WO2012176977A2 - Ifret용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 단백질 검출 또는 이미징방법 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a protein detection or imaging microscope apparatus using a probe for iFRET and a protein detection or imaging method using the same.
  • fluorescence microscopes which are optical devices, are widely used for detailed observation of microsamples using fluorescence.
  • the fluorescence microscope is a device that irradiates light onto a sample, which is a micro object, and captures fluorescence emitted through the excitation and fluorescence emission processes from the sample by the irradiated light, thereby observing information such as an image of the micro object.
  • various probes or reporters are inserted on the sample to be measured when using a fluorescence microscope.
  • probes or reporters for analyzing biological materials in or outside the body.
  • Such a probe or reporter system can be largely divided into a method of measuring the coloration, coloration, and luminescence of a specific substrate itself or a substrate decomposed or modified by an enzymatic reaction and observing the material itself having fluorescence or coloration ability.
  • the former methods are fused to the protein of interest, in addition to intracellular observations such as expression level of the protein, measurement of promoter strength, selection of recombinant cells, and extracellular such as Western / Norther blotting and ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). It is also used for observation, and representative examples are enzymes and substrates such as alkaline phosphatase, peroxidase, xanthine oxidase, and the like. Compounds such as acridinium ester, biotin, fluorescein, and dioxygenin have been used.
  • a representative example of the protein itself as a probe is a fluorescent protein having a characteristic in which energy is emitted in the form of light when the activated fluorophore is absorbed by a specific wavelength and is returned to a normal state with low energy.
  • Representative examples include green fluorescent protein (GFP) representing green fluorescence derived from jellyfish, Aequorea victoria, and discosoma red fluorescent protein (DsRed) derived from Discocosoma species.
  • the fluorescent protein fluoresces itself without a substrate or cofactor, there is little interference with metabolic disturbances and cytophysiological factors as in the former case, and thus, various probe fields and other fields in which the enzymes of the former are utilized, Due to the disadvantages of enzymes and substrates, they can be used in applications that are difficult to apply.
  • the cell in the living state in which the protein maintains normal physiology without destroying a cell or an organism through fluorescence having a unique wavelength generated by light of a specific wavelength, the cell, such as the movement and activity pathway of a specific protein, cell division and differentiation, etc. It is recognized as a superior to any existing method for direct monitoring of complex changes occurring inside.
  • fluorescence resonance energy transfer means that when an energy donor, a shorter wavelength dye, absorbs energy from the outside, the excitation energy of the donor is located within a predetermined distance ( ⁇ 10 nm) instead of being emitted as light energy. )
  • a predetermined distance ⁇ 10 nm
  • Fluorescent proteins absorb and excite light in different inherent wavelength ranges, and once their energy is released by light or heat, they return to the ground state and emit light in a unique wavelength range for each fluorescent protein.
  • the fluorescence resonance energy transfer principle is a phenomenon in which when the two different fluorescent proteins are within 10 to 100 Hz, the light emitted after the short wavelength fluorescent protein is excited to induce excitation of the long wavelength fluorescent protein to emit fluorescence. That is, by attaching two different fluorescent proteins to each of the two proteins to examine the interaction, and then detecting the fluorescence due to the fluorescence resonance energy transfer phenomenon that occurs when the two proteins are within 10 to 100 ⁇ by protein interaction. It is possible to analyze protein interactions.
  • a fluorescent protein excited by light at 488 nm wavelength emits fluorescence in the 520 nm wavelength band, which acts as a wavelength to stimulate another paired fluorescence protein and emits fluorescence in the 630 nm wavelength band. . Therefore, the interaction of two proteins can be analyzed by excitation at 488 nm and detection of fluorescence in the 630 nm wavelength.
  • This system has the advantage of being able to analyze the dynamic interaction of proteins in living cells, but only when the distance between two fluoroproteins is very close to detect them, and overexpression of proteins is necessary to detect subtle changes in fluorescence wavelength. have.
  • the probes used in FRET technology using protein intrinsic fluorescence which are known to date, overlap the emission wavelengths of the protein itself and the fluorescent molecules, and thus unnecessary signals are measured, and thus the sensitivity and specificity of the measurement results are impaired. .
  • the present inventors have conducted continuous research to solve the fundamental problem of existing widely used probe systems. As a result, we have identified new fluorescent molecules using protein-specific fluorescence and developed probe systems combining them with target protein binding sites.
  • the present invention was completed by developing a protein detection or imaging microscope apparatus using a probe for iFRET and a protein detection or imaging method using the same.
  • An object of the present invention is to target protein detection or imaging microscopy apparatus using a probe for intrinsic fluorescence resonance energy transfer (iFRET); And to provide a target protein detection or imaging method using a microscope device according to the invention.
  • iFRET intrinsic fluorescence resonance energy transfer
  • the present invention is a target protein detection or imaging microscope apparatus using a probe for intrinsic fluorescence resonance energy transfer (iFRET), the probe for iFRET is a binding site (binding site) or the binding specific to the target protein Molecules having a site; And fluorescent molecules having a receptor function for intrinsic fluorescence of the target protein are directly or via a linker, and fluorescent molecules of the first light and the iFRET probe for wavelength excitation of amino acids in the target protein.
  • iFRET intrinsic fluorescence resonance energy transfer
  • a light irradiation unit for irradiating the second light in the wavelength band that excites An objective lens for causing the light irradiated from the light irradiator to be incident on a sample into which an iFRET probe is introduced; And irradiating the first light of a wavelength band that excites amino acids in the target protein onto a sample to irradiate the first light emission signal generated by the iFRET probe and the second light of the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe.
  • a microscope device including a recognizer for detecting a second light emission signal generated by a probe.
  • the microscope device irradiates a first light of a wavelength band that excites an amino acid in a target protein onto a sample to generate a first emission signal value generated by an iFRET probe and a second light of a wavelength band that excites a fluorescent molecule of an iFRET probe.
  • a ratio measuring module for analyzing the second emission signal value generated by the probe for iFRET and calculating the third emission signal value by ratio measurement of the first emission signal value and the second emission signal value (ratiometric) It is preferable to further include a measurement module.
  • the present invention provides a method for detecting or imaging a target protein using a microscope device, comprising: a first step of introducing the iFRET probe into a sample containing a target protein; A second step of irradiating the sample prepared in the first step alternately between the first light of the wavelength band for exciting the amino acid in the target protein and the second light of the wavelength band for exciting the fluorescent molecules of the iFRET probe; And irradiating the first light of the wavelength band that excites the amino acid in the target protein on the sample, the first emission signal value generated by the iFRET probe, and the second light of the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe. And a third step of analyzing the second emission signal value generated by the melting probe and calculating the third emission signal value by ratiometric measurement of the first emission signal value and the second emission signal value.
  • the iFRET probe uses an amino acid in a protein as a fluorescent donor, so that an artificial label (fluorescent protein, etc.) is not required for the target protein, and only one fluorescent substance may be used.
  • iFRET probe has a light emission wavelength separated from the protein-specific fluorescence, has a high specificity and sensitivity, and can easily and accurately analyze the amount, activity and mechanism of various proteins, the diagnosis and disease associated with the target protein It can be used for the development of therapeutic agents.
  • the microscope device it is possible to easily perform a target protein detection or imaging method coupled with a probe for iFRET;
  • the detection or imaging method of the target protein according to the present invention the amount of the target protein, the activity of the target protein, the mechanism of action or the migration pathway of the target protein can be identified or tracked.
  • the target protein-containing sample is irradiated with the target protein containing the first light of the wavelength band that excites the amino acid in the target protein and the second light of the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe;
  • the behavior of the target protein can also be observed in a moving picture.
