A1 - がんまたは糖尿病治療のための医薬組成物 - Google Patents

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WO2006054555A1
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stranded rna
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Taeko Miyagi
Tadashi Wada
Kazunori Yamaguchi
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Miyagi Ken
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    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01129—Endo-alpha-sialidase (3.2.1.129)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • composition for the treatment of cancer or diabetes comprising
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer or diabetes.
  • the inventors of the present application have succeeded in isolating the human plasma membrane sialidase (NEU3) gene (see Patent Document 1).
  • the inventors of the present invention show that the expression of this gene is enhanced almost exclusively in various human cancers including human colon cancer (see Non-patent Document 1), prostate cancer, head and neck cancer and the like. I found.
  • Non-patent Document 1 human colon cancer
  • prostate cancer prostate cancer
  • head and neck cancer and the like. I found.
  • onset of diabetes is observed in transgenic mice introduced with this gene (see Non-Patent Document 2), and polymorphisms are found in the NEU3 gene of diabetic patients, which is closely related to the onset of type 2 diabetes. I've been helped by that.
  • RNA interference RNA int ference
  • RNA-induced silencing complex RNA-induced silencing complex
  • RNA small interfering RNA
  • siRNA that suppresses the expression of human plasma membrane sialidase (NEU3) gene is not known, and a pharmaceutical composition for treating cancer or diabetes using such siRNA. There was also no known.
  • Patent Document 1 Patent No. 3088681
  • Patent Document 2 JP 2003-55399 A
  • Non-patent literature l Proc. Natl. Acad. Sci "99, 10718-10723, 2002
  • Non-Patent Document 2 J. Biol. Chem., 278, 27896-27902, 2003
  • Non-Patent Document 3 Molecular Medicine, 41 (1), 10-29, 2004
  • Non Patent Literature 4 Nature, 411, 494-498, 2001
  • Non-Patent Document 5 Virus, 53rd, No. 1, p. 7-14, 2003
  • the present invention has been made from the above viewpoint, and a pharmaceutical composition for treating cancer or diabetes, comprising siRNA that efficiently suppresses the expression of the gene of human plasma membrane sialidase (NEU3).
  • a pharmaceutical composition for treating cancer or diabetes comprising siRNA that efficiently suppresses the expression of the gene of human plasma membrane sialidase (NEU3).
  • siRNA having a specific sequence efficiently suppresses the expression of human plasma membrane sialidase (NEU3) gene.
  • the present invention has been completed.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer or diabetes comprising the following double-stranded RNA of (A) or (B).
  • Double-stranded RNA having the sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 8.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer or diabetes comprising a vector having a base sequence capable of expressing the double-stranded RNA according to any one of (1) to (3) in a human cell.
  • the pharmaceutical composition for treating cancer or diabetes of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as "the pharmaceutical composition of the present invention") is the following (A) or (B): Contains double-stranded RNA.
  • Double-stranded RNA having the sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 8.
  • the double-stranded RNA used in the present invention is an siRNA as described above, which is a human plasma membrane shearer. Suppresses expression of the gene encoding ZE (NEU3).
  • the gene sequence is already known and disclosed as GenBank / DDBJ accession NO. AB008185 (see Patent No. 3088681).
  • the double-stranded RNA used in the present invention includes (A) double-stranded RNA having the sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 8, or (B) human plasma membrane sialidase (NEU3 A double-stranded RNA of 20 to 30 bases having a sequence homologous to a partial sequence of the gene coding for and comprising the sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 8. And double-stranded RNA that suppresses the expression of the gene encoding human plasma membrane sialidase (NEU3).
  • double-stranded RNA having a homologous sequence refers to RNA or DNA (antisense strand) having a sequence homologous to a partial sequence of the gene, It means a double strand consisting of RNA (sense strand) having a complementary sequence.
  • the RNA having a sequence “homologous” to the DNA sequence means an RNA having a sequence in which thymine in the DNA base sequence is replaced with uracil, and a DNA having a sequence “homologous” to the RNA sequence.
  • RNA '' is RNA or DNA that is homologous to the antisense strand of the gene encoding NEU3, and is RNA or DNA of 20 to 30 bases that contains SEQ ID NO: 2 or a homologous sequence thereof RNA or DNA that is homologous to the antisense strand of the gene that encodes NEU3, or a double strand consisting of a sense strand) and RNA having a complementary sequence (sense strand), or SEQ ID NO: 4 or homologous thereto Homologous to the 20- to 30-base RNA or DNA (antisense strand) containing the correct sequence and the RNA (sense strand) complementary to the double strand, or the antisense strand of the gene
  • double-stranded RNA having the sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 8 refers to SEQ ID NO: 2 or a 19-base sequence homologous thereto.
  • RNA or DNA consisting of a double-stranded RNA or DNA (antisense strand) and an RNA (sense strand) that also has a complementary sequence ability (SEQ ID NO: 4 or a 19-base sequence homologous thereto) RNA or DNA (antisense) that has a double strand composed of DNA (antisense strand) and RNA (sense strand) that is complementary to it, or SEQ ID NO: 8 or 25 bases homologous to it.
  • Strand and a double strand composed of RNA (sense strand) consisting of its complementary sequence.
  • SEQ ID NO: 2 shows an RNA sequence homologous to DNA consisting of the 704th to 722nd base sequences of GenBank / DDBJ accession NO. AB008185
  • SEQ ID NO: 4 is GenBank / DDBJ accession NO. AB008185
  • the RNA sequence homologous to the DNA consisting of the 1009th to 1027th base sequences of SEQ ID NO: 8 is shown, and SEQ ID NO: 8 represents the RNA sequence homologous to the DNA consisting of the base sequence of 833 to 857 of GenBank / DDBJ accession No. AB00 8185 Show.
  • RISC complex incorporating a double-stranded RNA causes the cleavage of the target gene mRNA. There may be 1, 2 or 3 base mismatches as long as they are obtained.
  • the sequence on the sense strand side of the double-stranded RNA may be RNA or DNA, but is preferably RNA.
  • JP-A 2003-219893 describes the inhibition of gene expression by RNA-DNA nobleds.
  • the double-stranded RNA sequence is shown as the RNA sequence or DNA sequence of the antisense strand.
  • "suppressing the expression of a gene encoding human plasma membrane sialidase (NEU3)” means that when the double-stranded RNA of the present invention is introduced into a human cell, 2 This means that a RISC complex is formed in which the antisense strand of the double-stranded RNA is incorporated, and that RISC complex cleaves the mRNA of the gene encoding human plasma membrane sialidase (NEU3).
  • Whether the expression of the gene encoding human plasma membrane sialidase (NEU3) is suppressed can be determined, for example, by introducing the double-stranded RNA of the present invention under the same conditions except that the double-stranded RNA of the present invention is introduced.
  • the amount of mRNA of the full length of the gene, the amount of protein of the human plasma membrane sialidase (NEU3), which is the gene product, or sialidase activity is produced in both cells.
  • the double-stranded RNA of the present invention was introduced and the double-stranded RNA of the present invention. This can be confirmed by confirming that the amount of mRNA, protein or sialidase activity decreases.
  • the above-mentioned mRNA amount can be measured using a known means such as the Northern blot method or the RT-PCR method described in the examples described later.
  • the above-mentioned protein amount can be measured using a known means such as RIA method or ELISA method.
  • the sialidase activity can also be measured by performing a test using redesignoside as a substrate, as described in the Examples below.
  • a double-stranded RNA having the sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8 is preferable.
  • NEU3 membrane sialidase
  • a double-stranded RNA of 20 to 30 bases comprising the sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8 that suppresses the expression of the gene encoding human plasma membrane sialidase (NEU3) should also be used. Can do.
  • double-stranded RNA that suppresses the expression of the gene encoding sialidase (NEU3). It has been reported that the activity of double-stranded RNA may not change so much up to about 27 bases (see J. Biol. Chem., 278,15991-15997, 2003).
