WO2011152699A2 - Early diagnosis of parkinson's disease - Google Patents
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Abstract
The invention relates to a method for the early diagnosis of Parkinson's disease in individuals, long before the damage becomes irreversible. The invention is based on the study of the formation of dopamine quinones and the detection, by cyclic voltamperometry, of oxidised metabolites of the dopamine in the plasma of patients showing very early symptoms. The detection can be carried out by electrochemical or immunochemical methods.
Description
DIAGNOSTICO TEMPRANO DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON EARLY DIAGNOSIS OF PARKINSON'S DISEASE
CAMPO DE LA INVENCIÓN FIELD OF THE INVENTION
La presente invención se refiere al campo de los métodos de diagnósticos electroquímicos que puede ser voltamétrico y también inmunológicos para detección de una molécula específica en muestras biológicas. La presente invención también pertenece al campo de los métodos de diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas a partir de moléculas detectables en muestras biológicas, especialmente en suero o plasma sanguíneo. The present invention relates to the field of electrochemical diagnostic methods that can be voltammetric and also immunological for the detection of a specific molecule in biological samples. The present invention also belongs to the field of diagnostic methods of neurodegenerative diseases from detectable molecules in biological samples, especially in serum or blood plasma.
OBJETO DE LA INVENCIÓN OBJECT OF THE INVENTION
Proveer de una prueba de laboratorio que permita realizar un diagnóstico temprano de la enfermedad de Parkinson antes de que el paciente presente síntomas clínicos de la enfermedad. Provide a laboratory test that allows an early diagnosis of Parkinson's disease before the patient has clinical symptoms of the disease.
Concretamente, la invención tiene como objetivo proveer de una prueba de detección de quinonas de dopamina en plasma sanguíneo, que permita realizar un diagnóstico temprano de la enfermedad de Parkinson antes de que el paciente presente síntomas clínicos de la enfermedad. Una modalidad de la invención consiste en proveer de un método voltamperométrico para la detección de quinonas de dopamina en muestras de plasma sanguíneo.
Una modalidad más de la invención consiste en proveer de un método de detección inmunológica de quinonas de dopamina en muestras de plasma sanguíneo, el método puede basarse en un ensayo por inmunoabsorción ligado a ezimas, (ELISA), por un radio inmunoensayo (RIA) o bien mediante una Inmunocromatografía. Specifically, the invention aims to provide a screening test for dopamine quinones in blood plasma, which allows an early diagnosis of Parkinson's disease before the patient has clinical symptoms of the disease. One embodiment of the invention consists in providing a voltammetric method for the detection of dopamine quinones in blood plasma samples. A further embodiment of the invention consists in providing a method of immunological detection of dopamine quinones in blood plasma samples, the method can be based on an assay for immunosorption linked to enzymes, (ELISA), by a radio immunoassay (RIA) or well by an immunochromatography.
Una modalidad más de la invención consiste en proveer de una prueba de laboratorio que permita realizar un diagnóstico certero de la enfermedad de Parkinson en pacientes sintomáticos o asintomáticos mediante la detección de quinonas de dopamina o dopamina oxidada presente en sangre y detectable en suero, plasma o sangre total. A further embodiment of the invention is to provide a laboratory test that allows an accurate diagnosis of Parkinson's disease in symptomatic or asymptomatic patients by detecting quinones of oxidized dopamine or dopamine present in blood and detectable in serum, plasma or whole blood
Una modalidad más de la invención se refiere al uso del método de diagnóstico del padecimiento de la enfermedad de Parkinson durante el tratamiento del paciente para determinar así si existe algún progreso clínico en la aplicación de dichos tratamientos utilizados. A further embodiment of the invention relates to the use of the method of diagnosis of Parkinson's disease during the treatment of the patient to determine if there is any clinical progress in the application of said treatments used.
ANTECEDENTES BACKGROUND
La enfermedad de Parkinson afecta a un porcentaje importante de la población en México, lo padecen más de medio millón de personas, además el riesgo de sufrir esta enfermedad aumenta con la edad. La enfermedad de Parkinson es el segundo trastorno neurológico crónico más común después de la enfermedad de Alzheimer en México. En Estados Unidos calculan que el costo anual total que significa para el país esta enfermedad excede los 7 mil millones de dólares.
La enfermedad de Parkinson lleva a un deterioro de la calidad de vida de los pacientes que la padecen, la edad es el factor de riesgo más importante para el desarrollo de esta enfermedad neurodegenerativa, teniendo en cuenta el envejecimiento progresivo de la población su prevalencia continuará aumentando en los próximos años. Parkinson's disease affects a significant percentage of the population in Mexico, more than half a million people suffer from it, and the risk of suffering from this disease increases with age. Parkinson's disease is the second most common chronic neurological disorder after Alzheimer's disease in Mexico. In the United States, they estimate that the total annual cost that this disease means to the country exceeds 7 billion dollars. Parkinson's disease leads to a deterioration in the quality of life of patients who suffer from it, age is the most important risk factor for the development of this neurodegenerative disease, taking into account the progressive aging of the population, its prevalence will continue to increase in the next years.
La enfermedad de Parkinson, afecta a todos los grupos étnicos y se presenta con ligera predisposición en los varones, tiene mayor incidencia en individuos de raza blanca y en la mayoría de los casos (95%), el diagnostico se establece en pacientes de más de 60 años lo cual indica que predomina la variante esporádica de la enfermedad. Parkinson's disease affects all ethnic groups and presents with a slight predisposition in men, has a higher incidence in white individuals and in most cases (95%), the diagnosis is established in patients over 60 years which indicates that the sporadic variant of the disease predominates.
La enfermedad de Parkinson se caracteriza por una neurodegeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la pars compacta de la sustancia nigra, así como de las proyecciones de estas neuronas, por lo tanto, la alteración más notable es la depleción de dopamina en el neostriado en más de un 80% de su contenido normal, esto va asociado a una gliosis reactiva, disminución de neuronas del locus ceruleus y del núcleo dorsal del vago con afectación de el núcleo basal de Meynert y de otros núcleos subcorticales, a medida que avanza la enfermedad se observa despigmentación de la sustancia nigra, el diagnóstico es clínico y la sintomatología se establece cuando se han muerto alrededor del 70 a 80% de las neuronas dopaminérgicas. La edad de inicio de los síntomas puede ser entre los 40 y 70 años. Parkinson's disease is characterized by a progressive neurodegeneration of the dopaminergic neurons of the compact pars of the nigra substance, as well as of the projections of these neurons, therefore, the most notable alteration is the depletion of dopamine in the neostriate in more of 80% of its normal content, this is associated with a reactive gliosis, decrease in neurons of the locus ceruleus and the dorsal nucleus of the vagus with involvement of the basal nucleus of Meynert and other subcortical nuclei, as the disease progresses observes depigmentation of the nigra substance, the diagnosis is clinical and the symptomatology is established when about 70 to 80% of dopaminergic neurons have died. The age of onset of symptoms can be between 40 and 70 years.