  • FIG. 1 is a block diagram of a target protein detection or imaging microscope apparatus using a probe for intrinsic fluorescence resonance energy transfer (iFRET) as a first embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a configuration diagram of a microscope device as a second embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a configuration diagram of a microscope device as a third embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a view showing a process of optical excitation and divergence through a probe for iFRET embedded on a sample used in the present invention.
  • Figure 5 is a flow chart showing the time course of the target protein detection or imaging process using the microscope device of the present invention.
  • Each component constituting the protein detection or imaging microscope device using the probe for iFRET in the present invention may be manufactured integrally or separately separated as necessary. In addition, some components may be omitted depending on the form of use.
  • FRET Fluorescence Spectroscopy
  • FRET is generally referred to as resonance energy transfer because the wavelength emitted from the fluorescent donor overlaps with the absorption spectrum of the fluorescent receptor and occurs without the appearance of photons, which is the result of long-range dipole interactions between the fluorescent donor and the fluorescent receptor. to be.
  • the energy transfer efficiency of FRET is determined by the overlap between the emission spectrum of the fluorescent donor and the absorption spectrum of the fluorescent receptor, the quantum efficiency of the fluorescent donor, the relative orientation of the transition dipoles of the fluorescent donor and the fluorescent receptor, and the fluorescence. It depends on the distance between the donor and the fluorescent receptor. Therefore, the energy transfer efficiency of FRET varies depending on the distance and relative direction of the fluorescent donor and the fluorescent receptor. Forster's equation is expressed as follows.
  • E represents FRET efficiency
  • R is a distance between the fluorescent donor and the fluorescent acceptor, and is usually defined to be within 2-9 nm although it varies depending on the fluorescent material.
  • R 0 also refers to the distance between the fluorescent donor and the fluorescent acceptor at which the FRET efficiency is 50%, commonly referred to as the Forster distance or Forster radius.
  • R 0 is represented by the following formula.
  • k 2 calculates the normal direction to the 2/3 coefficient (orientation factor), and has a value in the range 0-4, depending on the relative orientation of donor fluorescence emission and acceptor absorption fluorescence.
  • n is the refractive index of the medium, and water at 25 DEG C is -1.334, and Qn is the quantum efficiency of the fluorescent donor.
  • J ( ⁇ ) has a unit value of M ⁇ 1 cm ⁇ 1 nm 4 to the extent of overlap of the luminescence of the fluorescent donor and the absorption spectrum of the fluorescent receptor (Lakowicz, JR Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York: Plenum Press, 1999; Patterson et al., Anal. Biochem. 284: 438, 2000; Patterson et al., J. of Cell Sci. 114: 837, 2001).
  • a "fluorescent donor” is an amino acid involved in exerting the intrinsic fluorescence of a protein.
  • Most proteins exhibit intrinsic fluorescence, which is known to involve amino acids with aromatic ring structures. Examples include Tryptophan, Tyrosine, and Phenylalanine. Such tryptophan, tyrosine and phenylalanine are excited by light of 260-300 nm wavelength and emit light of 290-400 nm, and the light affects up to 440 nm wavelength.
  • fluorescent receiving and “fluorescent receptor” are used interchangeably, and mean a fluorescent molecule which is excited by the intrinsic fluorescence of a protein and emits light.
  • the iFRET probe 155 includes a binding site specific to a target protein or a molecule having the binding site (hereinafter abbreviated as 'binding molecule', 156) and a fluorescent molecule 158 having iFRET receiving function. It includes, the binding molecule and the fluorescent molecule is bound directly or through a linker. The binding molecule site induces the iFRET probe to specifically bind to the target protein (see FIG. 3).
  • Fluorescent molecule 158 having a function of receiving intrinsic fluorescence of a protein according to the present invention is excited by light of 300-400 nm, which is an emission wavelength of tryptophan, tyrosine and / or phenylalanine, amino acids representing intrinsic fluorescence of the protein. It is preferable that it has a light emission wavelength of 450 nm or more which is a wavelength isolate
  • the wavelength bands of all the areas emitted by the iFRET probe may be measured. However, it is preferable to measure light having a long wavelength of 450 nm or more among the light emitted by the iFRET probe.
  • Cells or tissues contain nucleic acids, NAD (P) H, collagen, or cellular proteins, which are cellular autofluorescence substances that fluoresce by 260-400 nm light, and the fluorescence generated by them The wavelength is mainly present over 300-450 nm.
  • the iFRET probe of the present invention is preferably used for cell imaging or cell extracts or tissue staining (iFRET) in order to avoid the interference of the iFRET probe of the present invention preferably has a light emission area of 450 nm or more.
  • LED light It can be effectively detected in a light emitting diode and can be used as a fluorescent probe. Since the excitation wavelength is 340 nm to 380 nm and the emission wavelength is 400 nm to 600 nm, the emission wavelength band is higher than that of a known phosphor. It can be measured separately from autofluorescence.
  • the “sample” in the present invention means a target to be contained or estimated to contain the target protein to be analyzed, the target protein itself, cells, blood, urine, water, soil, air, food, waste, It may be collected from one or more of the flora and fauna, flora and fauna and the organism itself, but is not limited thereto.
  • the target protein is treated with the probe for iFRET according to the present invention
  • conventional fluorescent material treatment conditions may be used. It may be carried out in a medium selected from the group consisting of water, buffers, lower alcohols having 1 to 6 carbon atoms and mixtures thereof, or on biochips or (micro) microparticles, or on cells or tissues.
  • the microscope device 100 irradiates first light of a wavelength band for exciting amino acids in a target protein and second light of a wavelength band for exciting fluorescent molecules of an iFRET probe.
  • the objective lens 140 for causing the light irradiating unit 110 to irradiate the light irradiated from the light irradiating unit 110 onto the sample 150 into which the iFRET probe is introduced, and the first wavelength band for exciting the amino acid in the target protein.
  • the sample stage 152 on which the sample 150 is placed enables the three-dimensional driving of the sample 150 by moving in three directions of x, y, and z.
  • the microscope apparatus of the present invention irradiates a first light of a wavelength band that excites an amino acid in a target protein onto a sample to generate a first light emission signal value generated by an iFRET probe and a second light of a wavelength band that excites a fluorescent molecule of an iFRET probe.
  • the ratio measurement module 170 may include a program for driving and calculating the module.
  • the first light 142 of the wavelength band that excites amino acids in the target protein generated from the light irradiation unit 110 and the second light 142 of the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe are collected by the objective lens 140.
  • the second light emission 146 generated by the iFRET probe 155 by irradiating the second light of the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the dragon probe is recognized by the recognition unit 160.
  • Sample 150 may generally contain a target protein 154 and a probe 155 for iFRET bound to the target protein.
  • the iFRET probe 155 is a combination of a binding molecule 156 specific to a target protein and a fluorescent molecule 158 having iFRET receiving function, directly or through a linker.
  • the first emission signal value, the second emission signal value, and the third emission signal value may be two-dimensional image values corresponding to respective two-dimensional points of the sample.
  • the present invention includes a first light 142a of the wavelength band to excite the amino acid in the target protein and a second light 142b of the wavelength band to excite the fluorescent molecules of the probe for iFRET, containing the target protein and the probe for iFRET coupled thereto It is characterized by irradiating the sample 150 alternately.
  • the second light 142b of the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe is a light that directly excites the fluorescent molecules of the iFRET probe without exciting amino acids in the target protein.
  • the ratiometric measurement module 170 is configured to irradiate a first light of a wavelength band that excites amino acids in a target protein onto a sample to generate a first luminous signal value generated by an iFRET probe and a fluorescent molecule of an iFRET probe.
  • a first luminous signal value generated by an iFRET probe and a fluorescent molecule of an iFRET probe By irradiating the second light in the excitation wavelength band, the second light emission signal value generated by the iFRET probe is analyzed, and the third light emission signal value is determined by ratiometric measurement of the first light emission signal value and the second light emission signal value. Can be calculated.