  • the double-stranded RNA used in the present invention has a force of 19 to 30 bases, preferably 19 to 27 bases, more preferably 19 to 25 bases, still more preferably 19 to 23 bases, and most preferably 19 ⁇ 21 bases.
  • the number of bases described here is the number of bases in the double-stranded part, and the number of bases at the 3 ′ protruding end described later is not included in the number of bases! /.
  • the double-stranded RNA used in the present invention may have the same length of the sense strand sequence and the antisense strand sequence, but either or both of the sequences have 1 to 4 bases. It also has a 3 'protruding end (overhang). This is because the double-stranded RNA of the present invention may be more stable by further having such a 3, protruding end. In addition, it is known that such 3 ′ protruding ends have no effect on the suppression effect of target gene expression up to 4 bases (see Nat. BiotechnoL, 20, 497-500, 2002).
  • RNA used in the present invention for example, a double-stranded RNA having a sequence homologous to a gene encoding human plasma membrane sialidase (NEU3) or a part thereof is prepared, and this is prepared using a Dice r enzyme. It can be obtained by cutting. A commercially available Dicer enzyme can be used.
  • NEU3 human plasma membrane sialidase
  • the double-stranded RNA has, for example, a sequence homologous to a partial sequence of a gene encoding human plasma membrane sialidase (NEU3), and the sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 8 RNA polymerase reaction using double-stranded DNA of 20 to 30 bases containing DNA as a vertical type, or RNA polymerase reaction using double-stranded DNA homologous to the sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 8 as a vertical type Can be prepared.
  • Such double-stranded DNA can be prepared by amplifying with a primer designed based on the sequence of the gene.
  • a double-stranded RNA (siRNA) used in the present invention is obtained by cleaving the double-stranded RNA obtained as described above with a Dicer enzyme.
  • the siRNA thus obtained is a mixture of a plurality of types of RNA molecules containing the siRNA used in the present invention.
  • the double-stranded RNA (siRNA) used in the present invention may be such a mixture or a homogeneous RNA molecule purified from this mixture! /.
  • Double-stranded RNA (siRNA) used in the present invention can also be produced by chemical synthesis. That is, a double-stranded RNA (siRNA) used in the present invention can be obtained by synthesizing a sense strand and an antisense strand corresponding to the target sequence and annealing them. Furthermore, the double-stranded RNA (siRN) used in the present invention can also be obtained by inserting a synthetic DNA designed according to the target gene sequence into a commercially available siRNA expression vector and expressing it in an appropriate host. A) can be obtained.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also use a double-stranded RNA that produces the desired double-stranded RNA (siRNA) by the endogenous Dicer enzyme in the target cell.
  • siRNA double-stranded RNA
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises the above-mentioned double-stranded RNA instead of the above-mentioned double-stranded RNA in the target human cell. It may contain a vector having a base sequence that can be expressed in. Examples of such vectors include tandem siRNA expression vectors and hairpin siRNA expression vectors. As the vectors used for these, commercially available vectors can be used as long as they can be expressed in human cells.
  • the sense strand and the antisense strand of the target siRNA are separately transcribed by intracellular RNA polymerase, and then both strands are aligned to form the target strand.
  • siRNA is produced in the cell.
  • RNA containing the sense strand and antisense strand of the target siRNA is transcribed as a whole by intracellular RNA polymerase, and then the sense strand and antisense strand.
  • the “double-stranded RNA used in the present invention” refers to a human cell into which a vector having a base sequence capable of expressing the above-described double-stranded RNA of the present invention in a human cell is introduced. In some cases, it includes double-stranded RNA (siRNA) produced by RNA expressed from the aforementioned vector.
  • siRNA double-stranded RNA
  • the double-stranded RNA used in the present invention has an action of suppressing the expression of a gene encoding human plasma membrane sialidase (NEU3).
  • NEU3 human plasma membrane sialidase
  • the double-stranded RNA used in the present invention further has an effect of suppressing cancer cell growth and inducing cancer cell apoptosis.
  • the degree to which the growth of cancer cells is suppressed is, for example, by measuring the number of cells, total DNA amount, total protein amount, etc. Can be measured by the method.
  • “having the effect of inhibiting the growth of cancer cells” means introduction of the double-stranded RNA of the present invention into cells introduced under the same conditions except that the double-stranded RNA of the present invention is introduced.
  • the cells in which the double-stranded RNA of the present invention is introduced are compared with the cells in which the double-stranded RNA of the present invention is not introduced. This means that the degree of cancer cell growth is low, or the degree of cancer cell reduction is high.
  • the degree of apoptosis induction can be measured by a known measurement method such as TUNEL method, DNA fragmentation detection method, FACS analysis method, Annexin method, and caspase activity measurement method.
  • “having an effect of inducing apoptosis” means a cell in which the double-stranded RNA of the present invention is introduced and a cell that has not been introduced under the same conditions except that the double-stranded RNA of the present invention is introduced.
  • the degree of apoptosis was measured using a cell, the degree of apoptosis was higher in cells into which the double-stranded RNA of the present invention was introduced than in cells into which the double-stranded RNA of the present invention was not introduced. Means.
  • the double-stranded RNA used in the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating cancer or diabetes.
  • the pharmaceutical composition suppresses the expression of a gene encoding human plasma membrane sialidase (NEU3).
  • the double-stranded RNA contained in the pharmaceutical composition of the present invention is introduced into human cells, the expression of a human plasma membrane sialidase (NEU3) gene that is strongly implicated in cancer and diabetes Is effectively suppressed.
  • NEU3 human plasma membrane sialidase
  • the double-stranded RNA contained in the pharmaceutical composition of the present invention suppresses the expression of the gene, thereby suppressing the growth of cancer cells and inducing apoptosis. From this, it is considered that the pharmaceutical composition of the present invention is effective for gene therapy for cancer and diabetes.
  • cancer or diabetes is not particularly limited as long as it is accompanied by an increase in the expression of human plasma membrane sialidase (NEU3) gene.
  • NEU3 human plasma membrane sialidase
  • colon cancer, prostate cancer, etc. include head and neck cancer.
  • one embodiment of the present invention suppresses the expression of a gene encoding human plasma membrane sialidase (NEU3) in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating cancer or diabetes.
  • NEU3 human plasma membrane sialidase
  • Another aspect of the present invention is a method for treating cancer or diabetes comprising administering the pharmaceutical composition of the present invention to humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be orally or parenterally administered to humans usually in combination with a pharmaceutically acceptable pharmaceutical carrier.
  • the preparation form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose of treatment. Specifically, tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, Examples include syrups, suppositories, injections, ointments, patches, eye drops, nasal drops and the like.
  • excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, diluents, surfactants, solvents for injections, etc. that are commonly used in ordinary drugs as pharmaceutical carriers Additives can be used
  • the amount of double-stranded RNA contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected.
  • siRNA 50 ⁇ gZml to 300 ⁇ gZml in the composition. It is better to
  • the administration form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and is appropriately determined according to the preparation form, the patient's disease site, the patient's sex, age, other conditions, the patient's symptom level, and the like.
  • the dosage of the double-stranded RNA in the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately selected depending on usage, patient age, sex, disease severity, other conditions, and the like.
  • the double-stranded RNA in the pharmaceutical composition of the present invention can be administered once a day or divided into a plurality of times.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is considered to be effective for the treatment of cancer or diabetes.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used together with a known preventive or therapeutic agent for cancer or diabetes, or separately before and after. By using it in this way, the preventive or therapeutic effect of the cancer or diabetes can be enhanced.
  • the above-mentioned preventive or therapeutic agent for cancer or diabetes may be contained as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention, or may be combined as a separate drug without being contained in the pharmaceutical composition of the present invention. May be commercialized and combined when used.
  • sequences have a GC content of around 50%, and a BLAST search for all human genes with the least influence of secondary structure results in 17 or more bases for all genes other than the human plasma membrane sialidase gene. A sequence that does not match.
  • RNA sequences having sequences homologous to the above five sequences are shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 and 8, respectively.