El diagnóstico es clínico (está basado en los siguientes signos: tremor, bradicinesia, akinesia o hipokinesia) lo que plantea un serio problema, existen estudios que al comparar el diagnostico clínico con el estudio histopatológico
cuando el paciente ha fallecido, se encuentra un 24% de error, lo que significa que de 100 pacientes diagnosticados por la sintomatología clínica que presentan 24 de ellos no tienen esta enfermedad, y reciben tratamiento equivocado hasta que fallecen y se puede hacer el estudio histopatológico. Este hecho se debe a que no se cuenta con un marcador bioquímico accesible para poder establecer un diagnostico diferencial con otros síndromes parkinsonianos, además de que esta enfermedad comparte datos clínicos con muchos padecimientos, por este hecho existen limitaciones para estimar correctamente los casos nuevos. The diagnosis is clinical (based on the following signs: tremor, bradykinesia, akinesia or hypokinesia) which poses a serious problem, there are studies that when comparing the clinical diagnosis with the histopathological study When the patient has died, a 24% error is found, which means that of 100 patients diagnosed by the clinical symptomatology that present 24 of them do not have this disease, and receive wrong treatment until they die and the histopathological study can be done . This fact is due to the lack of an accessible biochemical marker in order to establish a differential diagnosis with other Parkinsonian syndromes, in addition to the fact that this disease shares clinical data with many conditions, for this reason there are limitations to correctly estimate new cases.
Para la enfermedad de Parkinson hasta la fecha no se dispone de una cura, la terapia consiste principalmente en la mejora de los síntomas con L- Dopa y/ó con agonistas de dopamina, las terapias se enfocan en prevenir o al menos retardar el proceso neurodegenerativo; es de particular relevancia contar con un diagnóstico certero y temprano de la enfermedad. There is no cure for Parkinson's disease to date, the therapy consists mainly in the improvement of symptoms with L-Dopa and / or with dopamine agonists, the therapies focus on preventing or at least delaying the neurodegenerative process ; It is of particular relevance to have an accurate and early diagnosis of the disease.
En esta enfermedad el daño y la muerte neuronal puede empezar de 5 a In this disease the damage and neuronal death can start from 5 to
10 años (periodo de latencia preclínico) antes que el paciente presente sintomatología y se suele perder más del 10% por año, finalmente cuando la sintomatología se presenta, el 70% de las neuronas dopaminérgicas han muerto haciendo irreversible esta patología. Por otra parte no existen pruebas de laboratorio que permitan evaluar si existe algún progreso clínico en los tratamientos utilizados. 10 years (preclinical latency period) before the patient has symptoms and usually loses more than 10% per year, finally when the symptoms occur, 70% of dopaminergic neurons have died making this pathology irreversible. On the other hand, there are no laboratory tests to assess whether there is any clinical progress in the treatments used.
Del estado de la técnica más cercano a la invención, se encuentran patentes de pruebas genéticas basadas en la expresión genética alterada de la proteína parkina las cuales no son específicas para diagnóstico del Párkinson.
También se reportan estudios de imagen para diagnóstico temprano de la enfermedad de Parkinson, los cuales son tardados, costosos y no tan confiables ya que requieren de otras pruebas o datos clínicos para encontrar correlación para hacer el diagnóstico. From the state of the art closest to the invention, there are patents of genetic tests based on the altered genetic expression of parkin protein which are not specific for Parkinson's diagnosis. Imaging studies are also reported for early diagnosis of Parkinson's disease, which are delayed, expensive and not as reliable as they require other tests or clinical data to find correlation to make the diagnosis.
En la enfermedad de Parkinson ocurre una degeneración de neuronas dopaminérgicas que contienen neuromelanina, naturalmente en la sustancia nigra ocurre el proceso conocido como autooxidación de dopamina, que es una cadena de reacciones de oxidación en la cual se producen quinonas de dopamina que comienza por la presencia de iones de hierro (Fe++ ) y otras enzimas; las quinonas de dopamina son muy neurotóxicas; ya que en la sustancia nigra del parkinsoniano los niveles de iones de hierro libre y de sintasa de prostanglandina H se encuentran elevados, se asume que la tasa de autooxidación de dopamina esté incrementada en la enfermedad de Parkinson. In Parkinson's disease a degeneration of dopaminergic neurons that contain neuromelanin occurs, naturally in the nigra substance the process known as autopaxidation of dopamine occurs, which is a chain of oxidation reactions in which dopamine quinones are produced that begin by the presence of iron ions (Fe ++ ) and other enzymes; Dopamine quinones are very neurotoxic; Since in the nigra substance of Parkinsonian the levels of free iron ions and prostanglandin H synthase are elevated, it is assumed that the rate of dopamine autooxidation is increased in Parkinson's disease.
DA DA QuinoneDA DA Quinone
Con fines de terapia de destoxificación, las quinonas de dopamina pueden ser inactivadas mediante antioxidantes no enzimáticos como el ácido ascórbico y el glutatión, o por enzimas como oxidoreductasa NAD(P)H:quinona y la glutatión transferasa, ambas se expresan en la sustancia nigra en humanos.
Los cambios fisiopatológicos causados por el estrés oxidativo podrían ser los responsables de la lenta progresión natural de las enfermedades neurodegenerativas. La dopamina (DA) es una catecolamina que juega un rol importante en el sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos como neurotransmisor; y se encuentra en grandes cantidades con respecto a otros neurotransmisores. Sin embargo, se han encontrado niveles bajos de dopamina en pacientes con Enfermedad de Parkinson (Wrightman et al., 1988). El metabolismo normal de la dopamina involucra muchas reacciones oxidativas, las cuales producen metabolitos capaces de producir daño celular (Hermida-Ameijeiras et al 2004). En un estado de balance redox, la oxidación de la dopamina es parte del metabolismo normal; sin embargo, cuando un desequilibrio de la oxido-reducción está presente, la oxidación de la dopamina aumenta produciendo así un incremento de las quinonas de dopamina (DAQs), y la liberación de metales de transición con formación de superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo (Graham, 1978). Las quinonas de dopamina pueden reaccionar con la cisteína y producir residuos de cisteína capaces de inhibir la función de diversas proteínas (Ramsden et al 2001). Existen evidencias que muestran que el incremento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica ocurre en una gran cantidad de condiciones experimentales y patológicas, tales como: aumento de las especies reactivas de oxígeno, procesos neuroinflamatorios involucrados en enfermedades neurodegenerativas (Schreibelt et al 2007; Carvey et al 2005; Rite et al 2007; Zlokovic et al 2008). Además el metabolito oxidado de la dopamina puede cruzar la barrera hematoencefálica y circular en el plasma.