  • the third luminous signal value is the amount of iFRET probe (first luminous signal value) bound to the target protein relative to the amount of iFRET probe (second luminous signal value) present in the sample (e.g., cell, sample solution, etc.).
  • a reference value second luminescence signal value
  • the amount of light irradiated to the sample can be corrected.
  • the third light emission signal value can be calculated by the following equation.
  • the intensity of the first emission signal value is converted into the third emission signal value, thereby minimizing a measurement error due to localization of the iFRET probe.
  • the third luminous signal value can be calculated using conventional ratiometric measurement software.
  • the wavelength range of the first light in the wavelength band that excites amino acids in the target protein in the light irradiation unit 110 is 260 nm to 300 nm
  • the wavelength range of the second light in the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe is 300 nm to 400 nm. Is preferably.
  • the light irradiation unit 110 may be a laser power control device capable of alternately irradiating the first light of the wavelength band to excite the amino acid in the target protein and the second light of the wavelength band to excite the fluorescent molecules of the iFRET probe.
  • FIG. 2 a microscope device 100 ′ according to a second embodiment of the present invention will be described. In the following, only the parts different from those of the first embodiment 100 will be described, and the same parts will be omitted.
  • the light irradiation unit 110 as shown in Figure 2, the light source 111; And an excitation filter module 130 for selectively filtering the first light of the wavelength band that excites amino acids in the target protein from the light source and the second light of the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe.
  • an excitation filter module 130 for selectively filtering the first light of the wavelength band that excites amino acids in the target protein from the light source and the second light of the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe.
  • the light source may be an Xe / Hg (xenon / mercury) lamp.
  • Metal halide lamps using xenon gas for mercury vapor can increase luminous efficiency and reduce power consumption to 20% or less.
  • the light irradiator 110 may further include one or more first collimator mirrors 121 for guiding a part of the light from the light source to the excitation filter module through reflection.
  • the first parallel optical mirror 121 transmits light having a longer wavelength than the first specific wavelength value (> 600 nm) and reflects light having a shorter wavelength than the first specific wavelength value, thereby blocking excessive heat transfer from the light source to the filter. It prevents damage to the filter and can be replaced with an infrared absorption filter.
  • the first specific wavelength is longer than the second light in the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe.
  • the first parallel light mirror 121 primarily removes a wavelength region which does not need to be applied to the present invention, from light of a wide range of wavelengths generated by the light source 111. That is, light of 600 nm or less wavelength band is transmitted to the excitation filter module 130.
  • the excitation filter module 130 includes an optical separation plate 134 provided with a plurality of light windows 135 and 136, a light receiving unit 131 for receiving the reflected light from the first parallel light mirror 121, and light for transmitting light. It includes a water extraction unit 132.
  • the excitation filter module 130 may selectively transmit the first light 142a of the wavelength band that excites the amino acids in the target protein and the second light 142b of the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe.
  • the first optical window 135 that transmits the first light of the wavelength band to excite the amino acid in the target protein and the second wavelength band to excite the fluorescent molecules of the iFRET probe
  • a second light window 136 that transmits light may be disposed on an optical path connecting the light inlet 131 and the light outlet 132.
  • the light component exiting the light emitter 132 may be discharged to the light nozzle 138 through the light connecting line 136.
  • the optical connection line 136 is made of a flexible material to enable free positioning of the optical nozzle 138.
  • the light emitting unit 132 and the second parallel light mirror may be horizontally arranged in an appropriate manner.
  • the objective lens 140 collects the light emitted from the sample 150 to form an image.
  • the objective lens 140 may be made of, for example, quartz or fused silica.
  • a second collimator mirror 125 may be installed on an optical path connecting the objective lens 140 from the light irradiation unit 110.
  • the second parallel light mirror 125 transmits light having a longer wavelength than the second specific wavelength value, reflects light having a shorter wavelength than the second specific wavelength value, and the second specific wavelength value is the fluorescence of the probe for iFRET.
  • the wavelength is longer than that of the second light in the wavelength band that excites the molecules, and is shorter than the wavelength band of the luminescence generated by the iFRET probe to be detected.
  • the second specific wavelength value is preferably 400 nm, the absorption wavelength of the protein is 260-300 nm, the absorption wavelength of the iFRET probe is 300-400 nm, and the final emission wavelength of the iFRET probe is 400 nm or more.
  • the second parallel light mirror 125 reflects the first light in the wavelength band that excites the amino acids in the target protein, the second light in the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe, or both, and then supplies the light through the objective lens 140.
  • the first light or the second light can be incident on the sample.
  • the first light emission generated by the iFRET probe derived from the first light irradiated to the sample or the second light emission generated by the iFRET probe derived from the second light irradiated to the sample is the second parallel light mirror 140.
  • the wavelength band to excite the amino acid in the target protein Irradiates the first light of the first light emission signal value (A 1 , A 2 , A 3 , ...) generated by the iFRET probe and the second light of the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe. Irradiated from the second luminous signal values B 1 , B 2 , B 3 ,...
  • the change of the target protein over time may be calculated as a moving picture. From this, the intracellular location and spatial movement of the target protein over time, quantitative change, activity change, the degree of binding of the drug, or all of the above changes can be identified.
  • the technique used for the conventional fluorescence measuring method for example, the technique used for the fluorescence spectrometer of the filter method and the monochrome method may be applied.
  • FIG. 3 a microscope device 100 ′′ according to a third embodiment of the present invention will be described.
  • the parts different from those of the second embodiment 100 ' will be described, and the descriptions of the same parts will be omitted.
  • a first wavelength selection mirror 126 may be provided to guide a part of light from the light source 111 to the excitation filter module 130 through reflection.
  • the first wavelength selective mirror 126 transmits light having a longer wavelength than the first specific wavelength value (600 nm) and reflects light having a shorter wavelength than the first specific wavelength value, similarly to the first parallel optical mirror 121. This primarily removes a wavelength region which is not required to be applied to the present invention among light of a wide range of wavelengths.
  • the light component emitted through the light exiting portion 132 of the excitation filter module 130 may be a relay lens system 144, a second wavelength selection mirror 146, an objective lens 140 ′, and a third wavelength.
  • the detection unit 160 detects the selection mirror 148.
  • the relay lens system 144 concentrates the light filtered through the excitation filter module 130 to the second wavelength selection mirror 146, or the objective lens 140 ′.
  • the second wavelength selective mirror 146 reflects light of all incident wavelengths.
  • the objective lens 140 ′ includes a first objective lens 141 disposed at the front end of the sample 150 and a second objective lens 145 disposed at the rear end of the sample 150.
  • the first objective lens 141 may be a quartz or reflecting objective lens and concentrates light onto the sample 150 to facilitate the excitation action.
  • the second objective lens 145 transmits light of 340 nm or more among the light components emitted from the sample 150 and at the same time enables the enlargement of the sample 150.
  • the second objective lens 145 may be made of fused silica.
  • the third wavelength selective mirror 148 filters out light having a wavelength of 310 nm or less. As a result, the residual image in the recognition unit 160 is minimized by removing unnecessary light components that may remain in the process supplied from the light source 111.
  • a separate emission filter 149 may be provided before the light passing through the third wavelength selection mirror 148 reaches the recognition unit 160.
  • FIGS. 2, 4 and 5 a target protein imaging method using a microscope device according to an embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 2, 4 and 5.
  • the light source 111 generates light in all regions including visible light or invisible light (S10).
  • the generated light passes through the first parallel light mirror 121 and the excitation filter module 130 to excite the first light 142a and the fluorescent molecules of the iFRET probe to excite the amino acid in the target protein. Is separated into the second light 142b (S20).
  • step S20 the light having the wavelength separated by filtering is collected through the objective lens 140 (S30).
  • the resolution can be improved by various scaling.
  • the light component irradiated onto the sample 150 from the objective lens 140 is excited through the iFRET probe 155 embedded in the sample 150 to emit light at a wavelength in the visible light region (S40).