  • SEQ ID NO: 1 represents an RNA sequence homologous to DNA consisting of the 218th to 236th base sequences of GenBank / DDBJ accession NO. AB008185
  • SEQ ID NO: 2 represents GenBank / DD BJ accession NO. AB008185
  • the RNA sequence homologous to the DNA consisting of the 704th to 722th base sequences of SEQ ID NO: 3 is shown.
  • SEQ ID NO: 3 is RNA homologous to the DNA consisting of the 949th to 967th base sequences of GenBank / DDBJ accession No. AB008185.
  • SEQ ID NO: 4 shows the RNA sequence homologous to the DNA having the 1009th to 1027th base sequences of GenBank / DDBJ accession NO. AB008185
  • SEQ ID NO: 5 shows GenBank / DDBJ accession NO. AB008185
  • SEQ ID NO: 8 is the RNA homologous to the DNA consisting of the base sequence of 833 to 857 of GenBank / DDBJ accession NO. AB008185 An array is shown.
  • a double-stranded RNA contained in the pharmaceutical composition of the present invention was produced.
  • siRNA double-stranded RNA having the above five sequences was prepared using Silencer siRNA Construction kit (Ambion). The preparation method followed the method described in the manual attached to the kit. Specifically, it is as follows.
  • oligonucleotides containing the target siRNA sequence and leader sequence were synthesized for the sense strand and the antisense strand. Both these oligonucleotides and T7 promoter primer (T7 RNA promoter sequence and sequence homologous to the leader sequence) are respectively Redided.
  • Template DNA for siRNA transcription was synthesized using Exo-Klenow DNA polymerase. In vitro transcription reaction with T7 RNA polymerase was performed to synthesize sense strand RNA and antisense strand RNA. Both strands were noidized to produce double-stranded RNA. A single-strand-specific RNase treatment digested the 8-base leader sequence that was not hybridized. DNase treatment was performed to decompose the template DNA. Thereafter, siRNA was purified.
  • siRNAs having the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5 were produced, respectively, and used as test samples 1 to 5, respectively.
  • concentrations of siRNA in test samples 1 to 5 were 75 M, 63 M, 61 M, 65 M, and 74 M, respectively.
  • test samples 1 to 10 samples for cell introduction were prepared. Specifically, the procedure was as follows.
  • test sample 1 to 10! / A solution (Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen): mixed solution of 10 1 and Opti-MEM I (registered trademark, GIBCO) 250 ⁇ 1) (A mixed solution of 4 ⁇ g of a test sample and 250 ⁇ 1 of Opti-MEM I (GIBCO)) was prepared. After each of the filtrate and the B solution was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, the A solution and the B solution were mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. For each of the test samples 1 to 6, test sample 1 for cell introduction ⁇ : L0 was prepared.
  • the cell introduction test samples 1 to 10 were transiently introduced into human eclampsia cancer HeLa cells and colon cancer DL D-1 cells. Specifically, the following method was used.
  • Example 4 Using the cells transformed in Example 4, the effect of the siRNA on the expression of the plasma membrane sialidase gene was examined by quantifying the mRNA level of the gene.
  • PBGD porphobilinogen deaminase
  • test samples 1 to 5 inhibited the expression of the plasma membrane sialidase gene as follows, compared to test samples 6 to 10 that are scrambled controls. showed that.
  • Test sample 4 94% inhibition of expression
  • Test sample 2 45% inhibition of expression
  • Test sample 1 3, 5: 0-15% expression inhibition
  • test samples 2 and 4 showed the ability to inhibit the expression.
  • Test samples 1, 3 and 5 did not show the clear expression inhibition.
  • the above-mentioned plasma membrane siRNA with siRNA was used.
  • the effect on the expression of the salidase gene was examined by measuring the salidase activity.
  • sialidase activity was performed as follows.
  • Human uterine cervical cancer HeLa cells transfected with the cell introduction test samples 3 and 4 were cultured in DMEM medium for 48 hours. The cells were collected and washed with ice-cold physiological saline, followed by sonication for 10 seconds to obtain a crude cell extract.
  • the crude cell extract obtained as described above was used to measure sialidase activity using gandarioside as a substrate.
  • the reaction system contains 0.5 M sodium acetate (pH 4.6) of 101, 1% Triton X-100 of 51, lOnmol gandarioside, 101 crude cell extract, and total volume including distilled water. 50 ⁇ 1. After incubating the 50 ⁇ 1 solution at 37 ° C for 30-60 minutes, the solution 101 was used to remove free sialic acid with DMB (1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzen). It was fluorescently labeled and analyzed and quantified by high performance liquid chromatography. The analysis of free sialic acid was according to J. Chromatogr. 377, 111-119 (1986).
  • sialidase activity was also measured in a crude extract of non-transfected cells.
  • the sialidase activity of the cells transfected with the test sample 3 for cell introduction which had almost no effect of suppressing the expression of the plasma membrane sialidase gene mRNA in Example 5, was the same as the control.
  • Specific activity (5.6 units / mg 'protein).
  • the specific activity of sialidase was shown to be 94% of the expression of plasma membrane sialidase gene mRNA. 1. It was suppressed to 0 unit / mg 'protein. From this, it was found that the siRNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 shows the inhibitory effect on the expression of the plasma membrane sialidase gene at the protein level as well as at the mRNA level. From this result, it was predicted that the siRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2 would also have the effect of suppressing the expression of the plasma membrane sialidase gene at the protein level, as shown at the mRNA level.
  • siRNA used in the present invention Inhibitory power of plasma membrane sialidase gene expression by siRNA used in the present invention
  • Premix WST-1 Cell Proli feration Assay System (Takara) was used.
  • MTT Atsey was performed.
  • MTT Atsei is a type of tetrazolium salt that is broken down into formazan dyes by succinate tetrazolium reductase present in the mitochondria of MTT-viable cells. By comparing the absorbance of the sample solution stained with formazan dye, the amount of viable cells in the sample can be compared.
  • the cells transfected with the test samples for cell introduction 2, 3, 4, and 9 are cultured at 1 x 10 4 to 7 x 10 4 cells per well in 96 well plates. Sampling was performed after 12 hours, 24 hours and 48 hours. To each sample, a solution 101 containing tetrazolium salt and an electron binding reagent was added and incubated for 30 minutes, and the formazan product was measured at 450 nm absorbance with a microphone plate reader.
  • the cells transfected with the cell introduction test sample 2 and the cells transfected with the cell introduction test sample 4 are transformed with the cell introduction test sample 9.
  • the cell growth was suppressed.
  • the cells transfected with the test sample 4 for cell introduction had the most excellent effect of suppressing cell proliferation.
  • the cells transformed with the test sample 3 for cell introduction proliferated almost in the same manner as the control, and almost no cell growth inhibitory effect was observed.
  • the siRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 has an effect of suppressing the growth of human cervical cancer HeLa cells compared to the control (scramble control sequence of SEQ ID NO: 4). It was shown to have In particular, the siRNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 showed an excellent cell growth inhibitory effect.
  • the siRNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 showed an excellent cell growth inhibitory effect.
  • Inhibitory power of the expression of plasma membrane sialidase gene by siRNA used in the present invention was determined by In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche Measured by the TUNEL method. Specifically, according to the manual of the kit, the following method was used.
  • the cells (1 ⁇ 10 6 cells) transfected with the cell introduction test sample 4 were fixed with paraformaldehyde for 30 minutes at room temperature.
  • the sample was washed with distilled water and then subjected to membrane permeation treatment with an osmotic solution for 2 minutes while cooling on ice.
  • the sample was then washed again and incubated with TUNEL reaction mixture (containing TdT and dUTP) containing enzyme and label at 37 ° C for 60 minutes.
  • the same treatment was performed using the cells transfected with the cell introduction test sample 3.
  • the number of fluorescent dyes (FITC) of dUTP bound to DNA fragments by TdT (terminal deoxynucleotidyltransferase) in both sampnores was detected using a flow cytometer (Betaton Dickinson).