El desarrollo de técnicas electroquímicas para el monitoreo de catecolaminas ha probado ser una nueva y poderosa herramienta para el estudio de señales químicas en el sistema nervioso. Debido al hecho de que la dopamina es rápidamente oxidada, las técnicas electroquímicas han sido exploradas para su análisis en buffers y media controlada (Marystela et al., 2004; Ting-Liu, et al., 2004; Guan-Ping , et al., 2004; Ramesh et al., 2004; Aguilar et al., 2004; Yongxin and Xiangqin, 2006 Patel et al 2005, Liu et al 2005; Saeed et al., 2006; Sanket et al., 2007; Guan-Ping, et al., 2007). Sin embargo, los metabolitos oxidados de la dopamina y otras catecolaminas han sido pobremente estudiados en sistemas biológicos. Nosotros consideramos conveniente desarrollar un método basado en voltamperometría cíclica que nos permitiera medir quinonas de dopamina en plasma, y así correlacionar esto con el daño progresivo en la sustancia nigra causado por el estrés oxidativo. For the purpose of detoxification therapy, dopamine quinones can be inactivated by non-enzymatic antioxidants such as ascorbic acid and glutathione, or by enzymes such as NAD (P) H oxidoreductase: quinone and glutathione transferase, both expressed in the nigra substance in humans The pathophysiological changes caused by oxidative stress could be responsible for the slow natural progression of neurodegenerative diseases. Dopamine (DA) is a catecholamine that plays an important role in the central nervous system (CNS) of mammals as a neurotransmitter; and is found in large quantities with respect to other neurotransmitters. However, low levels of dopamine have been found in patients with Parkinson's disease (Wrightman et al., 1988). The normal metabolism of dopamine involves many oxidative reactions, which produce metabolites capable of producing cellular damage (Hermida-Ameijeiras et al 2004). In a state of redox balance, oxidation of dopamine is part of normal metabolism; however, when an oxidation-reduction imbalance is present, the oxidation of dopamine increases thus producing an increase in dopamine quinones (DAQs), and the release of transition metals with formation of superoxide, hydrogen peroxide and radicals hydroxyl (Graham, 1978). Dopamine quinones can react with cysteine and produce cysteine residues capable of inhibiting the function of various proteins (Ramsden et al 2001). There is evidence to show that the increase in blood brain barrier permeability occurs in a large number of experimental and pathological conditions, such as: increase in reactive oxygen species, neuroinflammatory processes involved in neurodegenerative diseases (Schreibelt et al 2007; Carvey et to 2005; Rite et al 2007; Zlokovic et al 2008). In addition, the oxidized dopamine metabolite can cross the blood brain barrier and circulate in the plasma. The development of electrochemical techniques for monitoring catecholamines has proven to be a powerful new tool for the study of chemical signals in the nervous system. Due to the fact that dopamine is rapidly oxidized, electrochemical techniques have been explored for analysis in buffers and controlled media (Marystela et al., 2004; Ting-Liu, et al., 2004; Guan-Ping, et al. , 2004; Ramesh et al., 2004; Aguilar et al., 2004; Yongxin and Xiangqin, 2006 Patel et al 2005, Liu et al 2005; Saeed et al., 2006; Sanket et al., 2007; Guan-Ping, et al., 2007). However, the oxidized metabolites of dopamine and other catecholamines have been poorly studied in biological systems. We consider it convenient to develop a method based on cyclic voltammetry that would allow us to measure dopamine quinones in plasma, and thus correlate this with the progressive damage to the nigra substance caused by oxidative stress.
Cabe mencionar que todos los pacientes estudiados con enfermedad de Parkinson presentaron en el registro el pico de metabolitos de dopamina oxidada (QD). It is worth mentioning that all patients studied with Parkinson's disease presented the peak of oxidized dopamine (QD) metabolites in the registry.
Como ya se menciono, el metabolismo oxidativo de este neurotransmisor en un equilibrio redox será rápidamente compensados por sistemas antioxidantes y llevara a la formación de neuromelanina, sin embargo cuando esta presente un estado crónico de estrés oxidativo las quinonas de dopamina no pueden ser contrarestadas por los sistemas antioxidantes y la vía de formación de neuromelanina aportara mayor cantidad de hierro oxidado que contribuye a formar un circulo vicioso que lleva paulatinamente a la muerte de
las neuronas dopaminérgicas proceso que puede durar años antes que aparezcan los síntomas clínicos. As already mentioned, the oxidative metabolism of this neurotransmitter in a redox equilibrium will be quickly compensated by antioxidant systems and will lead to the formation of neuromelanin, however when a chronic state of oxidative stress is present, dopamine quinones cannot be counteracted by antioxidant systems and the neuromelanin formation pathway will contribute a greater amount of oxidized iron that contributes to form a vicious circle that gradually leads to the death of The dopaminergic neurons process that can take years before clinical symptoms appear.
En el estado de la técnica, se encuentran documentos de patentes otorgadas y en trámite relacionadas con métodos electroquímicos para diagnósticos de varias enfermedades neurológicas basado en la comparación entre los niveles normales y anormales de neurotransmisores, ninguna de ellas menciona metabolitos oxidados de dopamina, ni propone las quinonas de dopamina, ni en líquido extraceluiar, ni en sangre o plasma, para el diagnostico temprano de la Enfermedad de Parkinson, tal y como está planteado en el método que conforma la presente invención, algunos de los documentos que mencionan estas técnicas son: In the state of the art, patent documents are granted and pending related to electrochemical methods for diagnosing various neurological diseases based on the comparison between normal and abnormal levels of neurotransmitters, none of them mention oxidized metabolites of dopamine, nor does it propose Dopamine quinones, neither in extracellular fluid, nor in blood or plasma, for the early diagnosis of Parkinson's Disease, as proposed in the method that forms the present invention, some of the documents that mention these techniques are:
La patente US 4883057 utiliza métodos electroquímicos por voltamperometría cíclica para medir aminas, ácido ascórbico, así como neurotransmisores y moduladores neuroquímicos cerebrales. Este método es utilizado para predecir el surgimiento de enfermedades neurológicas y de otros tipos como: diabetes, enfermedad de Parkinson, Alzheimer y Huntington; mediante la comparación entre los valores normales y los anormales de sustancias específicas. US 4883057 uses electrochemical methods by cyclic voltammetry to measure amines, ascorbic acid, as well as neurotransmitters and brain neurochemical modulators. This method is used to predict the emergence of neurological and other diseases such as: diabetes, Parkinson's disease, Alzheimer's and Huntington; by comparing normal and abnormal values of specific substances.
De manera similar, la patente US 5443710 utiliza un micro electrodo para medir aminas, neurotransmisores, neuromoduladores, entre otros; el método se utiliza para predecir el surgimiento de enfermedades neurológicas como Parkinson basado en la comparación de niveles normales y anormales de sustancias específicas e incluye la voltamperometría cíclica. Sin embargo los métodos de las patentes US 4883057 y US 5443710, no posibilitan un
diagnóstico temprano de ninguna de estas enfermedades; la estrategia referente a la medición de metabolitos oxidados, en particular de quinonas de dopamina, para determinar una etapa temprana de la presencia del parkinsonismo, no puede inferirse de este documento. Similarly, US 5443710 uses a micro electrode to measure amines, neurotransmitters, neuromodulators, among others; The method is used to predict the emergence of neurological diseases such as Parkinson's based on the comparison of normal and abnormal levels of specific substances and includes cyclic voltammetry. However, the methods of US patents 4883057 and US 5443710 do not allow early diagnosis of any of these diseases; The strategy concerning the measurement of oxidized metabolites, in particular dopamine quinones, to determine an early stage of the presence of parkinsonism, cannot be inferred from this document.
La patente US 5938903 se refiere a un microelectrodo para mediciones de biomoleculas presentes en fluidos biológicos; las finalidades son diversas incluyendo diagnósticos tempranos para varias enfermedades basado en la comparación entre los niveles normales y los metabolitos correspondientes, está ausente la posibilidad de un diagnóstico temprano de la Enfermedad de Parkinson. La patente US 6,287,452 también plantea el uso de electrodos para diagnóstico temprano y monitoreo de varias condiciones médicas en las que el oxido nítrico tiene un papel importante, no aborda la posibilidad del diagnóstico de la enfermedad de Parkinson. US 5938903 refers to a microelectrode for measurements of biomolecules present in biological fluids; the purposes are diverse including early diagnoses for various diseases based on the comparison between normal levels and corresponding metabolites, the possibility of an early diagnosis of Parkinson's disease is absent. US Patent 6,287,452 also proposes the use of electrodes for early diagnosis and monitoring of various medical conditions in which nitric oxide has an important role, does not address the possibility of the diagnosis of Parkinson's disease.
