WO2008029685A1 - Procédé pour analyse d'échantillon par électrophorèse capillaire - Google Patents

Procédé pour analyse d'échantillon par électrophorèse capillaire Download PDF

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WO2008029685A1
WO2008029685A1 PCT/JP2007/066752 JP2007066752W WO2008029685A1 WO 2008029685 A1 WO2008029685 A1 WO 2008029685A1 JP 2007066752 W JP2007066752 W JP 2007066752W WO 2008029685 A1 WO2008029685 A1 WO 2008029685A1
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capillary
sample
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capillary tube
tube
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PCT/JP2007/066752
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Yoshihide Tanaka
Shinichi Wakida
Yusuke Nakayama
Satoshi Yonehara
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Arkray, Inc.
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
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    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a sample by a capillary single electrophoresis method, a single capillary tube and a capillary electrophoresis device used therefor.
  • an electroosmotic flow is generated by the movement of the ion force S collected on the inner wall of the capillary pipe by application, thereby moving the sample and performing electrophoresis.
  • a force using a fused silica tube is used as the capillary tube.
  • a good electroosmotic flow cannot be obtained due to adsorption of the sample.
  • Patent Documents 1, 2, 3, and 4 techniques for covering the inner wall of a single pipe have been proposed (Patent Documents 1, 2, 3, and 4).
  • Hb hemoglobin
  • Glycation in blood Hb reflects the past history of blood glucose levels in the body, and is therefore an index for the diagnosis and treatment of diabetes.
  • / 3-chain N-terminal parin is glycated It is called hemoglobin Alc (HbAlc)
  • HbAlc hemoglobin Alc
  • Examples of the method for measuring hemoglobin in blood include agarose electrophoresis, capillary single electrophoresis, HPLC, immunization, and enzymatic methods.
  • capillary mutation electrophoresis and HPLC methods can detect minute variations such as genetic variation of hemoglobin.
  • miniaturization is required for hemoglobin analyzers. In this regard, it is difficult for the HPLC method to reduce the size of the entire apparatus.
  • capillary electrophoresis the entire device can be miniaturized by using a microchip.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-291926
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 4 320957
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 5-503989
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. 8-504037
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 9 105739
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2006-145537
  • an object of the present invention is to provide a method for analyzing a sample by a single-electrophoresis method that can be easily performed with high analysis accuracy, and can be downsized, and a capillary tube used therefor. And providing a capillary electrophoresis device.
  • an analysis method of the present invention is a method for analyzing a sample by a capillary single electrophoresis method
  • the capillary tube is a capillary tube in which a cathode layer formed of a cathodic group-containing compound is laminated on the inner wall of the chamber tube, and the cathode layer is formed by covalent bonding. It is characterized by being fixed to.
  • the capillary tube of the present invention is a capillary tube for capillary electrophoresis used in the analysis method of the present invention, and is a cathode formed from a cathode group-containing compound on the inner wall of the capillary tube.
  • the cathode layer is fixed to the inner wall of the cylindrical pipe by a covalent bond.
  • the capillary electrophoresis apparatus of the present invention is a capillary used in the analysis method of the present invention.
  • a rally electrophoresis apparatus comprising the above-described single tube of the present invention.
  • the miniature electrophoresis device of the present invention may be a microchip electrophoresis device that is miniaturized (microchip)!
  • a capillary tube in which a cathodic layer fixed by a covalent bond is formed on the inner wall of the capillary tube is used. Adsorption to the inner wall of the single pipe can be prevented, and thus it is possible to generate a good electroosmotic flow. Further, in the analysis method of the present invention, the sample and the cathodic group-containing compound are combined to form a complex, which is electrophoresed, so that the separation efficiency is higher than that of electrophoresis by the sample alone. From these facts, according to the analysis method of the present invention, it is possible to analyze a sample such as hemoglobin in a short time and with high accuracy.
  • the cathode layer is firmly fixed to the inner wall of the single pipe, once it is formed, it can be used repeatedly without being easily peeled off even after washing. For this reason, in the analysis method of the present invention, once the cathodic layer is formed, it is not necessary to form the cathodic layer every time it is analyzed, so that the analysis can be easily performed. In the present invention, since the capillary electrophoresis method is employed, the analyzer can be miniaturized.
  • FIG. 1 is a chart showing the results of hemoglobin analysis in one example of the present invention.
  • FIG. 2 is a chart showing the results of hemoglobin analysis in other examples of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a configuration of an example of a capillary single electrophoresis apparatus of the present invention.
  • Fig. 3 (A) is a plan view of the capillary electrophoresis apparatus of this example
  • Fig. 3 (B) is a cross-sectional view taken along line I-I in Fig. 3 (A)
  • Fig. 3 (C) is a diagram of FIG. 3 is a sectional view taken along line II-II in (A).
  • FIG. 4 is a diagram showing the configuration of another example of the capillary electrophoresis device of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the configuration of still another example of the capillary electrophoresis device of the present invention.
  • FIG. 6 shows the configuration of still another example of the capillary electrophoresis device of the present invention.
  • the running buffer refers to a buffer solution (buffer) used in an actual separation step.
  • a sample is added to a running buffer containing a cathodic group-containing compound, and then both ends of the capillary tube are applied to combine the sample and the cathodic group-containing compound.
  • the body is preferably electrophoresed.
  • the anionic group-containing compound that forms a complex with the sample is preferably an anionic group-containing polysaccharide.
  • the anionic group-containing polysaccharide include sulfated polysaccharides, carboxylated polysaccharides, sulfonated polysaccharides and phosphorylated polysaccharides, and among them, sulfated polysaccharides and carboxylated polysaccharides are preferable.
  • sulfated polysaccharide chondroitin sulfate, heparin and the like are preferable, and chondroitin sulfate is more preferable.
  • alginic acid or a salt thereof for example, sodium alginate
  • chondroitin sulfate There are seven types of chondroitin sulfate, A, B, C, D, E, H, and K, and any of them may be used.
  • the anionic group is preferably at least one of a sulfone group and a carboxyl group. ,.
  • the sample is preferably a sample containing hemoglobin! /.
  • the capillary electrophoresis apparatus of the present invention includes a substrate, a plurality of liquid tanks, and a capillary tube, wherein the plurality of liquid tanks are formed on the substrate, and the plurality of liquid tanks are It is possible to communicate with a single pipe, and the single pipe may be the single pipe of the present invention.
  • the maximum length of the substrate is, for example, in the range of 10 to 100 mm, preferably in the range of 30 to 70 mm, and the maximum width of the substrate is in the range of, for example, 10 to 60 mm.
  • the maximum thickness of the substrate is, for example, in the range of 0.3 to 5 mm.
  • the maximum length of the substrate is the length of the longest portion in the longitudinal direction of the substrate, and the maximum width of the substrate is the longest portion of the substrate in the direction (width direction) perpendicular to the longitudinal direction.
  • the maximum thickness of the substrate is the longitudinal direction and the width direction of the substrate. It is the length of the longest part of the direction (thickness direction) perpendicular to both.
  • the capillary electrophoresis apparatus of the present invention may be a microchip electrophoresis apparatus that is miniaturized (microchip).
  • the cathode tube which is effective in the present invention has the cathode layer formed on the inner wall thereof.
  • the material of the single tube is not particularly limited, and examples thereof include glass, fused silica, and plastic.
  • the inner wall of a glass or fused silica glass pipe is usually in a state of negative charge.
  • the plastic inner wall of the plastic pipe is either positively or negatively charged or uncharged (nonpolar) depending on the presence or type of polar groups in the plastic. Even a plastic having no polar group can be charged by introducing the polar group.