  • fluorescence having a wavelength of FL1 530 nm ⁇ 15 nm
  • excitation light having a wavelength of 488.
  • RNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 induces apoptosis of cancer cells.
  • siRNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 was determined by iGENE Therapeutics. I asked.
  • the siRNA was transiently introduced into HeLa cells. Then, the NEU3 mRNA level was quantified in the same manner as in Example 5. In addition, the degree of apoptosis was measured by the TUNEL method in the same manner as in Example 8. As a scramble control, a double-stranded RNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 was used.
  • NEU3 mRNA showed 94% inhibition of expression. In addition, 85% of the cells were apoptotic.
  • Double-stranded RNA contained in the pharmaceutical composition of the present invention has been strongly suggested to be involved in cancer and diabetes! / Efficiently suppresses the expression of human plasma membrane sialidase (NEU3) gene To do. Further, the double-stranded RNA contained in the pharmaceutical composition of the present invention suppresses the expression of the gene, thereby suppressing the growth of cancer cells and inducing apoptosis. From this, it is considered that the pharmaceutical composition of the present invention is effective for gene therapy for cancer and diabetes.
  • FIG. L A graph showing the suppressive effect of cancer cell proliferation by siRNA introduction.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of siRNA on cell death.

Abstract

　下記の（Ａ）または（Ｂ）の２本鎖ＲＮＡを含む、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物。 （Ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を有する２本鎖ＲＮＡ。 （Ｂ）ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号２、配列番号４、または配列番号８の配列を含む２０～３０塩基の２本鎖ＲＮＡであって、ヒト形質膜シアリダーゼ（ＮＥＵ３）をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡ。

Description

明 細 書
がんまたは糖尿病治療のための医薬組成物
技術分野
[0001] 本発明は、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物に関する。
背景技術
[0002] 本願発明者らは、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)遺伝子を単離することに成功し た (特許文献 1参照)。また、本願発明者らは、この遺伝子の発現がヒト大腸がん (非 特許文献 1参照）、前立腺がん、頭頸部がん等を含む各種ヒトがん等でほとんど例外 なく亢進していることを見出した。一方、この遺伝子を導入したトランスジエニックマウ スには、糖尿病の発症が認められ (非特許文献 2参照）、また、糖尿病患者の NEU3 遺伝子に多型が見いだされ、 2型糖尿病発症と深い関係があることがわ力 てきた。 このように、ヒト形質膜シァリダーゼの発現量の亢進が、細胞のがん化や糖尿病の 発症に深く関与していることが示唆されている。このことを利用して、本発明者らは、ヒ ト形質膜シァリダーゼを特異的に認識する抗体を用いたがんの診断方法を提供して いる (特許文献 2参照)。
[0003] 一方、近年、特定の遺伝子の発現を特異的に抑制させる手段として、その遺伝子 に相補的な配列を有する 2本鎖 RNAにより引き起こされる RNA干渉（RNAi: RNA int erference)を利用した手段が注目を集めている。この手段のメカニズムは以下のよう なものであると考えられている。
発現抑制の標的となる遺伝子に相補的な配列を有する 2本鎖 RNAが細胞内に取 り込まれると、その 2本鎖 RNAは、 RNAaselllファミリーに属する Dicer酵素により切 断され、約 21〜23塩基の短い 2本鎖 RNA断片にプロセスされる。それらの RNA断 片のアンチセンス鎖は、それぞれ RNA分解酵素活性を有するタンパク質と結合して RISC (RNA-induced silencing complex)と呼ばれる複合体が形成される。 RISCに含 まれるアンチセンス鎖が標的遺伝子の mRNAに結合すると、 mRNAが切断され、そ の結果として、標的遺伝子の発現が抑制されると考えられている（非特許文献 3参照
) o [0004] 線虫、菌類、ショウジヨウバエ、植物などの遺伝子の発現を抑制させる場合は、一般 的に長鎖 (数百塩基以上)の 2本鎖 RNAを用いた方が、発現抑制効果が高いことが 知られていた力 哺乳動物細胞の系では、長鎖の 2本鎖 RNAを導入するとインター フエロンのシグナル経路が活性ィ匕することによって細胞毒性を示すため、哺乳動物 への応用は困難だと考えられて 、た。
しかし、その後、初め力も短い 2本鎖 RNA (例えば約 21〜23塩基）を導入すること によって、インターフ ロン応答を回避する方法が開発され、哺乳動物細胞への適用 が可能となった（非特許文献 4参照）。このような短い 2本鎖 RNAは、 siRNA (small in terfering RNA)と呼ばれ、遺伝子の機能解析やウィルスを用いた遺伝子治療への応 用に期待が寄せられて ヽる (例えば、非特許文献 5参照)。
しカゝしながら、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)の遺伝子の発現を抑制する siRNA は知られておらず、また、そのような siRNAを用いた、がんまたは糖尿病を治療する ための医薬組成物も知られて 、なかった。
特許文献 1：特許 3088681号
特許文献 2：特開 2003 - 55399号
非特許文献 l : Proc. Natl. Acad. Sci" 99, 10718-10723, 2002
非特許文献 2 : J. Biol. Chem., 278, 27896-27902, 2003
非特許文献 3 : Molecular Medicine, 41(1), 10-29, 2004
非特許文献 4: Nature, 411, 494-498, 2001
非特許文献 5 :ウィルス、第 53卷、第 1号、 p. 7— 14、 2003年
発明の開示
[0005] 本発明は上記観点からなされたものであり、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)の遺伝 子の発現を効率よく抑制する siRNAを含む、がんまたは糖尿病を治療するための医 薬組成物を提供することを目的として!ヽる。
[0006] 本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の配列 を有する siRNAがヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)の遺伝子の発現を効率よく抑制 することを見出し、本発明を完成するに至った。
[0007] すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。 (1)下記の (A)または (B)の 2本鎖 RNAを含む、がんまたは糖尿病を治療するため の医薬組成物。
(A)配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8の配列を有する 2本鎖 RNA。
(B)ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配 列を有し、かつ、配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8の配列を含む 20〜30 塩基の 2本鎖 RNAであって、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の 発現を抑制する 2本鎖 RNA。
(2)前記 2本鎖 RNAが 20〜27塩基である、 (1)に記載の医薬組成物。