En la patente US 7112319 se describen técnicas electroquímicas que detectan dopamina norepinefrina y sus metabolitos en un solo pico (no separados por cada neurotransmisor) en núcleo caudado de rata utilizando técnica de voltamperometría cíclica: La invención relaciona métodos de diagnostico y de tratamiento a sujetos que presentan riesgo de enfermedad o alguna condición asociada con niveles anormales de uno o más neurotransmisores incluyendo epilepsia, enfermedades de ganglios básales, distonía y una serie de otras enfermedades entre las que se encuentra la enfermedad de Parkinson. El método está basado en la búsqueda de niveles anormales y los metabolitos correspondientes, es inespecífico y no menciona
metabolitos oxidados ni propone a las quinonas de dopamina para el diagnostico temprano de la Enfermedad de Parkinson In US patent 7112319 electrochemical techniques are described that detect dopamine norepinephrine and its metabolites in a single peak (not separated by each neurotransmitter) in rat caudate nucleus using cyclic voltammetry technique: The invention relates diagnostic and treatment methods to subjects who present a risk of disease or some condition associated with abnormal levels of one or more neurotransmitters including epilepsy, basal ganglia diseases, dystonia and a number of other diseases, including Parkinson's disease. The method is based on the search for abnormal levels and corresponding metabolites, it is nonspecific and does not mention oxidized metabolites nor proposes to dopamine quinones for the early diagnosis of Parkinson's disease
La patente US 20030032001 está relacionada con métodos electroquímicos muy generales de diagnóstico y/o tratamiento de un sujeto que presenta o está en riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con niveles anormales de algún neurotransmisor, también se basa en niveles comparativos entre enfermos y normales. US 20030032001 is related to very general electrochemical methods of diagnosis and / or treatment of a subject that presents or is at risk of developing a disease associated with abnormal levels of some neurotransmitter, it is also based on comparative levels between sick and normal.
La publicación internacional WO 2002082970 determina métodos muy generales de diagnóstico y/o monitoreo de una enfermedad neurológica mediante la generación de un microvoltamperograma, en el que se determina la presencia y concentración de, al menos, un marcador como dopamina. Se realiza una comparación del marcador determinado con parámetros normales para establecer si hay una diferencia significativa. En la microvoltamperometría se identifica cada metabolito mediante un pico de potencial de oxidación. The international publication WO 2002082970 determines very general methods of diagnosis and / or monitoring of a neurological disease by generating a microvoltarogram, in which the presence and concentration of at least one marker such as dopamine is determined. A comparison of the determined marker is made with normal parameters to establish if there is a significant difference. In microvoltage measurement, each metabolite is identified by a peak of oxidation potential.
La patente WO 2006041871 plantea un método de tratamiento de enfermedades psiquiátricas y neurológicas como Parkinson. Se miden niveles de catecolaminas mediante microdialisis, microvoltamperometría, entre otros. WO 2006041871 proposes a method of treating psychiatric and neurological diseases such as Parkinson's. Catecholamine levels are measured by microdialisis, microvoltaometry, among others.
La patente AU 2002303295 determina la presencia y concentración de químicos incluyendo neurotransmisores, en una célula, tejido, órgano u organismo mediante mediciones voltamperométricas y cronoamperométricas. Patent AU 2002303295 determines the presence and concentration of chemicals including neurotransmitters, in a cell, tissue, organ or organism by means of voltammetric and chronoamperometric measurements.
Puede ser utilizada para el diagnóstico o tratamiento de sujetos que tengan o estén en riesgo de desarrollar alguna enfermedad relacionada con niveles anormales de algún neurotransmisor, como Parkinson.
La patente JP 2008070209 provee un equipo de diagnóstico para la enfermedad de Parkinson mediante uso de muestras de sangre arterial. El equipo calcula la reacción de dopamina mediante el uso de PET, y determina niveles de dopamina, no plantea detección de ningún otro metabolito de dopamina ni un diagnóstico temprano de la enfermedad de Parkinson. It can be used for the diagnosis or treatment of subjects who have or are at risk of developing a disease related to abnormal levels of a neurotransmitter, such as Parkinson's. JP 2008070209 provides diagnostic equipment for Parkinson's disease through the use of arterial blood samples. The team calculates the reaction of dopamine through the use of PET, and determines levels of dopamine, does not raise detection of any other metabolite of dopamine or an early diagnosis of Parkinson's disease.
El estudio de la formación de quinonas de dopamina y la detección por voltamperometría cíclica de metabolitos oxidados de la dopamina en el plasma de pacientes que presentan síntomas muy tempranos que hacen sospechar en ellos la presencia de esta patología, nos ha permitido identificar que las quinonas presentes en sangre periférica de estos pacientes ocurre mucho antes que el daño sea irreversible. La invención se basa en esta correlación y se describe en seguida de manera detallada. The study of the formation of dopamine quinones and the detection by cyclic voltammetry of oxidized dopamine metabolites in the plasma of patients who have very early symptoms that make them suspect the presence of this pathology, has allowed us to identify that the quinones present In peripheral blood of these patients occurs long before the damage is irreversible. The invention is based on this correlation and is described in detail below.
La presente invención se destaca por lo siguiente: solo requiere una muestra de plasma sanguíneo obtenido de una vena periférica, detecta alteraciones del metabolismo de la dopamina antes que la mayoría de las células dopaminérgicas hayan muerto, el estudio es altamente específico, no encontramos estos metabolitos en otras enfermedades crónicas neurodegenerativas como: Enfermedad de Alzheimer y Corea de Huntington, también puede utilizase como un parámetro bioquímico para medir el grado de avance o de efectividad de un tratamiento en pacientes que padecen esta enfermedad; es factible en un futuro realizar esta prueba de rutina en un laboratorio clínico en pacientes mayores de 40 años. Finalmente no existen en este momento patentes u otros estudios que empleen esta metodología para el diagnostico temprano de esta enfermedad.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS The present invention stands out for the following: it only requires a sample of blood plasma obtained from a peripheral vein, detects alterations of the metabolism of dopamine before most dopaminergic cells have died, the study is highly specific, we do not find these metabolites In other chronic neurodegenerative diseases such as: Alzheimer's disease and Huntington's Korea, it can also be used as a biochemical parameter to measure the degree of progress or effectiveness of a treatment in patients suffering from this disease; It is feasible in the future to perform this routine test in a clinical laboratory in patients over 40 years. Finally, there are currently no patents or other studies that use this methodology for the early diagnosis of this disease. DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1. Voltamperometría cíclica típica de un paciente control en el cual se observa la ausencia de metabolitos oxidados de dopamina. Figure 1. Typical cyclic voltammetry of a control patient in which the absence of oxidized dopamine metabolites is observed.
Figura 2. Voltamperometría cíclica típica de un paciente con enfermedad de Parkinson, diagnosticado clínicamente, sin tratamiento; en el cual se puede observar presencia de quinonas de dopamina (QD). Figure 2. Typical cyclic voltammetry of a patient with Parkinson's disease, diagnosed clinically, without treatment; in which the presence of dopamine quinones (QD) can be observed.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invención consiste en una prueba de laboratorio que permite realizar un diagnóstico certero de la enfermedad de Parkinson en pacientes sintomáticos o asintomáticos con diferente nivel de desarrollo de la enfermedad, pero se hace especial énfasis en la posibilidad de realizar un diagnóstico temprano. La prueba de laboratorio es un método que se basa en la detección de quinonas de dopamina o dopamina oxidada presente en sangre y que es detectable en suero, plasma o sangre total. The present invention consists of a laboratory test that allows an accurate diagnosis of Parkinson's disease in symptomatic or asymptomatic patients with different levels of disease development, but special emphasis is placed on the possibility of early diagnosis. The laboratory test is a method that is based on the detection of dopamine or oxidized dopamine quinones present in blood and is detectable in serum, plasma or whole blood.