  • Commercially available plastic canisters such as polymethyl methacrylate, polycarbonate, polystyrene, polyethylene, polytetrafluoroethylene (PTFE), polyetheretherketone (PEEK)
  • PEEK polyetheretherketone
  • the cathode layer on the inner wall of the capillary tube with the anionic group-containing compound for example, a compound containing the anionic group and a reactive group may be used.
  • a compound having a cathodic group and a key silica
  • the anionic group is preferably at least one of a sulfonate group and a carboxyl group.
  • silylating agent examples include 2- (4 chlorosulfophenyl) ethyltrimethylsilane, 2- (4 chlorosulfuylphenyl) ethyltrichlorosilane, and the like.
  • the silylating agent one obtained by substituting a silicon atom with titanium or zirconium may be used.
  • the silylating agent may be used alone or in combination of two or more.
  • the formation of the cathodic layer using the silylating agent is performed, for example, as follows. First, a treatment liquid is prepared by dissolving or dispersing a silylating agent in an organic solvent. Examples of the organic solvent used for preparing the treatment liquid include dichloromethane and toluene. The concentration of the silylating agent in the treatment liquid is not particularly limited. This treatment liquid is passed through a glass or fused silica glass pipe and heated.
  • the silylating agent is covalently bonded to the inner wall of the capillary tube, and as a result, the cathodic group is arranged on the inner wall of the tube.
  • the substrate is washed (post-treated) with at least one of an organic solvent (dichloromethane, methanol, acetone, etc.), an acidic solution (phosphoric acid, etc.), an alkaline solution, and a surfactant solution.
  • an organic solvent dichloromethane, methanol, acetone, etc.
  • an acidic solution phosphoric acid, etc.
  • alkaline solution a surfactant solution
  • a commercially available product may be used as the capillary tube having the cathode layer formed of the silylating agent.
  • the running buffer is not particularly limited, but a buffer using an acid is preferable.
  • the acid include maleic acid, tartaric acid, succinic acid, fumaric acid, phthalic acid, malonic acid, and malic acid.
  • the running buffer preferably contains a weak base. Examples of the weak base include arginine, lysine, histidine, and tris.
  • the pH of the running buffer is, for example, in the range of ⁇ 4 ⁇ 5-6.
  • the buffer type of the running buffer includes MES, ADA, ACES, BES, MOPS, TES, HEPE S and the like.
  • the concentration of the anionic group-containing compound forming a complex with the sample is, for example, in the range of 0.0;! To 5% by weight.
  • the analysis method of the present invention can be carried out, for example, on a sample containing hemoglobin as follows.
  • a glass or fused silica firefly pipe is prepared.
  • An anionic group-containing compound is covalently fixed to the inner wall of the capillary tube.
  • Purified water is passed through this single pipe and washed.
  • the passage time of the purified water is, for example, ! to 10 minutes, and the pressure at the time of the passage is, for example, 0.05-0. IMPa.
  • a running buffer containing a cathodic group-containing polysaccharide such as chondroitin sulfate is passed through the above-mentioned cylindrical pipe under pressure by a pump or the like.
  • the passing time is, for example, 10 to 60 minutes, and the passing pressure is, for example, 0.05-0. IMPa.
  • the hemoglobin-containing sample is introduced into the capillary tube, and both ends of the capillary tube are applied to perform electrophoresis.
  • the hemoglobin-containing sample is not particularly limited, and examples thereof include a sample obtained by hemolyzing whole blood, and this sample may be diluted with purified water or a running buffer.
  • the introduction of the hemoglobin-containing sample is carried out from the anode side of the above-mentioned single tube.
  • the introduced hemoglobin binds with the anionic group-containing polysaccharide in the running buffer to form a complex.
  • an electroosmotic flow is generated in the running buffer in the capillary tube, and the complex moves toward the cathode side of the capillary tube.
  • the degree of application is, for example, 10 to 30 kV.
  • This movement is detected by an optical method. Detection by an optical method is not particularly limited, but is preferably performed at a wavelength of 415 nm.
  • the hemoglobin to be analyzed is not particularly limited, and examples thereof include normal hemoglobin, glycated hemoglobin (eg, HbAlc, unstable HbAlc, GHbLys, etc.), genetic variant hemoglobin, and the like. In the present invention, it is possible to separate and analyze HbAlc and other hemoglobin.
  • the capillary electrophoresis device of the present invention will be described with examples.
  • the capillary electrophoresis apparatus of the present invention is not limited to the following examples.
  • FIG. 3 shows an example of a single-electrophoresis device of the present invention.
  • Fig. 3 (A) is a plan view of the capillary electrophoresis apparatus of this example
  • Fig. 3 (B) is a sectional view taken along line II in Fig. 3 (A)
  • Fig. 3 (C) is a diagram of Fig. 3 (C). It is sectional drawing in II-II of (A).
  • the size and ratio of each component are different from the actual ones in order to facilitate power distribution.
  • This example of a single-electrophoresis device is a miniaturized microchip electrophoresis device.
  • this microchip electrophoresis apparatus includes a substrate 1, a plurality (four in this example) of liquid tanks 2a to 2d, and four single-tube tubes 3x1, 3x2, 3yl and 3y 2. Including. All four of the four tubes are the one tubes of the present invention.
  • the four liquid tanks 2a to 2d include a first introduction tank 2a, a first collection tank 2b, a second introduction tank 2c, and a second collection tank 2d.
  • the four pipes are gathered at one end force central portion c of each of them and connected in a cross shape. As a result, the inside of the four captive pipes is in communication. In order to fit the four above-mentioned single pipes into the substrate 1 (Not shown).
  • the one end pipe 3x1 is fitted in the substrate 1 so that the other end is located on the bottom surface of the first introduction tank 2a.
  • the capillary tube 3x2 is fitted in the substrate 1 so that the other end is located on the bottom surface of the first recovery tank 2b.
  • the above-mentioned capillary single pipes 3x1 and 3x2 serve as a single capillary flow path 3x for sample analysis.
  • the one end pipe 3yl is fitted in the substrate 1 so that the other end is located on the bottom surface of the second introduction tank 2c.
  • the capillary one pipe 3y2 is fitted in the substrate 1 so that the other end is located on the bottom surface of the second collection tank 2d.
  • the above-mentioned capillary single pipes 3yl and 3y2 serve as a sample single-purpose capillary single flow path 3y.
  • Each of the plurality of liquid tanks 2a to 2d is formed as a recess on the substrate 1.
  • the substrate 1 has a rectangular parallelepiped opening (window) 9 on the side of the first recovery tank 2b from the sample introduction capillary flow path 3y.
  • the microphone-tip electrophoresis device of this example has a rectangular parallelepiped shape.
  • the microchip electrophoresis apparatus of the present invention may have any shape as long as it does not hinder electrophoresis measurement. Further, the planar shape of the microchip electrophoresis apparatus of this example is a rectangle.
  • the planar shape of the microchip electrophoresis apparatus of the present invention may be, for example, a square or other shapes.
  • the maximum lengths of the sample analysis capillary flow path 3x and the sample introduction capillary flow path 3y are different.
  • the present invention is not limited to this.
  • the maximum lengths of the sample analysis capillary flow path 3x and the sample introduction chiral flow path 3y may be the same.
  • the configuration of the microchip electrophoretic device of the present invention is not limited to this example.
  • the microchip electrophoresis chip may be manufactured by a method other than the following manufacturing method.
  • the substrate 1 for example, a substrate formed from glass, a polymer material, or the like can be used.
  • the glass material include synthetic quartz glass and borosilicate glass.