(3)前記 2本鎖 RNAが、 1〜4塩基の 3 '突出末端をさらに有する 2本鎖 RNAである、 (1)に記載の医薬組成物。
(4) (1)〜（3)のいずれかに記載の 2本鎖 RNAをヒト細胞内で発現しうる塩基配列を 有するベクターを含む、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物。
(5)前記がんまたは糖尿病が、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)遺伝子の発現の上 昇を伴うことを特徴とする（1)〜 (4)のいずれか 1つに記載の医薬組成物。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以 下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができ るものである。なお、本明細書において、百分率は特に断りのない限り質量による表 示である。
[0009] 本発明のがんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物（以下、単に「本発明の 医薬組成物」と記載することがある。）は、下記の (A)または（B)の 2本鎖 RNAを含ん でいる。
(A)配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8の配列を有する 2本鎖 RNA。
(B)ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配 列を有し、かつ、配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8の配列を含む 20〜30 塩基の 2本鎖 RNAであって、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の 発現を抑制する 2本鎖 RNA。
[0010] 本発明に用いる 2本鎖 RNAは、上記のような siRNAであり、ヒト形質膜シァリダ一 ゼ (NEU3)をコードする遺伝子の発現を抑制する。前記遺伝子の配列は、既に公知 であり、 GenBank/DDBJ accession NO. AB008185として開示されている（特許 3088 681号参照)。
[0011] 本発明に用いる 2本鎖 RNAとしては、（A)配列番号 2、配列番号 4、または配列番 号 8の配列を有する 2本鎖 RNA、または、（B)ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコ ードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号 2、配列番号 4、 または配列番号 8の配列を含む 20〜30塩基の 2本鎖 RNAであって、ヒト形質膜シァ リダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の発現を抑制する 2本鎖 RNAが挙げられる。 ここで、遺伝子の一部の配列に対して「相同な配列を有する 2本鎖 RNA」とは、前 記遺伝子の一部の配列に相同な配列を有する RNAまたは DNA (アンチセンス鎖）と 、それと相補的な配列を有する RNA (センス鎖)からなる 2本鎖を意味する。なお、 D NAの配列に「相同な」配列を有する RNAとは、 DNAの塩基配列におけるチミンをゥ ラシルに置換した配列を有する RNAを意味し、 RNA配列に「相同な」配列を有する DNAとは、 RN Aの塩基配列におけるゥラシルをチミンに置換した配列を有する DN Aを意味する。
[0012] また、「ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の一部の配列に相同 な配列を有し、かつ、配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8の配列を含む 20〜 30塩基の 2本鎖 RNA」とは、 NEU3をコードする遺伝子のアンチセンス鎖に相同な RNAまたは DNAであって、配列番号 2またはそれと相同な配列を含む 20〜30塩基 の RNAまたは DNA (アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列を有する RNA (センス 鎖）からなる 2本鎖、あるいは、 NEU3をコードする遺伝子のアンチセンス鎖に相同な RNAまたは DNAであって、配列番号 4またはそれと相同な配列を含む 20〜30塩基 の RNAまたは DNA (アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列を有する RNA (センス 鎖）からなる 2本鎖、あるいは、 NEU3をコードする遺伝子のアンチセンス鎖に相同な RNAまたは DNAであって、配列番号 8またはそれと相同な配列を含む 20〜30塩基 の RNAまたは DNA (アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列を有する RNA (センス 鎖)からなる 2本鎖を意味する。また、「配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8の 配列を有する 2本鎖 RNA」とは、配列番号 2またはそれと相同な 19塩基の配列から なる RNAまたは DNA (アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列力もなる RNA (セン ス鎖）により構成される 2本鎖、あるいは、配列番号 4またはそれと相同な 19塩基の配 列からなる RNAまたは DNA (アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列からなる RNA (センス鎖）により構成される 2本鎖、あるいは、配列番号 8またはそれと相同な 25塩 基の配列力もなる RNAまたは DNA (アンチセンス鎖）と、それと相補的な配列からな る RNA (センス鎖）により構成される 2本鎖を意味する。
[0013] なお、配列番号 2は、 GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の 704〜722番目 の塩基配列からなる DNAに相同な RNA配列を示しており、配列番号 4は、 GenBank /DDBJ accession NO. AB008185の 1009〜1027番目の塩基配列からなる DNAに 相同な RNA配列を示しており、配列番号 8は、 GenBank/DDBJ accession NO. AB00 8185の 833〜857の塩基配列からなる DNAに相同な RNA配列を示している。 なお、「相補的」または「相同」は、必ずしも完全に相補的または相同であることを意 味するものではなぐ 2本鎖 RNAが取り込まれた RISC複合体によって、標的遺伝子 の mRNAの切断が起こり得る限り、 1、 2または 3塩基のミスマッチがあってもよい。
2本鎖 RNAのセンス鎖側の配列は、 RNAであっても DNAであってもよいが、 RN Aであることが好ましい。 RNA—DNAノヽイブリツドによる遺伝子発現阻害については 、特開 2003— 219893に記載されている。本明細書においては、 2本鎖 RNAの配 列は、アンチセンス鎖の RNA配列または DNA配列として示す。
[0014] また、本発明で ヽぅ「ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の発現を 抑制する」とは、本発明の 2本鎖 RNAをヒトの細胞に導入した場合に、その 2本鎖 RN Aのアンチセンス鎖が取り込まれた RISC複合体が形成され、その RISC複合体がヒト 形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の mRNAを切断することを意味す る。ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の発現が抑制されているか どうかは、例えば、本発明の 2本鎖 RNAを導入すること以外は同様の条件で本発明 の 2本鎖 RNAを導入した細胞と導入しなカゝつた細胞を作製し、それらの両細胞にお いて、前記遺伝子の全長の mRNA量、前記遺伝子産物であるヒト形質膜シァリダ一 ゼ (NEU3)のタンパク量またはシァリダーゼ活性の値等を測定し、本発明の 2本鎖 R NAを導入しなカゝった細胞に比べて、本発明の 2本鎖 RNAを導入した細胞で前述の mRNA量、タンパク量またはシァリダーゼ活性が減少して ヽることを確認することによ つて確かめることができる。前述の mRNA量の測定は、ノーザンブロット法や、後述 の実施例にも記載されているような RT— PCR法等の公知の手段を用いて測定する ことができる。また、前述のタンパク量は、 RIA法や ELISA法等の公知の手段を用い て測定することができる。また、シァリダーゼ活性についても、後述の実施例に記載さ れているように、ガンダリオシドを基質として用いた試験を行うことにより測定すること ができる。