En el estudio clínico para detectar la presencia de dopamina se llevaron a cabo los siguientes experimentos: In the clinical study to detect the presence of dopamine the following experiments were carried out:
Se colectó sangre de pacientes diagnosticados con enfermedad de Parkinson, pacientes diagnosticados con Enfermedad de Alzheimer y Corea de Huntington y de individuos sanos pareados por edad y sexo. Blood was collected from patients diagnosed with Parkinson's disease, patients diagnosed with Alzheimer's disease and Huntington's Korea and from healthy individuals matched by age and sex.
Las muestras fueron centrifugadas para obtener el plasma y las mediciones de concentraciones voltamperométricas (CV) se llevaron a cabo usando una estación de trabajo electroquímica BAS epsilon ( Wets Lafayette, Indianápolis,
USA) controlada por una PC y conectada a una celda C-3 con una configuración de tres electrodos: un electrodo de carbón vitreo (GC) (BAS MF- 2012, Φ= 3mm) como electrodo de trabajo, Ag/AgCI 3M KCI (BAS MW-2063) como electrodo de referencia y un alambre de platino como electrodo auxiliar (BAS MW-1032) todos ellos de West Lafayette , Indianápolis, USA. El software OriginPro7.0 se uso para la transformación de las señales voltamperométricas y para obtener sus primeras derivadas. Todos los potenciales están expresados con respecto al electrodo normal de hidrógeno (NHE). Samples were centrifuged to obtain plasma and measurements of voltammetric concentrations (CV) were carried out using a BAS epsilon electrochemical workstation (Wets Lafayette, Indianapolis, USA) controlled by a PC and connected to a C-3 cell with a three electrode configuration: a vitreous carbon electrode (GC) (BAS MF- 2012, Φ = 3mm) as working electrode, Ag / AgCI 3M KCI ( BAS MW-2063) as reference electrode and a platinum wire as auxiliary electrode (BAS MW-1032) all of them from West Lafayette, Indianapolis, USA. OriginPro7.0 software was used for the transformation of voltammetric signals and to obtain their first derivatives. All potentials are expressed with respect to the normal hydrogen electrode (NHE).
El plasma (1.5ml) se colocó en una celda de pequeño volumen y se purgó con nitrógeno de ultra alta pureza (Praxair) para eliminar el oxígeno que pudiese interferir en los experimentos. The plasma (1.5ml) was placed in a small volume cell and purged with ultra high purity nitrogen (Praxair) to remove oxygen that could interfere with the experiments.
Los voltamperogramas se registraron entre -1.3 y 1.7 voltios (V) a una velocidad de barrido de 0.1 Vs"1. La ventana electroquímica del plasma se localizó entre -1.6 y 1.7 V. Todas las mediciones se hicieron a temperatura ambiente. Antes de cada medición el electrodo de trabajo se pulió manualmente con alúmina (Φ= Ο.Οδμιη; LECO St Joseph Missouri, USA), se lavó con agua destilada y ultrasonido durante 2-4 minutos, finalmente se secó con acetona. Voltamperograms were recorded between -1.3 and 1.7 volts (V) at a scanning speed of 0.1 Vs "1. The electrochemical plasma window was located between -1.6 and 1.7 V. All measurements were made at room temperature. Before each Measurement The working electrode was manually polished with alumina (Φ = Ο.Οδμιη; LECO St Joseph Missouri, USA), washed with distilled water and ultrasound for 2-4 minutes, finally dried with acetone.
Para conocer el comportamiento voltamperométrico del sistema biológico no afectado por estrés oxidativo, previamente se registró el CV del plasma obtenido de ratas no expuestas a ozono y de personas sanas, bajo las mismas In order to know the voltammetric behavior of the biological system not affected by oxidative stress, the CV of the plasma obtained from rats not exposed to ozone and from healthy people was previously registered, under them
condiciones experimentales. Éstas se consideraron curvas control y las subsecuentes comparaciones se basaron en estos resultados
El nivel más bajo detectable de quinonas de dopamina por el método de voltamperometría cíclica, se considera que se trata de un diagnóstico positivo, no se requiere determinar su concentración pero los pacientes con enfermedad de Parkinson presentan concentraciones aproximadas de 9 x 10"5 g/mL o 4.7 x 10-4 mol /L experimental conditions These were considered control curves and subsequent comparisons were based on these results. The lowest detectable level of dopamine quinones by the cyclic voltammetry method is considered to be a positive diagnosis, its concentration is not required but patients with Parkinson's disease have approximate concentrations of 9 x 10 "5 g / mL or 4.7 x 10-4 mol / L
La sensibilidad del método y la posibilidad de detectar la presencia de dopamina oxidada ya es indicativo de un proceso de neurodegeneración de las neuronas de dopamina en substancia nigra ya que en el paciente sano no existe esta molécula en sangre, pero en un paciente con Parkinson declarado estará presente The sensitivity of the method and the possibility of detecting the presence of oxidized dopamine is already indicative of a neurodegeneration process of dopamine neurons in nigra substance since in the healthy patient there is no such molecule in blood, but in a patient with Parkinson's declared will be present
A partir de lo anteriormente expuesto podemos inferir que en pacientes con síntomas subclínicos el nivel de quinonas de dopaminas es detectable lo que significa que un proceso neurodegenerativo está ocurriendo en substancia nigra mucho antes de que se presente la sintomatología clínica. From the above, we can infer that in patients with subclinical symptoms the level of dopamine quinones is detectable, which means that a neurodegenerative process is occurring in a substantiated substance long before clinical symptoms occur.
Una de las ventajas destacadas de la invención es que no se requiere realizar la medición de los niveles de las quinonas de dopamina en muestras de líquido extracelular de tejido de la sustancia nigra, sino que se realiza de manera menos complicada, en una muestra de plasma sanguíneo. One of the outstanding advantages of the invention is that it is not necessary to measure the levels of dopamine quinones in samples of extracellular fluid from tissue of the nigra substance, but that it is performed in a less complicated way, in a plasma sample blood
Otra modalidad de la invención consiste en proveer de un método de detección inmunológica de quinonas de dopamina en muestras de plasma sanguíneo, el método puede basarse en un ensayo por inmunoabsorción ligado a ezimas, (ELISA). Another embodiment of the invention consists in providing a method of immunological detection of dopamine quinones in blood plasma samples, the method may be based on an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Los fundamentos de la presente invención se refieren al estado de estrés oxidativo crónico y el daño neuronal en la enfermedad de Parkinson,
esto va acompañado de una respuesta inflamatoria que altera la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica; y aunque en el organismo en un equilibrio de oxido-reducción la barrera hematoencefálica es impermeable a la dopamina, esta barrera permite el paso de quinonas de dopamina. Todo lo anterior aunado a la pérdida de la funcionalidad de la barrera por la respuesta inflamatoria permite que quinonas de dopamina producida en la sustancia nigra, por tal alteración del metabolismo oxidativo del sistema dopaminérgico, puedan ser detectadas en sangre periférica de estos pacientes. The foundations of the present invention refer to the state of chronic oxidative stress and neuronal damage in Parkinson's disease, this is accompanied by an inflammatory response that alters the permeability of the blood-brain barrier; and although in the organism in an oxidizing-reducing balance the blood brain barrier is impermeable to dopamine, this barrier allows the passage of dopamine quinones. All of the above combined with the loss of the barrier's functionality due to the inflammatory response allows dopamine quinones produced in the nigra substance, due to such an alteration of the oxidative metabolism of the dopaminergic system, can be detected in the peripheral blood of these patients.