  • the polymer material For example, polymethyl methacrylate (PMMA), cycloolefin polymer (COP), polycarbonate (PC), polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), polylactic acid and the like can be mentioned.
  • the maximum length, maximum width and maximum thickness of the substrate 1 are as described above.
  • the inner diameters of the four capillary single tubes are the same as the inner diameters of the single cylindrical tubes of the present invention, respectively.
  • the maximum length of the sample-analyzing single channel 3x and the sample-introducing one-channel 3y is, for example, in the range of 0.5 to 15 cm.
  • the lengths of the four capillary tubes are determined according to the maximum lengths of the sample analysis capillary channel 3x and the sample introduction capillary channel 3y, respectively.
  • volume of the plurality of fluid reservoirs 2a ⁇ d is not particularly limited, for example, respectively;! In the range of ⁇ 1 000 mm 3, preferably 50 to; in the range of 100 mm 3.
  • the shapes of the plurality of liquid tanks 2a to 2d are cylindrical.
  • the present invention is not limited to this.
  • the shape of the plurality of liquid tanks is not particularly limited as long as it does not hinder the introduction and recovery of a sample to be described later.
  • a quadrangular prism shape, a quadrangular pyramid shape, a conical shape The shape can be any shape such as a combination of these.
  • the volumes and shapes of the plurality of liquid tanks may all be the same or different.
  • microchip electrophoresis apparatus An example of the manufacturing process of the microchip electrophoresis apparatus of this example is shown below.
  • the microchip electrophoresis apparatus may be manufactured by a process other than the following manufacturing process.
  • the substrate 1 is manufactured.
  • a method for forming the four liquid tanks 2a to 2d and the opening (window) 9 on the substrate 1 is not particularly limited.
  • the forming method includes, for example, ultrasonic processing.
  • examples of the forming method include molding methods such as injection molding using a mold, injection molding, press molding, and cutting methods.
  • the four liquid tanks 2a to 2d and the opening (window) 9 may be formed separately or all of them may be formed simultaneously.
  • the four capillary pipes are fitted into the substrate 1.
  • the microchip electrophoresis apparatus of this example can be obtained.
  • the microchip electrophoresis apparatus may further include a plurality of electrodes.
  • FIG. 4 shows a microchip electrophoresis apparatus of this example having the plurality of electrodes.
  • this microchip electrophoresis apparatus has four electrodes 6a to 6d.
  • Each of the four electrodes 6a to 6d is embedded in the substrate 1 so that one end thereof is positioned in the plurality of liquid tanks 2a to 2d.
  • the four electrodes 6a to 6d can be easily arranged by forming introduction holes for the four electrodes 6a to 6d on the side surface of the substrate 1 at the time of manufacturing the substrate 1, for example.
  • the plurality of electrodes are arbitrary constituent members.
  • the plurality of electrodes may be inserted into the plurality of liquid tanks when the microchip electrophoresis apparatus is used.
  • the plurality of electrodes 6a to 6d may be any as long as they can be used for electrophoresis.
  • the plurality of electrodes 6a to 6d are, for example, stainless steel (SUS) electrodes, platinum (Pt) electrodes, gold (Au) electrodes, and the like.
  • the microchip electrophoresis apparatus may further include a pretreatment tank for hemolyzing and diluting a sample containing hemoglobin or the like.
  • the hemolysis treatment of the hemoglobin-containing sample is not particularly limited.
  • the hemoglobin-containing sample may be hemolyzed with a hemolytic agent.
  • the hemolytic agent destroys, for example, the blood cell membrane of the blood cell component in the hemoglobin-containing sample.
  • examples of the hemolytic agent include the running buffer, saponin, and trade name “Triton X-100” manufactured by Nacalai Testa Co., Ltd., and the running buffer is particularly preferable.
  • the pretreatment tank is preferably communicated with the introduction tank, for example.
  • the pretreatment tank may be formed in a suitable place such as a liquid tank in communication with the pretreatment tank, for example, near the second introduction tank 2c.
  • the pretreatment tank When the pretreatment tank is present, the hemoglobin-containing sample is introduced into the pretreatment tank. It is.
  • the hemoglobin-containing sample pretreated is transferred to the second introduction tank 2c by a flow path connecting the pretreatment tank and a liquid tank in communication with the pretreatment tank, for example, the second introduction tank 2c. be introduced.
  • the pretreatment tank may have a configuration in which two tanks, a tank for hemolyzing the hemoglobin-containing sample and a tank for diluting the hemoglobin-containing sample, are communicated with each other.
  • the microchip electrophoresis apparatus may further include an analysis unit.
  • FIG. 5 shows a microchip electrophoresis apparatus of this example having the analysis unit.
  • the same parts as those in FIGS. 3 and 4 are denoted by the same reference numerals.
  • this microchip electrophoresis apparatus has an analysis unit 7.
  • the analysis unit 7 is a detector (line detector).
  • the line detector 3x2 is arranged such that the line detector is positioned closer to the first recovery tank 2b than an intersection between the sample analysis capillary flow path 3x and the sample introduction capillary flow path 3y. Located directly above.
  • a substrate 1 is provided with a cavity for fitting the analysis section (line detector) 7 in addition to the cavity for fitting the four capillary tubes (not shown). ).
  • the line detector includes a light source and a detection unit. The line detector measures the absorbance by emitting light from the light source toward the sample and detecting reflected light from the sample by the detection unit.
  • the analysis unit 7 is not limited to the line detector, and may be anything as long as it can analyze a sample containing hemoglobin, for example.
  • the analysis unit 7 may include a light source disposed below the microchip electrophoresis apparatus and a detection unit disposed at a position corresponding to the position where the line detector is disposed. In this case, the light source power also emits light toward the sample, and the absorbance is measured by detecting the transmitted light from the sample with the detection unit.
  • FIG. 6 shows still another example of the microchip electrophoresis apparatus of the present invention.
  • the microphone chip electrophoresis apparatus of this example has the same configuration as the microchip electrophoresis apparatus shown in FIG. 5 except that the analysis unit 7 is different.
  • the analysis unit 7 may measure absorbance at one point.
  • the analysis method of the present invention using the microchip electrophoresis apparatus shown in Figs. can be carried out as follows on a sample containing hemoglobin.
  • purified water is passed through and washed through the sample analysis single flow channel 3x and the sample introduction single flow channel 3y.
  • the passage time of the purified water and the pressure at the time of the passage are, for example, as described above.
  • a running buffer containing a cathodic group-containing polysaccharide such as chondroitin sulfate is pressurized with a pump or the like to the sample analysis capillary flow path 3x and the sample introduction capillary flow path 3y. Pass the liquid.
  • the time for passing the liquid and the pressure for passing the liquid are, for example, as described above.
  • the running buffer is filled into the sample analysis capillary flow path 3x and the sample introduction capillary flow path 3y by pressure or capillary action.
  • a hemoglobin-containing sample is introduced into the second introduction tank 2c.
  • the hemoglobin-containing sample is as described above.
  • the microchip electrophoresis apparatus has the pretreatment tank (not shown)
  • the hemoglobin-containing sample is introduced into the pretreatment tank and pretreated there.
  • a voltage is applied to the electrode 6c and the electrode 6d to generate a potential difference between both ends of the sample introduction chiral flow path 3y.
  • the hemoglobin-containing sample is introduced into the sample introduction flow path 3y.
  • the introduced hemoglobin is combined with the cathodic group-containing polysaccharide in the running buffer to form a complex.
  • an electroosmotic flow is generated in the running buffer in the sample introduction capillary flow passage 3y, and the complex is formed between the sample analysis capillary flow passage 3x and the sample introduction capillary flow passage 3y.