  • the light for exciting the iFRET probe 155 alternates between the first light 142a in the wavelength band that excites the amino acids in the target protein and the second light 142b in the wavelength band that excites the fluorescent molecules of the iFRET probe. It may be repeated as.
  • the recognition unit 160 detects the light emission signal generated by the iFRET probe 155 (S50).
  • the recognition unit 160 may be a CCD camera module.
  • the CCD camera module has an array of light collecting devices in an enclosed space and allows converting a pattern of incident photon energy into a discrete analog signal.
  • the second light emission signal value generated by the probe calculates a third light emission signal value by performing ratiometric measurement (S60).
  • the imaging method according to the invention is preferably carried out by an automated workstation.

Abstract

본 발명에 따른 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치는, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하는 광 조사부; 상기 광 조사부에서 조사되는 광을 iFRET용 탐침이 도입된 시료 상에 입사하게 하는 대물 렌즈; 및 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호와, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호를 검출하는 인식부를 포함하며, 여기서 iFRET용 탐침은 표적 단백질에 특이적인 결합 부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 표적 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이다.

Description

IFRET용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 단백질 검출 또는 이미징방법
본 발명은 iFRET용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 단백질 검출 또는 이미징 방법에 관한 것이다.
유전체 칩 등의 바이오 칩의 형광 분석을 비롯한 다양한 생체 의학 분야에서 형광을 이용한 미세 시료의 상세 관찰을 위해 광학 장비인 형광(fluorescence) 현미경이 널리 사용된다. 형광 현미경은 마이크로 객체인 시료에 광을 조사하고, 조사된 광에 의하여 시료에서 여기(excitation) 및 형광 방출 과정을 거쳐 방출되는 형광을 포착하여 마이크로 객체의 이미지 등 정보를 관측하는 장치이다. 통상, 형광 현미경 이용시 측정 가능하게 하기 위해서는 측정되는 시료 상에 다양한 탐침자 또는 리포터가 삽입된다.
한편, 생명과학과 관련된 많은 분야에서 다양한 물질들이 생체 내 또는 외에서 생체 물질을 분석하기 위한 탐침자 또는 리포터로 활용되고 있다. 이러한 탐침자 또는 리포터 시스템은 크게 특정 기질 자체 또는 기질이 효소 반응에 의해 분해 또는 변형되어 나타나는 착색, 발색, 발광을 측정하는 방법과 형광이나 착색능을 지닌 물질 자체를 관찰하는 것으로 구분할 수 있다.
전자의 방법들은 목적하는 단백질에 융합된 형태로 단백질의 발현량, 프로모터의 세기 측정, 재조합 균체의 선별 등의 세포 내 관찰뿐만 아니라 웨스턴/노던 블랏팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)등의 세포 외 관찰에도 활용되고 있으며, 대표적인 예로는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 크산틴옥시다아제(xanthine oxidase) 등의 효소와 기질로서 루미놀(luminol), 루시게닌(lucigenin), 아크리디늄에스테르(acridinium ester), 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein), 디옥시제닌(dioxigenin) 등의 화합물이 이용되고 있다.
그러나, 이들이 세포 내에서 발현될 경우 생체 내 대사경로들을 교란시켜 성장을 저해하거나 세포사멸을 유도하는 등의 위험성이 존재하는 단점을 갖는다. 또한, 상기 효소들의 촉매 특성에 기인하는 문제뿐만 아니라 사용되는 기질의 낮은 안정성은 실험오차의 주요한 원인이 되며, 이들 대부분이 생물소재가 아닌 화학 합성물이기 때문에 세포에 유해할 수 있는 가능성이 있어 생체 내에서 지속적인 관찰이 어렵다는 단점도 상존한다. 따라서 전술한 탐침자 또는 리포터의 대부분은 생체 내 보다는 생체 외 탐침에 주로 이용되고 있다.
따라서, 상기 문제점을 개선하기 위하여 단백질 자체가 탐침자로서 작용하는 리포터에 관한 연구가 활발히 진행되었다. 단백질 자체가 탐침자인 대표적인 예로는 특정 파장의 빛을 받아 흡수하여 활성화된 형광단이 낮은 에너지를 지닌 정상상태로 되돌아가는 과정에서 방출되는 에너지가 빛의 형태로 나타나는 특성을 갖는 형광 단백질이 있다. 대표적인 예로는 해파리(jellyfish)인 Aequorea victoria로부터 유래한 녹색형광을 나타내는 GFP(green fluorescent protein)와, Discocosoma 종에서 유래한 DsRed(Discosoma red fluorescent protein)가 존재한다.
상기 형광 단백질은 기질이나 보조인자 없이 단백질 자체가 형광을 나타내기 때문에 전자의 경우처럼 대사교란 및 세포생리학적 인자들에 대한 간섭이 적어, 전자의 효소들이 활용되는 여러 탐침 분야와 그 외의 분야 즉, 효소 및 기질이 지닌 단점으로 인해 적용하기 힘든 분야에서도 활용이 가능하다. 특히 단백질이 특정 파장의 빛에 의해 생성하는 고유한 파장을 갖는 형광을 통하여 세포나 생물체를 파괴하지 않고 정상생리를 유지하는 살아있는 상태에서 특정 단백질의 이동과 활성 경로, 세포분열 및 분화과정 등과 같이 세포 내부에서 일어나는 복잡한 변화들을 직접 모니터링 하는 것에 있어 현존하는 어떠한 방법보다도 우수한 요소로 인정받고 있다.
또한, 단백질 공학 기술을 활용하여 야생형 형광 단백질과 다른 파장의 빛을 방출하도록 개량된 적색의 RFP, 노란색의 YFP, 청록색의 CFP, 청색의 BFP 등을 조합하여 활용하는 경우에는 여러 현상들을 동시에 관찰할 수 있으며, 다른 파장의 빛을 방출하는 형광 단백질들이 인접하거나 융합된 형태로 발현되었을 때 일어나는 FRET 현상을 활용하여 시료 내 특정 물질의 존재 여부 탐색, 단백질간의 상호작용 관찰 등의 연구 목적에 다양하게 활용 될 수 있는 장점을 갖는다.
한편, 형광 공명 에너지 전이란, 단파장 형광 단백질(shorter wavelength dye)인 에너지 공여체(donor)가 외부에서 에너지를 흡수하면 공여체의 여기에너지가 빛 에너지로 방출되는 대신, 소정의 거리 안에 위치한(<10 nm) 장파장 형광 단백질(longer wavelength excitation dye)인 에너지 수용체(acceptor)로 발광없이(radiationless) 전달되어, 수용체의 장파장 형광만이 방출되는 현상을 말한다. Miyawaki 등(Miyawaki et al., Nature, 1997, 388:882-887)은 FRET 원리를 이용하여 칼모둘린(calmodulin)과 칼모둘린 결합 펩티드(calmodulin-binding peptide)간의 상호작용을 분석하면서, 새로운 개념의 단백질 상호작용 분석 시스템을 개발하였다. 형광 단백질은 서로 다른 고유한 파장 영역의 빛을 흡수하여 여기(excitation)되며, 그 에너지가 빛 또는 열로 발산되고 나면 기저 상태로 회복되면서 형광단백질 마다 독특한 파장대의 빛을 발산(emission)하게 된다. 형광 공명에너지 전이 원리는 서로 다른 두 형광단백질이 10~100 Å 내에 있을 경우, 단파장 형광단백질이 여기된 후 방출하는 빛이 장파장 형광단백질의 여기를 유도하여 형광을 발산하는 현상이다. 즉 상호작용을 알아보고자 하는 두 단백질 뒤에 서로 다른 두 형광단백질을 각각 부착시킨 후, 단백질 상호작용에 의해 두 형광단백질이 10~100 Å 이내로 가까워졌을 때 일어나는 형광 공명에너지 전이 현상에 의한 형광을 탐지함으로써 단백질 상호작용을 분석할 수 있는 것이다.