El análisis teórico de estos fundamentos finalmente pudo ser confirmado durante el desarrollo experimental de la invención: La determinación de los metabolitos oxidados de la dopamina se llevó a cabo mediante la aplicación la voltamperometría cíclica, con esta técnica se ha detectado que solo los pacientes que presentan enfermedad de Parkinson presentan dopamina oxidada en plasma. (Figuras 1 y 2). The theoretical analysis of these fundamentals could finally be confirmed during the experimental development of the invention: The determination of oxidized dopamine metabolites was carried out by applying cyclic voltammetry, with this technique it has been detected that only patients presenting Parkinson's disease have oxidized plasma dopamine. (Figures 1 and 2).
Las concentraciones aproximadas de quinonas de dopamina en individuos con enfermedad de Parkinson están alrededor de 9 x 10"5 g/mL o 4.7 x 10-4 mol /L. El solo hecho de detectar la presencia de dopamina oxidada en plasma la cual no esta presente en individuos sanos o que presentan enfermedades neurodegenerativas puede ser indicativo de un proceso neurodegenerativo en la substancia nigra The approximate concentrations of dopamine quinones in individuals with Parkinson's disease are around 9 x 10 "5 g / mL or 4.7 x 10-4 mol / L. The mere fact of detecting the presence of oxidized dopamine in plasma which is not present in healthy individuals or those with neurodegenerative diseases may be indicative of a neurodegenerative process in the nigra substance
Durante el desarrollo experimental, se obtuvo sangre periférica de los pacientes a estudiar, se separó por centrifugación el hematocrito del plasma, a continuación se utilizó el plasma para registrar por medio de voltamperometría cíclica la dopamina reducida y oxidada, cabe destacar que los pacientes con
enfermedad de Alzheimer, Corea de Huntington y otras demencias así como los controles que son individuos sanos, no presentan la curva de dopamina oxidada por lo que no existe posibilidad de confundir el diagnóstico con otro padecimiento relacionado con la función de la dopamina. During the experimental development, peripheral blood was obtained from the patients to be studied, the hematocrit was separated from the plasma by centrifugation, then the plasma was used to record the reduced and oxidized dopamine by cyclic voltammetry, it should be noted that patients with Alzheimer's disease, Huntington's Korea and other dementias, as well as controls that are healthy individuals, do not have the oxidized dopamine curve, so there is no possibility of confusing the diagnosis with another condition related to dopamine function.
Una vez obtenido el marcador específico para esta enfermedad se procedió a trabajar en un método de diagnóstico inmunológico, por lo que otra modalidad de la invención se refiere a dicho método y a un Kit para llevar a cabo un ELISA que nos permita detectar esta quinona en sangre periférica en pacientes. La prueba se basa en lo siguiente: Once the specific marker for this disease was obtained, we proceeded to work on an immunological diagnostic method, so another modality of the invention refers to said method and a Kit for carrying out an ELISA that allows us to detect this quinone in blood peripheral in patients. The test is based on the following:
En la neurodegeneración progresiva, que ocurre en sustancia nigra en los pacientes con enfermedad de Parkinson, está presente un estado crónico de estrés oxidativo. Esto es de gran relevancia ya que una parte del metabolismo de la dopamina es oxidante; sin embargo en personas sanas, las cuales se encuentran en un equilibrio de oxido-reducción las defensas antioxidante son capaces de mantener el equilibrio redox, pero en presencia de un estado de estrés oxidativo, la oxidación de la dopamina contribuye a incrementar el desequilibrio de oxido reducción y directamente a causar daño oxidativo; y a la muerte de las neuronas dopaminérgicas por la formación de dopamina oxidada. In progressive neurodegeneration, which occurs in nigra substance in patients with Parkinson's disease, a chronic state of oxidative stress is present. This is of great relevance since a part of the metabolism of dopamine is oxidizing; However, in healthy people, who are in a rust-reducing balance, antioxidant defenses are able to maintain redox balance, but in the presence of a state of oxidative stress, oxidation of dopamine contributes to increasing the oxide imbalance. reduction and directly to cause oxidative damage; and to the death of dopaminergic neurons due to the formation of oxidized dopamine.
Por otra parte, el estado de estrés oxidativo crónico y el daño neuronal van acompañados de una respuesta inflamatoria que altera la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica; y aunque en el organismo en un equilibrio de oxido-reducción la barrera hematoencefálica es impermeable a la dopamina, esta barrera si permite el paso de quinonas de dopamina. Todo lo anterior
aunado a la pérdida de la funcionalidad de la barrera por la respuesta inflamatoria permite que quinonas de dopamina producidas en substancia nigra por la alteración del metabolismo oxidativo del sistema dopaminérgico puedan ser detectadas en sangre periférica de estos pacientes. On the other hand, the state of chronic oxidative stress and neuronal damage are accompanied by an inflammatory response that alters the permeability of the blood-brain barrier; and although in the organism in an oxide-reduction balance the blood brain barrier is impermeable to dopamine, this barrier does allow the passage of dopamine quinones. All previous coupled with the loss of the functionality of the barrier due to the inflammatory response, it allows that dopamine quinones produced in nigra substance due to the alteration of the oxidative metabolism of the dopaminergic system can be detected in peripheral blood of these patients.
Una modalidad más de la invención se refiere al uso del método de diagnóstico del padecimiento de la enfermedad de Parkinson durante el tratamiento del paciente para determinar así si existe algún progreso clínico en la aplicación de dichos tratamientos farmacológicos o quirúrgicos utilizados, y para la selección de terapias combinadas. A further embodiment of the invention relates to the use of the method of diagnosis of Parkinson's disease during the treatment of the patient to determine if there is any clinical progress in the application of said pharmacological or surgical treatments used, and for the selection of Combined therapies
El diagnostico temprano de la Enfermedad de Parkinson de la invención, permite detectar una quinona de dopamina que solo está presente en sangre periférica de pacientes con dicha enfermedad, mucho antes que se manifiesten síntomas clínicos, lo que permitirá realizar un diagnostico oportuno antes que el 70% de las neuronas dopaminérgicas hayan muerto; también permitirá tomar medidas preventivas que impidan que la neurodegeneración siga avanzando otorgándoles una buena calidad de vida. The early diagnosis of Parkinson's disease of the invention, allows to detect a dopamine quinone that is only present in peripheral blood of patients with said disease, long before clinical symptoms manifest, which will allow an early diagnosis before 70 % of dopaminergic neurons have died; It will also allow preventive measures to prevent neurodegeneration from moving forward, giving them a good quality of life.
EJEMPLOS EXAMPLES
Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos de la presente invención y no deberán considerarse en modo alguno limitativos del alcance de la misma. The following examples are merely illustrative of the present invention and should not be considered in any way limiting the scope thereof.