  • the potential difference between the electrode 6c and the electrode 6d is, for example, in the range of 0.5 to 5 kV.
  • a voltage is applied to the electrode 6a and the electrode 6b to generate a potential difference across the sample analysis capillary channel 3x.
  • the arrows in FIGS. As shown, before The sample 8 is moved to the first recovery tank 2b side from the intersection of the sample analysis first flow passage 3 ⁇ and the sample introduction first flow passage 3y.
  • the potential difference between the electrode 6a and the electrode 6b is, for example, in the range of 0.5 to 5 kV.
  • each component in the hemoglobin-containing sample separated by the difference in moving speed is detected by the detector 7. Thereby, each component in the hemoglobin-containing sample can be separated and analyzed.
  • a fused silica-made single tube (total length 32 cm, effective length 8.5 cm, inner diameter 50 111) having a cathodic layer formed by covalently fixing a silylating agent having a sulfone group on the inner wall was prepared.
  • Purified water was allowed to pass through this single pipe at a pressure of 0 ⁇ lMPa (lOOOmbar) for 20 minutes for washing.
  • a running buffer ( ⁇ 5 ⁇ 5) in which chondroitin sulfate was added to lOOmM malic acid and arginic acid aqueous solution at a ratio of 0.5% by weight was prepared.
  • the running buffer was passed through the one capillary tube at the same pressure as described above.
  • a sample prepared by dissolving hemoglobin in purified water in a state where the above-mentioned capillary tube was filled with a running buffer was injected into the above-mentioned vial tube, and both ends of the above-mentioned capillary tube were applied at 10 kV for electrophoresis.
  • the hemoglobin-containing sample was injected from the anode side of the capillary tube.
  • the migrated hemoglobin was detected at an absorbance of 415 nm.
  • the result is shown in the chart of FIG.
  • normal hemoglobin (HbAO) and glycated hemoglobin (HbAlc) could be separated and detected.
  • the single pipe used in this example can be analyzed immediately after washing.
  • the analyzer can be downsized.
  • the present invention can be applied to all fields for analyzing samples such as hemoglobin for clinical examination, biochemical examination, medical research, etc., and its use is not limited and can be applied to a wide range of fields.

Description

明 細 書
キヤピラリー電気泳動法による試料の分析方法
技術分野
[0001] 本発明は、キヤビラリ一電気泳動法による試料の分析方法、それに用いるキヤビラリ 一管およびキヤピラリー電気泳動装置に関する。
背景技術
[0002] キヤビラリ一電気泳動法では、キヤビラリ一管内壁に集合したイオン力 S、印加によつ て移動することで電気浸透流が生じ、これにより試料が移動して電気泳動が行われる 。キヤビラリ一管としては、溶融シリカ製のキヤビラリ一管が使用されている力 これは 、試料の吸着により良好な電気浸透流が得られない場合がある。このため、キヤビラリ 一管内壁を被覆する技術が提案されている（特許文献 1、 2、 3、 4)。一方、血液中の ヘモグロビン（Hb)は、血液中のグルコースと反応して糖化 Hbとなる。血液中の糖化 Hbは、生体内血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病の診断や治療等に おける指標とされており、中でも、 /3鎖 N末端のパリンが糖化したものは、へモグロビ ン Alc (HbAlc)と呼ばれ、特に重要な指標として、臨床検査等で、その測定が実施 されている。血液中のヘモグロビンの測定方法は、例えば、ァガロース電気泳動法、 キヤビラリ一電気泳動法、 HPLC法、免疫法、酵素法等がある。これらの中で、へモ グロビンの遺伝的変異等の微小な変異が検出できるのは、キヤピラリー電気泳動法と HPLC法である。一方、ヘモグロビンの分析装置に対しては、小型化が求められてい る。この点に関し、 HPLC法は、装置全体の小型化が困難である。これに対し、キヤ ピラリー電気泳動法では、マイクロチップ化することで、装置全体を小型化することが 可能である。
[0003] しかしながら、前述の従来のキヤビラリ一電気泳動法では、ヘモグロビンを高精度で 分析できないという問題がある。この問題を解決するために、キヤビラリ一管内壁を、 タンパク質で被覆し、さらにこの上を多糖類で被覆するという技術がある（特許文献 5 )。しかしながら、この技術では、分析の度に、キヤビラリ一管内壁をタンパク質で被覆 する操作が必要であり、分析が煩雑になるという問題がある。一方、キヤビラリ一管内 壁を被覆せずに、双性イオン性タイプのランニングバッファーに脂肪族ジァミン等の 流れ阻害剤を含有させてキヤビラリ一電気泳動するという方法がある（特許文献 6)。 しかしながら、この方法では、変異ヘモグロビンは分離できても、ヘモグロビン Aleは 分離できないという問題がある。これらの問題は、ヘモグロビンに限らず、その他の試 料におけるキヤピラリー電気泳動法全般の問題である。
[0004] 特許文献 1：特開 2005— 291926号公報
特許文献 2：特開平 4 320957号公報
特許文献 3：特表平 5— 503989号公報
特許文献 4：特表平 8— 504037号公報
特許文献 5：特開平 9 105739号公報
特許文献 6：特開 2006— 145537号公報