[0015] 本発明に用いる 2本鎖 RNAとしては、配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8 の配列を有する 2本鎖 RNAが好ましいが、それらの 2本鎖 RNAと同様に、ヒト形質膜 シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の発現を抑制する効果を有している限り、 ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を 有し、かつ、配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8の配列を含む 20〜30塩基 の 2本鎖 RNAであって、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の発現 を抑制する 2本鎖 RNAも用いることができる。後述の実施例において、ヒト形質膜シ ァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の発現を抑制する効果力 配列番号 2、配 列番号 4、または配列番号 8の配列を有する 2本鎖 RNAにつ 、て実際に確認されて いるが、それらの 2本鎖 RNAと同様に、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする 遺伝子の発現を抑制する効果を有している限り、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)を コードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号 2、配列番号 4 、または配列番号 8の配列を含む 20〜30塩基の 2本鎖 RNAであって、ヒト形質膜シ ァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の発現を抑制する 2本鎖 RNAも用いること 力 Sできる。 2本鎖 RNAは、 27塩基程度まではあまり活性が変わらない場合があること が報告されており（J. Biol. Chem., 278,15991-15997, 2003参照）、後述の実施例でも 25塩基の 2本鎖 RNAでも前記効果が確認されているので、配列番号 2、配列番号 4 、または配列番号 8の配列を含む 20〜30塩基程度の 2本鎖 RNAについても同様の 効果が認められると推定される。
[0016] 本発明に用いる 2本鎖 RNAは 19〜30塩基である力 好ましくは 19〜27塩基、より 好ましくは 19〜25塩基、さらに好ましくは 19〜23塩基であり、最も好ましいのは 19 〜21塩基である。なお、ここで述べている塩基数は、 2本鎖になっている部分の塩基 数であり、後述の 3 '突出末端の塩基数はここで 、う塩基数には含まれな!/、。
[0017] また、本発明に用いる 2本鎖 RNAは、センス鎖の配列とアンチセンス鎖の配列の長 さが同一であってもよいが、両配列のいずれかまたは両方に 1〜4塩基の 3'突出末 端 (オーバーハング)をさらに有して 、てもよ 、。このような 3，突出末端をさらに有する ことにより、本発明の 2本鎖 RNAがより安定する場合があるからである。また、このよう な 3'突出末端は、 4塩基までは標的遺伝子の発現抑制効果に影響がないことが知ら れている（Nat. BiotechnoL, 20, 497-500, 2002参照）。
[0018] 本発明に用いる 2本鎖 RNAは、例えば、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコード する遺伝子またはその一部に相同な配列を有する 2本鎖 RNAを調製し、これを Dice r酵素で切断することによって得ることができる。 Dicer酵素は、市販されているものを 使用することができる。前記 2本鎖 RNAは、例えば、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3 )をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配列を有し、かつ、配列番号 2、配列番 号 4、または配列番号 8の配列を含む 20〜30塩基の 2本鎖 DNAを铸型とする RNA ポリメラーゼ反応や、配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8の配列に相同な 2本 鎖 DNAを铸型とする RNAポリメラーゼ反応によって調製することができる。そのよう な 2本鎖 DNAは、前記遺伝子の配列に基づ 、て設計されたプライマーにより増幅す ること〖こよって、調製することができる。
[0019] 上記のようにして得られる 2本鎖 RNAを Dicer酵素で切断することによって、本発明 に用いる 2本鎖 RNA (siRNA)が得られる。こうして得られる siRNAは、本発明に用 いる siRNAを含む、複数種の RNA分子の混合物である。本発明に用いる 2本鎖 RN A (siRNA)は、このような混合物であってもよいし、この混合物から精製された均一 な RNA分子であってもよ!/、。
[0020] また、本発明に用いる 2本鎖 RNA (siRNA)は、化学合成によっても製造することが できる。すなわち、標的配列に相当するセンス鎖とアンチセンス鎖を合成し、それらを ァニールさせることによって、本発明に用いる 2本鎖 RNA (siRNA)が得られる。さら に、標的遺伝子配列に応じて設計した合成 DNAを、市販の siRNA発現ベクターに 挿入し、適当な宿主で発現させることによつても、本発明に用いる 2本鎖 RNA(siRN A)を得ることができる。
また、本発明の医薬組成物には、標的細胞内の内在性 Dicer酵素によって目的の 2本鎖 RNA(siRNA)が生成するような 2本鎖 RNAを用いることもできる。
[0021] また、本発明の医薬組成物の別の実施態様として、本発明の医薬組成物は、前述 の 2本鎖 RNAの代わりに、前述の 2本鎖 RNAを、標的であるヒト細胞内で発現しうる 塩基配列を有するベクターを含んでいてもよい。そのようなベクターとして、例えば、 タンデム型の siRNA発現ベクター、および、ヘアピン型の siRNA発現ベクターが挙 げられる。これらに用いるベクターは、ヒト細胞で発現しうるベクターであれば特に制 限はなぐ市販のものを使用することができる。
[0022] タンデム型の siRNA発現ベクターの場合は、 目的の siRNAのセンス鎖とアンチセ ンス鎖が細胞内の RNAポリメラーゼによって別々に転写された後、両方の鎖がァ- 一リングすることにより目的の siRNAが細胞内で作られる。一方、ヘアピン型の siRN A発現ベクターの場合は、細胞内の RNAポリメラーゼによって、 目的の siRNAのセ ンス鎖とアンチセンス鎖を含む RNAがー体となって転写された後、センス鎖とアンチ センス鎖の間の領域で折れ曲がって両鎖がアニーリングしてヘアピン型の前駆体 R NA(shRNA; short hairpin RNA)となり、アニーリングしていない一本鎖の領域が細 胞内の RNAaseにより除去されることにより、 目的の siRNAが細胞内で作られる。そ の具体的な方法は、例えば特開 2004— 261002や「改訂 RNAi実験プロトコール、 羊土社、 2004年 10月 1日発行」等に記載されている。本明細書において、「本発明 に用いる 2本鎖 RNA」には、上述のような本発明の 2本鎖 RNAをヒト細胞内で発現し うる塩基配列を有するベクターが導入されたヒト細胞内で、前述のベクターから発現 した RNAによって生成した 2本鎖 RNA (siRNA)を含む場合がある。
[0023] 本発明に用いる 2本鎖 RNAは、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝 子の発現を抑制する作用を有する。当該作用の定義および測定法は、前記の通りで ある。
[0024] 本発明に用いる 2本鎖 RNAは、さらに、がん細胞の増殖を抑制し、がん細胞のアポ トーシスを誘導するという効果を有する。がん細胞の増殖を抑制する程度は、例えば 、細胞数、総 DNA量、総タンパク質量等を測定したり、 MTTアツセィなどの公知の 方法で測定することができる。ここでいう「がん細胞の増殖を抑制する効果を有する」 とは、本発明の 2本鎖 RNAを導入すること以外は同様の条件で本発明の 2本鎖 RN Aを導入した細胞と導入しなカゝつた細胞を培養した場合にぉ ヽて、本発明の 2本鎖 R N Aを導入しなカゝった細胞に比べて、本発明の 2本鎖 RN Aを導入した細胞の方が、 がん細胞の増殖の程度が低い、または、がん細胞の減少の程度が高いことを意味す る。
[0025] アポトーシスの誘導する程度は、例えば、 TUNEL法、 DNA断片化検出法、 FAC S解析法、 Annexin法、 caspase活性測定法等の公知の測定法で測定することがで きる。
ここでいう「アポトーシスを誘導する効果を有する」とは、本発明の 2本鎖 RNAを導 入すること以外は同様の条件で本発明の 2本鎖 RNAを導入した細胞と導入しなかつ た細胞を用いてアポトーシスの程度を測定した場合に、本発明の 2本鎖 RNAを導入 しなかった細胞に比べて、本発明の 2本鎖 RNAを導入した細胞の方がアポトーシス の程度が高 、ことを意味する。
[0026] 本発明に用いる 2本鎖 RNAは、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物 の有効成分とすることができる。同医薬組成物は、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3) をコードする遺伝子の発現を抑制する。
[0027] 本発明の医薬組成物に含まれる 2本鎖 RNAがヒトの細胞に導入されると、がんや 糖尿病への関与が強く示唆されているヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)の遺伝子の 発現を効率良く抑制する。また、本発明の医薬組成物に含まれる 2本鎖 RNAは、前 記遺伝子の発現を抑制する結果、がん細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導す る。このことから、本発明の医薬組成物は、がんや糖尿病の遺伝子治療に有効であ ると考免られる。
[0028] ここで 、う「がんまたは糖尿病」とは、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)遺伝子の発 現の上昇を伴うものであれば特に制限はないが、例えば、大腸がん、前立腺がん、 頭頸部がん等が含まれる。