Ejemplo 1 : Método de diagnóstico por voltamperometría cíclica:
Obtención de la muestra biológica: Se obtiene sangre periférica de los pacientes a estudiar, se separa el plasma para registrar las quinonas de dopamina por el método de voltamperometría cíclica Example 1: Cyclic voltammetry diagnostic method: Obtaining the biological sample: Peripheral blood is obtained from the patients to be studied, the plasma is separated to record the dopamine quinones by the cyclic voltammetry method
El plasma (1.5ml) se colocó en una celda de pequeño volumen y se purgó con nitrógeno de ultra alta pureza (Praxair) para eliminar el oxígeno que pudiese interferir en los experimentos. The plasma (1.5ml) was placed in a small volume cell and purged with ultra high purity nitrogen (Praxair) to remove oxygen that could interfere with the experiments.
Los voltamperogramas se registraron entre -1.3 y 1.7 voltios (V) a una velocidad de barrido de 0.1 Vs"1. La ventana electroquímica del plasma se localizó entre -1.6 y 1.7 V. Todas las mediciones se hicieron a temperatura ambiente. Antes de cada medición el electrodo de trabajo se pulió manualmente con alúmina (Φ= 0.05μιη; LECO St Joseph Missouri, USA), se lavó con agua destilada y ultrasonido durante 2-4 minutos, finalmente se secó con acetona. Voltamperograms were recorded between -1.3 and 1.7 volts (V) at a scanning speed of 0.1 Vs "1. The electrochemical plasma window was located between -1.6 and 1.7 V. All measurements were made at room temperature. Before each Measurement The working electrode was manually polished with alumina (Φ = 0.05μιη; LECO St Joseph Missouri, USA), washed with distilled water and ultrasound for 2-4 minutes, finally dried with acetone.
Para conocer el comportamiento voltamperométrico del sistema biológico no afectado por estrés oxidativo, previamente se registró el CV del plasma obtenido de ratas no expuestas a ozono o de personas sanas, bajo las mismas condiciones experimentales. Éstas se consideraron curvas control y las subsecuentes comparaciones se basaron en estos resultados. In order to know the voltammetric behavior of the biological system not affected by oxidative stress, the CV of the plasma obtained from rats not exposed to ozone or from healthy people was previously registered, under the same experimental conditions. These were considered control curves and subsequent comparisons were based on these results.
En la figura 1 se muestra un voltamperograma tipo obtenido de un paciente control en el cual se puede observar la ausencia de metabolitos oxidados de dopamina. Figure 1 shows a type voltamperogram obtained from a control patient in which the absence of oxidized dopamine metabolites can be observed.
En la figura 2 se muestra un voltamperograma tipo obtenido de un paciente con enfermedad de Parkinson en el cual se puede observar presencia de quinonas de dopamina (QD).
Para obtener las concentraciones de metabolitos oxidados de la dopamina se realizo previamente voltamperogramas adicionándoles al plasma de individuos controles con cantidades conocidas de quinonas de dopamina Ejemplo 2: Métodos de diagnóstico inmunológico. Figure 2 shows a type voltamperogram obtained from a patient with Parkinson's disease in which the presence of dopamine quinones (QD) can be observed. To obtain the concentrations of oxidized metabolites of dopamine, voltamperograms were previously performed by adding them to the plasma of control individuals with known amounts of dopamine quinones Example 2: Immunological diagnostic methods.
Obtención de la muestra biológica: Se obtiene sangre periférica de los pacientes a estudiar, se separa el plasma para someterlo a la prueba inmunológica. Obtaining the biological sample: Peripheral blood is obtained from the patients to be studied, the plasma is separated for immunological testing.
RIA: A partir de una anticuerpo primario que es monoclonal específico para quinona de dopamina éste se une al fondo de los pozos de la placa o de los tubos para RIA, en seguida se promueve la unión específica con las moléculas de quinonas de dopamina presentes en la muestra biológica (antígeno frío) ya obtenida que a su vez compite con quinonas de dopamina marcadas radiactivamente (antígeno marcado), se ensayan diferentes relaciones de antígeno marcado con frío. RIA: From a primary antibody that is monoclonal specific for dopamine quinone, it binds to the bottom of the plate wells or tubes for RIA, then specific binding to dopamine quinone molecules present in The biological sample (cold antigen) already obtained that in turn competes with radioactively labeled dopamine quinones (labeled antigen), different cold labeled antigen ratios are tested.
ELISA: al fondo de los pozos de la placa para ELISA se unen los anticuerpos policlonales específicos para Dopamina, la muestra biológica se adiciona, las quinonas de dopamina presentes en la muestra se unen al igual que la dopamina, el anticuerpo secundario marcado (por ejemplo con peroxidasa) es específico para las quinonas de dopamina, este se revela por la marca para reacción enzimática. ELISA: the polyclonal antibodies specific for Dopamine bind to the bottom of the ELISA wells, the biological sample is added, the dopamine quinones present in the sample bind just like dopamine, the labeled secondary antibody (for example with peroxidase) is specific for dopamine quinones, this is revealed by the brand for enzymatic reaction.
Otra modalidad de ELISA es: al fondo de los pozos de la placa se une un anticuerpo monoclonal específico para quinonas de dopamina, se incuba con la muestra biológica y en seguida con el anticuerpo secundario marcado para ser
revelado por reacción enzimática. Las placas se leen por absorbancia, por ejemplo a 450 nm si la marca es peroxidasa. Another modality of ELISA is: a monoclonal antibody specific for dopamine quinones is attached to the bottom of the plate wells, incubated with the biological sample and then with the secondary antibody labeled to be revealed by enzymatic reaction. The plates are read by absorbance, for example at 450 nm if the label is peroxidase.
Para interpretar las pruebas ELISA ó RIA se establece una curva control o de referencia con concentraciones conocidas de quinonas y se interpolan los datos obtenidos pudiendo ser: negativo, positivo bajo y positivo alto. Criterio de interpretación: Se considerara positivo si el paciente presenta positivo ya sea bajo ó alto. To interpret the ELISA or RIA tests, a control or reference curve is established with known concentrations of quinones and the data obtained can be interpolated, being: negative, positive low and positive positive. Interpretation criteria: It will be considered positive if the patient presents positive either low or high.
Pruebas rápidas por inmunocromatografía de flujo lateral: a partir de un anticuerpo monoclonal de ratón específico para quinonas de dopamina conjugado a oro o bien a perlas de látex, etc. La muestra biológica se agrega a un soporte sólido impregnado con dicho anticuerpo, se desplaza por flujo lateral conformado por oro o látex-anticuerpo-quinona de dopamina, al llegar por desplazamiento a la zona que tiene quinonas de dopamina, en presencia de complejos no se ve una banda y el resultado se interpreta como positivo, pero si al llegar a esta zona de quinonas de dopamina se observa una banda, significa que el anticuerpo no encontró al antígeno en la muestra (al menos no en suficiente cantidad), por lo que aglutina en la zona se observa dicha banda, el resultado se interpreta como diagnóstico de parkinson negativo. Finalmente el desplazamiento continúa y el complejo se enfrenta a una zona de anticuerpos específicos para el monoclonal de ratón, esta banda debe dar positivo ya que representa el control de que el desplazamiento se llevó a cabo correctamente la prueba.
Rapid tests by lateral flow immunochromatography: from a mouse monoclonal antibody specific for dopamine quinones conjugated to gold or latex beads, etc. The biological sample is added to a solid support impregnated with said antibody, it is displaced by lateral flow consisting of gold or latex-antibody-dopamine quinone, when it arrives by displacement to the area that has dopamine quinones, in the presence of complexes You see a band and the result is interpreted as positive, but if a band is observed when you reach this zone of quinone dopamine, it means that the antibody did not find the antigen in the sample (at least not in sufficient quantity), so agglutinates in the area, this band is observed, the result is interpreted as a diagnosis of negative parkinson's. Finally the displacement continues and the complex faces an area of antibodies specific for the mouse monoclonal, this band must be positive since it represents the control that the displacement was carried out correctly.