発明の開示
[0005] そこで、本発明の目的は、装置の小型化が可能であり、分析精度が高ぐ容易に実 施することが可能なキヤビラリ一電気泳動法による試料の分析方法、それに用いるキ ャピラリー管およびキヤピラリー電気泳動装置を提供することである。
[0006] 前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、キヤビラリ一電気泳動法による 試料の分析方法であって、
前記キヤビラリ一電気泳動法に用いるキヤビラリ一管を準備する工程と、
前記キヤビラリ一管中において、試料と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を 電気泳動する工程とを含み、
前記キヤビラリ一管が、前記キヤビラリ一管内壁に、陰極性基含有化合物から形成さ れた陰極性層が積層されたキヤビラリ一管であり、前記陰極性層は共有結合により前 記キヤビラリ一管内壁に固定されていることを特徴とする。
[0007] 本発明のキヤビラリ一管は、前記本発明の分析方法に使用するキヤピラリー電気泳 動用のキヤビラリ一管であって、前記キヤビラリ一管内壁に、陰極性基含有化合物か ら形成された陰極性層が積層され、前記陰極性層が共有結合で前記キヤビラリ一管 内壁に固定されていることを特徴とする。
[0008] 本発明のキヤピラリー電気泳動装置は、前記本発明の分析方法に使用するキヤピ ラリー電気泳動装置であって、前記本発明のキヤビラリ一管を含むことを特徴とする。 本発明のキヤビラリ一電気泳動装置は、後述のように、小型化（マイクロチップ化）さ れたマイクロチップ電気泳動装置であってもよ!/、。
[0009] 本発明の分析方法では、キヤビラリ一管内壁に共有結合で固定された陰極性層が 形成されているキヤビラリ一管を使用するため、ヘモグロビン等の血液試料中のタン ノ ク質等のキヤビラリ一管内壁への吸着を防止でき、これにより、良好な電気浸透流 を生じさせること力 S可能である。また、本発明の分析方法では、試料と陰極性基含有 化合物とを結合させて複合体を生成し、これを電気泳動するため、試料単独で電気 泳動するよりも分離効率が高くなる。これらのことから、本発明の分析方法によれば、 短時間かつ高精度でヘモグロビン等の試料の分析が実施できる。また、前記陰極性 層は、キヤビラリ一管内壁に強固に固定されているため、一度形成してしまえば、洗 浄しても容易に剥離することが無ぐ繰り返し使用可能である。このため、本発明の分 析方法では、一度陰極性層を形成すれば、分析の度に陰極性層を形成する必要が ないため、容易に分析を実施することができる。また、本発明では、キヤピラリー電気 泳動法を採用しているため、分析装置を小型化することが可能である。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]図 1は、本発明の一実施例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートで ある。
[図 2]図 2は、本発明のその他の実施例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチヤ ートである。
[図 3]図 3は、本発明のキヤビラリ一電気泳動装置の一例の構成を示す図である。図 3 (A)は、この例のキヤピラリー電気泳動装置の平面図であり、図 3 (B)は、図 3 (A)の I —Iにおける断面図であり、図 3 (C)は、図 3 (A)の II— IIにおける断面図である。
[図 4]図 4は、本発明のキヤピラリー電気泳動装置のその他の例の構成を示す図であ
[図 5]図 5は、本発明のキヤピラリー電気泳動装置のさらにその他の例の構成を示す 図である。
[図 6]図 6は、本発明のキヤピラリー電気泳動装置のさらにその他の例の構成を示す 図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明において、前記ランニングバッファーとは、実際の分離工程に使用する緩衝 液 (バッファー）をいう。本発明の分析方法の前記キヤビラリ一管において、陰極性基 含有化合物を含むランニングバッファーに試料を添加し、ついで、キヤビラリ一管の 両端を印加して、前記試料と陰極性基含有化合物との複合体を電気泳動することが 好ましい。
[0012] 本発明の分析方法およびキヤビラリ一管において、前記試料と複合体を形成する 前記陰極性基含有化合物としては、陰極性基含有多糖類が好ましい。前記陰極性 基含有多糖類としては、例えば、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸 化多糖類およびリン酸化多糖類があり、このなかで、硫酸化多糖類およびカルボン 酸化多糖類が好ましい。前記硫酸化多糖類としては、コンドロイチン硫酸、へパリン 等が好ましぐより好ましくは、コンドロイチン硫酸である。前記カルボン酸化多糖類と しては、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）が好ましい。コンドロ ィチン硫酸は、 A、 B、 C、 D、 E、 H、 Kの七種類があり、いずれを用いてもよい。
[0013] 本発明の分析方法およびキヤビラリ一管の前記陰極性層を形成する前記陰極性基 含有化合物において、前記陰極性基は、スルホン基およびカルボキシル基の少なく とも一方であることが好ましレ、。
[0014] 本発明にお!/、て、前記試料は、ヘモグロビンを含む試料が好まし!/、。
[0015] 本発明のキヤピラリー電気泳動装置において、基板と、複数の液槽と、キヤビラリ一 管とを含み、前記基板上に、前記複数の液槽が形成され、前記複数の液槽が、前記 キヤビラリ一管で連通され、前記キヤビラリ一管が前記本発明のキヤビラリ一管であつ てもよい。この場合において、前記基板の最大長さは、例えば、 10〜； 100mmの範囲 であり、好ましくは、 30〜 70mmの範囲であり、前記基板の最大幅は、例えば、 10〜 60mmの範囲であり、前記基板の最大厚みは、例えば、 0. 3〜5mmの範囲である。 なお、前記基板の最大長さとは、前記基板の長手方向の最長部の長さであり、前記 基板の最大幅とは、前記基板の前記長手方向とは垂直な方向（幅方向）の最長部の 長さであり、前記基板の最大厚みとは、前記基板の前記長手方向および前記幅方向 の両方に垂直な方向（厚み方向）の最長部の長さである。このように、本発明のキヤピ ラリー電気泳動装置は、小型化（マイクロチップ化）されたマイクロチップ電気泳動装 置であってもよい。
[0016] つぎに、本発明を詳しく説明する。
[0017] 前述のように、本発明に力、かるキヤビラリ一管は、その内壁に前記陰極性層が形成 されている。
[0018] 前記キヤビラリ一管の材質は、特に制限されず、例えば、ガラス、溶融シリカ、プラス チック等があげられる。ガラス製、溶融シリカ製のキヤビラリ一管の内壁は、通常、陰 性の電荷を有する状態である。プラスチック製のキヤビラリ一管内壁は、プラスチック 中の極性基の有無や種類により、陽性もしくは陰性の電荷を有する状態であり、また は無電荷（無極性）の状態である。また、極性基を持たないプラスチックであっても、 極性基を導入することにより、電荷を有する状態にすることができる。前記プラスチッ ク製のキヤビラリ一管としては、市販品を使用してもよぐ例えば、ポリメチルメタクリレ ート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテトラフノレ才ロエチレン（PTF E)、ポリエーテルエーテルケトン (PEEK)等から形成されたキヤビラリ一管があげら れる。前記キヤビラリ一管の内径は、例えば、 10〜200 111の範囲、好ましくは、 25 〜； 100〃 mの範囲である。前記キヤビラリ一管の長さは、例えば、 10〜； 1000mmの 範囲である。
[0019] 前記陰極性基含有化合物による前記キヤビラリ一管内壁への前記陰極性層の形 成は、例えば、前記陰極性基および反応基を含む化合物を用いればよい。前記キヤ ビラリ一管が、ガラス製若しくは溶融シリカ製である場合は、陰極性基およびケィ素を 有する化合物（シリル化剤）を使用することができる。前記陰極性基としては、スルホ ン基およびカルボキシル基の少なくとも一方が好ましいのは、前述のとおりである。
[0020] 前記シリル化剤は、例えば、 2—（4 クロロスルフォユルフェニル）ェチルトリメトキシ シラン、 2—（4 クロロスルフォユルフェニル）ェチルトリクロロシラン等がある。