[0029] すなわち、本発明の一態様は、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物の 製造における、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の発現を抑制す る 2本鎖 RNAの使用である。また、本発明の他の態様は、本発明の医薬組成物をヒ トに投与することを含む、がんまたは糖尿病を治療する方法である。
[0030] 本発明の医薬組成物は、通常は、製剤学的に許容される製剤担体と組み合わせて 、経口的または非経口的にヒトに投与することができる。本発明の医薬組成物の製剤 形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤 、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏 剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示することができる。製剤化にあたっては、製剤 担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯 味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる
[0031] 本発明の医薬組成物に含まれる 2本鎖 RNAの量は、特に限定されず適宜選択す ればよいが、例えば、 siRNAの場合は、組成物中に 50 μ gZml〜300 μ gZmlとす るのがよい。
本発明の医薬組成物の投与形態は特に限定されず、製剤形態、患者の疾患の部 位、患者の性別、年齢、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて適宜決定され る。
本発明の医薬組成物中の 2本鎖 RNAの投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾 患の程度、その他の条件等により適宜選択される。また、本発明の医薬組成物中の 2 本鎖 RNAは、 1日 1回又は複数回に分けて投与することができる。
[0032] 本発明の医薬組成物は、がんまたは糖尿病の治療に有効であると考えられる。本 発明の医薬組成物は、公知のがんまたは糖尿病の予防'治療剤と一緒に、または前 後に別々に使用することも可能である。このように使用することによって、前記がんま たは糖尿病の予防 '治療効果を高めることができる。さらに、前記がんまたは糖尿病 の予防'治療剤を、本発明の医薬組成物中に有効成分として含有させても良いし、 本発明の医薬組成物中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて商品化し 、使用時に組み合わせても良い。
実施例
[0033] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例 に限定されるものではない。
[実施例 1]
ヒト形質膜シァリダーゼ遺伝子の配列（GenBank/DDBJ accession NO. AB008185 参照）に基づいて、前記遺伝子の発現を抑制する 2本鎖 RNAの候補となる 19塩基 の 5つの配列を選択した。
これらの配列は、 GC含有量が 50%前後で、最も 2次構造の影響が少なぐヒトの全 遺伝子に対する BLASTサーチの結果、ヒト形質膜シァリダーゼ遺伝子以外の全遺 伝子に対して 17塩基以上一致することがない配列である。
上記の 5つの配列に相同な配列を有する RNA配列（アンチセンス鎖）を、それぞれ 配列番号 1〜5、及び 8に示す。
[0034] 配列番号 1は、 GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の 218〜236番目の塩 基配列からなる DNAに相同な RNA配列を示しており、配列番号 2は、 GenBank/DD BJ accession NO. AB008185の 704〜722番目の塩基配列からなる DNAに相同な R NA配列を示しており、配列番号 3は、 GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の 9 49〜967番目の塩基配列からなる DNAに相同な RNA配列を示しており、配列番 号 4は、 GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の 1009〜1027番目の塩基配列 力 なる DNAに相同な RNA配列を示しており、配列番号 5は、 GenBank/DDBJ acce ssion NO. AB008185の 1321〜1339番目の塩基配列からなる DNAに相同な RNA 配列を示しており、配列番号 8は、 GenBank/DDBJ accession NO. AB008185の 833 〜857の塩基配列からなる DNAに相同な RNA配列を示している。
[0035] [実施例 2]
本発明の医薬組成物に含まれる 2本鎖 RNAを製造した。
すなわち、上記の 5つの配列を有する 2本鎖 RNA (siRNA)を、 Silencer siRNA Co nstruction kit (Ambion社製)を用いて作製した。作製方法は、そのキットに添付され たマニュアルに記載された方法に従った。具体的には、以下の通りである。
まず、 目的の siRNAの配列とリーダー配列を含むオリゴヌクレオチドを、センス鎖用 とアンチセンス鎖用に 2種類合成した。これらの両オリゴヌクレオチドと、 T7 promoter primer (T7 RNAプロモーター配列とリーダー配列に相同な配列）とをそれぞれノ、イブ リダィズさせた。 Exo-KlenowDNA polymeraseにより、 siRNAの転写用のテンプレー ト DNAを合成した。 T7 RNA polymeraseで in vitro転写反応を行い、センス鎖 RNA 、アンチセンス鎖 RNAをそれぞれ合成した。この両鎖をノヽイブリダィズさせ、二本鎖 RNAを作製した。一本鎖特異的 RNase処理で、ノ、イブリダィズしなかった 8塩基のリ ーダー配列を分解した。 DNase処理を行い、テンプレートの DNAを分解した。その 後、 siRNAを精製した。
[0036] このような in vitro転写反応による生合成により、配列番号 1〜5の配列を有する siR NAをそれぞれ製造し、順にそれぞれ試験試料 1〜5とした。試験試料 1〜5の siRN Aの濃度は、それぞれ 75 M、 63 M、 61 M、 65 M、 74 Mであった。
また、 Dharmacon社に委託して、同様の siRNAを 5種類、化学合成により作製した。 さらに、コントロールとして、配列番号 1の塩基配列をランダムに入れ替えて標的部 位を認識できな 、ようにしたスクランブルコントロール配列をィ匕学合成により製造し、 試験試料 6とした。また、配列番号 2〜5の塩基配列に対しても、同様にスクランブル コントロール配列をィ匕学合成によりそれぞれ製造し、それぞれ試験試料 7〜 10とした
[0037] [実施例 3]
前記試験試料 1〜10について、それぞれの細胞導入用試料を調製した。具体的に は以下のような手順で行った。
試験試料 1〜10のそれぞれにつ!/、て A液 (LipofectamineTM 2000 (Invitrogen社製 )： 10 1と Opti- MEM I (登録商標、 GIBCO社製） 250 μ 1との混合溶液）と Β液 (試験 試料 4 μ gと Opti- MEM I (GIBCO社製） 250 μ 1との混合溶液）を調製した。 Α液およ び B液それぞれを室温で 5分間放置した後、 A液と B液を混合して室温で 20分間放 置して、試験試料 1〜6のそれぞれについて、細胞導入用試験試料 1〜： L0を調製し た。
[0038] [実施例 4]
前記細胞導入用試験試料 1〜10をヒト子宫頸部がん HeLa細胞および大腸がん DL D-1細胞に一過性導入した。具体的には以下のような方法で行った。
ヒト子宫頸部がん HeLa細胞および大腸がん DLD-1細胞を、 DMEM培地で懸濁し 、 70〜80%の細胞密度になるまでプレートで培養した。前記細胞導入用試験試料 1 〜10を、それぞれ前記細胞の培養液に添加し、トランスフエクシヨンを行った。
[0039] [実施例 5]
実施例 4でトランスフエクシヨンを行った細胞を用いて、前記 siRNAによる形質膜シ ァリダーゼ遺伝子の発現への影響を、その遺伝子の mRNAレベルを定量することに より検討した。
細胞導入用試験試料 1〜10をそれぞれトランスフエクシヨンしたヒト子宫頸部がん H eLa細胞（トランスフエクシヨン後 48時間培養）から、 totalRNAを抽出し、逆転写酵素 を用いてその cDNAを合成した。その cDNAを用いて、リアルタイム PCRを行い、形 質膜シァリダーゼ遺伝子の mRNAレベルの定量を試みた。 目的の mRNAの検出は 、 目的遺伝子の配列に基づいて作製したプライマーを用いて行った。プライマーの 配列を、配列番号 6および 7に示す。
サンプル間の調製差を補正するために、ハウスキーピング遺伝子である porphobilin ogen deaminase (PBGD)の mRNAレベルの定量も同様に行った。
[0040] 以上の試験の結果、試験試料 1〜5の siRNAは、それぞれのスクランブルコント口 ールである試験試料 6〜10に比べて、形質膜シァリダーゼ遺伝子に対してそれぞれ 以下のような発現阻害を示した。
試験試料 4： 94%の発現阻害
試験試料 2： 45%の発現阻害
試験試料 1、 3、 5 : 0〜15%の発現阻害
このように、試験試料 2および 4は発現阻害を示した力 試験試料 1、 3および 5は、 明確な発現阻害を示さな力 た。
また、上述の in vitro転写反応による生合成により製造した siRNAの代わりに、化 学合成により製造した siRNAを用いた場合も、ほぼ同様の結果が得られた。また、ヒ ト子宫頸部がん HeLa細胞に代えて、大腸がん DLD-1細胞を用いた同様の実験でも 、ほぼ同様の結果が得られた。
[0041] [実施例 6]