예를 들면, 488 nm 파장의 빛으로 여기되는 형광단백질은 520 nm 파장대의 형광을 발산하게 되며, 이는 다시 짝을 이룬 다른 형광단백질을 자극하는 파장으로 작용하게 되고 630 nm 파장대의 형광을 발산하게 된다. 따라서 488 nm로 여기시키고 630 nm 파장대의 형광을 탐지함으로써 두 단백질의 상호작용을 분석할 수 있다. 이 시스템은 살아있는 세포내에서 단백질의 동적인 상호작용 분석이 가능한 장점이 있지만, 두 형광단백질의 거리가 매우 가까이 있어야만 탐지가 가능하고 미묘한 형광 파장의 변화를 감지하기 위해서는 단백질의 과량발현이 필요한 경우가 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 최근 단백질 고유 형광을 이용하려는 연구가 진행되어 아미노산 중 하나인 트립토판을 FRET에 응용할 수 있음이 보고되었고(Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4562-4588), 트립토판 결합 도메인 및 이를 검출할 수 있는 형광 부분을 이용하여 FRET를 측정하는 다중결합 트립토판 바이오센서 기술이 알려져 있다(미국공개특허 제2008/0311047호).
그러나, 현재까지 알려진 단백질 고유 형광을 이용한 FRET 기술에 사용되는 탐침들은 단백질 자체와 형광 분자의 발광 파장이 서로 중첩되어 불필요한 신호가 측정되어지고, 이로 인해 측정 결과의 민감도와 특이성이 저해되는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 기존의 광범위하게 활용되고 있는 탐침 시스템들이 갖는 근본적인 문제를 해결하고자 지속적인 연구를 수행한 결과, 단백질 고유 형광을 이용하는 새로운 형광 분자들을 확인하고, 이들을 표적 단백질 결합 부위와 결합한 탐침 시스템들을 개발하였으며, iFRET용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 단백질 검출 또는 이미징 방법을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치; 및 본 발명에 따른 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치로서, 상기 iFRET용 탐침은 표적 단백질에 특이적인 결합 부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 표적 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이고, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하는 광 조사부; 상기 광 조사부에서 조사되는 광을 iFRET용 탐침이 도입된 시료 상에 입사하게 하는 대물 렌즈; 및 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호와, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호를 검출하는 인식부를 포함하는, 현미경 장치를 제공한다.
상기 현미경 장치는 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 비율 계량 모듈(ratiometric measurement module)을 더 구비하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법으로서, 상기 iFRET용 탐침을 표적 단백질이 함유된 시료 내에 도입하는 제1 단계; 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 번갈아 제1단계에서 제조된 시료에 조사하는 제2단계; 및 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 iFRET용 탐침을 사용하면 기존의 FRET 방법과 달리 단백질 내의 아미노산을 형광 공여체로 사용하므로 표적단백질에 인위적인 표지(형광단백질 등)가 필요 없을 뿐 아니라, 하나의 형광물질만 사용하여도 되고, iFRET용 탐침은 단백질고유 형광과 분리된 발광파장을 가지므로 높은 특이성과 민감도를 가져, 다양한 단백질의 양, 활성 및 기작 등을 보다 쉽고 정확하게 분석할 수 있으며, 상기 표적 단백질과 관련된 질병의 진단 및 치료제의 개발에 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 현미경 장치를 사용하면, iFRET용 탐침이 결합된 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법을 용이하게 수행할 수 있으며; 본 발명에 따른 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법에 의해, 표적 단백질의 양, 표적 단백질의 활성, 표적 단백질의 작용기전 또는 이동 경로를 확인 또는 추적할 수 있다.
또한, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 표적 단백질 함유 시료에 조사하여, 정확한 표적 단백질 정량 분석이 가능하고; 또한 일정간격으로 제1광 및 제2광을 번갈아 시료에 조사하면, 표적 단백질의 거동을 동영상으로도 관찰할 수 있다.
도 1은 본 발명의 제 1 실시예로서 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치에 대한 구성도,
도 2는 본 발명의 제 2 실시예로서의 현미경 장치에 대한 구성도,
도 3은 본 발명의 제 3 실시예로서의 현미경 장치에 대한 구성도,
도 4는 본 발명에 사용되는 시료 상에 내재되는 iFRET용 탐침을 통한 광 여기 및 발산 과정을 도시한 도면, 및
도 5는 본 발명의 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미징 과정을 시계열적으로 도시한 순서도이다.
본 발명의 상기와 같은 목적, 특징 및 다른 장점들은 첨부도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예를 상세히 설명함으로써 더욱 명백해질 것이다. 기술되는 실시예는 발명의 설명을 위해 예시적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 iFRET용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치를 이루는 각 구성요소들은 필요에 따라 일체형으로 제조되거나 각각 분리되어 제조될 수 있다. 또한, 사용 형태에 따라 일부 구성요소를 생략하여 사용이 가능하다.
본 발명에서 "FRET"이란 서로 다른 발광 파장대의 두 형광물질 사이에서 발생하는 비방사성 (non-radiative) 에너지 전이현상으로, 여기(excitation)된 상태의 형광 공여체의 여기 준위 에너지가 형광 받게로 전달되어 형광수용체로부터 발광 (emission)이 관찰되거나, 형광 공여체의 형광감소(quenching)가 관찰되는 현상을 의미한다(Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999).
FRET은 일반적으로 형광 공여체로부터 방출되는 파장이 형광 수용체의 흡광스펙트럼과 겹치며, 광자(photon)의 출현 없이 발생하기 때문에 공명 에너지 전이라 하고, 이는 형광 공여체와 형광 수용체 사이의 장거리쌍극자 상호작용에 의한 결과이다. FRET의 에너지전이 효율은 형광 공여체의 발광스펙트럼과 형광 수용체의 흡광스펙트럼이 겹치는 범위와 형광 공여체의 양자효율, 형광 공여체와 형광 수용체의 전이쌍극자들(transition dipoles)의 상대적 방향(relative orientation), 그리고 형광 공여체와 형광 수용체 사이의 거리에 따라 달라진다. 따라서 FRET의 에너지전이 효율은 형광 공여체와 형광 수용체의 거리와 상대적 방향에 따라 다르게 나타나는데, Forster의 수식에 따르면 다음과 같이 표현된다.
E=R0 6 /(R6 +R0 6 ) [수식 1]
상기의 수식에서 E는 FRET 효율을 나타내며, R은 형광 공여체와 형광 수용체 사이의 거리로서 형광 물질에 따라 차이는 있지만 통상 2-9 nm 이내로 정의된다. 또한 R0는 FRET 효율이 50%가 되는 형광 공여체와 형광 수용체 사이의 거리를 말하며, 일반적으로 Forster distance 또는 Forster radius로 불려진다. R0는 다음의 수식으로 표현된다.
R0=0.211[k 2 n -4 Q D J(λ)]1/6 (in Å) [수식 2]
상기의 수식에서 k 2 는 방향계수 (orientation factor)로 통상 2/3로 계산하며, 형광 공여체 발광과 형광 수용체 흡광의 상대적 방향에 따라 0~4 범위의 값을 갖는다. n은 매질의 굴절율로 통상 25℃의 물은 ~1.334이며, Qn는 형광 공여체의 양자효율이다. J(λ)는 형광 공여체의 발광과 형광 수용체의 흡광스펙트럼상의 겹침(overlap) 정도로 M-1cm-1nm4의 단위 값을 갖는다 (Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999; Patterson et al., Anal. Biochem. 284: 438, 2000; Patterson et al., J. of Cell Sci. 114: 837, 2001).