[0021] 前記シリル化剤において、ケィ素原子をチタン若しくはジルコニウムに置換したもの を用いてもよい。前記シリル化剤は、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上 で併用してもよい。 [0022] 前記シリル化剤を用いた陰極性層の形成は、例えば、つぎのようにして実施する。 まず、シリル化剤を有機溶媒に溶解若しくは分散させて処理液を調製する。前記処 理液の調製に使用する前記有機溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、トルエン等が 使用できる。前記処理液のシリル化剤の濃度は特に制限されない。この処理液を、ガ ラス製若しくは溶融シリカ製のキヤビラリ一管に通液し、加熱する。この加熱によって、 前記シリル化剤が前記キヤビラリ一管内壁に共有結合で結合し、その結果、陰極性 基が前記キヤビラリ一管内壁に配置されることになる。その後、有機溶媒 (ジクロ口メタ ン、メタノール、アセトン等）、酸性溶液（リン酸等）、アルカリ性溶液および界面活性 剤溶液の少なくとも一つで洗浄 (後処理)する。なお、この洗浄は任意であるが、実施 すること力 S好ましい。前記シリル化剤により陰極性層が形成されたキヤビラリ一管は、 市販品を使用してもよい。
[0023] 前記ランニングバッファ一は、特に制限されないが、酸を用いたバッファーが好まし い。前記酸は、例えば、マレイン酸、酒石酸、こはく酸、フマル酸、フタル酸、マロン酸 、リンゴ酸がある。また、前記ランニングバッファ一は、弱塩基を含むことが好ましい。 前記弱塩基としては、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリス等がある。前記ラ ンユングバッファーの pHは、例えば、 ρΗ4· 5〜6の範囲である。前記ランニングバッ ファーのバッファーの種類は、 MES、 ADA, ACES, BES、 MOPS, TES、 HEPE S等がある。前記ランニングバッファーにおいて、前記試料と複合体を形成する前記 陰極性基含有化合物の濃度は、例えば、 0. 0；!〜 5重量％の範囲である。
[0024] つぎに、本発明の分析方法は、例えば、ヘモグロビンを含む試料に対し、つぎのよ うにして実施できる。
[0025] まず、ガラス製若しくは溶融シリカ製のキヤビラリ一管を準備する。このキヤビラリ一 管の内壁には、陰極性基含有化合物が共有結合で固定されている。このキヤビラリ 一管に、精製水を通液して洗浄する。前記精製水の通液時間は、例えば、；!〜 10分 間であり、前記通液時の圧力は、例えば、 0. 05—0. IMPaである。つぎに、コンドロ ィチン硫酸等の陰極性基含有多糖類を含むランニングバッファーを前記キヤビラリ一 管に、ポンプ等により圧力をかけて通液する。この通液の時間は、例えば、 10〜60 分間であり、通液の圧力は、例えば、 0. 05-0. IMPaである。前記キヤビラリ一管 に前記ランニングバッファーが充填された状態で、ヘモグロビン含有試料を前記キヤ ビラリ一管に導入し、前記キヤビラリ一管の両端を印加して、電気泳動を行う。前記へ モグロビン含有試料は、特に制限されず、例えば、全血を溶血処理した試料があげ られ、また、この試料を精製水やランニングバッファーで希釈してもよい。前記へモグ ロビン含有試料の導入は、前記キヤビラリ一管の陽極側から行う。導入されたへモグ ロビンは、前記ランニングバッファ一中の陰極性基含有多糖類と結合して複合体とな る。印加により、前記キヤビラリ一管内のランニングバッファーにおいて電気浸透流が 生じ、前記複合体がキヤビラリ一管の陰極側に向かって移動する。前記印加の程度 は、例えば、 10〜30kVである。この移動を、光学的手法により検出する。光学的手 法による検出は、特に制限されないが、 415nmの波長で行うことが好ましい。
[0026] 本発明において、分析対象となるヘモグロビンは、特に制限されず、例えば、正常 ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン（例えば、 HbAlc、不安定型 HbAlc、 GHbLys等） 、遺伝的変異型ヘモグロビン等がある。本発明では、 HbAlcと、これ以外のへモグロ ビンとを分離して分析することが可能である。
[0027] つぎに、本発明のキヤピラリー電気泳動装置について例を挙げて説明する。ただし 、本発明のキヤピラリー電気泳動装置は、下記の例に限定されない。
[0028] 図 3に、本発明のキヤビラリ一電気泳動装置の一例を示す。図 3 (A)は、この例のキ ャピラリー電気泳動装置の平面図であり、図 3 (B)は、図 3 (A)の I Iにおける断面図 であり、図 3 (C)は、図 3 (A)の II— IIにおける断面図である。また、同図において、分 力、りやすくするために、各構成要素の大きさや比率等は、実際と異なっている。この 例のキヤビラリ一電気泳動装置は、小型化（マイクロチップ化）されたマイクロチップ電 気泳動装置である。図示のように、このマイクロチップ電気泳動装置は、基板 1と、複 数（この例では 4つ）の液槽 2a〜dと、 4本のキヤビラリ一管 3x1、 3x2、 3ylおよび 3y 2とを含む。前記 4本のキヤビラリ一管は、全て前記本発明のキヤビラリ一管である。前 記 4つの液槽 2a〜dは、第 1の導入槽 2a、第 1の回収槽 2b、第 2の導入槽 2cおよび 第 2の回収槽 2dを含む。前記 4本のキヤビラリ一管は、そのそれぞれの一端力 中心 部 cで集合し、十字状に連結している。この結果、前記 4本のキヤビラリ一管は、その 内部が連通されている。前記基板 1には、前記 4本のキヤビラリ一管をはめ込むため の空洞が設けられている（図示せず)。前記キヤビラリ一管 3x1は、その他端が、前記 第 1の導入槽 2aの底面に位置するように、前記基板 1中にはめ込まれている。前記キ ャピラリー管 3x2は、その他端が、前記第 1の回収槽 2bの底面に位置するように、前 記基板 1中にはめ込まれている。前記キヤビラリ一管 3x1および 3x2は、試料分析用 のキヤビラリ一流路 3xとなっている。前記キヤビラリ一管 3ylは、その他端が、前記第 2の導入槽 2cの底面に位置するように、前記基板 1中にはめ込まれている。前記キヤ ビラリ一管 3y2は、その他端が、前記第 2の回収槽 2dの底面に位置するように、前記 基板 1中にはめ込まれている。前記キヤビラリ一管 3ylおよび 3y2は、試料導入用の キヤビラリ一流路 3yとなっている。前記複数の液槽 2a〜dは、それぞれ、前記基板 1 上に凹部として形成されている。前記基板 1は、前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yより第 1の回収槽 2b側に直方体状の開口部（窓） 9を有する。なお、この例のマイク 口チップ電気泳動装置は、直方体状である。ただし、本発明は、これに限定されない 。本発明のマイクロチップ電気泳動装置は、電気泳動測定に支障をきたさなければ、 いかなる形状であってもよい。また、この例のマイクロチップ電気泳動装置の平面形 状は、長方形である。ただし、本発明は、これに限定されない。本発明のマイクロチッ プ電気泳動装置の平面形状は、例えば、正方形やその他の形状であってもよい。そ して、この例のマイクロチップ電気泳動装置では、前記試料分析用のキヤビラリ一流 路 3xと前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yの最大長さは、異なっている。ただし、 本発明は、これに限定されない。本発明のマイクロチップ電気泳動装置において、前 記試料分析用のキヤビラリ一流路 3xと前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yの最大 長さは、同じであってもよい。これら以外においても、本発明のマイクロチップ電気泳 動装置の構成は、この例に限定されない。
[0029] つぎに、この例のマイクロチップ電気泳動装置の製造方法につ!/、て説明する。ただ し、前記マイクロチップ電気泳動チップは、下記の製造方法以外の方法で製造され てもよい。
[0030] この例のマイクロチップ電気泳動装置においては、前記基板 1として、例えば、ガラ ス、ポリマー材料等から形成されたものが使用できる。前記ガラス材料としては、例え ば、合成石英ガラス、ホウケィ酸ガラス等が挙げられる。前記ポリマー材料としては、 例えば、ポリメチルメタタリレート（PMMA)、シクロォレフインポリマー（COP)、ポリ力 ーボネート（PC)、ポリジメチルシロキサン（PDMS)、ポリスチレン（PS)、ポリ乳酸等 が挙げられる。