実施例 4でトランスフエクシヨンを行った細胞を用いて、前記 siRNAによる形質膜シ ァリダーゼ遺伝子の発現への影響を、シァリダーゼ活性を測定することにより検討し た。
シァリダーゼ活性の測定は以下のように行った。
前記細胞導入用試験試料 3および 4でトランスフエクシヨンしたヒト子宫頸部がん He La細胞を、 DMEM培地で 48時間培養を行った。細胞を集めて氷冷生理食塩水で 洗った後、 10秒間超音波処理し、細胞粗抽出液とした。
上記のようにして得られた細胞粗抽出液にっ ヽてシァリダーゼ活性を、ガンダリオ シドを基質として測定した。反応系は、 10 1の0. 5M酢酸ナトリウム (pH4. 6)、 5 1の 1%トリトン X— 100、 lOnmolのガンダリオシド、 10 1の細胞粗抽出液を含み、蒸 留水をカ卩えて全量 50 μ 1とした。その 50 μ 1の溶液を、 37°Cで 30〜60分間インキュ ベートを行った後、その溶液 10 1を用いて、遊離シアル酸を DMB (1,2- diamino- 4, 5-methylenedioxybenzen)により蛍光標識し、高速液体クロマトグラフィーで分析定量 した。遊離シアル酸の分析は、 J. Chromatogr. 377, 111-119 (1986)に従った。
また、コントロールとして、トランスフエクシヨンしていない細胞の粗抽出液についても シァリダーゼ活性を測定した。
その結果、実施例 5で形質膜シァリダーゼ遺伝子の mRNAの発現抑制効果がほと んど見られな力つた、前記細胞導入用試験試料 3でトランスフエクシヨンした細胞のシ ァリダーゼ活性は、コントロールと同程度の比活性（5. 6ユニット /mg'タンパク）であ つた。一方、実施例 5で、形質膜シァリダーゼ遺伝子の mRNAの発現に対して 94% もの発現阻害を示した、前記細胞導入用試験試料 4でトランスフエクシヨンした細胞で は、シァリダ一ゼの比活性は 1. 0ユニット /mg'タンパクにまで抑制されていた。 このことから、配列番号 4の配列を有する siRNAは、 mRNAレベルで示したのと同 様に、タンパクレベルでも形質膜シァリダーゼ遺伝子の発現の抑制効果を示すこと 分かった。また、この結果から、配列番号 2の配列を有する siRNAも、 mRNAレベル で示したのと同様に、タンパクレベルでも形質膜シァリダーゼ遺伝子の発現の抑制効 果を示すであろうと予測された。
なお、ヒト子宫頸部がん HeLa細胞に代えて、大腸がん DLD-1細胞を用いた同様の 実験でも、ほぼ同様の結果が得られた。 [0043] [実施例 7]
本発明に用いる siRNAによる形質膜シァリダーゼ遺伝子の発現の阻害力 がん細 胞の細胞増殖にどのような影響を与えるかを調べるために、 Premix WST-1 Cell Proli feration Assay System (Takara)を用いて、 MTTアツセィを行った。
MTTアツセィは、テトラゾリゥム塩の一種である MTT力 生存細胞のミトコンドリア に存在するコハク酸塩テトラゾリゥム還元酵素によってホルマザン色素に分解される ことを利用したアツセィである。ホルマザン色素により染色されたサンプル溶液の吸光 度を比較することにより、サンプル中の生存細胞の量を比較することができる。
前記細胞導入用試験試料 2、 3、 4、 9でトランスフエクシヨンした細胞を、 1ゥエル当 たり 1 X 104〜7 X 104個で、 96ゥエルプレートでそれぞれ培養し、培養を始めてから 12時間後、 24時間後、 48時間後にサンプリングした。それぞれのサンプルにテトラ ゾリゥム塩と電子結合試薬を含む溶液 10 1を加えて 30分間インキュベートし、マイク 口プレートリーダーでホルマザン産物を吸光度 450nmで測定した。
その結果を以下の図 1に示す。
図 1に示されて 、る通り、前記細胞導入用試験試料 2でトランスフエクシヨンした細胞 および前記細胞導入用試験試料 4でトランスフエクシヨンした細胞は、前記細胞導入 用試験試料 9でトランスフエクシヨンした細胞（コントロール）に比べて、細胞増殖の抑 制効果を示した。特に、前記細胞導入用試験試料 4でトランスフエクシヨンした細胞は 、細胞増殖の抑制効果が最も優れていた。また、前記細胞導入用試験試料 3でトラン スフヱクシヨンした細胞は、コントロールとほぼ同様に増殖しており、細胞増殖抑制効 果はほとんど見られなかった。
[0044] これらの結果から、配列番号 2または 4の配列を有する siRNAは、コントロール（配 列番号 4のスクランブルコントロール配列）と比較して、ヒト子宫頸部がん HeLa細胞の 増殖を抑制する効果を有していることが示された。特に、配列番号 4の配列を有する s iRNAは、優れた細胞増殖抑制効果を示した。また、 mRNAレベル、タンパクレベル で
形質膜シァリダーゼ遺伝子の発現抑制が見られな力つた配列番号 3の配列を有する siRNAは、がん細胞の増殖抑制効果も見られな力つた。 なお、ヒト子宫頸部がん HeLa細胞に代えて、大腸がん DLD-1細胞を用いた同様の 実験でも、ほぼ同様の結果が得られた。
[0045] [実施例 8]
本発明に用いる siRNAによる形質膜シァリダーゼ遺伝子の発現の阻害力 がん細 胞のアポトーシスにどのような影響を与えるかを調べるために、アポトーシスの程度を I n Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche社製)を用いた TUNEL法により 測定した。具体的には前記 Kitのマニュアルにしたがって、以下のような方法で行つ た。
まず、前記細胞導入用試験試料 4でトランスフエクシヨンした細胞（1 X 106個）を、パ ラホルムアルデヒドで 30分間室温で固定した。そのサンプルを蒸留水で洗浄後、氷 上で冷やしながら、 2分間浸透ィ匕液で膜透過処理した。次いで、再びサンプルを洗 浄した後、酵素およびラベルを含む TUNEL reaction mixture (TdTおよび dUTPを含 む）をカ卩えて 37°Cで 60分間インキュベートした。
また、前記細胞導入用試験試料 4でトランスフ クシヨンした細胞に代えて、前記細 胞導入用試験試料 3でトランスフエクシヨンした細胞を用いて同様の処理を行った。 その後、両サンプノレにおける、 TdT (terminal deoxynucleotidyltransferase)によって DNA断片に結合した dUTPの蛍光色素（FITC)の数を、フローサイトメーター（ベタト ン 'ディッキンソン社製)を用いて検出した。この際、 488應の波長の励起光を使って 、 FL1 (530nm± 15nm)の波長の蛍光を検出した。
その結果を図 2に示す。
図 2の結果から、前記細胞導入用試験試料 4でトランスフエクシヨンした細胞では、 9 1. 3%の細胞がアポトーシスを起こしていることが分力つた。すなわち、本発明の 2本 鎖 RNA (配列番号 4の配列を有する siRNA)は、がん細胞のアポトーシスを誘導する ことが示された。
なお、ヒト子宫頸部がん HeLa細胞に代えて、大腸がん DLD-1細胞を用いた同様の 実験でも、ほぼ同様の結果が得られた。
[0046] [実施例 9]
配列番号 8に示す塩基配列を有する siRNAの合成を、 iGENE Therapeutics社に依 頼した。
実施例 3、 4と同様にして、上記 siRNAを HeLa細胞に一過性導入した。そして、実 施例 5と同様にして NEU3 mRNAレベルを定量した。また、実施例 8と同様にして T UNEL法にアポトーシスの程度を測定した。尚、スクランブルコントロールとして、配 列番号 9に示す塩基配列を有する 2本鎖 RNAを用いた。
その結果、 NEU3 mRNAについては 94%の発現阻害を示した。また、 85%の細 胞がアポトーシスを起こして ヽた。
産業上の利用可能性
[0047] 本発明の医薬組成物に含まれる 2本鎖 RNAは、がんや糖尿病への関与が強く示 唆されて!/ヽるヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)の遺伝子の発現を効率良く抑制する。 また、本発明の医薬組成物に含まれる 2本鎖 RNAは、前記遺伝子の発現を抑制す る結果、がん細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する。このことから、本発明の 医薬組成物は、がんや糖尿病の遺伝子治療に有効であると考えられる。
図面の簡単な説明
[0048] [図 l]siRNA導入によるがん細胞増殖の抑制効果を示す図。
[図 2]siRNAの細胞死に対する影響を示す図。

Claims

請求の範囲
[1] 下記の (A)または (B)の 2本鎖 RNAを含む、がんまたは糖尿病を治療するための 医薬組成物。
(A)配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8の配列を有する 2本鎖 RNA。
(B)ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の一部の配列に相同な配 列を有し、かつ、配列番号 2、配列番号 4、または配列番号 8の配列を含む 20〜30 塩基の 2本鎖 RNAであって、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)をコードする遺伝子の 発現を抑制する 2本鎖 RNA。
[2] 前記 2本鎖 RNAが 20〜27塩基である、請求項 1に記載の医薬組成物。
[3] 前記 2本鎖 RNAが、 1〜4塩基の 3'突出末端をさらに有する 2本鎖 RNAである、請 求項 1に記載の医薬組成物。
[4] 請求項 1〜3のいずれか一項に記載の 2本鎖 RNAをヒト細胞内で発現しうる塩基配 列を有するベクターを含む、がんまたは糖尿病を治療するための医薬組成物。
[5] 前記がんまたは糖尿病が、ヒト形質膜シァリダーゼ (NEU3)遺伝子の発現の上昇 を伴うことを特徴とする請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の医薬組成物。
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