본 발명에서 "형광 공여체"는 단백질의 고유 형광을 발휘하는데 관여하는 아미노산이다. 대부분의 단백질은 고유 형광(intrinsic fluorescence)을 발휘하는데, 이때 방향족고리 구조를 갖는 아미노산들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 그 예로는 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine), 및 페닐알라닌(Phenylalanine) 등이 있다. 이러한 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌은 260 ~ 300 nm 파장의 빛에 의해 여기되어 290 ~ 400 nm의 파장의 빛을 발광하고, 그 빛이 440 nm 파장까지 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 "형광 받게" 및 "형광 수용체"는 혼용하여 사용되며, 단백질의 고유 형광에 의해 여기되어 발광하는 형광분자를 의미한다.
본 발명에 따른 iFRET용 탐침(155)은, 표적 단백질에 특이적인 결합 부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자(이하 '결합분자'로 약칭함, 156)와 iFRET 받게 기능을 갖는 형광분자(158)를 포함하며, 상기 결합분자와 형광분자가 직접 또는 링커를 통해 결합되어 있다. 상기 결합분자 부위는 iFRET용 탐침이 표적 단백질에 특이적인 결합을 하도록 유도한다(도 3 참조).
본 발명에 따른 단백질의 고유 형광에 대한 받게 기능을 갖는 형광분자(158)는 상기 단백질의 고유 형광을 나타내는 아미노산인 트립토판, 티로신 및/또는 페닐알라닌의 발광 파장인 300 ~ 400 nm의 빛에 의해 여기되는 것이 바람직하고, 단백질 고유 형광과 분리되는 파장인 450 nm 이상의 발광 파장을 갖는 것이 더욱 바람직하다.
iFRET용 탐침이 발광하는 빛을 확인 또는 추적시 iFRET용 탐침이 발광하는 모든 영역의 파장대를 측정할 수 있으나, iFRET용 탐침이 방출하는 빛 중 450nm 또는 그 이상의 장파장의 빛을 측정하는 것이 바람직하다. 세포 혹은 조직(tissue)에는 260~400 nm의 빛에 의하여 형광을 내는 세포자가형광(cellular autofluorescence)물질인 핵산, NAD(P)H나 콜라겐, 혹은 세포단백질 등이 존재하며, 이들이 생성하는 형광 발광파장이 주로 300~450 nm에 걸쳐 존재한다. 따라서, 본 발명의 iFRET용 탐침은 세포 이미징에 사용되거나 세포추출물 혹은 조직염색(tissue staining)에 사용될 경우 이들의 간섭을 피하기 위하여 본 발명의 iFRET용 탐침은 발광영역이 450 nm 이상인 것이 바람직하다.
일례로, 본 발명에서 사용되는 iFRET용 탐침에서 단백질의 고유 형광에 대한 받게 기능을 갖는 형광분자(158)로 하기 화학식 I의 1-나프틸디아민 (1-naphthyldiamine)을 사용하는 경우, LED (light-emitting diode)에 효과적으로 검출 가능하여 형광탐침자로 사용될 수 있으며, 여기 파장이 340 nm 내지 380 nm이고, 발광 파장이 400 nm 내지 600 nm이므로 공지된 형광체와 비교하여 발광(emission) 파장대가 높아 세포의 자가 형광과 분리되어 측정될 수 있다.
[화학식 I]
Figure PCTKR2012003126-appb-I000001
한편, 본 발명에서 "시료"란, 표적 단백질을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 관찰 대상물을 의미하며, 표적 단백질 자체, 세포, 혈액, 뇨, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내, 동식물 조직 및 생물체 자체 중 어느 하나 이상에서 수집된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
표적 단백질에 본 발명에 따른 iFRET용 탐침을 처리하는 경우, 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 빛을 조사하여 발광하는 iFRET용 탐침을 확인하기 위해, 통상의 형광 물질 처리 조건을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 물, 완충용액, 탄소수 1 ~ 6의 저급알콜 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 매질내, 혹은 바이오칩이나 (극)미세입자 상, 혹은 세포나 조직(tissue)를 대상으로 수행되어질 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법을 상세히 설명하기로 한다.
표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치(100)의 전체적인 구성 설명
먼저, 도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 현미경 장치(100)는 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하는 광 조사부(110), 상기 광 조사부(110)에서 조사되는 광을 iFRET용 탐침이 도입된 시료(150) 상에 입사하게 하는 대물 렌즈(140), 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침(155)에서 생성되는 제1 발광 신호와, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침(155)에서 생성되는 제2 발광 신호를 검출하는 인식부(160)를 포함한다. 시료(150)가 놓이는 시료 스테이지(152)는 x,y,z 3방향으로 운동을 함으로써 시료(150)의 3차원 구동을 가능하게 한다.
본 발명의 현미경 장치는 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET용탐침에서생성되는제1 발광신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의제2 광을 조사하여 iFRET용탐침에서생성되는제2 발광신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 비율계량 모듈(170,ratiometric measurement module) 을 더 구비하는 것이 바람직하다. 비율계량 모듈(170)은 모듈 구동 및 계산용 프로그램을 구비할 수 있다.
광 조사부(110)로부터 생성된 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광(142) 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광(142)은 대물 렌즈(140)에서 집광되어 시료(150)로 전달되고, 시료(150) 내에서 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침(155)에서 생성되는 제1 발광(146)과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침(155)에서 생성되는 제2 발광(146)은 인식부(160)에서 인식된다.
시료(150)에는 일반적으로 표적 단백질(154) 및 상기 표적 단백질에 결합된 iFRET 용 탐침(155)이 함유될 수 있다. iFRET용 탐침(155)은, 표적 단백질에 특이적인 결합 분자(156)와 iFRET 받게 기능을 갖는 형광분자(158)가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것으로, 상기 결합분자 부위는 iFRET용 탐침이 표적 단백질에 특이적인 결합을 하도록 유도하여, iFRET을 통해 표적 단백질의 정량이 가능하게 할 뿐만 아니라, iFRET용 탐침이 표적 단백질과 함께 이동하게 하여 표적 단백질의 거동을 확인할 수 있게 한다.
따라서, 제1 발광 신호값, 제2 발광 신호값 및 제3 발광 신호값은 시료의 2차원 각 지점에 대응되는 2차원적인 영상값일 수 있다.
한편, 본 발명은 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의제1 광(142a) 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의제2 광(142b)을, 표적 단백질 및 이에 결합된 iFRET용 탐침이 함유된 시료(150)에 번갈아 조사하는 것이 특징이다.
iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광(142b)은 표적단백질 내 아미노산을 여기하지 아니하고 iFRET용 탐침의 형광분자를 직접 여기시키는 광이다.
비율 계량 모듈(170, ratiometric measurement module)은, 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출할 수 있다.
제3 발광 신호값은 측정시료(예: 세포, 검액 등)에 존재하는 iFRET용 탐침 (제2 발광 신호값)의 양에 대한 표적 단백질에 결합한 iFRET용 탐침의 양(제1 발광 신호값)의 비로서, 측정의 시간적 공간적 변화에 관계없이 늘 기준값(제2 발광 신호값)이 제공되어 표적단백질과 iFRET용 탐침의 결합을 정량화하는 것을 가능하게 한다. 또한, 비율계량법(ratiometric measurement)을 사용하면, 시료에 조사되는 빛의 량이 변해도 보정가능하다.
제3 발광 신호값은 다음과 같은 식에 의하여 계산될 수 있다.
제3 발광 신호값 = 제1 발광 신호값÷ 제2 발광 신호값 [수식 3]
비율 계량법에 따라 제2 발광 신호값을 기준값(reference)으로 사용하여 제1 발광 신호값의 세기를 제3 발광 신호값으로 환산함으로써, iFRET용 탐침의 편재화(localization)에 따른 측정오차를 최소화하며, 선명한 이미지를 얻을 수 있어서, 표적단백질의 양과 표적 단백질에 대한 약물결합의 정량적 측정, 표적단백질의 공간적 이동 추적 등이 가능하다.