[0031] この例のマイクロチップ電気泳動装置において、前記基板 1の最大長さ、最大幅お よび最大厚みは、前述のとおりである。
[0032] 前記 4本のキヤビラリ一管の内径は、それぞれ、前記本発明のキヤビラリ一管の内 径のとおりである。前記試料分析用のキヤビラリ一流路 3xおよび前記試料導入用の キヤビラリ一流路 3yの最大長さは、例えば、 0. 5〜； 15cmの範囲である。前記 4本の キヤビラリ一管の長さは、それぞれ、前記試料分析用のキヤビラリ一流路 3xおよび前 記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yの最大長さに従って決定される。
[0033] 前記複数の液槽 2a〜dの容積は、特に制限されないが、例えば、それぞれ、；!〜 1 000mm3の範囲であり、好ましくは、 50〜； 100mm3の範囲である。図 3においては、 前記複数の液槽 2a〜dの形状は、円柱状である。ただし、本発明は、これに限定され ない。本発明のマイクロチップ電気泳動装置において、前記複数の液槽の形状は、 後述の試料の導入および回収に支障のないものであれば特に制限されず、例えば、 四角柱状、四角錘状、円錐状、これらを組み合わせた形状等、任意の形状とすること 力 Sできる。また、前記複数の液槽の容積および形状は、全て同じであってもよいし、 それぞれ異なってもよい。
[0034] この例のマイクロチップ電気泳動装置の製造工程の一例を、下記に示す。ただし、 前記マイクロチップ電気泳動装置は、下記の製造工程以外の工程で製造されてもよ い。
[0035] まず、前記基板 1を作製する。前記基板 1への前記 4つの液槽 2a〜dおよび前記開 口部（窓） 9の形成方法は、特に制限されない。例えば、前記基板 1の材質が前記ガ ラスの場合、前記形成方法としては、例えば、超音波加工等が挙げられる。例えば、 前記基板 1の材質が前記ポリマー材料の場合、前記形成方法としては、例えば、金 型を用いた射出成型、注入成型、プレス成型等の成型法や切削加工法等が挙げら れる。前記 4つの液槽 2a〜dおよび前記開口部（窓） 9は、それぞれ別個に形成して もよいし、全てを同時に形成してもよい。前記 4つの液槽 2a〜dおよび前記開口部（ 窓） 9を別個に形成する場合には、どの順序で形成してもよい。前記金型を用いた方 法等により、前記 4つの液槽 2a〜dおよび前記開口部（窓） 9の全てを同時に形成す ること力 工程が少なくてすみ、好ましい。
[0036] つぎに、前記 4本のキヤビラリ一管を、前記基板 1にはめ込む。このようにして、この 例のマイクロチップ電気泳動装置を得ることができる。
[0037] 前記マイクロチップ電気泳動装置は、さらに、複数の電極を有してもよい。図 4に、 前記複数の電極を有するこの例のマイクロチップ電気泳動装置を示す。同図におい て、図 3と同一部分には、同一符号を付している。図示のように、このマイクロチップ電 気泳動装置は、 4本の電極 6a〜dを有する。前記 4本の電極 6a〜dは、それぞれ、そ の一端が前記複数の液槽 2a〜d内に位置するように、前記基板 1に埋め込まれてい る。前記 4本の電極 6a〜dは、例えば、前記基板 1の製造時に、前記 4本の電極 6a〜 dの導入孔を前記基板 1側面に形成しておくことで、容易に配置することができる。な お、前記マイクロチップ電気泳動装置において、前記複数の電極は、任意の構成部 材である。前記複数の電極は、例えば、前記マイクロチップ電気泳動装置の使用時 に、前記複数の液槽内に挿入してもよい。
[0038] 前記複数の電極 6a〜dは、電気泳動法に使用可能なものであればいかなるもので あってもよい。前記複数の電極 6a〜dは、例えば、それぞれ、ステンレス鋼（SUS)製 電極、白金（Pt)電極、金 (Au)電極等である。
[0039] 前記マイクロチップ電気泳動装置は、さらに、ヘモグロビン等を含む試料を溶血さ せ、且つ希釈するための前処理槽を含んでいてもよい。前記ヘモグロビン含有試料 の溶血処理は、特に制限されないが、例えば、前記ヘモグロビン含有試料を溶血剤 で溶血させる処理であってもよい。前記溶血剤は、例えば、前記ヘモグロビン含有試 料中の血球成分の血球膜を破壊する。前記溶血剤としては、例えば、前記ランニン グバッファー、サポニン、ナカライテスタ (株)製の商品名「Triton X— 100」等が挙 げられ、特に好ましくは、前記ランニングバッファーである。前記前処理槽は、例えば 、前記導入槽と連通されていることが好ましい。前記前処理槽は、それが連通される 液槽、例えば、前記第 2の導入槽 2cの近くなど、適当な場所に形成すればよい。前 記前処理槽がある場合には、前記ヘモグロビン含有試料は、前記前処理槽に導入さ れる。これにより前処理された前記ヘモグロビン含有試料は、前記前処理槽とそれが 連通される液槽、例えば、前記第 2の導入槽 2cとを結ぶ流路により、前記第 2の導入 槽 2cへと導入される。前記前処理槽は、前記ヘモグロビン含有試料を溶血させるた めの槽と前記ヘモグロビン含有試料を希釈するための槽との 2つの槽が連通された 構成であってもよい。
[0040] 前記マイクロチップ電気泳動装置は、さらに、分析部を有してもよい。図 5に、前記 分析部を有するこの例のマイクロチップ電気泳動装置を示す。同図において、図 3お よび 4と同一部分には、同一符号を付している。図示のように、このマイクロチップ電 気泳動装置は、分析部 7を有する。この例のマイクロチップ電気泳動装置においては 、前記分析部 7が、検出器 (ライン検出器)である。前記ライン検出器は、前記試料分 析用のキヤビラリ一流路 3xと前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yとの交差部分より 前記第 1の回収槽 2b側に位置するように、前記キヤビラリ一管 3x2上に直接配置され ている。このマイクロチップ電気泳動装置では、基板 1に、前記 4本のキヤビラリ一管 をはめ込むための空洞に加え、前記分析部（ライン検出器） 7をはめ込むための空洞 が設けられている（図示せず)。前記ライン検出器は、光源および検出部を内蔵する 。前記ライン検出器は、前記光源から試料に向けて光を発し、試料からの反射光を 前記検出部で検出することで、吸光度を測定する。前記分析部 7は、前記ライン検出 器に限定されず、例えば、ヘモグロビンを含む試料の分析を行えるものであれば、い かなるものであってもよい。例えば、前記分析部 7は、前記マイクロチップ電気泳動装 置の下方に配置された光源と、前記ライン検出器の配置箇所に対応する位置に配置 された検出部とで構成されていてもよい。この場合には、前記光源力も試料に向けて 光を発し、試料からの透過光を前記検出部で検出することで、吸光度を測定する。
[0041] 図 6に、本発明のマイクロチップ電気泳動装置のさらにその他の例を示す。同図に おいて、図 5と同一部分には、同一符号を付している。図示のとおり、この例のマイク 口チップ電気泳動装置は、分析部 7が異なること以外、図 5に示したマイクロチップ電 気泳動装置と同様の構成である。この例のように、前記分析部 7は、 1点で吸光度を 測定するものであってもよレ、。
[0042] 図 5および 6に示したマイクロチップ電気泳動装置を用いた本発明の分析方法は、 例えば、ヘモグロビンを含む試料に対し、つぎのようにして実施できる。
[0043] まず、前記試料分析用のキヤビラリ一流路 3xおよび前記試料導入用のキヤビラリ一 流路 3yに、精製水を通液して洗浄する。前記精製水の通液時間および前記通液時 の圧力は、例えば、前述のとおりである。つぎに、コンドロイチン硫酸等の陰極性基含 有多糖類を含むランニングバッファーを、前記試料分析用のキヤビラリ一流路 3xおよ び前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yに、ポンプ等で圧力をかけて通液する。こ の通液の時間および通液の圧力は、例えば、前述のとおりである。ついで、前記試料 分析用のキヤビラリ一流路 3xおよび前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yに、前記 ランニングバッファーを、圧力または毛細管作用によって充填する。