Claims
1. Un método de diagnostico temprano in vitro del padecimiento de la enfermedad de Parkinson mediante voltamperometria cíclica, en individuos clínicamente asintomáticos o sintomáticos, que consiste en la detección de quinonas de dopamina en una muestra biológica del individuo que puede ser sangre total, plasma o suero, y en donde por la presencia de niveles detectables por el voltamperimetro se considera positivo. 1. A method of early in vitro diagnosis of Parkinson's disease by cyclic voltammetry in clinically asymptomatic or symptomatic individuals, which consists of the detection of dopamine quinones in a biological sample of the individual that can be whole blood, plasma or serum, and where the presence of levels detectable by the voltameter is considered positive.
2. El método de diagnóstico de la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra biológica se somete a medición voltamperometrica cíclica para determinar la presencia de quinonas de dopamina y su concentración. 2. The diagnostic method of claim 1, further characterized in that the biological sample is subjected to cyclic voltammetric measurement to determine the presence of dopamine quinones and their concentration.
3. Un método de diagnóstico temprano in vitro del padecimiento de la enfermedad de Parkinson en individuos clínicamente asintomáticos o sintomáticos, de acuerdo con la reivindicación 2, que se caracteriza por: a. A partir de una muestra de sangre total, plasma o suero, somerterla a medición voltamperométrica cíclica, 3. A method of early in vitro diagnosis of Parkinson's disease in clinically asymptomatic or symptomatic individuals, according to claim 2, characterized by: a. From a sample of whole blood, plasma or serum, subject it to cyclic voltammetric measurement,
b. Identificar en la gráfica voltamperométrica la presencia de quinonas de dopamina b. Identify in the voltammetric graph the presence of dopamine quinones
c. Si se detecta la quinona de dopamina se diagnostica como positivo de la enfermedad. C. If dopamine quinone is detected, it is diagnosed as positive for the disease.
d. Si solo se detecta dopamina se diagnostica como negativo. d. If only dopamine is detected, it is diagnosed as negative.
4. El método de diagnostico temprano de la reivindicación 3, caracterizada porque la concentración de quinonas de dopamina se encuentra en aproximadamente 9x10"5 pg/mL o 4.7 x 10"4 mol/L. 4. The early diagnostic method of claim 3, characterized in that the concentration of dopamine quinones is approximately 9x10 "5 pg / mL or 4.7 x 10 " 4 mol / L.
5. El método de diagnostico de la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra biológica puede ser plasma ó suero la cual se somete a medición inmunológica mediante un ELISA, un RIA o una Prueba rápida por inmunocromatografía de flujo lateral. 5. The diagnostic method of claim 1, further characterized in that the biological sample can be plasma or serum which is subjected to immunological measurement by means of an ELISA, an RIA or a rapid test by lateral flow immunochromatography.
6. El método de diagnostico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, para utilizarse durante el monitoreo del progreso de tratamientos farmacológicos o quirúrgicos contra el Parkinson. 6. The diagnostic method according to claims 1 to 5, for use during the monitoring of the progress of pharmacological or surgical treatments against Parkinson's.
7. Un kit para RIA para diagnostico temprano, de la enfermedad de Parkinson, que comprende: a. Anticuerpo monoclonal especifico para quinonas de dopamina. 7. A kit for RIA for early diagnosis of Parkinson's disease, comprising: a. Monoclonal antibody specific for dopamine quinones.
b. Quinonas de dopamina con marca radiactiva. b. Dopamine quinones with radioactive brand.
c. Medios para la incubación de los anticuerpos con la muestra biológica que es plasma sanguíneo. C. Means for incubation of the antibodies with the biological sample that is blood plasma.
d. Medios para detección de la marca radiactiva en las muestras. d. Means for detecting the radioactive mark in the samples.
e. Especificaciones sobre el método diagnóstico de conformidad con la reivindicación 1 para llevar a cabo el RIA. and. Specifications on the diagnostic method according to claim 1 for carrying out the RIA.
8. Un kit para ELISA para diagnóstico temprano, de la enfermedad de Parkinson, que comprende: 8. An ELISA kit for early diagnosis of Parkinson's disease, comprising:
f. Una placa para ELISA sensibilizada con un Anticuerpo primario policlonal específico para dopamina. F. An ELISA plate sensitized with a polyclonal primary antibody specific for dopamine.
g. Un anticuerpo secundario especifico para quinonas de dopamina marcado con una enzima para detección. g. A secondary antibody specific for dopamine quinones labeled with an enzyme for detection.
h. Medios para incubación de los anticuerpos con la muestra biológica que es plasma sanguíneo. h. Means for incubation of the antibodies with the biological sample that is blood plasma.
i. Medios para lectura de la placa de ELISA mediante absorbancia que incluye el sustrato enzimático. i. Means for reading the ELISA plate by absorbance that includes the enzyme substrate.
j. Especificaciones sobre el método diagnóstico de conformidad con la reivindicación 1 para llevar a cabo el ELISA. j. Specifications on the diagnostic method according to claim 1 for carrying out the ELISA.
9. Una tira para prueba de diagnóstico rápido basado en inmunocromatografia de flujo lateral, para la detección temprana de padecimiento de la enfermedad de Parkinson que comprende: a) Un soporte solido que en la primera zona está impregnado con un anticuerpo monoclonal de ratón especifico para quinonas de dopamina conjugado a oro o bien a perlas de látex, 9. A rapid diagnostic test strip based on lateral flow immunochromatography, for the early detection of Parkinson's disease comprising: a) A solid support that in the first zone is impregnated with a specific mouse monoclonal antibody for dopamine quinones conjugated to gold or latex beads,
b) En esta primera zona del soporte, se incluye un sitio especifico para la deposición de la muestra biológica que es plasma sanguíneo, b) In this first area of the support, a specific site for the deposition of the biological sample that is blood plasma is included,
c) Una segunda zona que contiene quinonas de dopamina, dispuestas en una barrera y como una franja delgada alejada de la primera zona, la aparición de una banda en esta zona indica un resultado de diagnostico negativo para el padecimiento de Parkinson, la ausencia de banda visible en esta zona indica un resultado positivo para el padecimiento de Parkinson, c) A second zone that contains dopamine quinones, arranged in a barrier and as a thin strip away from the first zone, the appearance of a band in this area indicates a negative diagnostic result for Parkinson's disease, the absence of visible band in this area indicates a positive result for Parkinson's disease,
Una tercera zona para control positivo del funcionamiento de la tira, que contiene anticuerpos específicos para el monoclonal de ratón, dispuestas en una barrera y como una franja delgada alejada de la primera zona, la banda debe aparecer al realizar la prueba. A third zone for positive control of the operation of the strip, which contains specific antibodies for the mouse monoclonal, arranged in a barrier and as a thin strip away from the first zone, the band must appear when performing the test.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020254667A1 (en) | 2019-06-19 | 2020-12-24 | Universidad De Granada | Series of metabolites as biomarkers for the diagnosis of pancreatic cancer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2011152699A3 (en) | 2012-04-12 |
| MX2010006076A (en) | 2011-12-09 |
| MX341697B (en) | 2016-08-12 |
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