제3 발광 신호값은 기존의 비율계량법(ratiometric measurement) 소프트웨어를 사용하여 계산될 수 있다.
광조사부(110)에서 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1광의 파장 범위는 260㎚ 내지 300㎚이고, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2광의 파장 범위는 300㎚ 내지 400㎚인 것이 바람직하다.
광 조사부(110)는, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광과 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 교대로 조사할 수 있는 레이저 전원 조절장치일 수 있다.
도 2를 참조하여 본 발명의 제 2 실시예에 따른 현미경 장치(100')를 설명하면 다음과 같다. 하기에서는 제 1 실시예(100)와 비교하여 차별적인 부분에 대해서만 설명하고 동일한 부분에 대해서는 생략한다.
광 조사부(110)는, 도 2에 도시된 바와 같이, 광원(111); 및 상기 광원으로부터의 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광과 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 선택적으로 필터링하는 여기 필터 모듈(130, exitation filter module) 를 구비할 수 있다.
상기 광원은 Xe/Hg(크세논/수은) 램프일 수 있다. 수은 증기에 크세논 가스를 이용하는 방식의 메탈 할라이드 램프는 발광 효율을 높일 수 있고 소비전력을 20% 이하로 감소시킬 수 있다.
광 조사부(110)는 상기 광원으로부터의 광 일부를 반사를 통해 여기 필터 모듈에 안내하는 하나 이상의 제1 평행광 미러(121, collimate mirror)를 더 구비할 수 있다. 제1 평행광미러(121)는 제1 특정 파장값(>600 nm)보다는 장파장대의 광은 투과시키고, 상기 제1 특정 파장값보다 단파장대의 광은 반사시킴으로써 광원으로부터 필터에 대한 과도한 열전달을 차단함으로써 필터의 손상을 방지하며, 적외선 흡수필터 등으로 대체도 가능하다. 상기 제1 특정 파장값은 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광보다 장파장대인 것이다. 제 1 평행광 미러(121)는 광원(111)에서 생성되는 광범위한 파장의 광 중 본 발명에는 적용할 필요 없는 파장 영역을 1차적으로 제거한다. 즉, 600 nm이하 파장 대역의 광을 여기 필터 모듈(130)로 전송하게 한다.
여기 필터 모듈(130)은 복수의 광 윈도우(135,136)가 설치된 광 분리판(134), 제 1 평행광 미러(121)로부터의 반사 광을 수신하는 광 입수부(131), 및 광을 보내는 광 출수부(132)를 포함한다.
여기 필터 모듈(130)은 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광(142a)과 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광(142b)을 선택적으로 투과시킬 수 있는데, 이는 광 분리판(134)을 주기적으로 회전구동하는 과정을 통해 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 투과하는 제 1 광 윈도우(135) 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 투과하는 제 2 광 윈도우(136)가 광 유입부(131)와 광 배출부(132)를 연결하는 광로 상에 배치될 수 있다. 광 배출부(132)로 나오는 광 성분은 광 연결 라인(136)을 통해 광 노즐(138)로 토출될 수 있다. 광 연결 라인(136)은 플렉시블한 재질로 구성됨으로써 광 노즐(138)의 자유로운 위치 선정을 가능하게 한다. 혹은 적절한 방법으로 광배출부(132)와 제2 평행광 미러를 수평 배열하는 것도 가능하다.
대물 렌즈(140)는 시료(150)에서 방출되는 광을 집광하여 상을 형성하게 한다. 대물 렌즈(140)는 예를 들어, 석영 또는 fused silica 로 제조될 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 광조사부(110)로부터 대물렌즈(140)를 연결하는 광 경로 상에 제2 평행광 미러(125, collimate mirror)가 설치될 수 있다. 이때, 제2 평행광 미러(125)는 제2 특정 파장값 보다는 장파장대의 광은 투과시키고, 상기 제2 특정 파장값보다 단파장대의 광은 반사시키며, 상기 제2 특정 파장값은 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광보다 장파장이고, 검출하고자하는 iFRET 용 탐침에서 생성되는 발광의 파장대 보다는 단파장인 것이다. 제2 특정 파장값은 400nm이 바람직하며, 단백질의 흡수파장이 260~300nm, iFRET용 탐침의 흡수파장이 300~400nm 이고 iFRET용 탐침의 최종 발광파장이 400nm 이상이기 때문이다.
제2 평행광 미러(125)는 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광, 또는 둘다를 반사시켜 대물 렌즈(140)를 통해 제1광 또는 제2광을 시료에 입사시킬 수 있다. 한편, 시료에 조사된 제1 광으로부터 유래된 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 또는, 시료에 조사된 제2 광으로부터 유래된 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광은 제2 평행광 미러(140)를 투과하여 인식부(160)에 입사되어 각각 제1 발광신호 또는 제2 발광신호로 검출될 수 있다.
한편, 광 조사부가 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 일정한 시간 간격으로 번갈아 조사하는 경우, 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값(A1, A2, A3,…)과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값(B1, B2, B3,…)으로부터 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값(C1, C2, C3,…)이 비율 계량 모듈(ratiometric measurement module)에서 일정한 시간 간격으로 산출되고 축적되므로, 시간에 따른 표적 단백질의 위치, 양 또는 둘다의 변화를 확인할 수 있다. 따라서, 시간에 따른 표적 단백질의 변화가 동영상으로 산출될 수도 있다. 이로부터, 시간에 따른 표적 단백질의 세포내 위치와 공간적 이동, 양적변화, 활성변화, 약물의 결합정도, 또는 상기한 모든 변화를 확인할 수 있다.
그외에는 통상의 형광 측정법에 이용되어지는 기술, 예컨대 필터방식 및 모노크롬 방식의 형광분광기에 사용되는 기술이 적용될 수 있다.
도 3을 참조하여 본 발명의 제 3 실시예에 따른 현미경 장치(100'')를 설명하면 다음과 같다. 하기에서는 제 2 실시예(100')와 비교하여 차별적인 부분에 대해서만 설명하고 동일한 부분에 대해서는 설명을 생략한다.
본 실시예에서는 광원(111)으로부터의 광 일부를 반사를 통해 여기 필터 모듈(130)에 안내하는 제 1 파장선택미러(126, dichroic mirror)를 구비할 수 있다. 상기 제 1 파장선택미러(126)는 제1 평행광미러(121)와 동일하게 제1 특정 파장값(600 nm)보다는 장파장대의 광은 투과시키고, 상기 제1 특정 파장값보다 단파장대의 광은 반사시킴으로써 광범위한 파장의 광 중 본 발명에는 적용할 필요 없는 파장 영역을 1차적으로 제거한다.
여기 필터 모듈(130)의 광 배출부(132)를 통해 나오는 광 성분은 릴레이 렌즈 시스템(relay lens system,144), 제 2 파장선택미러(146), 대물 렌즈(140'), 및 제 3 파장선택미러(148)를 거쳐 인식부(160)에서 검출된다.
릴레이 렌즈 시스템(144)은 여기 필터 모듈(130)을 통해 필터링된 광을 제 2 파장선택미러(146), 또는 대물 렌즈(140')로 집중하게 한다. 제 2 파장선택미러(146)는 입사되는 모든 파장의 광을 반사한다.
대물 렌즈(140')는 시료(150)의 전단에 배치되는 제 1 대물 렌즈(141) 및 시료(150)의 후단에 배치되는 제 2 대물 렌즈(145)를 포함한다. 제 1 대물 렌즈(141)는 석영(Quartz) 또는 반사(reflecting) 대물 렌즈일 수 있고, 여기 작용을 용이하게 하도록 시료(150) 상으로 광을 집중하게 한다.