[0044] なお、マイクロチップ電気泳動装置非使用時 (非分析時）において、あらかじめ前記 ランニングバッファーの充填工程までが完了していれば、前述の各工程を省略し、た だちに以下の工程に移ることが可能であるため好ましい。
[0045] つぎに、前記第 2の導入槽 2cにヘモグロビン含有試料を導入する。前記へモグロビ ン含有試料としては、前述のとおりである。マイクロチップ電気泳動装置が、前記前処 理槽（図示せず）を有する場合には、前記ヘモグロビン含有試料を、前記前処理槽 に導入し、そこで前処理する。ついで、前記電極 6cおよび前記電極 6dに電圧を印加 して、前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yの両端に電位差を生じさせる。これによ り、前記ヘモグロビン含有試料を、前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yに導入する 。導入されたヘモグロビンは、前記ランニングバッファ一中の陰極性基含有多糖類と 結合して複合体となる。印加により、前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3y内のラン ユングバッファーにおいて電気浸透流が生じ、前記複合体が前記試料分析用のキヤ ビラリ一流路 3xと前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yとの交差部分まで移動する
〇
[0046] 前記電極 6cと前記電極 6dとの間の電位差は、例えば、 0. 5〜5kVの範囲である。
[0047] つぎに、前記電極 6aおよび前記電極 6bに電圧を印加して、前記試料分析用のキ ャピラリー流路 3xの両端に電位差を生じさせる。このように、両端に電位差があるキヤ ビラリ一流路を、前記試料導入用のキヤビラリ一流路 3yから前記試料分析用のキヤピ ラリー流路 3xに瞬間的に切り替えることにより、図 5および 6に矢印で示すように、前 記試料 8を、前記試料分析用のキヤビラリ一流路 3χと前記試料導入用のキヤビラリ一 流路 3yとの交差部分から、前記第 1の回収槽 2b側に移動させる。
[0048] 前記電極 6aと前記電極 6bとの間の電位差は、例えば、 0. 5〜5kVの範囲である。
[0049] つぎに、前記検出器 7により、移動速度の差により分離された前記ヘモグロビン含 有試料中の各成分を検出する。これにより、前記ヘモグロビン含有試料中の各成分 を分離して分析することが可能である。
実施例
[0050] つぎに、本発明の実施例について説明する。
[0051] (実施例 1)
内壁にスルホン基を有するシリル化剤が共有結合で固定されて形成された陰極性 層を有する溶融シリカ製のキヤビラリ一管（全長 32cm、有効長 8. 5cm、内径 50 111 )を準備した。このキヤビラリ一管に、精製水を圧力 0· lMPa (lOOOmbar)で 20分間 通液して洗浄した。つぎに、 lOOmMリンゴ酸とアルギニン酸水溶液に、 0. 5重量％ の割合でコンドロイチン硫酸を添加したランニングバッファー（ρΗ5· 5)を準備した。 このランニングバッファーを、前記キヤビラリ一管に、前記と同じ圧力で通液した。前 記キヤビラリ一管内にランニングバッファーが充填された状態で、ヘモグロビンを精製 水に溶解した試料を前記キヤビラリ一管内に注入し、前記キヤビラリ一管の両端を 10 kVで印加し電気泳動を行った。前記ヘモグロビン含有試料の注入は、前記キヤビラ リー管の陽極側から行った。移動したヘモグロビンを、 415nmの吸光度で検出した。 この結果を、図 1のチャートに示す。図示のように、本実施例において、正常へモグロ ビン (HbAO)と糖化ヘモグロビン (HbAlc)を分離して検出することができた。また、 本実施例で用いたキヤビラリ一管は、洗浄した後、直ぐに分析可能となった。
[0052] (実施例 2)
内壁にカルボキシル基を有するシリル化剤が共有結合で固定されて形成された陰 極性層を有する溶融シリカ製のキヤビラリ一管（全長 32cm、有効長 8. 5cm、内径 50 m)を用いた以外は、実施例 1と同様にしてキヤピラリー電気泳動を行ってへモグロ ビンを分析した。この結果を、図 2のチャートに示す。図示のように、本実施例におい て、正常ヘモグロビン（HbAO)と糖化ヘモグロビン（HbAlc)を分離して検出すること ができた。また、本実施例で用いたキヤビラリ一管は、洗浄した後、直ぐに分析可能と なった。
産業上の利用可能性
以上のように、本発明によれば、キヤビラリ一電気泳動法により、ヘモグロビン等の 試料の分析を、容易かつ高精度で実施可能である。しかも、本発明は、キヤビラリ一 電気泳動法を採用しているため、分析装置を小型化することも可能である。本発明は 、臨床検査、生化学検査、医学研究等のヘモグロビン等の試料を分析する全ての分 野に適用することができ、その用途は限定されず、広い分野に適用可能である。

Claims

請求の範囲
[1] キヤビラリ一電気泳動法による試料の分析方法であって、
前記キヤビラリ一電気泳動法に用いるキヤビラリ一管を準備する工程と、
前記キヤビラリ一管中において、試料と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を 電気泳動する工程とを含み、
前記キヤビラリ一管が、前記キヤビラリ一管内壁に、陰極性基含有化合物から形成さ れた陰極性層が積層されたキヤビラリ一管であり、前記陰極性層は共有結合により前 記キヤビラリ一管内壁に固定されていることを特徴とする分析方法。
[2] 前記キヤビラリ一管において、陰極性基含有化合物を含むランニングバッファーに試 料を添加し、ついで、キヤビラリ一管の両端を印加して、試料と陰極性基含有化合物 との複合体を電気泳動する請求の範囲 1記載の分析方法。
[3] 前記試料と複合体を形成する前記陰極性基含有化合物が、陰極性基含有多糖類で ある請求の範囲 1記載の分析方法。
[4] 前記陰極性基含有多糖類が、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化 多糖類およびリン酸化多糖類からなる群から選択される少なくとも一つの多糖類であ る請求の範囲 3記載の分析方法。
[5] 前記硫酸化多糖類が、コンドロイチン硫酸である請求の範囲 4記載の分析方法。
[6] 前記陰極性層を形成する前記陰極性基含有化合物において、前記陰極性基が、ス ルホン基およびカルボキシル基の少なくとも一方である請求の範囲 1記載の分析方 法。
[7] 前記試料が、ヘモグロビンを含む試料である請求の範囲 1記載の分析方法。
[8] 請求の範囲 1記載の分析方法に使用するキヤピラリー電気泳動用のキヤビラリ一管で あって、前記キヤビラリ一管内壁に、陰極性基含有化合物から形成された陰極性層 が積層され、前記陰極性層が共有結合で前記キヤビラリ一管内壁に固定されている ことを特徴とするキヤビラリ一管。
[9] 前記試料と複合体を形成する前記陰極性基含有化合物が、陰極性基含有多糖類で ある請求の範囲 8記載のキヤビラリ一管。
[10] 前記陰極性基含有多糖類が、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化 多糖類およびリン酸化多糖類からなる群から選択される少なくとも一つの多糖類であ る請求の範囲 9記載のキヤビラリ一管。
[11] 前記硫酸化多糖類が、コンドロイチン硫酸である請求の範囲 10記載のキヤビラリ一 管。
[12] 前記陰極性層を形成する前記陰極性基含有化合物において、前記陰極性基が、ス ルホン基およびカルボキシル基の少なくとも一方である請求の範囲 8記載のキヤビラ リー管。
[13] 請求の範囲 1記載の分析方法に使用するキヤビラリ一電気泳動装置であって、請求 の範囲 8記載のキヤビラリ一管を含むことを特徴とするキヤビラリ一電気泳動装置。
[14] 基板と、複数の液槽と、キヤビラリ一管とを含み、前記基板上に、前記複数の液槽が 形成され、前記複数の液槽が、前記キヤビラリ一管で連通され、前記キヤビラリ一管 が請求の範囲 8記載のキヤビラリ一管である請求の範囲 13記載のキヤピラリー電気 泳動装置。
[15] 前記基板の最大長さが、 10〜； 100mmの範囲であり、前記基板の最大幅が、 10〜6 Ommの範囲であり、前記基板の最大厚みが、 0. 3〜5mmの範囲である請求の範囲 14記載のキヤピラリー電気泳動装置。
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