한편, 제 2 대물 렌즈(145)는 시료(150)로부터 나오는 광 성분 중 340nm 이상의 광을 투과하게 하는 동시에, 시료(150)의 확대를 가능하게 한다. 상기 제 2 대물 렌즈(145)는 fused silica 로 제조되는 것이 바람직할 수 있다.
제 3 파장선택미러(148)는 310nm 파장 이하의 광을 필터링하여 제거한다. 이를 통해 광원(111)으로부터 공급되는 과정 중에 잔존할 수 있는 불필요한 광성분을 제거함으로써 인식부(160)에서의 잔상을 최소화한다.
한편, 제 3 파장선택미러(148)를 거친 광이 인식부(160)에 도달하기 전에 별도의 배출 필터(emission filter,149)가 구비될 수 있다.
현미경 장치(100)를 이용한 세포 단백질 이미징 방법 설명
이하, 도 2, 도 4 및 도 5를 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 이미징 방법을 설명한다.
먼저, 광원(111)에서는 가시광선 또는 비가시광선을 포함한 전 영역의 광을 생성한다(S10).
생성된 광은 제 1 평행광 미러(121) 및 여기 필터 모듈(130)를 거치는 과정을 통해 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광(142a) 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광(142b)으로 분리된다(S20).
상기 S20 단계에서 필터링으로 분리 선택된 파장의 광은 대물 렌즈(140)를 통해 집광된다(S30). 이 경우에 다양한 배율 조정을 통해 분해능을 향상할 수 있다.
대물 렌즈(140)에서 시료(150) 상으로 조사된 광 성분이 시료(150)에 내재된 iFRET 용 탐침(155)을 통해 여기되어 가시광 영역의 파장으로 발광한다(S40). 여기에서, 상기 iFRET 용 탐침(155)을 여기시키는 광은 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광(142a) 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광(142b)이 교대로 반복되는 것일 수 있다.
인식부(160)는 iFRET 용 탐침(155)에서 생성되는 발광 신호를 검출한다(S50). 인식부(160)는 CCD 카메라 모듈일 수 있다. 상기 CCD 카메라 모듈은 밀폐된 공간에 있는 집광 장치들의 배열을 가지며, 입사되는 광자 에너지의 패턴을 이산적인 아날로그 신호로 변환하게 한다.
표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값은 비율 계량법(ratiometric measurement)을 수행하여 제3 발광 신호값을 산출한다(S60).
본 발명에 따른 이미지화 방법은 자동화 워크스테이션에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
iFRET용 탐침과 관련하여, 동일자로 출원된 본 발명자의 한국출원(iFRET용 탐침 및 이의 용도) 은 본 발명의 명세서 일부로 통합된다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니한다. 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대한 다수의 변경 및 수정이 가능하며, 그러한 모든 적절한 변경 및 수정의 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되어야 할 것이다.

Claims (16)

  1. 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치로서,
    상기 iFRET용 탐침은 표적 단백질에 특이적인 결합 부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 표적 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이고,
    표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하는 광 조사부;
    상기 광 조사부에서 조사되는 광을 iFRET용 탐침이 도입된 시료 상에 입사하게 하는 대물 렌즈; 및
    표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호와, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호를 검출하는 인식부;
    를 포함하는,
    현미경 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 비율 계량 모듈(ratiometric measurement module)을 더 구비하는 것이 특징인,
    현미경 장치.
  3. 제 2 항에 있어서, 제1 발광 신호값, 제2 발광 신호값 및 제3 발광 신호값은 시료의 2차원 각 지점에 대응되는 2차원적인 영상값인 것이 특징인,
    현미경 장치.
  4. 제 1 항에 있어서, 제1광의 파장 범위는 260㎚내지 300㎚이고,
    제2광의 파장 범위는 300㎚ 내지 400㎚인 것이 특징인,
    현미경장치.
  5. 제 1 항에 있어서,
    표적 단백질의 고유 형광을 발휘하는 아미노산은 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine), 페닐알라닌(Phenylalanine) 또는 이들의 조합인 것이 특징인,
    현미경 장치.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 광 조사부는,
    광원; 및 상기 광원으로부터의 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광과 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 선택적으로 필터링하는 여기 필터 모듈(excitation filter module) 를 구비하는 것이 특징인,
    현미경 장치.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 광원으로부터의 광 일부를 반사를 통해 여기 필터 모듈에 안내하는 하나 이상의 제1 평행광 미러(collimate mirror)를 더 구비하고,
    제1 평행광 미러는 제1 특정 파장값보다는 장파장대의 광은 투과시키고, 상기 제1 특정 파장값보다 단파장대의 광은 반사시키는 것으로,
    상기 제1 특정 파장값은 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광보다 장파장대인 것이 특징인,
    현미경 장치.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 대물 렌즈는 상기 시료의 전단에 배치되는 제 1 대물 렌즈 및 상기 시료의 후단에 배치되는 제 2 대물 렌즈를 포함하며, 상기 제 1 대물 렌즈는 석영(Quartz) 또는 반사(reflecting) 대물 렌즈일 수 있고, 상기 제 2 대물 렌즈는 fused silica 대물 렌즈인 것이 특징인,
    현미경 장치.
  9. 제 1 항에 있어서,
    광조사부로부터 대물 렌즈를 연결하는 광 경로 상에 제2 평행광 미러(collimate mirror)가 설치되고,
    제2 평행광 미러는 제2 특정 파장값보다는 장파장대의 광은 투과시키고, 상기 제2 특정 파장값보다 단파장대의 광은 반사시키는 것으로,
    상기 제2 특정 파장값은 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광보다 장파장대이고, 검출하고자 하는 iFRET 용 탐침에서 생성되는 발광의 파장대 보다는 단파장인 것이 특징인,
    현미경 장치.
  10. 제 9 항에 있어서,
    제2 평행광 미러는 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광, 또는 둘다를 반사시켜 대물 렌즈를 통해 제1광 또는 제2광을 시료에 입사시키고,
    시료에 조사된 제1 광으로부터 유래된 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 또는, 시료에 조사된 제2 광으로부터 유래된 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광은 제2 평행광 미러를 투과하여 인식부에 입사되어 각각 제1 발광신호 또는 제2 발광신호로 검출되는 것이 특징인,
    현미경 장치.
  11. 제 2 항에 있어서,
    광조사부는 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의제2 광을 일정한 시간 간격으로 번갈아 조사하는 것이고,
    표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET용탐침에서생성되는제1 발광신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의제2 광을 조사하여 iFRET용탐침에서생성되는제2 발광신호값으로부터비율계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값이비율계량 모듈(ratiometric measurement module)에서 일정한 시간 간격으로 산출되고 축적되어, 시간에 따른 표적 단백질의 위치, 양 또는 둘다의 변화를 확인할 수 있는 것이 특징인,
    현미경 장치.
  12. 제 11 항에 있어서,
    시간에 따른 표적 단백질의 변화는 동영상으로 산출되는 것이 특징인,
    현미경 장치.
  13. 제 1 항에 있어서,
    시료는 표적단백질 자체, 용액, 세포, 혈액, 뇨, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내, 동식물 조직 또는 생물체 자체인 것이 특징인,
    현미경 장치.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 하나의 항에 기재된 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법으로서,
    상기 iFRET용 탐침을 표적 단백질이 함유된 시료 내에 도입하는 제1 단계;
    표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 번갈아 제1단계에서 제조된 시료에 조사하는 제2단계; 및
    표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 제3단계;
    를 포함하는 것이 특징인,
    방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 일정한 시간 간격으로 번갈아 조사하고,
    표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값으로부터 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값이 일정한 시간 간격으로 산출되고 축적되어, 시간에 따른 표적 단백질의 변화를 확인할 수 있는 것이 특징인,
    방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    시간에 따른 표적 단백질의 변화는 동영상으로 산출되는 것이 특징인,
    방법.
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